Summary
Qui, gli autori mostrano l'utilità di MULTI-seq per la fenotipizzazione e il successivo accoppiato scRNA-seq e scATAC-seq nel caratterizzare i profili di accessibilità trascrittomica e cromatina nella retina.
Abstract
Potenti tecniche di sequenziamento di nuova generazione offrono un'analisi robusta e completa per studiare come funzionano le reti di regolazione genica retinica durante lo sviluppo e negli stati patologici. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula ci consente di profilare in modo completo i cambiamenti di espressione genica osservati nello sviluppo retinico e nella malattia a livello cellulare, mentre l'ATAC-Seq a cellula singola consente di profilare l'analisi dell'accessibilità della cromatina e del legame del fattore di trascrizione a risoluzione simile. Qui viene descritto l'uso di queste tecniche nella retina in via di sviluppo e viene dimostrato MULTI-Seq, in cui i singoli campioni sono etichettati con un complesso oligonucleotide-lipidico modificato, consentendo ai ricercatori di aumentare la portata dei singoli esperimenti e ridurre sostanzialmente i costi.
Introduction
Capire come i geni possono influenzare il destino cellulare gioca un ruolo chiave nell'interrogare processi come la malattia e la progressione embrionale. Le complesse relazioni tra i fattori di trascrizione e i loro geni bersaglio possono essere raggruppate in reti di regolazione genica. Prove crescenti collocano queste reti di regolazione genica al centro sia della malattia che dello sviluppo attraverso i lignaggi evolutivi1. Mentre tecniche precedenti come la qRT-PCR si concentravano su un singolo gene o insieme di geni, l'applicazione della tecnologia di sequenziamento ad alto rendimento consente la profilazione di trascrittomi cellulari completi.
RNA-seq offre uno sguardo alla trascrittomica su larga scala 2,3. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) offre ai ricercatori la capacità non solo di profilare i trascrittomi, ma di collegare specifici tipi di cellule con i profili di espressione genica4. Ciò si ottiene bioinformaticamente alimentando i singoli profili cellulari in algoritmi di ordinamento utilizzando marcatori genici noti5. Il multiplexing che utilizza il sequenziamento degli indici con tag lipidi (MULTI-seq) offre una diversità senza precedenti nel numero di profili scRNA-Seq che possono essere raccolti6. Questa tecnica basata sui lipidi differisce da altre tecniche di indicizzazione dei campioni come l'hashing cellulare che si basano sulla presenza di antigeni di superficie e anticorpi ad alta affinità anziché sull'integrazione della membranaplasmatica 7. Non solo è ora possibile profilare i profili di espressione genica in tipi di cellule, ma diversi esperimenti possono essere combinati in un'unica libreria di sequenziamento, riducendo drasticamente il costo di un singolo esperimento scRNA-seq6. Il costo di scRNA-seq può sembrare proibitivo per l'uso in esperimenti di fenotipizzazione in cui vengono analizzati molti genotipi, condizioni o campioni di pazienti diversi, ma il multiplexing consente la combinazione di un massimo di 96 campioni in una singola libreria6.
La profilazione dell'espressione genica tramite scRNA-seq non è stata l'unica tecnica basata sul sequenziamento ad alto rendimento a rivoluzionare l'attuale comprensione di come i meccanismi molecolari dettano il destino cellulare. Mentre capire quali trascritti genici sono presenti in una cellula consente l'identificazione del tipo di cellula, altrettanto importante è capire come l'organizzazione genomica regola lo sviluppo e la progressione della malattia. I primi studi si sono basati sul rilevamento della scissione mediata dalla DNasi di sequenze non legate agli istoni, seguita dal sequenziamento dei frammenti di DNA risultanti per identificare le regioni di cromatina aperta. Al contrario, il test a singola cellula per il sequenziamento della cromatina accessibile al trasposone (scATAC-seq) consente ai ricercatori di sondare il DNA con un trasposone addomesticato per profilare facilmente la cromatina aperta al livello8 del singolo nucleotide. Questo è passato attraverso un ridimensionamento simile a scRNA-seq e ora i ricercatori possono identificare singoli tipi di cellule e fenotipi di profilo su migliaia di singoli genomi8.
L'accoppiamento di scRNA-seq e scATAC-seq ha permesso ai ricercatori di profilare migliaia di cellule per determinare le popolazioni cellulari, l'organizzazione genomica e le reti di regolazione genica nei modelli di malattia e nei processi di sviluppo 9,10,11,12. Qui gli autori delineano come utilizzare prima MULTI-seq per condensare la fenotipizzazione di una miriade di modelli animali e impiegare accoppiati scRNA-seq e scATAC-seq per ottenere una migliore comprensione del panorama della cromatina e delle reti regolatorie in questi modelli animali.
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Protocol
L'uso di animali per questi studi è stato condotto utilizzando protocolli approvati dal Johns Hopkins Animal Care and Use Committee, in conformità con le linee guida ARRIVE, e sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e le normative pertinenti.
