Summary
여기에서, 저자들은 망막에서 전사체 및 크로마틴 접근성 프로파일을 특성화하는데 있어서 표현형 및 후속 쌍을 이룬 scRNA-seq 및 scATAC-seq 에 대한 MULTI-seq 의 유용성을 보여준다.
Abstract
강력한 차세대 시퀀싱 기술은 개발 중 및 질병 상태에서 망막 유전자 조절 네트워크가 어떻게 기능하는지 조사하기 위해 강력하고 포괄적 인 분석을 제공합니다. 단일 세포 RNA 시퀀싱을 통해 망막 발달 및 질병에서 관찰 된 유전자 발현 변화를 세포 수준에서 포괄적으로 프로파일 링 할 수 있으며 단일 세포 ATAC-Seq 는 크로마틴 접근성 및 전사 인자 결합의 분석을 유사한 해상도로 프로파일 링 할 수 있습니다. 여기에서 망막 발달에서 이러한 기술의 사용이 설명되고, 개별 샘플이 변형된 올리고뉴클레오티드-지질 복합체로 표지되는 MULTI-Seq 가 입증되며, 연구자가 개별 실험의 범위를 늘리고 비용을 실질적으로 절감할 수 있게 한다.
Introduction
유전자가 세포 운명에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 이해하는 것은 질병 및 배아 진행과 같은 과정을 심문하는 데 중요한 역할을합니다. 전사 인자와 그들의 표적 유전자 사이의 복잡한 관계는 유전자 조절 네트워크로 그룹화될 수 있다. 이러한 유전자 조절 네트워크를 진화 계통에 걸쳐 질병과 발달의 중심에 두는 증거가 늘어나고있다1. qRT-PCR과 같은 이전 기술은 단일 유전자 또는 유전자 세트에 초점을 맞추었지만 고처리량 시퀀싱 기술을 적용하면 완전한 세포 전사체의 프로파일 링이 가능합니다.
RNA-seq 는 대규모 전사체 2,3을 엿볼 수 있습니다. 단일 세포 RNA 시퀀싱 (scRNA-seq)은 조사관에게 전사체를 프로파일 링할뿐만 아니라 특정 세포 유형을 유전자 발현 프로필과 연결하는 능력을 제공합니다4. 이것은 개별 세포 프로파일을 공지된 유전자 마커5를 사용하여 분류 알고리즘으로 공급함으로써 생물 정보학적으로 달성된다. 지질-태그된 인덱스 시퀀싱(MULTI-seq)을 이용한 멀티플렉싱은 수집될 수 있는 scRNA-Seq 프로파일의 수6에서 전례 없는 다양성을 제공한다. 이러한 지질 기반 기술은 원형질막 통합(7) 대신에 표면 항원 및 높은 친화성 항체의 존재에 의존하는 세포-해싱과 같은 다른 샘플 인덱싱 기술과는 다르다. 유전자 발현 프로필을 세포 유형으로 프로파일링할 수 있을 뿐만 아니라 다른 실험을 단일 시퀀싱 라이브러리로 결합할 수 있어 개별 scRNA-seq 실험6의 비용을 획기적으로 낮출 수 있습니다. scRNA-seq 의 비용은 많은 상이한 유전자형, 상태 또는 환자 샘플이 분석되는 표현형 실험에 사용하기에 금지된 것처럼 보일 수 있지만, 멀티플렉싱은 단일 라이브러리6에서 최대 96개의 샘플의 조합을 허용한다.
scRNA-seq 를 통한 유전자 발현 프로파일링은 분자 메커니즘이 세포 운명을 어떻게 지시하는지에 대한 현재의 이해에 혁명을 일으키는 유일한 고처리량 시퀀싱 기반 기술은 아니었다. 세포에 어떤 유전자 전사체가 존재하는지 이해하면 세포 유형을 확인할 수 있지만, 게놈 조직이 발달과 질병 진행을 어떻게 조절하는지 이해하는 것도 똑같이 중요합니다. 초기 연구는 히스톤에 결합하지 않은 서열의 DNase 매개 절단을 검출 한 다음 결과 DNA 단편의 시퀀싱을 수행하여 열린 크로마틴의 영역을 확인하는 데 의존했습니다. 대조적으로, 트랜스포존 접근 가능한 크로마틴 시퀀싱 (scATAC-seq)에 대한 단일 세포 분석은 연구자가 단일 뉴클레오티드 수준8에서 개방 크로마틴을 쉽게 프로파일 링하기 위해 길들여진 트랜스포존으로 DNA를 프로브 할 수있게합니다. 이것은 scRNA-seq 와 유사한 스케일링을 거쳤으며 이제 조사관은 수천 개의 개별 게놈8에 걸쳐 개별 세포 유형 및 프로파일 표현형을 식별 할 수 있습니다.
scRNA-seq 및 scATAC-seq 의 페어링을 통해 연구원은 질병 모델 및 발달 과정 9,10,11,12에서 세포 집단, 게놈 조직 및 유전자 조절 네트워크를 결정하기 위해 수천 개의 세포를 프로파일 링 할 수있었습니다. 여기서 저자는 먼저 MULTI-seq 를 활용하여 무수한 동물 모델의 표현형을 응축하고 쌍을 이루는 scRNA-seq 및 scATAC-seq 를 사용하여 이러한 동물 모델의 크로마틴 풍경 및 규제 네트워크를 더 잘 이해하는 방법을 설명합니다.
