Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Multiplekset analyse av retinal genuttrykk og kromatin tilgjengelighet ved hjelp av scRNA-Seq og scATAC-Seq

Published: March 12, 2021 doi: 10.3791/62239
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3,4,5,6
1Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Science, The Johns Hopkins Hospital, 3Department of Ophthalmology, The Johns Hopkins Hospital, 4Department of Neurology, The Johns Hopkins Hospital, 5Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Kavli Neuroscience Discovery Institute, Johns Hopkins University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Her viser forfatterne nytten av MULTI-seq for fenotyping og påfølgende parret scRNA-seq og scATAC-seq ved karakterisering av transkriptomiske og kromatin tilgjengelighetsprofiler i netthinnen.

Abstract

Kraftige neste generasjons sekvenseringsteknikker tilbyr robust og omfattende analyse for å undersøke hvordan retinale genregulerende nettverk fungerer under utvikling og i sykdomstilstander. Enkeltcellet RNA-sekvensering gjør det mulig for oss å profilere genuttrykksendringer observert i retinal utvikling og sykdom på mobilnivå, mens enkeltcellet ATAC-Seq tillater analyse av kromatintilgjengelighet og transkripsjonsfaktorbinding som skal profileres ved lignende oppløsning. Her beskrives bruken av disse teknikkene i den utviklende netthinnen, og MULTI-Seq demonstreres, hvor individuelle prøver er merket med et modifisert oligonukleotid-lipidkompleks, slik at forskere både kan øke omfanget av individuelle eksperimenter og redusere kostnadene betydelig.

Introduction

Å forstå hvordan gener kan påvirke celle skjebne spiller en nøkkelrolle i å undersøke prosesser som sykdom og embryonal progresjon. De komplekse forholdene mellom transkripsjonsfaktorer og deres målgener kan grupperes i genregulerende nettverk. Montering av bevis plasserer disse genregulerende nettverkene i sentrum av både sykdom og utvikling på tvers av evolusjonære linjer1. Mens tidligere teknikker som qRT-PCR fokuserte på et enkelt gen eller sett med gener, tillater anvendelsen av sekvenseringsteknologi med høy gjennomstrømning profilering av komplette cellulære transkriptomer.

RNA-seq gir et glimt inn i storskala transkriptomikk 2,3. Enkeltcellet RNA-sekvensering (scRNA-seq) gir etterforskere muligheten til ikke bare å profilere transkriptomer, men koble spesifikke celletyper med genuttrykksprofiler4. Dette oppnås bioinformatisk ved å mate individuelle celleprofiler inn i sorteringsalgoritmer ved hjelp av kjente genmarkører5. Multipleksing ved hjelp av lipidmerkede indekser sekvensering (MULTI-seq) gir enestående mangfold i antall scRNA-Seq profiler som kan samles6. Denne lipidbaserte teknikken skiller seg fra andre prøveindekseringsteknikker som celle-hashing som er avhengig av tilstedeværelsen av overflateantigener og antistoffer med høy affinitet i stedet for plasmamembranintegrasjon7. Ikke bare er det nå mulig å profilere genuttrykksprofiler i celletyper, men forskjellige eksperimenter kan kombineres til et enkelt sekvenseringsbibliotek, noe som dramatisk reduserer kostnadene for et individuelt scRNA-seq-eksperiment6. Kostnaden for scRNA-seq kan virke uoverkommelig for bruk i fenotypingseksperimenter der mange forskjellige genotyper, tilstander eller pasientprøver analyseres, men multipleksing tillater kombinasjon av opptil 96 prøver i et enkelt bibliotek6.

Profilering av genuttrykk via scRNA-seq har ikke vært den eneste sekvenseringsbaserte teknikken med høy gjennomstrømning for å revolusjonere den nåværende forståelsen av hvordan molekylære mekanismer dikterer celleskjebne. Mens forståelse av hvilke gentransskripter som er tilstede i en celle, gjør det mulig å identifisere celletype, er like viktig å forstå hvordan genomisk organisasjon regulerer utvikling og sykdomsprogresjon. Tidlige studier baserte seg på å oppdage DNase-mediert spaltning av sekvenser som ikke var bundet til histoner, etterfulgt av sekvensering av de resulterende DNA-fragmentene for å identifisere regioner med åpen kromatin. I motsetning til dette tillater enkeltcelleanalyse for transposontilgjengelig kromatinsekvensering (scATAC-seq) forskere å undersøke DNA med et domestisert transposon for lett å profilere åpent kromatin på enkeltnukleotidnivå8. Dette har gått gjennom en lignende skalering til scRNA-seq, og nå kan etterforskere identifisere individuelle celletyper og profilere fenotyper på tvers av tusenvis av individuelle genomer8.