1. MULTI-seq
- Preparazione dei media
- Preparare ed equilibrare l'inibitore dell'ovomucoide, 10 mg di inibitore dell'ovomucoide e 10 mg di albumina per mL di soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS), per 30 minuti prima dell'uso13. Equilibrare con 95% O2:5% CO2 in un incubatore.
- Preparare la soluzione di dissociazione di papaina, 20 unità/ml di papaina e 0,005% di DNasi in EBSS, durante questa fase di incubazione13.
NOTA: un flaconcino di soluzione di DNasi sarà sufficiente per 5 campioni. Potrebbe essere necessario ricostituire ulteriori flaconcini se si esegue MULTI-seq su più di 5 campioni.
- Preparare la soluzione di dissociazione di papaina, 20 unità/ml di papaina e 0,005% di DNasi in EBSS, durante questa fase di incubazione13.
- Preparare soluzioni di oligobarcoding lipidici modificati.
- Effettuare una diluizione univoca del codice a barre per ciascun campione combinando 0,5 μL di soluzione stock di codice a barre da 100 μM con 4,5 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Per preparare la soluzione anchor:barcode con rapporto molare 1:1, combinare 4,4 μL di diluizione del codice a barre da 10 μM, 0,9 μL di soluzione di ancoraggio da 50 μM e 16,7 μL di PBS e metterla sul ghiaccio. La concentrazione finale sia per i fili del codice a barre che per i fili di ancoraggio dovrebbe essere di 2 μM.
- Per preparare la soluzione di co-ancoraggio, combinare 0,88 μL di soluzione di co-ancoraggio da 50 μM e 21,12 μL di PBS e metterlo su ghiaccio. La concentrazione finale del co-ancoraggio deve essere di 2 μM. Moltiplicare i volumi in questa fase per 1,1 volte il numero di campioni.
- Per produrre l'1% di BSA in PBS, sciogliere 0,1 g di albumina sierica bovina (BSA) in 10 ml di PBS e metterla sul ghiaccio.
- Per produrre PBS con inibitore della RNasi, combinare 2,5 μL di inibitore della RNasi da 40 U/μL con 197,5 μL di PBS e conservare sul ghiaccio. Moltiplicare i volumi in questo passaggio per 1,1 volte il numero di campioni.
- Preparare ed equilibrare l'inibitore dell'ovomucoide, 10 mg di inibitore dell'ovomucoide e 10 mg di albumina per mL di soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS), per 30 minuti prima dell'uso13. Equilibrare con 95% O2:5% CO2 in un incubatore.
- Dissociazione del campione
- Eutanasia degli animali attraverso lussazione cervicale e/o asfissia da CO2 in conformità con i requisiti istituzionali IACUC. Il metodo per l'eutanasia dipenderà dai requisiti istituzionali e dall'organismo modello utilizzato.
- Sezionare la retina da entrambi gli occhi in PBS freddo al microscopio di dissezione e trasferirla in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 ml utilizzando una pipetta di trasferimento.
- Trasferire 500 μL della soluzione di papaina in un tubo da 1,5 mL per ciascun campione.
- Introdurre i campioni nella soluzione di papaina e tappare immediatamente i tubi.
- Incubare le provette contenenti i campioni a 37 °C, 5% CO2 per 30 min. Invertire i flaconcini 3 volte ogni 10 minuti. I campioni dovrebbero dissociarsi progressivamente ad ogni ciclo di inversioni.
- Riportare i flaconcini a temperatura ambiente e triturare ogni campione 3-4 volte con una pipetta da 1 mL impostata su 300 μL.
- Lasciare che eventuali pezzi di tessuto non dissociato rimanenti dopo la triturazione si depositino.
- Rimuovere la sospensione a cellule torbide evitando qualsiasi pezzo di tessuto non dissociato e posizionare la sospensione cellulare di ciascun campione in un nuovo tubo sterile da 15 mL con tappo a vite.
- Centrifugare le sospensioni cellulari a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Durante la fase di centrifugazione, preparare il mezzo di risospensione cellulare.
- Miscelare 857 μL di EBSS (Flaconcino 1) con 95 μL di soluzione ricostituita di inibitori dell'albumina-ovomucoide in un tubo sterile da 1,5 mL con tappo a vite. Aggiungere 48 μL di soluzione di DNasi salvata da 1.1.1. Moltiplicare i volumi in questo passaggio per 1,1 volte il numero di campioni.
- Scartare il surnatante, facendo attenzione a trattenere i pellet cellulari, e risospese immediatamente i pellet cellulari in 1 mL di soluzione di risospensione cellulare preparata al punto 1.2.10.
- Preparare il gradiente di densità discontinuo.