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Protocol
이러한 연구를 위한 동물의 사용은 존스 홉킨스 동물 관리 및 사용 위원회(Johns Hopkins Animal Care and Use Committee)가 승인한 프로토콜을 사용하여 ARRIVE 가이드라인에 따라 수행되었으며, 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었다.
1. 다중 서열
- 미디어 준비
- 사용하기 13분 전에 30분 동안 Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)의 mL당 난포 억제제, 10mg의 난포 억제제 및 알부민10mg을 준비하고 평형화하십시오. 인큐베이터에서 95% O2:5%CO2와 평형화시킨다.
- 이 인큐베이션 단계13 동안 EBSS에서 파파인 해리 용액, 20 units/mL 파파인 및 0.005% DNase를 준비한다.
참고 : DNase 용액의 한 바이알은 5 개의 샘플에 충분합니다. 추가 바이알은 5개 이상의 샘플에서 MULTI-seq 를 수행하는 경우 재구성될 필요가 있을 수 있다.
- 이 인큐베이션 단계13 동안 EBSS에서 파파인 해리 용액, 20 units/mL 파파인 및 0.005% DNase를 준비한다.
- 지질 개질된 올리고 바코딩 용액을 준비한다.
- 0.5 μL의 100 μM 바코드 원액과 4.5 μL의 인산완충식염수(PBS)를 결합하여 각 시료에 대해 고유한 바코드 희석액을 만듭니다.
- 1:1 몰비로 앵커:바코드 용액을 제조하려면, 4.4 μL의 10 μM 바코드 희석액, 0.9 μL의 50 μM 앵커 용액 및 16.7 μL의 PBS를 결합하고 얼음 위에 놓는다. 바코드 가닥과 앵커 가닥 모두에 대한 최종 농도는 2 μM이어야 한다.
- 코앵커 용액을 제조하기 위해, 0.88 μL의 50 μM 코앵커 용액과 21.12 μL의 PBS를 결합하고 얼음 위에 놓는다. 코앵커의 최종 농도는 2μM이어야 합니다. 이 단계의 부피에 샘플 수의 1.1배를 곱합니다.
- PBS에 1% BSA를 만들기 위해, 0.1 g의 소 혈청 알부민(BSA)을 PBS 10 mL에 녹이고 얼음 위에 놓는다.
- RNase 억제제로 PBS를 만들려면 2.5 μL의 40 U / μL RNase 억제제와 197.5 μL의 PBS를 결합하고 얼음 위에 보관하십시오. 이 단계의 볼륨에 샘플 수의 1.1배를 곱합니다.
- 사용하기 13분 전에 30분 동안 Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)의 mL당 난포 억제제, 10mg의 난포 억제제 및 알부민10mg을 준비하고 평형화하십시오. 인큐베이터에서 95% O2:5%CO2와 평형화시킨다.
- 샘플 해리
- 제도적 IACUC 요건에 따라 자궁경부 탈구 및/또는CO2 질식증을 통해 동물을 안락사시킨다. 안락사를위한 방법은 제도적 요구 사항 및 사용 된 모델 유기체에 달려 있습니다.
- 해부 현미경 하에 차가운 PBS에서 양쪽 눈으로부터 망막을 해부하고, 전사 피펫을 사용하여 멸균된 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다.
- 500 μL의 파파인 용액을 각 샘플에 대한 1.5 mL 튜브로 옮긴다.
- 샘플을 파파인 용액에 넣고 즉시 튜브를 캡핑하십시오.
- 샘플을 함유하는 튜브를 37°C, 5%CO2 에서 30분 동안 인큐베이션한다. 바이알을 10분마다 3번 뒤집습니다. 샘플은 각 반전 라운드와 점진적으로 분리되어야 합니다.
- 바이알을 실온으로 되돌리고 300 μL로 설정된 1 mL 피펫으로 각 샘플을 3-4회 트리튜레이트한다.
- 분쇄 후 남아있는 해리되지 않은 조직 조각이 정착되도록 허용하십시오.
- 해리되지 않은 조직의 어떤 조각도 피하면서 흐린 세포 현탁액을 제거하고 각 샘플의 세포 현탁액을 새로운 멸균 15mL 스크류 캡 튜브에 넣습니다.
- 세포 현탁액을 실온에서 5분 동안 300 x g에서 원심분리한다.
- 원심분리 단계 동안, 세포 재현탁 배지를 준비한다.
- 857 μL의 EBSS (Vial 1)와 95 μL의 재구성된 알부민-난포코이드 억제제 용액을 멸균된 1.5 mL 스크류 캡핑된 튜브에 혼합한다. 1.1.1에서 절약한 DNase 용액 48μL를 첨가합니다. 이 단계의 볼륨에 샘플 수의 1.1배를 곱합니다.
- 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 보유하도록 조심하고, 세포 펠릿을 단계 1.2.10에서 제조된 세포 재현탁 용액 1 mL에 즉시 재현탁시킨다.
- 불연속 밀도 구배를 준비합니다.