Sammenkoblingen av scRNA-seq og scATAC-seq har gitt forskere muligheten til å profilere tusenvis av celler for å bestemme cellepopulasjoner, genomisk organisasjon og genregulerende nettverk i sykdomsmodeller og utviklingsprosesser 9,10,11,12. Her skisserer forfatterne hvordan man først kan bruke MULTI-seq til å kondensere fenotyping av et mylder av dyremodeller og bruke parret scRNA-seq og scATAC-seq for å få en bedre forståelse av kromatinlandskapet og regulatoriske nettverk i disse dyremodellene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bruken av dyr til disse studiene ble utført ved hjelp av protokoller godkjent av Johns Hopkins Animal Care and Use Committee, i samsvar med ARRIVE-retningslinjene, og ble utført i samsvar med relevante retningslinjer og forskrifter.

1. Multi-seq

  1. Media forberedelse
    1. Klargjør og likevekt ovomucoidhemmer, 10 mg ovomucoidhemmer og 10 mg albumin per ml Earle's Balanced Salt Solution (EBSS), i 30 minutter før bruk13. Likevekt med 95% O2: 5% CO2 i en inkubator.
      1. Klargjør papaindissosiasjonsløsning, 20 enheter/ml papain og 0,005 % DNase i EBSS, under dette inkubasjonstrinn13.
        MERK: Ett hetteglass med DNase oppløsning vil være tilstrekkelig for 5 prøver. Det kan være nødvendig å rekonstituere ytterligere hetteglass hvis MULTI-seq utføres på mer enn 5 prøver.
    2. Forbered lipidmodifiserte oligo-strekkodingsløsninger.
      1. Lag en unik strekkodefortynning for hver prøve ved å kombinere 0,5 μL 100 μM strekkodelagerløsning med 4,5 μL fosfatbufret saltvann (PBS).
      2. For å forberede anker: strekkodeløsning ved 1: 1 molarforhold, kombiner 4.4 μL 10 μM strekkodefortynning, 0.9 μL av 50 μM ankerløsning og 16.7 μL PBS og legg på is. Den endelige konsentrasjonen for både strekkodestrengene og ankerstrengene skal være 2 μM.
      3. For å forberede medankerløsning, kombiner 0,88 μL 50 μM samankerløsning og 21,12 μL PBS og legg på is. Den endelige konsentrasjonen av medankeret skal være 2 μM. Multipliser volumene i dette trinnet med 1,1 ganger antall prøver.
    3. For å lage 1% BSA i PBS, oppløs 0,1 g bovint serumalbumin (BSA) i 10 ml PBS og legg på is.
    4. For å lage PBS med RNase-hemmer, kombiner 2,5 μL 40 U / μL RNase-hemmer med 197,5 μL PBS og lagre på is. Multipliser volumene i dette trinnet med 1,1 ganger antall prøver.
  2. Dissosiasjon av prøver
    1. Avliv dyr gjennom cervikal dislokasjon og/eller CO 2-asfyksi i samsvar med institusjonelle IACUC-krav. Metode for eutanasi vil avhenge av institusjonelle krav og modellorganisme som benyttes.
    2. Disseker netthinnen fra begge øynene i kald PBS under et disseksjonsmikroskop og overfør til et sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør ved hjelp av en overføringspipette.
    3. Overfør 500 μL av papainoppløsningen til et 1,5 ml rør for hver prøve.
    4. Plasser prøver i papainoppløsningen og dekk rørene umiddelbart.
    5. Inkuber rørene som inneholder prøvene ved 37 °C, 5 % CO2 i 30 minutter. Snu hetteglassene 3 ganger hvert 10. minutt. Prøvene skal gradvis dissosieres med hver runde med inversjoner.
    6. Sett hetteglassene tilbake til romtemperatur og triturer hver prøve 3-4 ganger med en 1 ml pipette satt til 300 mikroliter.
    7. Tillat eventuelle biter av udissosiert vev igjen etter triturasjon å bosette seg.
    8. Fjern den uklare cellesuspensjonen mens du unngår biter av udissosiert vev og plasser hver prøves cellesuspensjon i et nytt sterilt 15 ml skruekappet rør.
    9. Sentrifuger cellesuspensjonene ved 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
    10. Under sentrifugeringstrinnet, klargjør celleresuspenderingsmediet.
      1. Bland 857 μL EBSS (hetteglass 1) med 95 μL rekonstituert albumin-ovomucoidhemmeroppløsning i et sterilt 1,5 ml skruekappet rør. Tilsett 48 μL DNase-løsning lagret fra 1.1.1. Multipliser volumene i dette trinnet med 1,1 ganger antall prøver.
    11. Kast supernatanten, pass på å beholde cellepellets, og resuspender umiddelbart cellepellets i 1 ml cellerespenderingsoppløsning fremstilt i trinn 1.2.10.