- Per ogni campione, aggiungere 1,6 mL di soluzione di inibitore dell'ovomucoide a un nuovo tubo sterile con tappo a vite da 15 mL e sovrapporre accuratamente la sospensione cellulare sulla parte superiore. L'interfaccia tra i due livelli del gradiente dovrebbe essere visibile, ma alcune combinazioni non influiscono sui risultati.
- Centrifugare i gradienti di densità discontinua a 70 x g per 6 min a temperatura ambiente. Le cellule dissociate dovrebbero essere pellet sul fondo dei tubi mentre i frammenti di membrana rimangono all'interfaccia.
- Scartare il surnatante e aggiungere 200 μL di PBS per lavare le celle pellettate. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Scartare il surnatante e risospese le cellule in 180 μL di PBS con inibitore della RNasi. Passare le cellule attraverso un filtro cellulare da 40 μm in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 ml.
- Codifica a barre cellulare
- Aggiungere 20 μL di soluzione anchor:barcode a ciascun campione e pipettare delicatamente per miscelare. Assicurarsi che ogni campione riceva una soluzione unica anchor:barcode e incubare sul ghiaccio per 5 minuti.
- Preparare i materiali necessari per la generazione di perline di gel in emulsione (GEM) e il codice a barre durante questa incubazione14.
- Aggiungere 20 μL di soluzione di co-ancoraggio a ciascun campione e pipettare delicatamente per miscelare. Incubare su ghiaccio per 5 min.
- Aggiungere 1 mL di BSA all'1% ghiacciato in PBS a ciascun campione e centrifugare le celle a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet cellulare e aggiungere 400 μL di BSA all'1% ghiacciato in PBS. Centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 °C.
- Ripetere il passaggio 1.3.4 per un totale di 2 lavaggi. Rimuovere il surnatante e risospese in 400 μL di ghiaccio freddo 1% BSA in PBS.
- Determinare la concentrazione di cellule per ciascun campione utilizzando un emocitometro.
- Determinare il numero totale di celle da caricare per ogni campione. In genere, questo è il numero totale di celle desiderate diviso per il numero di campioni. Tuttavia, se una replica biologica per una condizione è stata persa, la sua quota può essere divisa tra le altre repliche biologiche da quella condizione.
- Dividere il numero di celle desiderate per ciascun campione per la concentrazione cellulare di quel campione calcolata nel passaggio 3.5 per determinare il volume necessario per caricare il numero desiderato di celle.
- Combinare i volumi calcolati al punto 3.5.2 di ciascun campione in una nuova provetta sterile da 1,5 mL per centrifuga. È prudente raddoppiare il volume prelevato da ciascun campione in caso di guasto della generazione di GEM.
- Determinare la concentrazione cellulare "finale" dei campioni combinati utilizzando un emocitometro.
- Aggiungere 20 μL di soluzione anchor:barcode a ciascun campione e pipettare delicatamente per miscelare. Assicurarsi che ogni campione riceva una soluzione unica anchor:barcode e incubare sul ghiaccio per 5 minuti.
- Generazione GEM e codice a barre
- Utilizzare campioni combinati per generare e codici a barre GEM14.
- Pulizia post GEM-RT e amplificazione del cDNA
- Preparare i materiali per la pulizia della trascrittasi inversa post GEM e l'amplificazione del cDNA secondo le istruzioni del produttore con le seguenti modifiche14. Eseguire la pulizia post GEM-RT in base alla selezione della dimensione14.
- Aumentare il volume dell'80% di etanolo preparato di 2 ml.
- Preparare cDNA Amplification Mix su ghiaccio14. Aggiungere 1 μL di primer MULTI-seq da 2,5 μM alla miscela di amplificazione cDNA. Vortice per 5 s e centrifuga per 5 s in mini centrifuga da banco.
- Eseguire l'amplificazione del cDNA14. Il cDNA può essere conservato a 4 °C per un massimo di 72 ore a questo punto.
- Eseguire la pulizia del cDNA in base alla selezione della dimensione14. Il cDNA del trascritto endogeno può essere conservato a 4 °C fino a 72 ore o a -20 °C per un massimo di 4 settimane a questo punto.
- Non scartare il surnatante dal primo turno di selezione delle dimensioni . Questa frazione contiene i codici a barre campione. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga sterile da 1,5 ml.
- Conservare il surnatante sul ghiaccio.
- Vortice per risospese il reagente di selezione delle dimensioni basato su perline paramagnetiche e aggiungere 260 μL di reagente di selezione delle dimensioni a base di perline paramagnetiche (finale 3,2x) e 180 μL di isopropanolo al 100% (1,8x) al surnatante. Pipettare la miscela 10 volte e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Posizionare il tubo su un rack magnetico e attendere che la soluzione si schiarisca. Quindi rimuovere e scartare il surnatante.
- Aggiungere 500 μL di etanolo all'80% alle perline e lasciare riposare per 30 s. Rimuovere ed eliminare il surnatante.
- Ripetere per un totale di 2 lavaggi.