- 각 샘플에 대해 1.6mL의 난포성 억제제 용액을 새로운 15mL 멸균 스크류 캡핑 튜브에 넣고 세포 현탁액을 조심스럽게 위에 겹쳐 놓습니다. 그라디언트의 두 레이어 사이의 인터페이스가 표시되어야하지만 일부 혼합은 결과에 영향을 미치지 않습니다.
- 불연속 밀도 구배를 실온에서 6분 동안 70 x g에서 원심분리한다. 해리 된 세포는 튜브의 바닥에 펠릿을해야하며 멤브레인 조각은 계면에 남아 있어야합니다.
- 상청액을 버리고 PBS 200 μL를 첨가하여 펠릿화된 세포를 세척한다. 실온에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리한다.
- 상청액을 버리고 세포를 RNase 억제제와 함께 PBS의 180 μL에 재현탁시킨다. 세포를 40 μm 세포 스트레이너를 통해 멸균된 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 통과시킨다.
- 셀 바코딩
- 20μL의 앵커:바코드 용액을 각 샘플과 피펫에 부드럽게 혼합합니다. 각 샘플이 고유 한 앵커 : 바코드 용액을 받고 5 분 동안 얼음 위에서 배양되도록하십시오.
- 이 인큐베이션 동안 겔 비드-인-에멀젼(GEM) 생성 및 바코딩에 필요한 물질을 준비한다(14).
- 20 μL의 코앵커 용액을 각 샘플과 피펫에 부드럽게 첨가하여 혼합한다. 얼음 위에서 5 분 동안 배양하십시오.
- PBS 중의 빙냉 1% BSA 1 mL를 각 샘플에 첨가하고, 세포를 4°C에서 5분 동안 300 x g에서 원심분리한다.
- 세포 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 제거하고 PBS에 400 μL 얼음냉 1% BSA를 첨가한다. 4°C에서 5분 동안 300 x g에서 원심분리한다.
- 1.3.4 단계를 반복하여 총 2 번 씻으십시오. 상청액을 제거하고 PBS 중의 400 μL 얼음냉 1% BSA에 재현탁시켰다.
- 혈구분석기를 사용하여 각 샘플에 대한 세포의 농도를 결정하십시오.
- 각 샘플에 대해 로드할 총 셀 수를 결정합니다. 전형적으로, 이것은 원하는 총 세포 수를 샘플 수로 나눈 값입니다. 그러나, 한 조건에 대한 생물학적 복제가 손실되면, 그 공유는 그 조건으로부터의 다른 생물학적 복제물들 사이에서 분할될 수 있다.
- 각 샘플에 대해 원하는 세포 수를 단계 3.5에서 계산한 샘플의 세포 농도로 나누어 원하는 세포 수를 로딩하는 데 필요한 부피를 결정합니다.
- 각 샘플로부터 단계 3.5.2에서 계산된 부피를 새로운 멸균 1.5 mL 원심분리 튜브에 합한다. GEM 생성이 실패한 경우 각 샘플에서 가져온 부피를 두 배로 늘리는 것이 현명합니다.
- 혈구측정기를 사용하여 결합된 샘플의 "최종" 세포 농도를 결정한다.
- 20μL의 앵커:바코드 용액을 각 샘플과 피펫에 부드럽게 혼합합니다. 각 샘플이 고유 한 앵커 : 바코드 용액을 받고 5 분 동안 얼음 위에서 배양되도록하십시오.
- GEM 생성 및 바코드
- 결합된 샘플을 사용하여 바코드 GEM14를 생성하고 바코드합니다.
- 포스트 GEM-RT 정리 및 cDNA 증폭
- 다음 변형14를 통해 제조업체의 지시에 따라 사후 GEM 역전사효소 정리 및 cDNA 증폭을 위한 물질을 준비한다. 크기 선택14에 따라 사후 GEM-RT 정리를 수행합니다.
- 2 mL로 준비된 80% 에탄올의 부피를 증가시킨다.
- 얼음14에 cDNA 증폭 믹스를 준비하십시오. 1 μL의 2.5 μM MULTI-seq 프라이머를 cDNA 증폭 믹스에 첨가한다. 5 초 동안 소용돌이 치고 벤치 탑 미니 원심 분리기에서 5 초 동안 원심 분리기.
- cDNA 증폭을 수행한다14. cDNA는 이 시점에서 최대 72시간 동안 4°C에서 저장될 수 있다.
- 크기 선택14에 의해 cDNA 정리를 수행한다. 내인성 전사체 cDNA는 이 시점에서 최대 72시간 동안 또는 -20°C에서 최대 4주 동안 4°C에서 저장될 수 있다.
- 크기 선택의 첫 번째 라운드에서 상청액을 버리지 마십시오. 이 부분에는 샘플 바코드가 포함되어 있습니다. 상청액을 새로운 멸균 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다.
- 상층액을 얼음 위에 보관하십시오.
- 소용돌이를 사용하여 상자성 비드 기반 크기 선택 시약을 재현탁하고 260 μL 상자성 비드 기반 크기 선택 시약 (최종 3.2x) 및 100 % 이소프로판올 (1.8x) 180 μL를 상청액에 첨가한다. 혼합된 피펫을 10회 피펫하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다.
- 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 용액이 지워질 때까지 기다립니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 버립니다.