    12. Klargjør diskontinuerlig tetthetsgradient.
      1. For hver prøve, tilsett 1,6 ml ovomucoidhemmeroppløsning til et nytt 15 ml sterilt skruekappet rør og lag cellesuspensjonen forsiktig på toppen. Grensesnittet mellom de to lagene i gradienten skal være synlig, men noe blanding påvirker ikke resultatene.
    13. Sentrifuger de diskontinuerlige tetthetsgradientene ved 70 x g i 6 minutter ved romtemperatur. De dissosierte cellene skal pelletere i bunnen av rørene mens membranfragmenter forblir i grensesnittet.
    14. Kast supernatanten og tilsett 200 μL PBS for å vaske de pelleterte cellene. Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
    15. Kast supernatanten og resuspender cellene i 180 μL PBS med RNase-hemmer. Pass cellene gjennom en 40 μm celle sil inn i en steril 1,5 ml mikrosentrifuge tube.
  3. Celle strekkoding
    1. Tilsett 20 μL anker:strekkodeoppløsning til hver prøve og pipetter forsiktig for å blande. Sørg for at hver prøve får en unik anker:strekkodeløsning og ruger på is i 5 minutter.
      1. Forbered materialene som kreves for gelperle-i-emulsjon (GEM) generering og strekkoding under denneinkubasjonen 14.
    2. Tilsett 20 μL samankerløsning til hver prøve og pipetter forsiktig for å blande. Rug på is i 5 min.
    3. Tilsett 1 ml iskald 1 % BSA i PBS til hver prøve og sentrifuger cellene ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    4. Fjern supernatanten uten å forstyrre cellepelleten og tilsett 400 μL iskald 1% BSA i PBS. Sentrifuge ved 300 x g i 5 min ved 4 °C.
      1. Gjenta trinn 1.3.4 for totalt 2 vasker. Fjern supernatanten og resuspender i 400 μL iskald 1% BSA i PBS.
    5. Bestem konsentrasjonen av celler for hver prøve ved hjelp av et hemocytometer.
      1. Bestem totalt antall celler som skal lastes inn for hver prøve. Vanligvis er dette det totale antall celler ønsket delt på antall prøver. Men hvis en biologisk replikasjon for en tilstand gikk tapt, kan andelen deles mellom de andre biologiske replikasjonene fra den tilstanden.
      2. Del antall celler som er ønsket for hver prøve med cellekonsentrasjonen av prøven beregnet i trinn 3.5 for å bestemme volumet som kreves for å laste inn ønsket antall celler.
    6. Kombiner volumene beregnet i trinn 3.5.2 fra hver prøve i et nytt sterilt sentrifugerør på 1,5 ml. Det er forsvarlig å doble volumet som er tatt fra hver prøve i tilfelle feil i GEM-generering.
      1. Bestem "endelig" cellekonsentrasjon av de kombinerte prøvene ved hjelp av et hemocytometer.
  4. GEM-generering og strekkoding
    1. Bruk kombinerte prøver til å generere og strekkode GEMs14.
  5. Post GEM-RT Opprydding og cDNA-forsterkning
    1. Klargjør materialer for opprydding etter GEM revers transkriptase og cDNA-forsterkning i henhold til produsentens instruksjoner med følgende modifikasjoner14. Utfør etter GEM-RT opprydding etter størrelsesvalg14.
      1. Øk volumet på 80% etanol fremstilt med 2 ml.
      2. Forbered cDNA Amplification Mix på is14. Tilsett 1 μL 2,5 μM MULTI-seq primer til cDNA Amplification mix. Vortex for 5 s og sentrifuge for 5 s i en stasjonær mini sentrifuge.
    2. Utfør cDNA-forsterkning14. CDNA kan lagres ved 4 °C i opptil 72 timer på dette tidspunktet.
    3. Utfør cDNA-opprydding etter størrelsesvalg14. Det endogene transkript-cDNA kan oppbevares ved 4 °C i opptil 72 timer eller ved -20 °C i opptil 4 uker på dette tidspunktet.
      1. Ikke kast supernatanten fra den første runden med valg av størrelse. Denne brøkdelen inneholder prøvestrekkodene. Overfør supernatanten til et nytt sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerrør.
      2. Oppbevar supernatanten på is.
    4. Vortex til resuspend paramagnetisk perlebasert størrelsesvalgreagens og tilsett 260 μL paramagnetisk perlebasert størrelsesvalgreagens (endelig 3,2x) og 180 μL 100% isopropanol (1,8x) til supernatanten. Pipette blandingen 10 ganger og rug ved romtemperatur i 5 minutter.