- Centrifugare brevemente le perline e tornare al rack magnetico. Avvia un timer per 2 minuti.
- Rimuovere l'etanolo rimanente con una pipetta P10 e asciugare all'aria le perline sul rack magnetico per il resto dei 2 minuti. Non superare i 2 min.
- Rimuovere le perline dal rack magnetico e risospescere il tampone di eluizione (EB) da 100 μL. Pipetta accuratamente per risospendare.
- Incubare a temperatura ambiente per 2 min.
- Tornare al rack magnetico e attendere che la soluzione si schiarisca.
- Trasferire il surnatante in un tubo microcentrifuga fresco da 1,5 ml.
- Ripetere i passaggi da 1.5.4 a 1.5.12. Dimezzare il volume del buffer EB utilizzato nel passaggio 1.5.9.
- Determinare la concentrazione di DNA del codice a barre e la distribuzione delle dimensioni utilizzando un kit di analisi ad alta sensibilità dsDNA e un fluorometro e analizzatore di frammenti15,16. Il codice a barre cDNA può essere conservato a 4 °C per un massimo di 72 ore o a -20 °C per un massimo di 4 settimane a questo punto.
- Preparare i materiali per la pulizia della trascrittasi inversa post GEM e l'amplificazione del cDNA secondo le istruzioni del produttore con le seguenti modifiche14. Eseguire la pulizia post GEM-RT in base alla selezione della dimensione14.
- Costruzione di librerie di codici a barre
- Preparare 1 ml di etanolo all'80%.
- Preparare la miscela master PCR della libreria di codici a barre in un tubo sterile per strisce PCR: combinare 26,25 μL di 2x miscela pronta PCR a avvio caldo, 2,5 μL di primer Universal i5 da 10 μM, 2,5 μL di primer RPI da 10 μM, 3,5 ng di cDNA per codice a barre (volume determinato dalla concentrazione dal passaggio 5.14) e acqua priva di nucleasi sufficiente per portare il volume finale a 50 μL.
- Utilizzare un primer RPI univoco per ogni libreria di codici a barre se più librerie MULTI-seq sono sequenziate insieme.
- Sottoporre la miscela master della libreria di codici a barre a una PCR di preparazione della libreria: 95 °C per 5 minuti; 10 cicli di 98 °C per 15 s, 60 °C per 30 s, 72 °C per 30 s; 72 °C per 1 min; e quindi tenere premuto a 4 °C.
- Vortice per risospese il reagente di selezione delle dimensioni basato su perline paramagnetiche.
- Rimuovere il prodotto PCR dal termociclatore e aggiungere 80 μL (1,6x) di reagente di selezione delle dimensioni a base di perline paramagnetiche. Pipetta accuratamente.
- Incubare a temperatura ambiente per 5 min. Posizionare il separatore magnetico in posizione elevata e attendere che la soluzione si schiarisca.
- Rimuovere ed eliminare il surnatante.
- Aggiungere 200 μL di etanolo all'80% alle perline e lasciare riposare per 30 s. Rimuovere ed eliminare il surnatante.
- Ripetere il passaggio 1.6.8 per un totale di 2 lavaggi.
- Centrifugare brevemente il tubo e posizionarlo sul separatore magnetico in posizione bassa. Avvia un timer per 2 minuti.
- Rimuovere l'etanolo rimanente con una pipetta P20 e asciugare all'aria le perline sul separatore magnetico per il resto dei 2 minuti. Non superare i 2 min.
- Rimuovere il tubo dal separatore magnetico e risospesciare le perline in 25 μL di tampone EB. Pipette mescolare accuratamente per risospesso le perline.
- Incubare per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Tornare al separatore magnetico in posizione bassa e attendere che la soluzione si schiarisca. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo a striscia PCR.
- Quantifica la concentrazione della libreria di espressioni e della libreria di codici a barre e la distribuzione delle dimensioni dei frammenti utilizzando il kit di analisi ad alta sensibilità adsDNA e l'analizzatore di fluorometri e frammenti.
- 3' Costruzione della libreria di espressione genica
- Eseguire la costruzione della libreria di espressione genica 3' secondo le istruzioni del produttore14.
- Sequenziamento
- Oltre alla libreria di cDNA endogena amplificata nel passaggio 7, invia la libreria di codici a barre amplificata nel passaggio 6. Per semplicità, inviare queste librerie separatamente o, come misura economicamente vantaggiosa, includere un'aliquota del materiale di codifica a barre del campione con la libreria di cDNA endogeno. Target tra 20.000-50.000 cDNA e 3.000-5.000 letture di codici a barre per cella.
- Converti i file bcl di sequenziamento risultanti in file fastq da cellranger mkfastq e conta le matrici generate da questi dal conteggio dei dispositivi di cella.
- Deconvolute samples post Cellranger analysis using the deMULTIplex r package available at the MULTI-seq GitHub repository (https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq).
