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Neuroscience

रेटिना जीन अभिव्यक्ति और क्रोमैटिन एक्सेसिबिलिटी का मल्टीप्लेक्स विश्लेषण एससीआरएनए-सीक और एससीएटीएसी-सेक का उपयोग करना

Published: March 12, 2021 doi: 10.3791/62239
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3,4,5,6
1Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Science, The Johns Hopkins Hospital, 3Department of Ophthalmology, The Johns Hopkins Hospital, 4Department of Neurology, The Johns Hopkins Hospital, 5Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Kavli Neuroscience Discovery Institute, Johns Hopkins University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

यहां, लेखक रेटिना में ट्रांसक्रिप्टोमिक और क्रोमैटिन एक्सेसिबिलिटी प्रोफाइल की विशेषता में फेनोटाइपिंग और बाद में युग्मित एससीआरएनए-सेक और एससीएटीएसी-सेक के लिए मल्टी-सेक की उपयोगिता का प्रदर्शन करते हैं।

Abstract

शक्तिशाली अगली पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीकें यह जांचने के लिए मजबूत और व्यापक विश्लेषण प्रदान करती हैं कि रेटिना जीन नियामक नेटवर्क विकास के दौरान और रोग राज्यों में कैसे कार्य करते हैं। सिंगल-सेल आरएनए अनुक्रमण हमें सेलुलर स्तर पर रेटिना विकास और बीमारी में देखे गए जीन अभिव्यक्ति परिवर्तनों को व्यापक रूप से प्रोफाइल करने की अनुमति देता है, जबकि एकल-सेल एटीएसी-सेक क्रोमेटिन पहुंच और प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी के विश्लेषण को समान रिज़ॉल्यूशन पर प्रोफाइल करने की अनुमति देता है। यहां विकासशील रेटिना में इन तकनीकों के उपयोग का वर्णन किया गया है, और मल्टी-सेक का प्रदर्शन किया जाता है, जहां व्यक्तिगत नमूनों को एक संशोधित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड-लिपिड कॉम्प्लेक्स के साथ लेबल किया जाता है, जिससे शोधकर्ताओं को व्यक्तिगत प्रयोगों के दायरे को बढ़ाने और लागत को काफी कम करने में सक्षम बनाता है।

Introduction

यह समझना कि जीन कोशिका भाग्य को कैसे प्रभावित कर सकते हैं, रोग और भ्रूण की प्रगति जैसी प्रक्रियाओं से पूछताछ करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। प्रतिलेखन कारकों और उनके लक्ष्य जीन के बीच जटिल संबंधों को जीन नियामक नेटवर्क में वर्गीकृत किया जा सकता है। बढ़ते सबूत इन जीन नियामक नेटवर्क को विकासवादी वंशों में बीमारी और विकास दोनों के केंद्र में रखते हैं1. जबकि क्यूआरटी-पीसीआर जैसी पिछली तकनीकें एक जीन या जीन के सेट पर केंद्रित थीं, उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण तकनीक का अनुप्रयोग पूर्ण सेलुलर ट्रांसक्रिप्टोम की प्रोफाइलिंग की अनुमति देता है।

आरएनए-सेक बड़े पैमाने पर ट्रांसक्रिप्टोमिक्स 2,3 में एक झलक प्रदान करता है। सिंगल-सेल आरएनए अनुक्रमण (एससीआरएनए-सेक) जांचकर्ताओं को न केवल ट्रांसक्रिप्टोम को प्रोफाइल करने की क्षमता देता है, बल्कि जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल के साथ विशिष्ट सेल प्रकारों कोजोड़ता है 4. यह ज्ञात जीन मार्करों का उपयोग करके छँटाई एल्गोरिदम में व्यक्तिगत सेल प्रोफाइल खिलाकर जैव सूचनात्मक रूप से प्राप्त किया जाता है5. लिपिड-टैग किए गए सूचकांक अनुक्रमण (मल्टी-सेक) का उपयोग करके मल्टीप्लेक्सिंग एससीआरएनए-सेक प्रोफाइल की संख्या में अभूतपूर्व विविधता प्रदान करता है जिसे एकत्र किया जा सकता है6. यह लिपिड आधारित तकनीक अन्य नमूना अनुक्रमण तकनीकों जैसे सेल-हैशिंग से भिन्न होती है जो प्लाज्मा झिल्ली एकीकरण7 के बजाय सतह एंटीजन और उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी की उपस्थिति पर निर्भर करती है। न केवल अब सेल प्रकारों में जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल को प्रोफाइल करना संभव है, बल्कि विभिन्न प्रयोगों को एक एकल अनुक्रमण पुस्तकालय में जोड़ा जा सकता है, नाटकीय रूप से एक व्यक्तिगत एससीआरएनए-सेक प्रयोग6 की लागत को कम करता है। एससीआरएनए-सेक की लागत फेनोटाइपिंग प्रयोगों में उपयोग के लिए निषेधात्मक लग सकती है जहां कई अलग-अलग जीनोटाइप, स्थितियों या रोगी के नमूनों का विश्लेषण किया जाता है, लेकिन मल्टीप्लेक्सिंग एकही पुस्तकालय 6 में 96 नमूनों के संयोजन की अनुमति देता है।

एससीआरएनए-सेक के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा एकमात्र उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण-आधारित तकनीक नहीं है जो वर्तमान समझ में क्रांतिकारी बदलाव करती है कि आणविक तंत्र सेल भाग्य को कैसे निर्देशित करते हैं। यह समझने के दौरान कि कोशिका में कौन से जीन टेप मौजूद हैं, सेल प्रकार की पहचान करने में सक्षम बनाता है, उतना ही महत्वपूर्ण यह समझना है कि जीनोमिक संगठन विकास और रोग प्रगति को कैसे नियंत्रित करता है। प्रारंभिक अध्ययन हिस्टोन से बंधे नहीं अनुक्रमों के डीएनए-मध्यस्थता दरार का पता लगाने पर निर्भर थे, इसके बाद खुले क्रोमैटिन के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए परिणामस्वरूप डीएनए टुकड़ों का अनुक्रमण किया गया था। इसके विपरीत, ट्रांसपोसन सुलभ क्रोमैटिन अनुक्रमण (एससीएटीएसी-सेक) के लिए एकल कोशिका परख शोधकर्ताओं को एकल न्यूक्लियोटाइड स्तर 8 पर खुले क्रोमैटिन को आसानी से प्रोफाइल करने के लिए एक पालतू ट्रांसपोसन के साथ डीएनए की जांच करने की अनुमतिदेती है। यह एससीआरएनए-सेक के समान स्केलिंग के माध्यम से चला गया है और अब जांचकर्ता हजारों व्यक्तिगत जीनोम8 में व्यक्तिगत सेल प्रकार और प्रोफाइल फेनोटाइप की पहचान कर सकते हैं।