    5. Plasser røret på et magnetisk stativ og vent til løsningen er klar. Fjern og kast deretter supernatanten.
    6. Tilsett 500 μL 80% etanol til perlene og la stå i 30 s. Fjern og kast supernatanten.
      1. Gjenta i totalt 2 vasker.
    7. Sentrifuger perlene kort og gå tilbake til magnetstativet. Start en timer i 2 min.
    8. Fjern den gjenværende etanolen med en P10-pipette og lufttørk perlene på magnetstativet resten av 2 minutter. Ikke overskrid 2 min.
    9. Fjern perlene fra magnetstativet og resuspender i 100 μL elueringsbuffer (EB). Pipetter grundig for å resuspendere.
    10. Rug ved romtemperatur i 2 minutter.
    11. Gå tilbake til magnetstativet og vent til løsningen er klar.
    12. Overfør supernatanten til et nytt mikrosentrifugerrør på 1,5 ml.
    13. Gjenta trinn 1.5.4 til 1.5.12. Halvere volumet av buffer EB som ble brukt i trinn 1.5.9.
    14. Bestem strekkode-DNA-konsentrasjon og størrelsesfordeling ved hjelp av et dsDNA-analysesett med høy følsomhet og fluorometer og fragmentanalysator15,16. Strekkode-cDNA kan lagres ved 4 °C i opptil 72 timer eller ved -20 °C i opptil 4 uker på dette tidspunktet.
  6. Strekkode bibliotek konstruksjon
    1. Forbered 1 ml 80% etanol.
    2. Forbered strekkodebibliotek PCR-masterblanding i et sterilt PCR-striperør: kombiner 26.25 μL 2x varmstart PCR-klar blanding, 2.5 μL 10 μM Universal i5 primer, 2.5 μL 10 μM RPI primer, 3.5 ng strekkode cDNA (volum bestemt ved konsentrasjon fra trinn 5.14), og nok nukleasefritt vann til å bringe det endelige volumet til 50 μL.
      1. Bruk en unik RPI-primer for hvert strekkodebibliotek hvis flere MULTI-seq-biblioteker er sekvensert sammen.
    3. Emne strekkodebibliotekets mastermiks til et bibliotek forberedelse PCR: 95 ° C i 5 min; 10 sykluser på 98 °C i 15 s, 60 °C i 30 s, 72 °C i 30 s; 72 °C i 1 min; og hold deretter ved 4 °C.
    4. Vortex for å resuspendere det paramagnetiske perlebaserte størrelsesvalgreagenset.
    5. Fjern PCR-produktet fra termosykleren og tilsett 80 μL (1,6x) paramagnetisk perlebasert størrelsesvalgreagens. Pipetter grundig.
    6. Inkuberes ved romtemperatur i 5 minutter. Plasser magnetseparatoren i høy stilling og vent til løsningen er klar.
    7. Fjern og kast supernatanten.
    8. Tilsett 200 μL 80% etanol til perlene og la stå i 30 s. Fjern og kast supernatanten.
      1. Gjenta trinn 1.6.8 for totalt 2 vasker.
    9. Sentrifuger røret kort og sett på magnetseparatoren i lav stilling. Start en timer i 2 min.
    10. Fjern den gjenværende etanolen med en P20-pipette og lufttørk perlene på magnetseparatoren resten av 2 minutter. Ikke overskrid 2 min.
    11. Fjern røret fra magnetseparatoren og resuspender perlene i 25 μL buffer EB. Pipetten blandes grundig for å blande perlene godt.
    12. Rug i 2 minutter ved romtemperatur.
    13. Gå tilbake til magnetseparatoren i lav stilling og vent til løsningen er klar. Overfør supernatanten til et nytt PCR-striperør.
    14. Kvantifiser uttrykksbibliotek og strekkodebibliotekkonsentrasjon og fragmentstørrelsesfordeling ved hjelp av adsDNA-analysesett med høy følsomhet og fluorometer og fragmentanalysator.
  7. 3 'Gene Expression Bibliotek Konstruksjon
    1. Utfør 3' genuttrykksbibliotekkonstruksjon i henhold til produsentens instruksjoner14.
  8. Sekvensering
    1. I tillegg til det endogene cDNA-biblioteket som ble forsterket i trinn 7, sender du inn strekkodebiblioteket som ble forsterket i trinn 6. For enkelhets skyld kan du sende inn disse bibliotekene separat, eller som et kostnadseffektivt tiltak inkludere et aliquot av prøvestrekkodingsmaterialet med det endogene cDNA-biblioteket. Mål mellom 20.000-50.000 cDNA og 3.000-5.000 strekkodeavlesninger per celle.
    2. Konverter de resulterende sekvenserende bcl-filene til fastq-filer etter cellranger mkfastq og tellematriser generert fra disse av cellranger count.
    3. Deconvolute prøver etter Cellranger analyse ved hjelp av deMULTIplex r pakken tilgjengelig på MULTI-seq GitHub depotet (https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq).