2. Accoppiato scRNA-seq e scATAC-seq
- Flash freeze tissue per la fissazione scATAC-seq e metanolo delle cellule retiniche per scRNA-seq
- Preparazione dei media
- Per preparare le soluzioni per la dissociazione retinica, ripetere i passaggi 1.1.1 e 1.1.4.
- Preparare un bagno di ghiaccio secco all'etanolo in un piccolo secchiello per il ghiaccio.
- Preparare 15 ml di etanolo al 70% aggiungendo 10,5 ml di etanolo a 4,5 ml di acqua priva di nucleasi.
- Aggiungere abbastanza ghiaccio secco al secchiello del ghiaccio (preferibilmente in forma di pellet) che 15 ml di liquido saliranno per coprire solo il ghiaccio. Aggiungere i 15 ml di etanolo.
- Posizionare PBS su ghiaccio e 1 mL aliquote di metanolo al 100% in un comodo congelatore a -20 °C.
- Preparazione del campione
- Seguire i passaggi 1.2.1 e 1.2.2 per isolare le retine; tuttavia, questa volta collocare ogni retina in un tubo microcentrifuga separato.
- Per i campioni destinati a scATAC-seq, rimuovere qualsiasi liquido dal tubo di microcentrifuga utilizzando una pipetta P200 e immediatamente tappare e posizionare il tubo in bagno di ghiaccio secco etanolo per congelare il campione.
- Per i campioni destinati a scRNA-seq, per dissociare le cellule, ripetere i passaggi da 1.2.3 a 1.2.15 sulla retina sezionata.
- Centrifugare le celle a 300 x g per 3 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il surnatante senza interrompere il pellet cellulare.
- Aggiungere 1 mL di PBS refrigerato e mescolare delicatamente la pipetta 10 volte o fino a quando le celle non sono completamente sospese.
- Centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 °C.
- Ripetere i passaggi da 2.1.2.5 a 2.1.2.7 per un totale di 2 lavaggi.
- Rimuovere il surnatante senza interrompere il pellet cellulare.
- Aggiungere 100 μL di PBS refrigerato e mescolare delicatamente 10x o fino a quando le cellule sono completamente sospese.
- Inizia a vorticare il tubo alla velocità più bassa. Aggiungere 900 μL di metanolo refrigerato (-20 °C) goccia a goccia continuando a ruotare delicatamente il tubo per evitare che le cellule si aggrovigliano.
- Incubare le cellule sul ghiaccio per 15 min.
- Determinare la concentrazione delle cellule fisse utilizzando un emocitometro.
- Valutare l'efficacia della fase di fissazione utilizzando il tripano blu. Un'alta frazione di cellule vitali indica che è necessario più tempo di fissazione.
- Conservare il tessuto congelato e le cellule fisse a -80 °C.
- Preparazione dei media
- Isolamento dei nuclei da tessuto congelato flash per scATAC-seq
- Preparazione dei media
- Preparare il tampone di diluizione della lisi combinando 9,77 mL di acqua priva di nucleasi, 100 μL di 1 M Tris-HCl (pH 7,4), 100 μL di 1 M NaCl, 30 μL di 1 M MgCl2 e 0,1 g di BSA.
- Preparare il tampone di diluizione della lisi in anticipo, ad esempio il giorno prima, e conservare a 4 °C. Il giorno del protocollo, mettere su ghiaccio.
- Equilibrate 20x nuclei tampone fornito dal produttore del kit scATACda -20 °C a temperatura ambiente. Vortice e centrifuga brevemente.
- Preparare il tampone di lisi 1x incubando la soluzione di digitonina al 5% a bagnomaria a 65 °C fino a quando il precipitato non viene sciolto. Quindi combinare 2 mL di tampone di diluizione di lisi, 20 μL di Tween-20 al 10%, 20 μL di Sostituto di Nonidet P40 (può in alternativa essere etichettato IGEPAL) e 4 μL di Digitonina.
- Conservare il tampone di lisi 1x sul ghiaccio.
- Per preparare il tampone di lisi 0,1x, combinare 1,8 mL di tampone di diluizione di lisi con 200 μL del tampone di lisi 1x e conservare su ghiaccio.
- Per preparare il tampone di lavaggio, combinare 2 mL di tampone di diluizione di lisi e 20 μL di Tween-20 al 10% e conservare su ghiaccio.
- Per preparare il tampone nucleico diluito, combinare 950 μL di acqua priva di nucleasi con 50 μL di tampone nucleico (20x) e conservare sul ghiaccio.
- Isolamento dei nuclei
- Non scongelare il campione prima della lisi. Aggiungere 500 μL di tampone di lisi refrigerato 0,1x a un tubo microcentrifuga da 1,5 mL contenente il campione congelato. Omogeneizzare immediatamente 15x usando un pestello a pellet.
- Incubare per 5 minuti su ghiaccio. Preparare i materiali necessari per la trasposizione scATAC durante questa fase di incubazione17.