- 500 μL의 80% 에탄올을 비드에 첨가하고 30초 동안 방치한다. 상층액을 제거하고 버립니다.
- 총 2 회 세척 반복하십시오.
- 비드를 간단히 원심분리하고 마그네틱 랙으로 돌아갑니다. 2분 동안 타이머를 시작합니다.
- P10 피펫으로 남은 에탄올을 제거하고 2분 동안 마그네틱 랙 상에서 비드를 공기 건조시킨다. 2 분을 초과하지 마십시오.
- 마그네틱 랙에서 비드를 제거하고 100μL 용출 완충액(EB)에 재현탁합니다. 피펫을 철저히 재현탁하십시오.
- 실온에서 2분 동안 인큐베이션한다.
- 마그네틱 랙으로 돌아가서 솔루션이 지워질 때까지 기다립니다.
- 상청액을 신선한 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다.
- 1.5.4~1.5.12단계를 반복합니다. 1.5.9단계에서 사용된 버퍼 EB의 부피를 절반으로 줄이십시오.
- dsDNA 고감도 분석 키트 및 형광계 및 단편 분석기(15,16)를 사용하여 바코드 DNA 농도 및 크기 분포를 결정한다. 바코드 cDNA는 이 시점에서 최대 72시간 동안 또는 -20°C에서 최대 4주 동안 4°C에서 저장될 수 있다.
- 다음 변형14를 통해 제조업체의 지시에 따라 사후 GEM 역전사효소 정리 및 cDNA 증폭을 위한 물질을 준비한다. 크기 선택14에 따라 사후 GEM-RT 정리를 수행합니다.
- 바코드 라이브러리 구축
- 80% 에탄올 1 mL를 준비한다.
- 멸균 PCR 스트립 튜브에서 바코드 라이브러리 PCR 마스터 믹스 준비: 2x 핫스타트 PCR 레디 믹스 26.25 μL, 10 μM 유니버설 i5 프라이머 2.5 μL, 10 μM RPI 프라이머 2.5 μL, 바코드 cDNA 3.5 ng (단계 5.14로부터의 농도에 의해 결정된 부피), 및 최종 부피를 50 μL로 가져오기에 충분한 뉴클레아제-프리 물을 조합한다.
- 여러 MULTI-seq 라이브러리가 함께 시퀀싱되는 경우 각 바코드 라이브러리에 대해 고유한 RPI 프라이머를 사용하십시오.
- 바코드 라이브러리 마스터 믹스를 라이브러리 제제 PCR에 적용한다: 5분 동안 95°C; 15초 동안 98°C, 30초 동안 60°C, 30초 동안 72°C의 10 사이클; 1분 동안 72°C; 이어서 4°C에서 유지한다.
- 소용돌이는 상자성 비드 기반 크기 선택 시약을 재현탁시킨다.
- 열순환기에서 PCR 산물을 제거하고 상자성 비드 기반 크기 선택 시약 80μL(1.6x)를 첨가한다. 철저하게 피펫.
- 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다. 높은 위치의 자석 분리기에 놓고 용액이 맑아질 때까지 기다리십시오.
- 상층액을 제거하고 버립니다.
- 200 μL의 80% 에탄올을 비드에 첨가하고 30초 동안 방치한다. 상층액을 제거하고 버립니다.
- 1.6.8 단계를 반복하여 총 2 번 씻으십시오.
- 튜브를 간단히 원심분리하고 낮은 위치의 자기 분리기 위에 놓습니다. 2분 동안 타이머를 시작합니다.
- P20 피펫으로 남아있는 에탄올을 제거하고 2분 동안 자기 분리기 상에서 비드를 공기 건조시킨다. 2 분을 초과하지 마십시오.
- 자기 분리기로부터 튜브를 제거하고 비드를 25 μL의 완충액 EB에 재현탁시켰다. 피펫을 완전히 섞어 비드를 재현탁시킵니다.
- 실온에서 2분 동안 인큐베이션한다.
- 낮은 위치의 자기 분리기로 돌아가서 용액이 지워질 때까지 기다리십시오. 상청액을 새로운 PCR 스트립 튜브로 옮긴다.
- 발현 라이브러리 및 바코드 라이브러리 농도 및 단편 크기 분포를 adsDNA 고감도 분석 키트 및 형광계 및 단편 분석기를 사용하여 정량화합니다.
- 3' 유전자 발현 도서관 구축
- 제조자의 지시14에 따라 3' 유전자 발현 라이브러리 구축을 수행한다.
- 시퀀싱
- 단계 7에서 증폭된 내인성 cDNA 라이브러리에 더하여, 단계 6에서 증폭된 바코드 라이브러리를 제출한다. 간략화를 위해, 이들 라이브러리를 개별적으로 제출하거나, 비용 효율적인 측정으로서 내인성 cDNA 라이브러리와 함께 샘플 바코딩 물질의 분취량을 포함한다. 세포당 20,000-50,000 cDNA와 3,000-5,000 바코드 판독 사이의 표적.
- 셀레인저 mkfastq에 의해 결과 시퀀싱 bcl 파일을 fastq 파일로 변환하고 셀레인저 카운트에 의해 이들로부터 생성된 카운트 행렬을 카운트하십시오.