2. Sammenkoblet scRNA-seq og scATAC-seq

  1. Flash frysevev for scATAC-seq og metanolfiksering av retinale celler for scRNA-seq
    1. Media forberedelse
      1. For å klargjøre løsningene for retinal dissosiasjon, gjenta trinn 1.1.1 og 1.1.4.
      2. Forbered et etanol tørrisbad i en liten isbøtte.
      3. Forbered 15 ml 70% etanol ved å tilsette 10,5 ml etanol til 4,5 ml nukleasefritt vann.
      4. Tilsett nok tørris i isbøtta (helst i pelletsform) til at 15 ml væske vil stige til bare å dekke isen. Tilsett 15 ml etanol.
      5. Plasser PBS på is og 1 ml aliquots 100% metanol i en praktisk -20 ° C fryser.
    2. Prøve forberedelse
      1. Følg trinn 1.2.1 og 1.2.2 for å isolere netthinnen; men denne gangen plasserer hver netthinne i et eget mikrosentrifugerør.
      2. For prøvene som er bestemt for scATAC-seq, fjern eventuell væske fra mikrosentrifugerøret ved hjelp av en P200-pipette og lukk umiddelbart røret i etanol-tørrisbad for å fryse prøven.
      3. For prøvene bestemt for scRNA-seq, for å dissosiere cellene, gjenta trinn 1.2.3 til 1.2.15 på den dissekerte netthinnen.
      4. Sentrifuger cellene ved 300 x g i 3 minutter ved romtemperatur.
      5. Fjern supernatanten uten å forstyrre cellepelleten.
      6. Tilsett 1 ml kjølt PBS og pipetter forsiktig 10 ganger eller til cellene er helt suspendert.
      7. Sentrifuge ved 300 x g i 5 min ved 4 °C.
        1. Gjenta trinn 2.1.2.5 til 2.1.2.7 for totalt 2 vasker.
      8. Fjern supernatanten uten å forstyrre cellepelleten.
      9. Tilsett 100 μL kjølt PBS og bland forsiktig 10x eller til cellene er helt suspendert.
      10. Begynn å virvle røret ved laveste hastighetsinnstilling. Tilsett 900 μL kjølt metanol (-20 °C) dråpe for dråpe mens du fortsetter å virvle røret forsiktig for å forhindre at cellene klumper seg.
      11. Inkuber cellene på is i 15 minutter.
      12. Bestem konsentrasjonen av de faste cellene ved hjelp av et hemocytometer.
      13. Vurder effekten av fikseringstrinnet ved hjelp av trypan blue. En høy del av levedyktige celler indikerer at mer fikseringstid er nødvendig.
      14. Oppbevar frosset vev og faste celler ved -80 °C.
  2. Kjerneisolering fra flashfrosset vev for scATAC-seq
    1. Media forberedelse
      1. Forbered lysisfortynningsbufferen ved å kombinere 9,77 ml nukleasefritt vann, 100 μL av 1 M Tris-HCl (pH 7,4), 100 μL av 1 M NaCl, 30 μL av 1 M MgCl2 og 0,1 g BSA.
      2. Klargjør lysisfortynningsbufferen fremover, for eksempel dagen før, og oppbevar ved 4 °C. På dagen for protokollen, legg på is.
      3. Likevekt 20x kjernebuffer levert av produsenten av scATAC-settet fra -20 °C til romtemperatur. Vortex og sentrifuge kort.
      4. Klargjør 1x lysisbufferen ved å inkubere 5 % Digitonin-oppløsning i et 65 °C vannbad til bunnfallet er oppløst. Kombiner deretter 2 ml lysisfortynningsbuffer, 20 μL på 10% Tween-20, 20 μL Nonidet P40 Substitute (kan alternativt merkes IGEPAL) og 4 μL Digitonin.
      5. Oppbevar 1x lysisbufferen på is.
      6. For å forberede 0,1x lysisbufferen, kombiner 1,8 ml lysisfortynningsbuffer med 200 μL av 1x lysisbufferen og lagre på is.
      7. For å forberede vaskebufferen, kombiner 2 ml lysisfortynningsbuffer og 20 μL på 10% Tween-20 og lagre på is.
      8. For å forberede den fortynnede kjernebufferen, kombiner 950 μL nukleasefritt vann med 50 μL kjernebuffer (20x) og lagre på is.
    2. Kjerner Isolasjon
      1. Ikke tine prøven før lysis. Tilsett 500 μL kjølt 0,1x lysisbuffer til et 1,5 ml mikrosentrifugerør som inneholder den frosne prøven. Homogeniser umiddelbart 15x ved hjelp av en pelletspestle.
      2. Rug i 5 min på is. Klargjør materialene som kreves for scATAC-transponering under dette inkubasjonstrinn17.
      3. Pipetteblanding 10x med 1 ml pipette og inkuber i 10 minutter på is. Fullstendig klargjøring av materialene som kreves for scATAC-transponering i løpet av dette inkubasjonstrinnet hvis det ikke allerede er fullført. Det er unødvendig å forberede mer fortynnet kjernebuffer.
      4. Tilsett 500 μL kjølt vaskebuffer til de lysede cellene. Pipette blanding 5x.
      5. Før suspensjonen gjennom en 70 μm cellesil til et nytt mikrosentrifugerrør på 1,5 ml. Filtrer ~300 μL om gangen ved hjelp av en ny 70 μm cellesil hver gang.
      6. Pass den oppsamlede gjennomstrømningen gjennom en 40 μm cellesil inn i et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør og lagre på is.
      7. Bestem kjernekonsentrasjonen ved hjelp av et hemocytometer. Basert på kjernekonsentrasjonen og det totale volumet av cellesuspensjonen, beregne det totale antall dissosierte kjerner.
      8. Sentrifuger ved 500 x g i 5 min ved 4 °C og fjern supernatanten uten å forstyrre kjernepelleten.
      9. For å lage kjernemassen basert på det totale kjernetallet bestemt i trinn 2.2.2.7, resuspender kjernene i nok fortynnet kjernebuffer for å oppnå en ønsket kjernekonsentrasjon.
        MERK: Ønsket kjernekonsentrasjon er basert på målrettet kjerneutvinning for scATAC-seq-eksperimentet og bestemmes ut fra retningslinjene for kjernekonsentrasjon som finnes i produsentens protokoll17. For eksempel, hvis 10.000 kjerner til slutt er ønsket, er den ønskede kjernekonsentrasjonen for Kjernebestanden mellom 3.080 og 7.700 kjerner / μL. Det kan være best å sikte på midten av området i konsentrasjon.
      10. Bestem kjernekonsentrasjonen ved hjelp av et hemocytometer.
      11. Fortsett umiddelbart til scATAC-transponering ved hjelp av den forberedte kjernemassen17.
  3. Rehydrering av metanol faste celler for bruk i scRNA-Seq
    1. Forberedelse av media
      1. For å klargjøre vaske-/fortynningsbufferen skal 0,01 g BSA løses opp i 1 ml PBS. Tilsett deretter 12,5 μL 40 U/μL RNase Inhibitor og bland forsiktig. Oppbevares på is.
    2. Cell rehydrering
      1. Sentrifugemetanol faste celler i et 1,5 ml mikrosentrifugerør ved 3000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Fjern deretter supernatanten.
      2. Tilsett 200 μL kjølt vaske-/fortynningsbuffer i mikrosentrifugerøret. Sentrifuger ved 300 x g i 10 min ved 4 °C og fjern supernatanten. Gjenta i totalt 2 vasker.
        MERK: Klargjør materialene som kreves for GEM-generering og strekkoding i løpet av de to foregående trinnene14.
      3. For å klargjøre cellemassen, basert på det totale celletallet beregnet i 2.1.2.12., resuspender cellene i nok vaske-/fortynningsbuffer til å oppnå ønsket cellekonsentrasjon. Foretrukne cellekonsentrasjoner er mellom 700 og 1200 celler / μL.
      4. Bestem cellekonsentrasjonen av cellemassen ved hjelp av et hemocytometer.
      5. Fortsett umiddelbart til GEM-generering og strekkoding ved hjelp avcellelageret 14.
    3. Sekvensering
      1. Når du utfører tidskursanalyse (som i utvikling eller sykdom), sekvenser flere prøver i en multiplekset kjøring (dvs. flere biblioteker på en enkelt flytcelle) for å kutte ned på teknisk variasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne arbeidsflyten legger ut en strategi for undersøkelse av utviklingsfenotyper og regulatoriske prosesser ved hjelp av enkeltcellesekvensering. MULTI-seq prøvemultipleksing muliggjør en innledende lavkost fenotypingsanalyse, mens parret innsamling og fiksering av prøver for scRNA-seq og scATAC-seq gir mulighet for mer grundig undersøkelse (figur 1).