- Pipetta mescolare 10x con una pipetta da 1 mL e incubare per 10 minuti sul ghiaccio. Preparazione completa dei materiali necessari per la trasposizione scATAC durante questa fase di incubazione se non già completata. Non è necessario preparare più buffer di nuclei diluiti.
- Aggiungere 500 μL di tampone di lavaggio refrigerato alle cellule lisate. Pipette mix 5x.
- Passare la sospensione attraverso un filtro a celle da 70 μm in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 mL. Filtrare ~ 300 μL alla volta utilizzando ogni volta un nuovo filtro cellulare da 70 μm.
- Passare il flusso raccolto attraverso un filtro cellulare da 40 μm in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 ml e conservare sul ghiaccio.
- Determinare la concentrazione dei nuclei utilizzando un emocitometro. In base alla concentrazione dei nuclei e al volume totale della sospensione cellulare, calcolare il numero totale di nuclei dissociati.
- Centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 °C e rimuovere il surnatante senza interrompere il pellet di nuclei.
- Per creare lo stock di nuclei in base al conteggio totale dei nuclei determinato nel passaggio 2.2.2.7., risospese i nuclei in un buffer di nuclei diluito sufficiente per raggiungere la concentrazione di nuclei desiderata.
NOTA: La concentrazione di nuclei desiderata si basa sul recupero mirato dei nuclei per l'esperimento scATAC-seq ed è determinata dalle linee guida sulla concentrazione dei nuclei che si trovano nel protocollo17 del produttore. Ad esempio, se alla fine si desiderano 10.000 nuclei, la concentrazione di nuclei desiderata per lo stock di nuclei è compresa tra 3.080 e 7.700 nuclei / μL. Potrebbe essere meglio mirare alla metà dell'intervallo di concentrazione. - Determinare la concentrazione dei nuclei utilizzando un emocitometro.
- Procedere immediatamente alla trasposizione scATAC utilizzando il nucleo preparato stock17.
- Preparazione dei media
- Reidratazione di celle fisse a metanolo per l'uso in scRNA-Seq
- Preparazione dei media
- Per preparare il tampone di lavaggio/diluizione, sciogliere 0,01 g di BSA in 1 mL di PBS. Quindi aggiungere 12,5 μL di inibitore della RNasi da 40 U/μL e mescolare delicatamente. Conservare sul ghiaccio.
- Reidratazione cellulare
- Centrifugare celle fisse di metanolo in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL a 3000 x g per 10 minuti a 4 °C. Quindi rimuovere il surnatante.
- Aggiungere un tampone di lavaggio/diluizione refrigerato da 200 μL al tubo microcentrifuga. Centrifugare a 300 x g per 10 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Ripetere per un totale di 2 lavaggi.
NOTA: Preparare i materiali necessari per la generazione e il codice a barre gem durante i due passaggi precedenti14. - Per preparare lo stock di cellule, in base al numero totale di cellule calcolato nel 2.1.2.12., risospese le cellule in un tampone di lavaggio/diluizione sufficiente per ottenere la concentrazione cellulare desiderata. Le concentrazioni cellulari preferite sono comprese tra 700 e 1200 cellule/μL.
- Determinare la concentrazione cellulare dello stock cellulare utilizzando un emocitometro.
- Procedere immediatamente alla generazione gem e al codice a barre utilizzando lo stock di celle14.
- Sequenziamento
- Quando si esegue l'analisi del corso temporale (come nello sviluppo o nella malattia), sequenziare più campioni in un'esecuzione multiplexata (ad esempio, più librerie su una singola cella di flusso) per ridurre le variazioni tecniche.
- Preparazione dei media
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Representative Results
Questo flusso di lavoro delinea una strategia per lo studio dei fenotipi dello sviluppo e dei processi regolatori utilizzando il sequenziamento a singola cellula. Il multiplexing di campioni MULTI-seq consente un test di fenotipizzazione iniziale a basso costo, mentre la raccolta e la fissazione accoppiate di campioni per scRNA-seq e scATAC-seq consentono un'indagine più approfondita (Figura 1).
Il codice a barre MULTI-seq consente il sequenziamento combinato di più campioni e la loro successiva deconvoluzione computazionale. Il campione di origine può essere determinato per ogni cella in base alla loro espressione di codice a barre (Figura 2A). Questi campioni combinati possono essere analizzati come un singolo set di dati ai fini del clustering cellulare e dell'identificazione del tipo di cella (Figura 2B). Poiché ogni cella è codificata con codice a barre prima della generazione gem, i doppietti cellulari avranno un'alta probabilità di mostrare l'espressione per più codici a barre MULTI-seq e la maggior parte dei doppietti può quindi essere identificata e rimossa prima del clustering e dell'identificazione del tipo di cella (Figura 2C). Aumentare il numero di cellule utilizzate nella fase di generazione GEM aumenterà la percentuale di doppietti trovati. scATAC-seq può essere utilizzato per generare un set di dati con tipi di cellule corrispondenti a quelli trovati da scRNA-seq (Figura 2D). L'accoppiamento dell'espressione genica scRNA-seq e delle informazioni sull'accessibilità del DNA scATAC-seq consente la ricostruzione delle reti di regolazione genica.