- 디컨볼루트 샘플은 MULTI-seq GitHub 리포지토리(https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq)에서 사용 가능한 deMULTIplex r 패키지를 사용하여 셀레인저 분석 후 분석합니다.
2. 쌍을 이룬 scRNA-seq 및 scATAC-seq
- scATAC-seq 및 scRNA-seq 용 망막 세포의 메탄올 고정을 위한 플래쉬 동결 조직
- 미디어 준비
- 망막 해리를 위한 용액을 준비하려면 1.1.1단계와 1.1.4단계를 반복한다.
- 작은 얼음 양동이에 에탄올 드라이 아이스 욕조를 준비하십시오.
- 뉴클레아제가 없는 물 4.5 mL에 에탄올 10.5 mL를 첨가하여 70% 에탄올 15 mL를 제조하였다.
- 얼음 양동이에 드라이 아이스를 충분히 넣으면 (펠릿 형태가 바람직 함) 15 mL의 액체가 얼음을 덮기 위해 상승합니다. 에탄올 15 mL를 첨가한다.
- PBS를 얼음 위에 놓고 100% 메탄올의 1 mL 분취량을 편리한 -20°C 냉동고에 놓는다.
- 시료 준비
- 망막을 분리하는 단계 1.2.1 및 1.2.2를 따르십시오; 그러나 이번에는 각 망막을 별도의 마이크로 원심 분리 튜브에 넣습니다.
- scATAC-seq로 향하는 샘플의 경우, P200 피펫을 사용하여 마이크로원심분리 튜브로부터 임의의 액체를 제거하고 즉시 캡하고 튜브를 에탄올-드라이 아이스 배쓰에 넣어 샘플을 플래쉬 동결시킨다.
- scRNA-seq로 향하는 샘플의 경우, 세포를 해리시키기 위해, 해부된 망막 상에서 단계 1.2.3 내지 1.2.15를 반복한다.
- 세포를 실온에서 3분 동안 300 x g에서 원심분리한다.
- 세포 펠릿을 파괴하지 않고 상청액을 제거한다.
- 냉각된 PBS 1 mL를 첨가하고, 세포가 완전히 현탁될 때까지 또는 10회 부드럽게 피펫 혼합한다.
- 4°C에서 5분 동안 300 x g에서 원심분리한다.
- 2.1.2.5 ~ 2.1.2.7 단계를 반복하여 총 2 회 세척하십시오.
- 세포 펠릿을 파괴하지 않고 상청액을 제거한다.
- 냉각된 PBS 100 μL를 첨가하고, 10x 또는 세포가 완전히 현탁될 때까지 부드럽게 혼합한다.
- 가장 낮은 속도 설정에서 튜브를 볼텍싱하기 시작합니다. 900 μL의 냉각된 메탄올 (-20°C)을 첨가하면서 튜브를 부드럽게 와류하면서 한 방울씩 떨어뜨려 세포가 뭉치는 것을 방지한다.
- 세포를 얼음 상에서 15분 동안 인큐베이션한다.
- 혈구분석기를 사용하여 고정된 세포의 농도를 결정한다.
- 트리판 블루를 사용하여 고정 단계의 효능을 평가한다. 생존 가능한 세포의 높은 분율은 더 많은 고정 시간이 필요하다는 것을 나타낸다.
- 동결된 조직과 고정된 세포를 -80°C에서 보관한다.
- 미디어 준비
- scATAC-seq 용 플래시 냉동 조직으로부터의 핵 분리
- 미디어 준비
- 9.77 mL의 뉴클레아제가 없는 물, 100 μL의 1 M Tris-HCl (pH 7.4), 100 μL의 1 M NaCl, 30 μL의 1 MMgCl2, 및 0.1 g의 BSA를 조합함으로써 용해 희석 완충액을 제조하였다.
- 용해 희석 완충액을 전날과 같이 미리 준비하고, 4°C에서 보관한다. 의정서의 날에 얼음 위에 놓으십시오.
- scATAC 키트의 제조자에 의해 제공된 20x 핵 완충액을 -20°C에서 실온까지 평형화시킨다. 소용돌이와 원심 분리기를 간략하게 설명합니다.
- 침전물이 용해될 때까지 65°C 수조에서 5% 디지토닌 용액을 인큐베이션하여 1x 용해 완충액을 준비한다. 이어서, 2 mL의 용해 희석 완충액, 20 μL의 10% 트윈-20, 20 μL의 노니데트 P40 대체물 (대안적으로 IGEPAL 표지될 수 있음) 및 4 μL의 디지토닌을 조합한다.
- 1x 용해 완충액을 얼음 위에 보관하십시오.
- 0.1x 용해 완충액을 준비하려면 1.8 mL의 용해 희석 완충액을 200 μL의 1x 용해 완충액과 결합하고 얼음 위에 보관하십시오.
- 세척 완충액을 제조하기 위해, 용해 희석 완충액 2 mL와 10% Tween-20 20 μL를 합치고 얼음 위에 보관한다.
- 희석된 핵 완충액을 제조하기 위해, 950μL의 핵이 없는 물과 50μL의 핵 완충액(20x)을 결합하고 얼음 위에 보관한다.