MULTI-seq-strekkoding muliggjør kombinert sekvensering av flere prøver og deres påfølgende beregningsmessige dekonvolusjon. Opprinnelsesprøven kan bestemmes for hver celle basert på deres strekkodeuttrykk (figur 2A). Disse kombinerte prøvene kan analyseres som et enkelt datasett med henblikk på celleklynger og celletypeidentifikasjon (figur 2B). Fordi hver celle er strekkodet før GEM-generering, vil celledobleringer ha stor sannsynlighet for å vise uttrykk for flere MULTI-seq strekkoder, og et flertall av dubletter kan derfor identifiseres og fjernes før klynger og celletypeidentifikasjon (figur 2C). Å øke antall celler som brukes i GEM-generasjonstrinnet vil øke andelen dubletter som er funnet. scATAC-seq kan brukes til å generere et datasett med celletyper for å matche de som finnes av scRNA-seq (figur 2D). Sammenkoblingen av scRNA-seq-genuttrykk og scATAC-seq DNA-tilgjengelighetsinformasjon muliggjør rekonstruksjon av genregulerende nettverk.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk demonstrasjon av bruk av MULTI-Seq i innledende analyse, etterfulgt av separat scRNA-Seq- og scATAC-Seq-analyse i grundig karakterisering av fenotyper, behandlinger eller sykdomstilstander av interesse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: UMAP dimensjonale reduksjonsrepresentasjoner av MULTI-seq-data for en allelisk serie P0 Sstr2 knockoutmus som demonstrerer (a) dekonvolusjon av genotype for hver celle i datasettet og (b) identifisering av celletyper i datasettet. Overbelastning av celler under GEM-genereringen og strekkodingstrinnet vil resultere i en økning i celledobleringer som de som er sett i (c), som viser dataene fra (a) og (b) før dobbeltfjerning og tilbakekalling. I (d) scATAC-Seq-data fra GFP-positive celler oppnådd ved E16 fra retinale eksplanter elektroporert med et GFP-uttrykkende kontrollplasmid ved E14. Celletyper er kommentert basert på tilgjengelighet av celletypespesifikke gener. Denne figuren er modifisert fra Weir, K., Kim, DW, Blackshaw, S. Regulering av retinal neurogenese ved somatostatinsignalering. bioRxiv 2020.09.26.314104 (2020) doi:10.1101/2020.09.26.31410418 og originale, upubliserte data. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kraften til MULTI-seq stammer fra sømløs integrering av data fra flere eksperimentelle forhold eller modeller og den enorme fordelen når det gjelder kostnader og begrensende batcheffekter. Utnytte MULTI-seq tilbyr et laboratorium enestående fenotyping dybde. Ikke-genetiske multipleksingsmetoder som cellehasjing eller kjernehasjing åpnet døren for multipleksede prøver ved bruk av strekkodede antistoffer 7,19,20. Dette er imidlertid avhengig av tilgjengeligheten av antistoffer med høy affinitet som gjenkjenner overflateproteiner uttrykt på celler eller deres kjerner, noe som ikke vil være mulig hvis disse antistoffene ikke er tilgjengelige eller cellene ikke uttrykker passende celleoverflate eller nukleære antigener7. Fordi MULTI-seq bruker lipidmodifiserte oligo strekkoder for å stabilt innlemme i cellene eller deres kjerner, tillater det forskere å samle transkriptomiske data fra opptil 96 friske eller faste prøver på en billigere og mer bredt anvendelig måte6.