Figura 1: Schema che dimostra l'uso di MULTI-Seq nell'analisi iniziale, seguita da analisi separate scRNA-Seq e scATAC-Seq nella caratterizzazione approfondita di fenotipi, trattamenti o stati patologici di interesse. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rappresentazioni di riduzione dimensionale UMAP di dati MULTI-seq per una serie allelica di topi knockout P0 Sstr2 che dimostrano (a) la deconvoluzione del genotipo per ogni cellula nel set di dati e (b) l'identificazione dei tipi di cellule nel set di dati. Il sovraccarico delle cellule durante la generazione GEM e la fase di codifica a barre comporterà un aumento dei doppietti cellulari come quelli visti in (c), che mostra i dati da (a) e (b) prima della rimozione del doppietto e del rilustering. In (d), dati scATAC-Seq da cellule GFP-positive ottenuti a E16 da espianti retinici elettroporati con un plasmide di controllo che esprime GFP a E14. I tipi di cellule sono annotati in base all'accessibilità dei geni specifici del tipo cellulare. Questa figura è stata modificata da Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regolazione della neurogenesi retinica mediante segnalazione di somatostatina. bioRxiv 2020.09.26.314104 (2020) doi:10.1101/2020.09.26.31410418 e dati originali non pubblicati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La potenza di MULTI-seq deriva dalla perfetta integrazione dei dati provenienti da più condizioni o modelli sperimentali e dall'enorme vantaggio in termini di costi e limitazione degli effetti batch. L'utilizzo di MULTI-seq offre una profondità di fenotipizzazione senza precedenti in laboratorio. I metodi di multiplexing non genetici come l'hashing cellulare o l'hashing dei nuclei hanno aperto la porta a campioni multiplexati attraverso l'uso di anticorpi con codice a barre 7,19,20. Tuttavia, questo si basa sulla disponibilità di anticorpi ad alta affinità che riconoscono le proteine di superficie espresse sulle cellule o sui loro nuclei, il che non sarà possibile se questi anticorpi non sono disponibili o le cellule non esprimono la superficie cellulare appropriata o gli antigeni nucleari7. Poiché MULTI-seq utilizza oligo codici a barre modificati dai lipidi per incorporarli stabilmente nelle cellule o nei loro nuclei, consente ai ricercatori di raccogliere dati trascrittomici da un massimo di 96 campioni freschi o fissi in modo più economico e più ampiamente applicabile6.
Il follow-up della fenotipizzazione iniziale MULTI-Seq con accoppiati scRNA-Seq e scATAC-Seq è suggerito e mostrato per acquisire una comprensione dell'organizzazione genomica che coincide con i dati trascrittomici1. Questo non solo dà un'idea delle regioni dell'eterocromatina e dell'eucromatina, ma anche una preziosa comprensione delle reti di fattori di trascrizione che guidano l'espressione genica. Un approccio multi-omico può essere utilizzato per rivelare i cambiamenti dinamici della cromatina che avvengono nei punti chiave delle decisioni sul destino cellulare e determinare le traiettorie cellulari nello sviluppo e nella malattia 1,21,22. Ciò può essere realizzato attraverso l'assoggettamento bioinformatico dei dati a pseudotime, interazioni cis-regolatorie e analisi dell'impronta 5,23,24,25. La correzione dei campioni e il sequenziamento multiplo in un'esecuzione multiplexata riducono le fonti di effetto batch, consentendo il confronto tra i campioni, ad esempio attraverso un esperimento di corso temporale. Il numero di campioni di tessuto richiesti dipende dall'ambito dell'esperimento. Quando si esaminano i fenotipi associati ai punti temporali embrionali, le singole retine sono spesso sufficienti e possono fornire centinaia di migliaia di cellule. Una singola retina potrebbe non fornire abbastanza cellule in schemi sperimentali più complessi: elettroporazioni ex vivo di espianti retinici, sondaggio per popolazioni cellulari rare o modelli genetici con insufficiente attivazione CRE. Mentre una singola retina può fornire alcune centinaia di cellule, queste non cattureranno l'intera complessità del tessuto. Per tali esperimenti, sarà necessaria l'ottimizzazione in base alle esigenze di un ricercatore. Utilizzando queste tecniche, si può ottenere informazioni su come i geni analizzati in MULTI-seq sono regolati durante processi dinamici come lo sviluppo e la malattia.
La regolazione delle reti di regolazione genica è al centro della comprensione dei processi cellulari e di come contribuiscono allo sviluppo e alla malattia 1,26,27. Il flusso di lavoro qui presentato può essere utilizzato per identificare queste reti di regolazione genica in specifici tipi di cellule. Tuttavia, questo protocollo è stato ottimizzato per l'uso con il tessuto retinico del topo. L'ottimizzazione di vari passaggi, come il tempo di lisi o dissociazione, le velocità / tempi di centrifugazione e il numero di passaggi di filtrazione possono essere necessari per massimizzare il numero di cellule o nuclei e ridurre al minimo i detriti cellulari in sospensioni cellulari da altri tipi di tessuto, campioni ex vivo o specie, indipendentemente dal fatto che i campioni siano freschi, congelati o fissati in metanolo. Potrebbe essere necessario aumentare il tempo di fissazione del metanolo se i campioni mostrano alti livelli di cellule vitali con colorazione blu tripano. La tecnica MULTI-seq introduce molte fasi di lavaggio aggiuntive rispetto al tradizionale scRNA-seq. Per evitare lo smaltimento accidentale di cellule preziose o DNA, è prudente ottimizzare le velocità di centrifugazione e mantenere i supernatanti che normalmente verrebbero scartati nelle fasi di codifica a barre delle cellule, pulizia post-GEM RT e costruzione della libreria di codici a barre sul ghiaccio fino a quando tale passaggio non è stato verificato per avere successo. Una limitazione al MULTI-seq è il numero limitato di cellule, e quindi campioni, che possono essere sequenziati da un singolo pozzo nella fase di generazione GEM. Si raccomanda di non cercare di sovraccaricare eccessivamente le cellule durante questa fase per evitare un aumento sostanziale della cattura delle cellule doppiette. Evitare di caricare un pozzo GEM con più di 20.000 celle. Piuttosto, più pozzetti possono essere preparati da una singola sospensione combinata e multiplexati durante il sequenziamento. Ciò richiederà la preparazione di un volume abbastanza grande di sospensione cellulare per la generazione di GEM e l'aggiunta di repliche ai passaggi 5, 6 e 7 e aumenterà il costo del sequenziamento poiché sono necessarie più letture totali per più celle. Con un'adeguata ottimizzazione, questo flusso di lavoro consentirà l'identificazione efficiente in termini di costi e tempi dei fenotipi specifici del tipo cellulare e delle reti di regolazione genica.
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Disclosures
Niente da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Linda Orzolek della Johns Hopkins Transcriptomics and Deep Sequencing Core per l'aiuto nel sequenziamento delle librerie prodotte e Lizhi Jiang per aver eseguito gli espianti retinici ex vivo .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips | |||
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 100 µM Barcode Solution | Request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 100% Ethanol | Millipore Sigma | E7023-500ML | |
| 100% Methanol | Millipore Sigma | 322415-100ML | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 1000195 | |
| 10x Chromium controller & Accessory Kit | 10x Genomics | PN-120263 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Quality Biological | P886-229411 | |
| 40 µm FlowMi Cell Strainer | Bel-Art | H13680-0040 | |
| 50 µM Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 50 µM Co-Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 5200 Fragment Analyzer system | Agilent | M5310AA | |
| 70 um FlowMi cell strainer | Bel-Art | H13680-0070 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | VWR | BK392302 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Chromium Next GEM Chip G | 10x Genomics | PN-1000120 | |
| Chromium Next GEM Chip H | 10x Genomics | PN-1000161 | |
| Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 | 10x Genomics | PN-1000175 | |
| Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121 | |
| Digitonin | Fisher Scientific | BN2006 | |
| Dissection microscope | Leica | ||
| DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dry Ice | |||
| EVA Foam Ice Pan | Tequipment | 04393-54 | |
| FA 12-Capillary Array Short, 33 cm | Agilent | A2300-1250-3355 | |
| Fisherbrand Isotemp Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-20Q | |
| Forma CO2 Water Jacketed Incubator | ThermoFisher Scientific | 3110 | |
| Glycerol 50% Aqueous solution | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| Illumina NextSeq or NovaSeq | Illumina | ||
| Kapa Hifi Hotstart ReadyMix | HiFi | 7958927001 | |
| Low TE Buffer | Quality Biological | 351-324-721 | |
| Magnesium Chloride Solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes | Millipore Sigma | 20-400 | |
| Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes | 10x Genomics | NC1469069 | |
| MULTI-seq Primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| MyFuge Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | C1008 | |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9937 | |
| P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes | Eppendorf | ||
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| Refridgerated Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 2231000655 | |
| RNase-free Disposable Pellet Pestles | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2615 | |
| RPI primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Single Index Kit N, Set A | 10x Genomics | PN-1000212 | |
| Single Index Kit T Set A | 10x Genomics | PN-1000213 | |
| Sodium Chloride Solution 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | |
| SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | B23318 | |
| Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| TempAssure PCR 8-tube strip | USA Scientific | 1402-4700 | |
| Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) | Corning | 25-900-CI | |
| Universal I5 primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 |
References
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