- 핵 분리
- 용해 전에 샘플을 해동하지 마십시오. 냉동된 샘플이 들어있는 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 냉각된 0.1x 용해 완충액 500 μL를 첨가한다. 펠릿 유모차를 사용하여 즉시 15x를 균질화하십시오.
- 얼음 위에서 5 분 동안 배양하십시오. 이러한 인큐베이션 단계17 동안 scATAC 전이에 필요한 물질을 준비한다.
- 피펫 10x를 1mL 피펫과 혼합하고 얼음 위에서 10분 동안 인큐베이션한다. 아직 완료되지 않은 경우 이러한 인큐베이션 단계 동안 scATAC 전치에 필요한 물질의 완전한 준비. 더 많은 희석 된 핵 버퍼를 준비 할 필요가 없습니다.
- 용해된 세포에 냉각된 세척 완충액 500 μL를 첨가한다. 피펫 믹스 5x.
- 현탁액을 70 μm 세포 스트레이너를 통해 새로운 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 통과시킨다. 매번 새로운 70 μm 세포 스트레이너를 사용하여 한 번에 ~300 μL를 여과한다.
- 수집된 유동을 40 μm 세포 스트레이너를 통해 새로운 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 통과시키고 얼음 위에 저장한다.
- 혈구분석기를 사용하여 핵 농도를 결정한다. 핵 농도 및 세포 현탁액의 총 부피에 기초하여, 해리된 핵의 총 수를 계산한다.
- 4°C에서 5분 동안 500 x g에서 원심분리하고, 핵 펠릿을 파쇄하지 않고 상층액을 제거하였다.
- 단계 2.2.2.7.에서 결정된 총 핵 카운트에 기초하여 핵 스톡을 생성하려면, 원하는 핵 농도에 도달하기에 충분한 희석된 핵 완충액에 핵을 재현탁시킨다.
참고: 원하는 핵 농도는 scATAC-seq 실험에 대한 표적 핵 회수를 기반으로 하며 제조업체의 프로토콜17에 있는 핵 농도 지침에서 결정됩니다. 예를 들어, 궁극적으로 10,000개의 핵이 필요하다면, 핵 스톡에 대한 원하는 핵 농도는 3,080 내지 7,700 핵/μL 사이이다. 집중력 범위의 중간을 목표로하는 것이 가장 좋습니다. - 혈구분석기를 사용하여 핵 농도를 결정한다.
- 즉시 준비된 핵 스톡(17)을 이용하여 scATAC 전이를 진행한다.
- 미디어 준비
- 메탄올의 재수화 scRNA-Seq 에 사용하기 위한 고정 세포
- 미디어 준비
- 세척/희석 완충액을 준비하기 위해, 0.01 g의 BSA를 PBS 1 mL에 용해시킨다. 그런 다음 12.5 μL의 40 U / μL RNase 억제제를 추가하고 부드럽게 혼합하십시오. 얼음 위에 보관하십시오.
- 세포 재수화
- 메탄올 원심분리기는 세포를 4°C에서 10분 동안 3000 x g의 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 고정시켰다. 그런 다음 상청액을 제거하십시오.
- 200μL 냉장 세척/희석 버퍼를 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다. 4°C에서 10분 동안 300 x g에서 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 총 2 회 세척 반복하십시오.
참고: 이전 두 단계(14) 동안 GEM 생성 및 바코딩에 필요한 재료를 준비하십시오. - 2.1.2.12.에서 계산된 총 세포 수를 기준으로 세포 스톡을 준비하려면 원하는 세포 농도를 달성하기 위해 충분한 세척/희석 완충액에 세포를 재현탁하십시오. 바람직한 세포 농도는 700 내지 1200 세포/μL 사이이다.
- 혈구분석기를 사용하여 세포 스톡의 세포 농도를 결정한다.
- 즉시 세포 스톡(14)을 이용하여 GEM 생성 및 바코딩을 진행한다.
- 시퀀싱
- 시간 과정 분석을 수행할 때(개발 또는 질병에서와 같이), 다중 실행(즉, 단일 흐름 셀의 여러 라이브러리)에서 여러 샘플을 시퀀스하여 기술적 변동을 줄입니다.
- 미디어 준비
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Representative Results
이 워크플로우는 단일 세포 시퀀싱을 사용하여 발달 표현형 및 규제 프로세스를 조사하기 위한 전략을 제시합니다. MULTI-seq 샘플 멀티플렉싱은 초기 저비용 표현형 분석을 가능하게 하며, scRNA-seq 및 scATAC-seq 에 대한 샘플의 쌍을 이루어 고정하면 보다 심층적인 조사가 가능합니다(그림 1).
MULTI-seq 바코딩은 여러 샘플의 결합 된 시퀀싱과 후속 계산 디컨볼루션을 가능하게합니다. 기원의 샘플은 그들의 바코드 발현에 기초하여 각 세포에 대해 결정될 수 있다(도 2A). 이러한 결합된 샘플은 셀 클러스터링 및 셀 유형 식별을 위해 단일 데이터 세트로 분석될 수 있습니다(그림 2B). 각 세포는 GEM 생성 전에 바코드되기 때문에, 세포 이중항은 다수의 MULTI-seq 바코드에 대한 발현을 나타낼 확률이 높으며, 따라서 대부분의 이중성은 클러스터링 및 세포 유형 식별 전에 확인 및 제거될 수 있다(도 2C). GEM 생성 단계에서 사용되는 세포의 수를 늘리면 발견된 이중항의 비율이 증가할 것이다. scATAC-seq 는 scRNA-seq 에 의해 발견 된 것과 일치하는 세포 유형이있는 데이터 세트를 생성하는 데 사용될 수 있습니다 (그림 2D). scRNA-seq 유전자 발현 및 scATAC-seq DNA 접근성 정보의 페어링은 유전자 조절 네트워크의 재구성을 가능하게 한다.