Oppfølging av den første MULTI-Seq fenotyping med parret scRNA-Seq og scATAC-Seq er foreslått og vist frem for å få en forståelse av den genomiske organisasjonen som sammenfaller med de transkriptomiske dataene1. Dette gir ikke bare en ide om heterokromatin- og eukromatinregionene, men også verdifull forståelse av transkripsjonsfaktornettverkene som driver genuttrykk. En multi-omisk tilnærming kan brukes til å avsløre de dynamiske kromatinendringene som finner sted på viktige punkter i celleskjebnebeslutninger og bestemme cellulære baner i utvikling og sykdom 1,21,22. Dette kan oppnås ved bioinformatisk å utsette dataene for pseudotid, cis-regulatoriske interaksjoner og fotavtrykksanalyse 5,23,24,25. Ved å fikse eksemplene og sekvensere flere i en multiplekset kjøring reduseres kilder til batcheffekt, noe som muliggjør sammenligning på tvers av prøver, for eksempel gjennom et tidskurseksperiment. Antall vevsprøver som kreves, avhenger av omfanget av forsøket. Når man undersøker fenotypene forbundet med embryonale tidspunkter, er enkle netthinner ofte tilstrekkelige og kan gi hundretusener av celler. En enkelt retina kan ikke gi nok celler i mer komplekse eksperimentelle ordninger: ex vivo elektroporasjoner av retinale eksplanter, sondering for sjeldne cellepopulasjoner eller genetiske modeller med utilstrekkelig CRE-aktivering. Mens en enkelt retina kan gi noen hundre celler, vil disse ikke fange hele vevskompleksiteten. For slike eksperimenter vil optimalisering være nødvendig basert på forskerens behov. Ved hjelp av disse teknikkene kan man få innsikt i hvordan genene analysert i MULTI-seq reguleres under dynamiske prosesser som utvikling og sykdom.