एससीआरएनए-सेक और एससीएटीएसी-सीक्यू की जोड़ी ने शोधकर्ताओं को रोग मॉडल और विकास प्रक्रियाओं 9,10,11,12 में सेल आबादी, जीनोमिक संगठन और जीन नियामक नेटवर्क निर्धारित करनेके लिए हजारों कोशिकाओं को प्रोफाइल करने की क्षमता की अनुमति दी है। यहां लेखकों ने रेखांकित किया है कि पशु मॉडल के असंख्य फेनोटाइपिंग को संघनित करने के लिए पहले मल्टी-सेक का उपयोग कैसे करें और इन पशु मॉडलों में क्रोमैटिन परिदृश्य और नियामक नेटवर्क की बेहतर समझ हासिल करने के लिए युग्मित एससीआरएनए-सेक और एससीएटीएसी-सेक को नियोजित करें।

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Protocol

इन अध्ययनों के लिए जानवरों का उपयोग जॉन्स हॉपकिन्स एनिमल केयर एंड यूज कमेटी द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग करके किया गया था, आगमन दिशानिर्देशों के अनुपालन में, और प्रासंगिक दिशानिर्देशों और नियमों के अनुसार प्रदर्शन किया गया था।

1. मल्टी-सेक

  1. मीडिया की तैयारी
    1. 13 का उपयोग करने से पहले 30 मिनट के लिए, ओवोमुकोइड अवरोधक के 10 मिलीग्राम और अर्ल के संतुलित नमक समाधान (ईबीएसएस) के प्रति एमएल एल्बुमिन के10 मिलीग्राम तैयार करें और संतुलित करें। इनक्यूबेटर में 95% ओ2: 5% सीओ 2 के साथसंतुलन ।
      1. इस इनक्यूबेशन चरण13 के दौरान पपैन पृथक्करण समाधान, 20 इकाइयां / एमएल पपैन और ईबीएसएस में 0.005% डीएनएएसई तैयार करें।
        नोट: डीएनए समाधान की एक शीशी 5 नमूनों के लिए पर्याप्त होगी। 5 से अधिक नमूनों पर मल्टी-सेक प्रदर्शन करने पर अतिरिक्त शीशियों को पुनर्गठित करने की आवश्यकता हो सकती है।
    2. लिपिड संशोधित ओलिगो बारकोडिंग समाधान तैयार करें।
      1. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 4.5 μL के साथ 100 μM बारकोड स्टॉक समाधान के 0.5 μL संयोजन द्वारा प्रत्येक नमूने के लिए एक अद्वितीय बारकोड कमजोर पड़ने बनाओ।
      2. 1: 1 दाढ़ अनुपात पर लंगर: बारकोड समाधान तैयार करने के लिए, 10 μM बारकोड कमजोर पड़ने के 4.4 μL, 50 μM लंगर समाधान के 0.9 μL, और पीबीएस के 16.7 μL गठबंधन और बर्फ पर जगह। बारकोड किस्में और लंगर किस्में दोनों के लिए अंतिम एकाग्रता 2 μM होनी चाहिए।
      3. सह-लंगर समाधान तैयार करने के लिए, 50 μM सह-लंगर समाधान के 0.88 μL और पीबीएस के 21.12 μL गठबंधन और बर्फ पर रखें। सह-लंगर की अंतिम एकाग्रता 2 μM होनी चाहिए। नमूनों की संख्या 1.1x से इस चरण में वॉल्यूम गुणा करें।
    3. पीबीएस में 1% बीएसए बनाने के लिए, पीबीएस के 10 एमएल में गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के 0.1 ग्राम को भंग करें और बर्फ पर रखें।
    4. आरनेस अवरोधक के साथ पीबीएस बनाने के लिए, पीबीएस के 197.5 μL के साथ 40 U/ μL आरएनएएसई अवरोधक के 2.5 μL गठबंधन करें और बर्फ पर स्टोर करें। नमूनों की संख्या 1.1x से इस चरण में वॉल्यूम गुणा करें।
  2. नमूना पृथक्करण
    1. संस्थागत आईएसीयूसी आवश्यकताओं के अनुसार गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था और / या सीओ2 श्वासावरोध के माध्यम से जानवरों को इच्छामृत्यु दें। इच्छामृत्यु के लिए विधि संस्थागत आवश्यकताओं और उपयोग किए जाने वाले मॉडल जीव पर निर्भर करेगी।
    2. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत ठंड पीबीएस में दोनों आंखों से रेटिना विच्छेदन और एक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग कर एक बाँझ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब के लिए स्थानांतरण।
    3. प्रत्येक नमूने के लिए एक 1.5 एमएल ट्यूब के लिए पपैन समाधान के 500 μL स्थानांतरण।
    4. पपैन समाधान में नमूने रखें और तुरंत ट्यूबों को कैप करें।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 5% सीओ2 पर नमूने युक्त ट्यूबों सेते हैं। शीशियों को हर 10 मिनट में 3 बार पलटें। नमूनों को उत्तरोत्तर व्युत्क्रम के प्रत्येक दौर के साथ अलग होना चाहिए।
    6. शीशियों को कमरे के तापमान पर लौटें और 300 μL पर सेट 1 एमएल पिपेट के साथ प्रत्येक नमूने को 3-4 बार ट्राइट्यूरेट करें।
    7. ट्रिट्यूरेशन के बाद शेष अविभाजित ऊतक के किसी भी टुकड़े को व्यवस्थित करने की अनुमति दें।
    8. बादल सेल निलंबन निकालें जबकि अविभाजित ऊतक के किसी भी टुकड़े से परहेज और एक नए बाँझ 15 एमएल पेंच-कैप्ड ट्यूब में प्रत्येक नमूने के सेल निलंबन जगह।
    9. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र।
    10. सेंट्रीफ्यूजेशन चरण के दौरान, सेल पुन: निलंबन मीडिया तैयार करें।
      1. एक बाँझ 1.5 एमएल स्क्रू-कैप्ड ट्यूब में पुनर्गठित एल्बुमिन-ओवोमुकोइड अवरोधक समाधान के 95 μL के साथ ईबीएसएस (शीशी 1) के 857 μL मिलाएं। 1.1.1 से सहेजे गए डीएनएज़ समाधान के 48 μL जोड़ें। नमूनों की संख्या 1.1x से इस चरण में वॉल्यूम गुणा करें।
    11. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, सेल छर्रों को बनाए रखने के लिए सावधान रहें, और चरण 1.2.10 में तैयार 1 एमएल सेल पुन: निलंबन समाधान में सेल छर्रों को तुरंत फिर से निलंबित करें।
    12. असंतत घनत्व ढाल तैयार करें।
      1. प्रत्येक नमूने के लिए, एक नए 15 एमएल बाँझ पेंच-कैप्ड ट्यूब में 1.6 एमएल ओवोमुकोइड अवरोधक समाधान जोड़ें और शीर्ष पर सेल निलंबन को ध्यान से परत दें। ढाल की दो परतों के बीच इंटरफ़ेस दिखाई देना चाहिए लेकिन कुछ मिश्रण परिणामों को प्रभावित नहीं करता है।
    13. कमरे के तापमान पर 6 मिनट के लिए 70 x g पर असंतत घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र। पृथक कोशिकाओं को ट्यूबों के तल पर गोली मारनी चाहिए जबकि झिल्ली के टुकड़े इंटरफ़ेस पर रहते हैं।
    14. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और गोली कोशिकाओं को धोने के लिए पीबीएस के 200 μL जोड़ें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर अपकेंद्रित्र।
    15. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और आरनेस अवरोधक के साथ पीबीएस के 180 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। एक बाँझ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में एक 40 μm सेल छलनी के माध्यम से कोशिकाओं पास।
  3. सेल बारकोडिंग
    1. लंगर के 20 μL जोड़ें: प्रत्येक नमूना और पिपेट धीरे मिश्रण करने के लिए बारकोड समाधान। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक नमूना एक अद्वितीय लंगर प्राप्त करता है: बारकोड समाधान और 5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
      1. इस इनक्यूबेशन14 के दौरान जेल मनका-इन-इमल्शन (जीईएम) पीढ़ी और बारकोडिंग के लिए आवश्यक सामग्री तैयार करें।
    2. मिश्रण करने के लिए धीरे प्रत्येक नमूना और पिपेट करने के लिए सह लंगर समाधान के 20 μL जोड़ें। 5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
    3. प्रत्येक नमूने के लिए पीबीएस में बर्फ-ठंडा 1% बीएसए के 1 एमएल जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें।
    4. सेल गोली परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला निकालें और पीबीएस में 400 μL बर्फ ठंडा 1% बीएसए जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
      1. कुल 2 धोने के लिए चरण 1.3.4 दोहराएँ। सतह पर तैरनेवाला निकालें और पीबीएस में 400 μL बर्फ ठंडा 1% बीएसए में पुन: निलंबित करें।
    5. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके प्रत्येक नमूने के लिए कोशिकाओं की एकाग्रता निर्धारित करें।
      1. प्रत्येक नमूने के लिए लोड करने के लिए कोशिकाओं की कुल संख्या निर्धारित करें। आमतौर पर, यह नमूनों की संख्या से विभाजित वांछित कोशिकाओं की कुल संख्या है। हालांकि, यदि एक स्थिति के लिए एक जैविक प्रतिकृति खो गई थी, तो इसका हिस्सा उस स्थिति से अन्य जैविक प्रतिकृतियों के बीच विभाजित किया जा सकता है।
      2. कोशिकाओं की वांछित संख्या लोड करने के लिए आवश्यक मात्रा निर्धारित करने के लिए चरण 3.5 में गणना की गई उस नमूने की सेल एकाग्रता द्वारा प्रत्येक नमूने के लिए वांछित कोशिकाओं की संख्या को विभाजित करें।
    6. एक नए बाँझ 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में प्रत्येक नमूने से चरण 3.5.2 में गणना की मात्रा गठबंधन। जीईएम पीढ़ी की विफलता के मामले में प्रत्येक नमूने से ली गई मात्रा को दोगुना करना विवेकपूर्ण है।
      1. एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग कर संयुक्त नमूनों की "अंतिम" सेल एकाग्रता निर्धारित करें।
  4. जीईएम पीढ़ी और बारकोडिंग
    1. उत्पन्न करने और बारकोड जीईएम14 करने के लिए संयुक्त नमूनों का उपयोग करें।
  5. पोस्ट जीईएम-आरटी क्लीनअप और सीडीएनए प्रवर्धन
    1. निम्नलिखित संशोधनों के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार पोस्ट जीईएम रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस क्लीनअप और सीडीएनए प्रवर्धन के लिए सामग्री तैयार करें14. आकार चयन14 द्वारा पोस्ट जीईएम-आरटी सफाई करें।
      1. 2 एमएल द्वारा तैयार 80% इथेनॉल की मात्रा बढ़ाएं।
      2. बर्फ पर सीडीएनए प्रवर्धन मिश्रण तैयार करें14. सीडीएनए प्रवर्धन मिश्रण के लिए 2.5 μM मल्टी-सेक प्राइमर के 1 μL जोड़ें। एक बेंचटॉप मिनी अपकेंद्रित्र में 5 एस के लिए भंवर और 5 एस के लिए अपकेंद्रित्र।
    2. सीडीएनए प्रवर्धन14 करें। सीडीएनए को इस बिंदु पर 72 घंटे तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. आकार चयन14 द्वारा सीडीएनए सफाई करें। अंतर्जात प्रतिलेख सीडीएनए को 72 घंटे तक 4 डिग्री सेल्सियस पर या इस बिंदु पर 4 सप्ताह तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
      1. आकार चयन के पहले दौर से सतह पर तैरनेवाला त्यागें नहीं। इस अंश में नमूना बारकोड होते हैं। सतह पर तैरनेवाला को एक नए बाँझ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      2. सतह पर तैरनेवाला बर्फ पर स्टोर करें।
    4. पैरामैग्नेटिक मनका-आधारित आकार चयन अभिकर्मक को फिर से निलंबित करने और सतह पर तैरनेवाला के लिए 260 μL पैरामैग्नेटिक मनका-आधारित आकार चयन अभिकर्मक (अंतिम 3.2x) और 100% आइसोप्रोपेनॉल (1.8x) के 180 μL जोड़ने के लिए भंवर। पिपेट मिश्रण 10 बार और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    5. ट्यूब को चुंबकीय रैक पर रखें और समाधान को साफ करने की प्रतीक्षा करें। फिर सतह पर तैरनेवाला निकालें और त्यागें।
    6. मोतियों के लिए 80% इथेनॉल के 500 μL जोड़ें और 30 एस के लिए खड़े होने दें। सतह पर तैरनेवाला निकालें और त्यागें।
      1. कुल 2 धोने के लिए दोहराएं।
    7. संक्षेप में मोतियों को अपकेंद्रित्र करें और चुंबकीय रैक पर लौटें। 2 मिनट के लिए टाइमर शुरू करें।
    8. एक पी 10 पिपेट के साथ शेष इथेनॉल निकालें और 2 मिनट के शेष के लिए चुंबकीय रैक पर मोती हवा सूखी। 2 मिनट से अधिक न करें।
    9. चुंबकीय रैक से मोती निकालें और 100 μL क्षालन बफर (ईबी) में पुन: निलंबित। पिपेट अच्छी तरह से फिर से निलंबित करने के लिए।
    10. 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    11. चुंबकीय रैक पर लौटें और समाधान को साफ करने की प्रतीक्षा करें।
    12. सतह पर तैरनेवाला को एक ताजा 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    13. चरण 1.5.4 से 1.5.12 दोहराएँ। चरण 1.5.9 में उपयोग किए जाने वाले बफर ईबी की मात्रा को आधा करें।
    14. एक डीएसडीएनए उच्च संवेदनशीलता परख किट और फ्लोरोमीटर और टुकड़ा विश्लेषक15,16 का उपयोग करके बारकोड डीएनए एकाग्रता और आकार वितरण निर्धारित करें। बारकोड सीडीएनए को 72 घंटे तक 4 डिग्री सेल्सियस पर या इस बिंदु पर 4 सप्ताह तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  6. बारकोड लाइब्रेरी निर्माण
    1. 80% इथेनॉल का 1 एमएल तैयार करें।
    2. एक बाँझ पीसीआर पट्टी ट्यूब में बारकोड लाइब्रेरी पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार करें: 2x गर्म शुरू पीसीआर तैयार मिश्रण के 26.25 μL, 10 μM यूनिवर्सल i5 प्राइमर के 2.5 μL, 10 μM RPI प्राइमर के 2.5 μL, बारकोड cDNA के 3.5 एनजी (चरण 5.14 से एकाग्रता द्वारा निर्धारित मात्रा), और 50 μL करने के लिए अंतिम मात्रा लाने के लिए पर्याप्त न्यूक्लियस मुक्त पानी गठबंधन
      1. प्रत्येक बारकोड लाइब्रेरी के लिए एक अद्वितीय आरपीआई प्राइमर का उपयोग करें यदि एकाधिक मल्टी-सेक लाइब्रेरी एक साथ अनुक्रमित हैं।
    3. एक पुस्तकालय तैयारी पीसीआर के लिए बारकोड लाइब्रेरी मास्टर मिश्रण के अधीन: 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 15 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 10 चक्र, 30 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 30 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
    4. पैरामैग्नेटिक मनका-आधारित आकार चयन अभिकर्मक को फिर से निलंबित करने के लिए भंवर।
    5. थर्मोसाइक्लर से पीसीआर उत्पाद निकालें और पैरामैग्नेटिक मनका-आधारित आकार चयन अभिकर्मक के 80 μL (1.6x) जोड़ें। पिपेट अच्छी तरह से।
    6. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। उच्च स्थिति में चुंबक विभाजक पर रखें और समाधान को साफ़ करने की प्रतीक्षा करें।
    7. सतह पर तैरनेवाला निकालें और त्यागें।
    8. मोतियों के लिए 80% इथेनॉल के 200 μL जोड़ें और 30 एस के लिए खड़े करने की अनुमति दें। सतह पर तैरनेवाला निकालें और त्यागें।
      1. कुल 2 धोने के लिए चरण 1.6.8 दोहराएँ।
    9. संक्षेप में ट्यूब अपकेंद्रित्र और कम स्थिति में चुंबकीय विभाजक पर रखें। 2 मिनट के लिए टाइमर शुरू करें।
    10. एक पी 20 विंदुक के साथ शेष इथेनॉल निकालें और 2 मिनट के शेष के लिए चुंबकीय विभाजक पर मोती हवा सूखी। 2 मिनट से अधिक न करें।
    11. चुंबकीय विभाजक से ट्यूब निकालें और बफर ईबी के 25 μL में मोती को फिर से निलंबित करें। पिपेट अच्छी तरह से मोती को फिर से निलंबित करने के लिए मिश्रण।
    12. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए सेते हैं।
    13. कम स्थिति में चुंबकीय विभाजक पर लौटें और समाधान के स्पष्ट होने की प्रतीक्षा करें। सतह पर तैरनेवाला एक नई पीसीआर पट्टी ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    14. विज्ञापन डीएनए उच्च संवेदनशीलता परख किट और फ्लोरोमीटर और टुकड़ा विश्लेषक का उपयोग करके अभिव्यक्ति पुस्तकालय और बारकोड लाइब्रेरी एकाग्रता और टुकड़ा आकार वितरण की मात्रा निर्धारित करें।
  7. 3 'जीन अभिव्यक्ति पुस्तकालय निर्माण
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 3 'जीन अभिव्यक्ति पुस्तकालय निर्माण करें14.
  8. अनुक्रमण
    1. चरण 7 में प्रवर्धित अंतर्जात सीडीएनए लाइब्रेरी के अलावा, चरण 6 में प्रवर्धित बारकोड लाइब्रेरी सबमिट करें। सादगी के लिए, इन पुस्तकालयों को अलग से प्रस्तुत करें, या लागत प्रभावी उपाय के रूप में अंतर्जात सीडीएनए पुस्तकालय के साथ नमूना बारकोडिंग सामग्री का एक विभाज्य शामिल है। प्रति सेल 20,000-50,000 सीडीएनए और 3,000-5,000 बारकोड पढ़ने के बीच लक्ष्य।
    2. परिणामी अनुक्रमण बीसीएल फ़ाइलों को सेलरेंजर एमकेफास्टक द्वारा फास्टक्यू फ़ाइलों में परिवर्तित करें और सेलरेंजर गिनती द्वारा इनसे उत्पन्न मैट्रिक्स की गणना करें।
    3. मल्टी-सेक गिटहब रिपॉजिटरी (https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq) में उपलब्ध डीएमयूएलटीप्लेक्स आर पैकेज का उपयोग करके सेलरेंजर विश्लेषण के बाद डीकॉन्वोल्यूट नमूने।

2. युग्मित एससीआरएनए-सेक और एससीएटीएसी-सेक

  1. एससीटीएसीएसी-सेक के लिए फ्लैश फ्रीज ऊतक और एससीआरएनए-सेक के लिए रेटिना कोशिकाओं के मेथनॉल निर्धारण
    1. मीडिया की तैयारी
      1. रेटिना पृथक्करण के लिए समाधान तैयार करने के लिए, चरण 1.1.1 और 1.1.4 दोहराएं।
      2. एक छोटी बर्फ बाल्टी में इथेनॉल सूखी बर्फ स्नान तैयार करें।
      3. न्यूक्लियस मुक्त पानी के 4.5 मिलीलीटर में 10.5 एमएल इथेनॉल जोड़कर 70% इथेनॉल का 15 एमएल तैयार करें।
      4. बर्फ की बाल्टी (अधिमानतः गोली के रूप में) में पर्याप्त सूखी बर्फ जोड़ें कि 15 मिलीलीटर तरल बर्फ को कवर करने के लिए बढ़ेगा। इथेनॉल के 15 एमएल जोड़ें।
      5. एक सुविधाजनक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में बर्फ और 100% मेथनॉल के 1 एमएल विभाज्य पर पीबीएस रखें।
    2. सैंपल की तैयारी
      1. रेटिना को अलग करने के लिए चरण 1.2.1 और 1.2.2 का पालन करें; हालाँकि, इस बार प्रत्येक रेटिना को एक अलग माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में रखें।
      2. एससीएटीएसी-सेक के लिए नियत नमूनों के लिए, पी 200 पिपेट का उपयोग करके माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब से किसी भी तरल को हटा दें और तुरंत टोपी और नमूने को फ्लैश फ्रीज करने के लिए इथेनॉल-सूखी बर्फ स्नान में ट्यूब रखें।
      3. एससीआरएनए-सेक के लिए नियत नमूनों के लिए, कोशिकाओं को अलग करने के लिए, विच्छेदित रेटिना पर 1.2.15 के माध्यम से चरण 1.2.3 दोहराएं।
      4. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 300 x g पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
      5. सेल गोली बाधित बिना सतह पर तैरनेवाला निकालें।
      6. ठंडा पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें और धीरे विंदुक मिश्रण 10 बार या जब तक कोशिकाओं को पूरी तरह से निलंबित कर रहे हैं।
      7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
        1. कुल 2 धोने के लिए चरण 2.1.2.5 से 2.1.2.7 दोहराएँ।
      8. सेल गोली बाधित बिना सतह पर तैरनेवाला निकालें।
      9. ठंडा पीबीएस के 100 μL जोड़ें और धीरे 10x मिश्रण या जब तक कोशिकाओं को पूरी तरह से निलंबित कर रहे हैं।
      10. सबसे कम गति सेटिंग पर ट्यूब भंवर शुरू करो। कोशिकाओं को क्लंपिंग से रोकने के लिए ट्यूब को धीरे-धीरे भंवर जारी रखते हुए बूंद से 900 μL ठंडा मेथनॉल (-20 डिग्री सेल्सियस) ड्रॉप जोड़ें।
      11. 15 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं सेते हैं।
      12. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके निश्चित कोशिकाओं की एकाग्रता निर्धारित करें।
      13. ट्रिपैन ब्लू का उपयोग करके निर्धारण चरण की प्रभावकारिता का आकलन करें। व्यवहार्य कोशिकाओं का एक उच्च अंश इंगित करता है कि अधिक निर्धारण समय की आवश्यकता है।
      14. -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए ऊतक और निश्चित कोशिकाओं को स्टोर करें।
  2. एससीएटीएसी-सेक के लिए फ्लैश जमे हुए ऊतक से नाभिक अलगाव
    1. मीडिया की तैयारी
      1. न्यूक्लियस मुक्त पानी के 9.77 मिलीलीटर, 1 एम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.4) के 100 μL, 1 एम एनएसीएल के 100 μL, 1 एम एमजीसीएल 2 के 30 μL, और बीएसए के 0.1 ग्राम के संयोजन सेलाइसिस कमजोर पड़ने बफर तैयार करें।
      2. लाइसिस कमजोर पड़ने बफर आगे तैयार करें, जैसे कि एक दिन पहले, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। प्रोटोकॉल के दिन, बर्फ पर रखें।
      3. -20 डिग्री सेल्सियस से कमरे के तापमान तक एससीएटीएसी किट के निर्माता द्वारा प्रदान किए गए 20x नाभिक बफर को संतुलित करें। भंवर और अपकेंद्रित्र संक्षेप में।
      4. अवक्षेप भंग होने तक 65 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 5% डिजिटोनिन समाधान को इनक्यूबेट करके 1 एक्स लाइसिस बफर तैयार करें। फिर लाइसिस कमजोर पड़ने बफर के 2 एमएल, 10% ट्वीन -20 के 20 μL, नॉनाइडेट पी 40 विकल्प के 20 μL (वैकल्पिक रूप से आईजीईपीएएल लेबल किया जा सकता है), और डिजिटोनिन के 4 μL को मिलाएं।
      5. बर्फ पर 1x लाइसिस बफर स्टोर करें।
      6. 0.1x लाइसिस बफर तैयार करने के लिए, 1x लाइसिस बफर के 200 μL के साथ लाइसिस कमजोर पड़ने बफर के 1.8 मिलीलीटर गठबंधन और बर्फ पर स्टोर।
      7. धोने बफर तैयार करने के लिए, लाइसिस कमजोर पड़ने बफर के 2 एमएल और 10% ट्वीन -20 के 20 μL गठबंधन और बर्फ पर स्टोर करें।
      8. पतला नाभिक बफर तैयार करने के लिए, नाभिक बफर (20x) के 50 μL के साथ न्यूक्लियस मुक्त पानी के 950 μL गठबंधन और बर्फ पर स्टोर।
    2. नाभिक अलगाव
      1. लाइसिस से पहले नमूने को पिघलाएं नहीं। जमे हुए नमूने युक्त 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में ठंडा 0.1 एक्स लाइसिस बफर के 500 μL जोड़ें। एक गोली मूसल का उपयोग करके तुरंत 15x होमोजेनाइज करें।
      2. बर्फ पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। इस इनक्यूबेशन चरण17 के दौरान एससीएटीएसी ट्रांसपोजिशन के लिए आवश्यक सामग्री तैयार करें।
      3. पिपेट एक 1 एमएल विंदुक के साथ 10x मिश्रण और बर्फ पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। इस इनक्यूबेशन चरण के दौरान एससीएटीएसी ट्रांसपोजिशन के लिए आवश्यक सामग्रियों की पूरी तैयारी यदि पहले से ही पूरी नहीं हुई है। अधिक पतला नाभिक बफर तैयार करना अनावश्यक है।
      4. लाइसेड कोशिकाओं के लिए ठंडा धोने बफर के 500 μL जोड़ें। पिपेट मिश्रण 5x.
      5. एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में एक 70 μm सेल छलनी के माध्यम से निलंबन पास करें। फ़िल्टर ~ 300 μL हर बार एक नया 70 μm सेल छलनी का उपयोग कर एक समय में.
      6. एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में एक 40 μm सेल छलनी के माध्यम से एकत्रित प्रवाह के माध्यम से पास करें और बर्फ पर स्टोर करें।
      7. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके नाभिक एकाग्रता का निर्धारण करें। नाभिक एकाग्रता और सेल निलंबन की कुल मात्रा के आधार पर, पृथक नाभिक की कुल संख्या की गणना करें।
      8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र और नाभिक गोली को बाधित किए बिना सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
      9. चरण 2.2.2.7 में निर्धारित कुल नाभिक गिनती के आधार पर नाभिक स्टॉक बनाने के लिए, वांछित नाभिक एकाग्रता तक पहुंचने के लिए पर्याप्त पतला नाभिक बफर में नाभिक को फिर से निलंबित करें।
        नोट: वांछित नाभिक एकाग्रता एससीएटीएसी-सेक प्रयोग के लिए लक्षित नाभिक वसूली पर आधारित है और निर्माता के प्रोटोकॉल17 में पाए जाने वाले नाभिक एकाग्रता दिशानिर्देशों से निर्धारित की जाती है। उदाहरण के लिए, यदि 10,000 नाभिक अंततः वांछित हैं, तो नाभिक स्टॉक के लिए वांछित नाभिक एकाग्रता 3,080 और 7,700 नाभिक / एकाग्रता में सीमा के मध्य के लिए लक्ष्य करना सबसे अच्छा हो सकता है।
      10. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके नाभिक एकाग्रता का निर्धारण करें।
      11. तुरंत तैयार नाभिक स्टॉक17 का उपयोग करके एससीएटीएसी ट्रांसपोजिशन पर आगे बढ़ें।
  3. एससीआरएनए-सेक में उपयोग के लिए मेथनॉल फिक्स्ड सेल का पुनर्जलीकरण
    1. मीडिया की तैयारी
      1. कमजोर पड़ने बफर तैयार करने के लिए, पीबीएस के 1 एमएल में बीएसए के 0.01 ग्राम भंग करें। फिर 40 यू/μL आरएनएएसई अवरोधक के 12.5 μL जोड़ें और धीरे-धीरे मिलाएं। बर्फ पर स्टोर करें।
    2. सेल पुनर्जलीकरण
      1. अपकेंद्रित्र मेथनॉल 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 3000 एक्स जी पर एक 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में कोशिकाओं को तय किया। फिर सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
      2. माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में 200 μL ठंडा धोने/कमजोर पड़ने बफर जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। कुल 2 धोने के लिए दोहराएं।
        नोट: पिछले दो चरणों के दौरान जीईएम पीढ़ी और बारकोडिंग के लिए आवश्यक सामग्री तैयार करें14.
      3. सेल स्टॉक तैयार करने के लिए, 2.1.2.12 में गणना की गई कुल सेल संख्या के आधार पर, वांछित सेल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पर्याप्त धोने / कमजोर पड़ने वाले बफर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। पसंदीदा सेल सांद्रता 700 और 1200 कोशिकाओं / μL के बीच हैं।
      4. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल स्टॉक की सेल एकाग्रता निर्धारित करें।
      5. तुरंत सेल स्टॉक14 का उपयोग करके जीईएम पीढ़ी और बारकोडिंग के लिए आगे बढ़ें।
    3. अनुक्रमण
      1. समय पाठ्यक्रम विश्लेषण (विकास या बीमारी के रूप में) करते समय, तकनीकी भिन्नता में कटौती करने के लिए मल्टीप्लेक्स रन (यानी, एक प्रवाह सेल पर कई पुस्तकालयों) में कई नमूनों को अनुक्रमित करें।

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Representative Results

यह वर्कफ़्लो एकल सेल अनुक्रमण का उपयोग करके विकासात्मक फेनोटाइप और नियामक प्रक्रियाओं की जांच के लिए एक रणनीति देता है। मल्टी-सेक नमूना मल्टीप्लेक्सिंग एक प्रारंभिक कम लागत वाले फेनोटाइपिंग परख को सक्षम बनाता है जबकि एससीआरएनए-एसईक्यू और एससीएटीएसी-सेक के लिए नमूनों का युग्मित संग्रह और निर्धारण अधिक गहन जांच (चित्रा 1) की अनुमति देता है।

मल्टी-सेक बारकोडिंग कई नमूनों के संयुक्त अनुक्रमण और उनके बाद के कम्प्यूटेशनल डिकंवोल्यूशन को सक्षम बनाता है। उत्पत्ति का नमूना उनके बारकोड अभिव्यक्ति (चित्रा 2 ए) के आधार पर प्रत्येक सेल के लिए निर्धारित किया जा सकता है। इन संयुक्त नमूनों सेल क्लस्टरिंग और सेल प्रकार की पहचान (चित्रा 2 बी) के प्रयोजनों के लिए एक एकल डेटासेट के रूप में विश्लेषण किया जा सकता है। चूंकि प्रत्येक सेल जीईएम पीढ़ी से पहले बारकोड किया जाता है, सेल डबलेट्स में कई मल्टी-सेक बारकोड के लिए अभिव्यक्ति दिखाने की उच्च संभावना होगी और अधिकांश डबलेट्स को क्लस्टरिंग और सेल प्रकार की पहचान (चित्रा 2 सी) से पहले पहचाना और हटाया जा सकता है। जीईएम पीढ़ी के चरण में उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि से पाए जाने वाले डबलेट्स के अनुपात में वृद्धि होगी। एससीएटीएसी-सेक का उपयोग एससीआरएनए-सेक (चित्रा 2 डी) द्वारा पाए गए लोगों से मेल खाने के लिए सेल प्रकारों के साथ डेटासेट उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। एससीआरएनए-सीक जीन अभिव्यक्ति और एससीएटीएसी-सेक डीएनए पहुंच की जानकारी की जोड़ी जीन नियामक नेटवर्क के पुनर्निर्माण को सक्षम बनाती है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रारंभिक विश्लेषण में मल्टी-सेक के उपयोग का प्रदर्शन करने वाला योजनाबद्ध, इसके बाद फेनोटाइप, उपचार या ब्याज की बीमारी की स्थिति के गहन लक्षण वर्णन में अलग-अलग एससीआरएनए-सेक और एससीएटीएसी-सेक विश्लेषण किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: पी 0 एसएसटीआर 2 नॉकआउट चूहों की एक एलीलिक श्रृंखला के लिए मल्टी-सेक डेटा के यूएमएपी आयामी कमी अभ्यावेदन (ए) डेटासेट में प्रत्येक सेल के लिए जीनोटाइप के विघटन और (बी) डेटासेट में सेल प्रकारों की पहचान। जीईएम पीढ़ी और बारकोडिंग चरण के दौरान ओवरलोडिंग कोशिकाओं के परिणामस्वरूप सेल डबलट्स में वृद्धि होगी जैसे कि (सी) में देखा गया है, जो डबलेट हटाने और पुनरावृत्ति से पहले (ए) और (बी) से डेटा दिखाता है। (डी) में, ई 14 पर जीएफपी-एक्सप्रेसिंग कंट्रोल प्लास्मिड के साथ इलेक्ट्रोपोरेटेड रेटिना एक्सप्लांट्स से ई 16 में प्राप्त जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं से एससीएटीएसी-सेक डेटा। सेल प्रकार सेल प्रकार-विशिष्ट जीन की पहुंच के आधार पर एनोटेट किए जाते हैं। इस आंकड़े को वियर, के, किम, डीडब्ल्यू, ब्लैकशॉ, एस से संशोधित किया गया है रेटिना न्यूरोजेनेसिस का विनियमन सोमाटोस्टैटिन सिग्नलिंग द्वारा। बायोरेक्सिव 2020.09.26.314104 (2020) दोई: 10.1101/2020.09.26.31410418 और मूल, अप्रकाशित डेटा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

मल्टी-सेक की शक्ति कई प्रयोगात्मक स्थितियों या मॉडलों से डेटा के निर्बाध एकीकरण और लागत और सीमित बैच प्रभावों के संदर्भ में भारी लाभ से उपजी है। मल्टी-सेक का उपयोग एक प्रयोगशाला अभूतपूर्व फेनोटाइपिंग गहराई प्रदान करता है। गैर-आनुवंशिक मल्टीप्लेक्सिंग विधियों जैसे सेल हैशिंग या नाभिक हैशिंग ने बारकोडेड एंटीबॉडी 7,19,20 के उपयोग के माध्यम से मल्टीप्लेक्स नमूनों के लिए दरवाजा खोला। हालांकि, यह उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी की उपलब्धता पर निर्भर करता है जो कोशिकाओं या उनके नाभिक पर व्यक्त सतह प्रोटीन को पहचानते हैं, जो संभव नहीं होगा यदि ये एंटीबॉडी अनुपलब्ध हैं या कोशिकाएं उचित सेल सतह या परमाणु एंटीजन व्यक्त नहीं करती हैं7. क्योंकि मल्टी-सेक कोशिकाओं या उनके नाभिक में स्थिर रूप से शामिल करने के लिए लिपिड-संशोधित ओलिगो बारकोड का उपयोग करता है, यह शोधकर्ताओं को सस्ते और अधिक व्यापक रूप से लागू तरीके से 96 ताजा या निश्चित नमूनों से ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा इकट्ठा करनेकी अनुमति देता है।

युग्मित एससीआरएनए-सेक और एससीएटीएसी-सेक के साथ प्रारंभिक मल्टी-सेक फेनोटाइपिंग का पालन करने का सुझाव दिया जाता है और जीनोमिक संगठन की समझ हासिल करने के लिए प्रदर्शित किया जाता है जो ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा1 के साथ मेल खाता है। यह न केवल हेटरोक्रोमैटिन और यूक्रोमैटिन क्षेत्रों का एक विचार देता है, बल्कि जीन अभिव्यक्ति को चलाने वाले प्रतिलेखन कारक नेटवर्क की मूल्यवान समझ भी देता है। एक बहु-ओमिक दृष्टिकोण का उपयोग गतिशील क्रोमैटिन परिवर्तनों को प्रकट करने के लिए किया जा सकता है जो सेल भाग्य निर्णयों के प्रमुख बिंदुओं पर होते हैं और विकास और रोग 1,21,22 में सेलुलर प्रक्षेपवक्र निर्धारित करते हैं। यह बायोइन्फॉर्मेटिक रूप से डेटा को स्यूडोटाइम, सीआईएस-रेगुलेटरी इंटरैक्शन और फुटप्रिंटिंग विश्लेषण 5,23,24,25 के अधीन करके पूरा किया जा सकता है। मल्टीप्लेक्स रन में नमूनों को ठीक करना और अनुक्रमण एकाधिक बैच प्रभाव के स्रोतों को कम करता है, जिससे समय पाठ्यक्रम प्रयोग के माध्यम से नमूनों में तुलना को सक्षम किया जा सकता है। आवश्यक ऊतक नमूनों की संख्या प्रयोग के दायरे पर निर्भर करती है। भ्रूण के समय बिंदुओं से जुड़े फेनोटाइप की जांच करते समय, एकल रेटिना अक्सर पर्याप्त होते हैं और सैकड़ों हजारों कोशिकाएं प्रदान कर सकते हैं। एक एकल रेटिना अधिक जटिल प्रयोगात्मक योजनाओं में पर्याप्त कोशिकाएं प्रदान नहीं कर सकता है: रेटिना एक्सप्लांट्स के पूर्व विवो इलेक्ट्रोपोरेशन, दुर्लभ सेल आबादी की जांच, या अपर्याप्त सीआरई सक्रियण के साथ आनुवंशिक मॉडल। जबकि एक एकल रेटिना कुछ सौ कोशिकाएं प्रदान कर सकती है, ये पूर्ण ऊतक जटिलता पर कब्जा नहीं करेंगे। ऐसे प्रयोगों के लिए, एक शोधकर्ता की जरूरतों के आधार पर अनुकूलन की आवश्यकता होगी। इन तकनीकों का उपयोग करके, कोई भी अंतर्दृष्टि प्राप्त कर सकता है कि विकास और बीमारी जैसी गतिशील प्रक्रियाओं के दौरान मल्टी-सीक में विश्लेषण किए गए जीन को कैसे विनियमित किया जाता है।

जीन नियामक नेटवर्क का विनियमन सेलुलर प्रक्रियाओं को समझने के दिल में निहित है और वे विकास और बीमारी 1,26,27 में कैसे योगदान करते हैं। यहां प्रस्तुत वर्कफ़्लो का उपयोग विशिष्ट सेल प्रकारों में इन जीन नियामक नेटवर्क की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल माउस रेटिना ऊतक के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है। विभिन्न चरणों का अनुकूलन, जैसे कि लाइसिस या पृथक्करण समय, सेंट्रीफ्यूजेशन गति / समय, और निस्पंदन चरणों की संख्या कोशिकाओं या नाभिक की संख्या को अधिकतम करने और अन्य ऊतक प्रकारों, पूर्व विवो नमूनों या प्रजातियों से सेल निलंबन में सेल मलबे को कम करने के लिए आवश्यक हो सकती है, चाहे नमूने ताजा, जमे हुए हों, या मेथनॉल में तय किए गए हों। यदि नमूने ट्रिपैन ब्लू धुंधला के साथ व्यवहार्य कोशिकाओं के उच्च स्तर दिखाते हैं तो मेथनॉल निर्धारण समय को बढ़ाने की आवश्यकता हो सकती है। मल्टी-सीक तकनीक पारंपरिक एससीआरएनए-सेक पर कई अतिरिक्त धोने के चरणों का परिचय देती है। मूल्यवान कोशिकाओं या डीएनए के आकस्मिक निपटान से बचने के लिए, सेंट्रीफ्यूजेशन गति को अनुकूलित करना और सतह पर तैरनेवालों को बनाए रखना समझदारी है जो आमतौर पर सेल बारकोडिंग, पोस्ट-जीईएम आरटी सफाई और बर्फ पर बारकोड लाइब्रेरी निर्माण चरणों में त्याग दिए जाएंगे जब तक कि उस चरण को सफल होने के लिए सत्यापित नहीं किया जाता है। मल्टी-सेक की एक सीमा कोशिकाओं की सीमित संख्या है, और इसलिए नमूने, जिन्हें जीईएम पीढ़ी के चरण में एक कुएं से अनुक्रमित किया जा सकता है। डबलट सेल कैप्चर में पर्याप्त वृद्धि से बचने के लिए इस चरण के दौरान कोशिकाओं को अत्यधिक अधिभारित करने की कोशिश न करने की सिफारिश की जाती है। 20,000 से अधिक कोशिकाओं के साथ एक जीईएम अच्छी तरह से लोड करने से बचें। इसके बजाय, कई कुओं को एक संयुक्त निलंबन से तैयार किया जा सकता है और अनुक्रमण के दौरान मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है। इसके लिए जीईएम पीढ़ी के लिए सेल निलंबन की एक बड़ी पर्याप्त मात्रा तैयार करने और चरण 5, 6 और 7 में प्रतिकृतियों को जोड़ने की आवश्यकता होगी और अनुक्रमण की लागत में वृद्धि होगी क्योंकि अधिक कोशिकाओं के लिए अधिक कुल पढ़ने की आवश्यकता होती है। उचित अनुकूलन के साथ, यह वर्कफ़्लो सेल प्रकार-विशिष्ट फेनोटाइप और जीन नियामक नेटवर्क की लागत और समय कुशल पहचान को सक्षम करेगा।

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Disclosures

खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं।

Acknowledgments

हम उत्पादित पुस्तकालयों को अनुक्रमित करने में मदद के लिए जॉन्स हॉपकिन्स ट्रांसक्रिप्टोमिक्स और डीप सीक्वेंसिंग कोर से लिंडा ओर्ज़ोलेक और पूर्व विवो रेटिना एक्सप्लांट्स करने के लिए लिज़ी जियांग का धन्यवाद करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips
10% Tween 20 Bio-Rad 1662404
100 µM Barcode Solution Request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
100% Ethanol Millipore Sigma E7023-500ML
100% Methanol Millipore Sigma 322415-100ML
10x Chip Holder 10x Genomics 1000195
10x Chromium controller & Accessory Kit 10x Genomics PN-120263
15mL Centrifuge Tube Quality Biological P886-229411
40 µm FlowMi Cell Strainer Bel-Art H13680-0040
50 µM Anchor Solution Sigma or request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
50 µM Co-Anchor Solution Sigma or request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
5200 Fragment Analyzer system Agilent M5310AA
70 um FlowMi cell strainer Bel-Art H13680-0070
Allegra X-12R Centrifuge VWR BK392302
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647
Chromium Next GEM Chip G 10x Genomics PN-1000120
Chromium Next GEM Chip H 10x Genomics PN-1000161
Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 10x Genomics PN-1000175
Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 10x Genomics PN-1000121
Digitonin Fisher Scientific BN2006
Dissection microscope Leica
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431021
Dry Ice
EVA Foam Ice Pan Tequipment 04393-54
FA 12-Capillary Array Short, 33 cm Agilent A2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp Water Bath Fisher Scientific 15-460-20Q
Forma CO2 Water Jacketed Incubator ThermoFisher Scientific 3110
Glycerol 50% Aqueous solution Ricca Chemical Company 3290-32
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber Fisher Scientific 02-671-51B
Illumina NextSeq or NovaSeq Illumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMix HiFi 7958927001
Low TE Buffer Quality Biological 351-324-721
Magnesium Chloride Solution 1 M Sigma-Aldrich M1028
Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes Millipore Sigma 20-400
Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes 10x Genomics NC1469069
MULTI-seq Primer Sigma or IDT See sequence list
MyFuge Mini Centrifuge Benchmark Scientific C1008
Nonidet P40 Substitute Sigma-Aldrich 74385
Nuclease-free water Fisher Scientific AM9937
P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes Eppendorf
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150
PBS pH 7.4 (1X) Fisher Scientific 10010-023
Qiagen Buffer EB Qiagen 19086
Refridgerated Centrifuge 5424 R Eppendorf 2231000655
RNase-free Disposable Pellet Pestles Fisher Scientific 12-141-368
RNasin Plus RNase Inhibitor Promega N2615
RPI primer Sigma or IDT See sequence list
Single Index Kit N, Set A 10x Genomics PN-1000212
Single Index Kit T Set A 10x Genomics PN-1000213
Sodium Chloride Solution 5 M Sigma-Aldrich 59222C
SPRIselect Reagent Kit Beckman Coulter B23318
Standard Disposable Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
TempAssure PCR 8-tube strip USA Scientific 1402-4700
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 Sigma-Aldrich T2194
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) Corning 25-900-CI
Universal I5 primer Sigma or IDT See sequence list
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems 4375786
Vortex Mixer VWR 10153-838

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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रेटिना जीन अभिव्यक्ति और क्रोमैटिन एक्सेसिबिलिटी का मल्टीप्लेक्स विश्लेषण एससीआरएनए-सीक और एससीएटीएसी-सेक का उपयोग करना
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Weir, K., Leavey, P., Santiago, C.,… More

Weir, K., Leavey, P., Santiago, C., Blackshaw, S. Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq. J. Vis. Exp. (169), e62239, doi:10.3791/62239 (2021).

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