도 1: 초기 분석에서 MULTI-Seq 의 사용을 입증하고, 이어서 관심 있는 표현형, 치료 또는 질병 상태의 심층 특성화에서 분리된 scRNA-Seq 및 scATAC-Seq 분석을 시연하는 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: P0 Sstr2 녹아웃 마우스의 대립유전자 시리즈에 대한 MULTI-seq 데이터의 UMAP 차원 감소 표현은 (a) 데이터셋 내의 각 세포에 대한 유전자형의 디컨볼루션 및 (b) 데이터세트에서 세포 유형의 식별을 입증한다. GEM 생성 및 바코딩 단계 동안 세포를 과부하시키는 것은 (c)에서 보이는 것과 같은 세포 이중항의 증가를 초래할 것이며, 이는 더블릿 제거 및 재클러스터링 전에 (a) 및 (b)로부터의 데이터를 보여준다. (d)에서, E14에서 GFP 발현 조절 플라스미드로 전기천공된 망막 외식편으로부터 E16에서 수득된 GFP 양성 세포로부터의 scATAC-Seq 데이터. 세포 유형은 세포 유형 특이적 유전자의 접근성에 기초하여 주석이 첨부된다. 이 수치는 Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. 소마토스타틴 신호전달에 의한 망막 신경발생의 조절로부터 변형되었다. bioRxiv 2020.09.26.314104 (2020) doi:10.1101/2020.09.26.31410418 및 원본, 미공개 데이터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
MULTI-seq 의 힘은 여러 실험 조건 또는 모델의 데이터를 원활하게 통합하고 비용 및 배치 효과 제한 측면에서 엄청난 이점을 제공합니다. MULTI-seq 활용은 실험실에서 전례 없는 표현형 깊이를 제공합니다. 세포 해싱 또는 핵 해싱과 같은 비유전자 다중화 방법은 바코드된 항체 7,19,20의 사용을 통해 다중화된 샘플에 대한 문을 열었다. 그러나, 이것은 세포 또는 그들의 핵에서 발현된 표면 단백질을 인식하는 높은 친화성 항체의 가용성에 의존하며, 이는 이들 항체가 이용가능하지 않거나 세포가 적절한 세포 표면 또는 핵 항원(7)을 발현하지 않는 경우에는 가능하지 않을 것이다. MULTI-seq 는 지질 변형 된 올리고 바코드를 사용하여 세포 또는 핵에 안정적으로 통합하기 때문에 연구자는 최대 96 개의 신선하거나 고정 된 샘플에서 전사체 데이터를 저렴하고 광범위하게 적용 가능한 방식으로 수집 할 수 있습니다6.
쌍을 이룬 scRNA-Seq 및 scATAC-Seq 를 사용한 초기 MULTI-Seq 표현형에 대한 후속 후속 조치는 전사체 데이터1과 일치하는 게놈 조직에 대한 이해를 얻기 위해 제안되고 보여진다. 이것은 헤테로크로마틴 및 유크로마틴 영역에 대한 아이디어를 제공 할뿐만 아니라 유전자 발현을 유도하는 전사 인자 네트워크에 대한 귀중한 이해를 제공합니다. 다중 오믹 접근법은 세포 운명 결정의 핵심 지점에서 일어나는 동적 크로마틴 변화를 밝히고 발달 및 질병1,21,22에서 세포 궤적을 결정하는 데 사용될 수 있습니다. 이것은 생물 정보학적으로 데이터를 의사 시간, 시스 - 조절 상호 작용 및 풋 프린트 분석 5,23,24,25에 종속시킴으로써 달성 될 수 있습니다. 다중 실행에서 샘플을 고정하고 배수를 시퀀싱하면 배치 효과의 소스가 줄어들어 시간 코스 실험과 같은 샘플 간 비교가 가능합니다. 필요한 조직 샘플의 수는 실험의 범위에 따라 다릅니다. 배아 시점과 관련된 표현형을 조사 할 때, 단일 망막은 종종 충분하며 수십만 개의 세포를 제공 할 수 있습니다. 단일 망막은 망막 외식의 생체외 전기천공, 희귀 세포 집단에 대한 탐사 또는 CRE 활성화가 불충분 한 유전 모델과 같은보다 복잡한 실험 계획에서 충분한 세포를 제공하지 못할 수 있습니다. 단일 망막이 수백 개의 세포를 제공 할 수 있지만, 이들은 전체 조직 복잡성을 포착하지 못합니다. 이러한 실험의 경우 연구자의 요구에 따라 최적화가 필요합니다. 이러한 기술을 활용하면 MULTI-seq 에서 분석 된 유전자가 발달 및 질병과 같은 동적 과정 중에 어떻게 조절되는지에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
유전자 조절 네트워크의 조절은 세포 과정을 이해하고 그들이 발달과 질병에 어떻게 기여하는지 이해하는 핵심에 있습니다 1,26,27. 여기에 제시된 워크 플로우는 특정 세포 유형에서 이러한 유전자 조절 네트워크를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 이 프로토콜은 마우스 망막 조직과 함께 사용하기 위해 최적화되었다. 용해 또는 해리 시간, 원심분리 속도/시간 및 여과 단계 수와 같은 다양한 단계의 최적화는 세포 또는 핵의 수를 최대화하고 샘플이 메탄올에 신선하거나 동결되거나 고정되어 있는지 여부에 관계없이 다른 조직 유형, 생체외 샘플 또는 종의 세포 현탁액에서 세포 파편을 최소화하기 위해 필요할 수 있습니다. 메탄올 고정 시간은 샘플이 트리판 블루 염색으로 높은 수준의 생존 세포를 보여주는 경우 증가될 필요가 있을 수 있다. MULTI-seq 기술은 전통적인 scRNA-seq에 비해 많은 추가적인 세척 단계를 도입한다. 귀중한 세포 또는 DNA의 우발적 인 폐기를 피하려면 원심분리 속도를 최적화하고 세포 바코딩, GEM RT 정리 후 및 바코드 라이브러리 구축 단계에서 일반적으로 폐기되는 상청액을 그 단계가 성공적으로 검증 될 때까지 유지하는 것이 현명합니다. MULTI-seq 에 대한 한가지 제한은 GEM 생성 단계에서 단일 웰로부터 시퀀싱될 수 있는 제한된 수의 세포, 따라서 샘플이다. 이중 세포 포획의 실질적인 증가를 피하기 위해이 단계에서 과도하게 과부하 세포를 시도하지 않는 것이 좋습니다. 20,000개 이상의 세포로 GEM을 잘 로딩하지 마십시오. 오히려, 다수의 웰은 단일 결합 현탁액으로부터 제조될 수 있고 시퀀싱 동안 다중화될 수 있다. 이를 위해서는 GEM 생성을 위해 충분히 큰 부피의 세포 현탁액을 준비하고 단계 5, 6 및 7에 반복실험을 추가해야하며 더 많은 세포를 위해 더 많은 총 판독이 필요하므로 시퀀싱 비용이 증가합니다. 적절한 최적화를 통해이 워크 플로는 세포 유형 별 표현형 및 유전자 조절 네트워크의 비용 및 시간 효율적인 식별을 가능하게합니다.
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Disclosures
공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
Johns Hopkins Transcriptomics와 Deep Sequencing Core의 Linda Orzolek에게 제작 된 라이브러리의 시퀀싱에 도움을 주신 것과 생체 외 망막 외 식편을 수행 한 Lizhi Jiang에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips | |||
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 100 µM Barcode Solution | Request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 100% Ethanol | Millipore Sigma | E7023-500ML | |
| 100% Methanol | Millipore Sigma | 322415-100ML | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 1000195 | |
| 10x Chromium controller & Accessory Kit | 10x Genomics | PN-120263 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Quality Biological | P886-229411 | |
| 40 µm FlowMi Cell Strainer | Bel-Art | H13680-0040 | |
| 50 µM Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 50 µM Co-Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 5200 Fragment Analyzer system | Agilent | M5310AA | |
| 70 um FlowMi cell strainer | Bel-Art | H13680-0070 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | VWR | BK392302 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Chromium Next GEM Chip G | 10x Genomics | PN-1000120 | |
| Chromium Next GEM Chip H | 10x Genomics | PN-1000161 | |
| Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 | 10x Genomics | PN-1000175 | |
| Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121 | |
| Digitonin | Fisher Scientific | BN2006 | |
| Dissection microscope | Leica | ||
| DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dry Ice | |||
| EVA Foam Ice Pan | Tequipment | 04393-54 | |
| FA 12-Capillary Array Short, 33 cm | Agilent | A2300-1250-3355 | |
| Fisherbrand Isotemp Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-20Q | |
| Forma CO2 Water Jacketed Incubator | ThermoFisher Scientific | 3110 | |
| Glycerol 50% Aqueous solution | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| Illumina NextSeq or NovaSeq | Illumina | ||
| Kapa Hifi Hotstart ReadyMix | HiFi | 7958927001 | |
| Low TE Buffer | Quality Biological | 351-324-721 | |
| Magnesium Chloride Solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes | Millipore Sigma | 20-400 | |
| Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes | 10x Genomics | NC1469069 | |
| MULTI-seq Primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| MyFuge Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | C1008 | |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9937 | |
| P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes | Eppendorf | ||
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| Refridgerated Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 2231000655 | |
| RNase-free Disposable Pellet Pestles | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2615 | |
| RPI primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Single Index Kit N, Set A | 10x Genomics | PN-1000212 | |
| Single Index Kit T Set A | 10x Genomics | PN-1000213 | |
| Sodium Chloride Solution 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | |
| SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | B23318 | |
| Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| TempAssure PCR 8-tube strip | USA Scientific | 1402-4700 | |
| Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) | Corning | 25-900-CI | |
| Universal I5 primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 |
References
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