Regulering av genreguleringsnettverk ligger i hjertet av å forstå cellulære prosesser og hvordan de bidrar til utvikling og sykdom 1,26,27. Arbeidsflyten som presenteres her, kan brukes til å identifisere disse genregulerende nettverkene i bestemte celletyper. Imidlertid har denne protokollen blitt optimalisert for bruk med mus retinal vev. Optimalisering av ulike trinn, for eksempel lysis eller dissosiasjonstid, sentrifugeringshastigheter / tider og antall filtreringstrinn kan være nødvendig for å maksimere antall celler eller kjerner og minimere celleavfall i cellesuspensjoner fra andre vevstyper, ex vivo-prøver eller arter, enten prøvene er ferske, frosne eller faste i metanol. Metanolfikseringstid må kanskje økes hvis prøver viser høye nivåer av levedyktige celler med trypanblå farging. MULTI-seq-teknikken introduserer mange ekstra vasketrinn i forhold til tradisjonell scRNA-seq. For å unngå utilsiktet avhending av verdifulle celler eller DNA, er det forsvarlig å optimalisere sentrifugeringshastigheter og opprettholde supernatanter som normalt vil bli kastet i cellestrekkodingen, opprydding etter GEM RT og byggetrinn for strekkodebibliotek på is til det trinnet er bekreftet å være vellykket. En begrensning for MULTI-seq er det begrensede antallet celler, og derfor prøver, som kan sekvenseres fra en enkelt brønn i GEM-generasjonstrinnet. Det anbefales å ikke prøve å overbelaste celler for mye i løpet av dette trinnet for å unngå en betydelig økning i dobbeltcellefangst. Unngå å laste en GEM-brønn med mer enn 20 000 celler. I stedet kan flere brønner fremstilles fra en enkelt kombinert suspensjon og multiplekses under sekvensering. Dette vil kreve å forberede et stort nok volum cellesuspensjon for GEM-generering og tillegg av replikasjoner til trinn 5, 6 og 7, og vil øke kostnadene ved sekvensering ettersom flere totale avlesninger er nødvendig for flere celler. Med riktig optimalisering vil denne arbeidsflyten muliggjøre kostnads- og tidseffektiv identifisering av celletypespesifikke fenotyper og genregulerende nettverk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Linda Orzolek fra Johns Hopkins Transcriptomics og Deep Sequencing Core for hjelp til å sekvensere de produserte bibliotekene og Lizhi Jiang for å utføre ex vivo retinale eksplanter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips
10% Tween 20 Bio-Rad 1662404
100 µM Barcode Solution Request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
100% Ethanol Millipore Sigma E7023-500ML
100% Methanol Millipore Sigma 322415-100ML
10x Chip Holder 10x Genomics 1000195
10x Chromium controller & Accessory Kit 10x Genomics PN-120263
15mL Centrifuge Tube Quality Biological P886-229411
40 µm FlowMi Cell Strainer Bel-Art H13680-0040
50 µM Anchor Solution Sigma or request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
50 µM Co-Anchor Solution Sigma or request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
5200 Fragment Analyzer system Agilent M5310AA
70 um FlowMi cell strainer Bel-Art H13680-0070
Allegra X-12R Centrifuge VWR BK392302
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647
Chromium Next GEM Chip G 10x Genomics PN-1000120
Chromium Next GEM Chip H 10x Genomics PN-1000161
Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 10x Genomics PN-1000175
Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 10x Genomics PN-1000121
Digitonin Fisher Scientific BN2006
Dissection microscope Leica
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431021
Dry Ice
EVA Foam Ice Pan Tequipment 04393-54
FA 12-Capillary Array Short, 33 cm Agilent A2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp Water Bath Fisher Scientific 15-460-20Q
Forma CO2 Water Jacketed Incubator ThermoFisher Scientific 3110
Glycerol 50% Aqueous solution Ricca Chemical Company 3290-32
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber Fisher Scientific 02-671-51B
Illumina NextSeq or NovaSeq Illumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMix HiFi 7958927001
Low TE Buffer Quality Biological 351-324-721
Magnesium Chloride Solution 1 M Sigma-Aldrich M1028
Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes Millipore Sigma 20-400
Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes 10x Genomics NC1469069
MULTI-seq Primer Sigma or IDT See sequence list
MyFuge Mini Centrifuge Benchmark Scientific C1008
Nonidet P40 Substitute Sigma-Aldrich 74385
Nuclease-free water Fisher Scientific AM9937
P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes Eppendorf
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150
PBS pH 7.4 (1X) Fisher Scientific 10010-023
Qiagen Buffer EB Qiagen 19086
Refridgerated Centrifuge 5424 R Eppendorf 2231000655
RNase-free Disposable Pellet Pestles Fisher Scientific 12-141-368
RNasin Plus RNase Inhibitor Promega N2615
RPI primer Sigma or IDT See sequence list
Single Index Kit N, Set A 10x Genomics PN-1000212
Single Index Kit T Set A 10x Genomics PN-1000213
Sodium Chloride Solution 5 M Sigma-Aldrich 59222C
SPRIselect Reagent Kit Beckman Coulter B23318
Standard Disposable Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
TempAssure PCR 8-tube strip USA Scientific 1402-4700
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 Sigma-Aldrich T2194
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) Corning 25-900-CI
Universal I5 primer Sigma or IDT See sequence list
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems 4375786
Vortex Mixer VWR 10153-838

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
  2. Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
  3. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  4. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 96 (2018).
  5. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).
  6. McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16, 619-626 (2019).
  7. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19, 224 (2018).
  8. Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling. Nature Communications. 9, 5345 (2018).
  9. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. , 8598 (2020).
  10. Clark, B. S., et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification. Neuron. 102, 1111-1126 (2019).
  11. Zheng, Y., et al. A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19. Protein Cell. 11, 740-770 (2020).
  12. Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).
  13. Worthington Biochemical Corporation. Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).
  14. 10x Genomics. Chromium Single Cell 3' Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).
  15. Agilent. DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).
  16. ThermoFisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kits. ThermoFisher Scientific. , (2015).
  17. 10x Genomics. Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).
  18. Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling. bioRxiv. , (2020).
  19. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14, 865-868 (2017).
  20. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10, 2907 (2019).
  21. Ma, S., et al. Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin. Cell. , (2020).
  22. Buenrostro, J. D., et al. Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell. 173, 1535-1548 (2018).
  23. Pliner, H. A., et al. Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data. Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).
  24. Granja, J. M., et al. ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis. BioRxiv. , (2020).
  25. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177, 1888-1902 (2019).
  26. METABRIC Group. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature. 486, 346-352 (2012).
  27. Izadi, F. Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network. Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).

Tags

Nevrovitenskap utgave 169 utvikling sykdom scRNA-Seq scATAC-Seq MULTI-Seq multipleks kromatin
Multiplekset analyse av retinal genuttrykk og kromatin tilgjengelighet ved hjelp av scRNA-Seq og scATAC-Seq
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weir, K., Leavey, P., Santiago, C.,… More

Weir, K., Leavey, P., Santiago, C., Blackshaw, S. Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq. J. Vis. Exp. (169), e62239, doi:10.3791/62239 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter