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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Multiplexe Analyse der retinalen Genexpression und der Chromatinzugänglichkeit mittels scRNA-seq und scATAC-seq

Published: March 12, 2021 doi: 10.3791/62239
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3,4,5,6
1Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Science, The Johns Hopkins Hospital, 3Department of Ophthalmology, The Johns Hopkins Hospital, 4Department of Neurology, The Johns Hopkins Hospital, 5Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Kavli Neuroscience Discovery Institute, Johns Hopkins University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Hier zeigen die Autoren den Nutzen von MULTI-seq für die Phänotypisierung und nachfolgende gepaarte scRNA-seq und scATAC-seq bei der Charakterisierung der transkriptomischen und chromatinischen Zugänglichkeitsprofile in der Netzhaut.

Abstract

Leistungsstarke Next-Generation-Sequenzierungstechniken bieten robuste und umfassende Analysen, um zu untersuchen, wie retinale genregulatorische Netzwerke während der Entwicklung und in Krankheitszuständen funktionieren. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung ermöglicht es uns, Genexpressionsänderungen, die bei der Entwicklung und Erkrankung der Netzhaut auf zellulärer Ebene beobachtet wurden, umfassend zu profilieren, während Einzelzell-ATAC-Seq die Analyse der Chromatin-Zugänglichkeit und der Transkriptionsfaktorbindung mit ähnlicher Auflösung ermöglicht. Hier wird der Einsatz dieser Techniken in der sich entwickelnden Netzhaut beschrieben und MULTI-Seq demonstriert, bei dem einzelne Proben mit einem modifizierten Oligonukleotid-Lipid-Komplex markiert werden, der es den Forschern ermöglicht, sowohl den Umfang einzelner Experimente zu erhöhen als auch die Kosten erheblich zu senken.

Introduction

Zu verstehen, wie Gene das Zellschicksal beeinflussen können, spielt eine Schlüsselrolle bei der Befragung von Prozessen wie Krankheit und embryonalem Verlauf. Die komplexen Beziehungen zwischen Transkriptionsfaktoren und ihren Zielgenen können in genregulatorischen Netzwerken gruppiert werden. Immer mehr Beweise stellen diese genregulatorischen Netzwerke in den Mittelpunkt sowohl der Krankheit als auch der Entwicklung über evolutionäre Linien hinweg1. Während sich frühere Techniken wie die qRT-PCR auf ein einzelnes Gen oder einen Satz von Genen konzentrierten, ermöglicht die Anwendung der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie die Profilierung vollständiger zellulärer Transkriptome.

RNA-seq bietet einen Einblick in die großflächige Transkriptomik 2,3. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) gibt Forschern die Möglichkeit, nicht nur Transkriptome zu profilieren, sondern auch bestimmte Zelltypen mit Genexpressionsprofilenzu verknüpfen 4. Dies wird bioinformatisch erreicht, indem einzelne Zellprofile unter Verwendung bekannter Genmarker in Sortieralgorithmen eingespeistwerden 5. Das Multiplexing mittels lipid-tagged indices sequencing (MULTI-seq) bietet eine beispiellose Vielfalt in der Anzahl der scRNA-Seq-Profile, die gesammelt werden können6. Diese lipidbasierte Technik unterscheidet sich von anderen Probenindizierungstechniken wie dem Zell-Hashing, die auf dem Vorhandensein von Oberflächenantigenen und hochaffinen Antikörpern anstelle der Plasmamembranintegrationberuhen 7. Es ist jetzt nicht nur möglich, Genexpressionsprofile in Zelltypen zu profilieren, sondern verschiedene Experimente können auch in einer einzigen Sequenzierungsbibliothek kombiniert werden, wodurch die Kosten eines einzelnen scRNA-seq-Experiments drastisch gesenktwerden 6. Die Kosten für scRNA-seq mögen für den Einsatz in Phänotypisierungsexperimenten, bei denen viele verschiedene Genotypen, Bedingungen oder Patientenproben analysiert werden, unerschwinglich erscheinen, aber Multiplexing ermöglicht die Kombination von bis zu 96 Proben in einer einzigen Bibliothek6.

Die Profilierung der Genexpression über scRNA-seq war nicht die einzige auf Hochdurchsatz-Sequenzierung basierende Technik, die das derzeitige Verständnis dessen, wie molekulare Mechanismen das Zellschicksal bestimmen, revolutioniert. Während das Verständnis, welche Gentranskripte in einer Zelle vorhanden sind, die Identifizierung des Zelltyps ermöglicht, ist es ebenso wichtig zu verstehen, wie die genomische Organisation die Entwicklung und das Fortschreiten der Krankheit reguliert. Frühe Studien stützten sich auf den Nachweis einer DNase-vermittelten Spaltung von Sequenzen, die nicht an Histone gebunden sind, gefolgt von der Sequenzierung der resultierenden DNA-Fragmente, um Regionen mit offenem Chromatin zu identifizieren. Im Gegensatz dazu ermöglicht der Einzelzellassay für die transposonzugängliche Chromatinsequenzierung (scATAC-seq) den Forschern, DNA mit einem domestizierten Transposon zu untersuchen, um offenes Chromatin auf der Einzelnukleotidebene8 leicht zu profilieren. Dies hat eine ähnliche Skalierung wie scRNA-seq durchlaufen und jetzt können Forscher einzelne Zelltypen identifizieren und Phänotypen über Tausende von einzelnen Genomen hinwegprofilieren 8.

Die Paarung von scRNA-seq und scATAC-seq hat es Forschern ermöglicht, Tausende von Zellen zu profilieren, um Zellpopulationen, genomische Organisation und genregulatorische Netzwerke in Krankheitsmodellen und Entwicklungsprozessen zu bestimmen 9,10,11,12. Hier skizzieren die Autoren, wie man MULTI-seq zuerst nutzt, um die Phänotypisierung einer Vielzahl von Tiermodellen zu kondensieren, und paarweise scRNA-seq und scATAC-seq einsetzt, um ein besseres Verständnis der Chromatinlandschaft und der regulatorischen Netzwerke in diesen Tiermodellen zu erlangen.

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Protocol

Die Verwendung von Tieren für diese Studien erfolgte unter Verwendung von Protokollen, die vom Johns Hopkins Animal Care and Use Committee in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien genehmigt wurden, und wurde in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

1. MULTI-seq

  1. Medienvorbereitung
    1. Bereiten Sie den Ovomucoid-Inhibitor, 10 mg Ovomucoid-Inhibitor und 10 mg Albumin pro ml Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) für 30 min vor der Anwendung vor13 Minuten vor und gleichen Sie ihn aus. Equilibrat mit 95% O 2:5% CO2 in einem Inkubator.
      1. Bereiten Sie während dieses Inkubationsschritts13 eine Papain-Dissoziationslösung, 20 Einheiten / ml Papain und 0,005% DNase in EBSS vor.
        HINWEIS: Eine Durchstechflasche DNase-Lösung reicht für 5 Proben aus. Zusätzliche Durchstechflaschen müssen möglicherweise rekonstituiert werden, wenn MULTI-seq an mehr als 5 Proben durchgeführt wird.
    2. Bereiten Sie lipidmodifizierte Oligo-Barcode-Lösungen vor.
      1. Machen Sie eine einzigartige Barcode-Verdünnung für jede Probe, indem Sie 0,5 μL 100 μM Barcode-Stammlösung mit 4,5 μL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) kombinieren.
      2. Um eine Anker:Barcode-Lösung im Molverhältnis 1:1 herzustellen, kombinieren Sie 4,4 μL 10 μM Barcode-Verdünnung, 0,9 μL 50 μM Ankerlösung und 16,7 μL PBS und legen Sie sie auf Eis. Die Endkonzentration sowohl für die Barcode-Stränge als auch für die Ankerstränge sollte 2 μM betragen.
      3. Um eine Co-Ankerlösung herzustellen, kombinieren Sie 0,88 μL 50 μM Co-Ankerlösung und 21,12 μL PBS und legen Sie sie auf Eis. Die Endkonzentration des Co-Ankers sollte 2 μM betragen. Multiplizieren Sie die Volumina in diesem Schritt mit der 1,1-fachen Anzahl der Proben.
    3. Um 1% BSA in PBS herzustellen, lösen Sie 0,1 g Rinderserumalbumin (BSA) in 10 ml PBS auf und legen Sie es auf Eis.
    4. Um PBS mit RNase-Inhibitor herzustellen, kombinieren Sie 2,5 μL 40 U / μL RNase-Inhibitor mit 197,5 μL PBS und lagern Sie es auf Eis. Multiplizieren Sie die Volumina in diesem Schritt mit der 1,1-fachen Anzahl der Samples.
  2. Stichprobendissoziation
    1. Euthanasie von Tieren durch Zervixdislokation und/oder CO 2-Asphyxie gemäß den institutionellen IACUC-Anforderungen. Die Methode für die Euthanasie hängt von den institutionellen Anforderungen und dem verwendeten Modellorganismus ab.
    2. Sezieren Sie die Netzhaut von beiden Augen in kaltem PBS unter einem Dissektionsmikroskop und übertragen Sie sie mit einer Transferpipette auf ein steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
    3. Für jede Probe werden 500 μL der Papainlösung in ein 1,5 ml-Röhrchen übertragen.
    4. Proben in die Papainlösung geben und die Röhrchen sofort verschließen.
    5. Inkubieren Sie die Röhrchen mit den Proben bei 37 °C, 5% CO2 für 30 min. Kehren Sie die Durchstechflaschen 3 Mal alle 10 Minuten um. Die Stichproben sollten sich schrittweise mit jeder Runde von Inversionen dissoziieren.
    6. Die Durchstechflaschen werden auf Raumtemperatur zurückgeführt und jede Probe 3-4 Mal mit einer 1-ml-Pipette auf 300 μL geritutet.
    7. Lassen Sie alle Stücke von undissoziiertem Gewebe, die nach der Trituration übrig bleiben, sich absetzen.
    8. Entfernen Sie die trübe Zellsuspension, vermeiden Sie undissoziiertes Gewebe und legen Sie die Zellsuspension jeder Probe in ein neues steriles 15-ml-Röhrchen mit Schraubverschluss.
    9. Zentrifugieren Sie die Zellsuspensionen bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
    10. Bereiten Sie während des Zentrifugationsschritts die Zell-Resuspensionsmedien vor.
      1. Mischen Sie 857 μL EBSS (Durchstechflasche 1) mit 95 μL rekonstituierter Albumin-Ovomucoid-Inhibitorlösung in einem sterilen 1,5 ml verschraubten Röhrchen. Fügen Sie 48 μL DNase-Lösung hinzu, die aus 1.1.1 eingespart wurde. Multiplizieren Sie die Volumina in diesem Schritt mit der 1,1-fachen Anzahl der Samples.
    11. Verwerfen Sie den Überstand, achten Sie darauf, die Zellpellets zu behalten, und suspendieren Sie die Zellpellets sofort in 1 ml Zellaufsuspensionslösung, die in Schritt 1.2.10 hergestellt wurde.
    12. Bereiten Sie den diskontinuierlichen Dichtegradienten vor.
      1. Für jede Probe 1,6 ml Ovomucoid-Inhibitorlösung in ein neues steriles 15-ml-Röhrchen mit Schraubverschluss geben und die Zellsuspension vorsichtig darüber schichten. Die Grenzfläche zwischen den beiden Schichten des Gradienten sollte sichtbar sein, aber einige Mischungen haben keinen Einfluss auf die Ergebnisse.
    13. Zentrifugieren Sie die diskontinuierlichen Dichtegradienten bei 70 x g für 6 min bei Raumtemperatur. Die dissoziierten Zellen sollten am Boden der Röhrchen pelletieren, während Membranfragmente an der Grenzfläche verbleiben.
    14. Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 200 μL PBS hinzu, um die pelletierten Zellen zu waschen. Zentrifüchte bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
    15. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 180 μL PBS mit RNase-Hemmer. Führen Sie die Zellen durch ein 40 μm Zellsieb in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  3. Zellen-Barcode
    1. Fügen Sie jeder Probe 20 μL Anker-Barcode-Lösung hinzu und pipettieren Sie vorsichtig zum Mischen. Stellen Sie sicher, dass jede Probe eine einzigartige Anker-Barcode-Lösung erhält und 5 Minuten lang auf Eis inkubiert.
      1. Bereiten Sie die Materialien vor, die für die Erzeugung von Gelperlen in der Emulsion (GEM) und das Barcoding während dieser Inkubation erforderlichsind 14.
    2. 20 μL Co-Ankerlösung in jede Probe geben und vorsichtig zum Mischen pipettieren. 5 min auf Eis inkubieren.
    3. 1 ml eiskaltes 1% BSA in PBS zu jeder Probe geben und zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min bei 4 °C.
    4. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören, und fügen Sie 400 μL Eiskalt 1% BSA in PBS hinzu. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4 °C.
      1. Wiederholen Sie Schritt 1.3.4 für insgesamt 2 Wäschen. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie in 400 μL eiskalt 1% BSA in PBS.
    5. Bestimmen Sie die Zellkonzentration für jede Probe mit einem Hämozytometer.
      1. Bestimmen Sie die Gesamtzahl der zu ladenden Zellen für jede Probe. Typischerweise ist dies die Gesamtzahl der gewünschten Zellen geteilt durch die Anzahl der Proben. Wenn jedoch eine biologische Replikation für eine Bedingung verloren ging, kann ihr Anteil unter den anderen biologischen Replikaten aus dieser Bedingung aufgeteilt werden.
      2. Teilen Sie die Anzahl der für jede Probe gewünschten Zellen durch die in Schritt 3.5 berechnete Zellkonzentration dieser Probe, um das Volumen zu bestimmen, das zum Laden der gewünschten Anzahl von Zellen erforderlich ist.
    6. Die in Schritt 3.5.2 berechneten Volumina aus jeder Probe werden in einem neuen sterilen 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen kombiniert. Es ist ratsam, das aus jeder Probe entnommene Volumen zu verdoppeln, falls die GEM-Generierung fehlschlägt.
      1. Bestimmen Sie die "endgültige" Zellkonzentration der kombinierten Proben mit einem Hämozytometer.
  4. Gem-Generierung und Barcode
    1. Verwenden Sie kombinierte Proben, um GEMs14 zu generieren und Barcodes zu erstellen.
  5. Post-GEM-RT-Reinigung und cDNA-Amplifikation
    1. Bereiten Sie die Materialien für die Reverse Transkriptase-Reinigung nach GEM und die cDNA-Amplifikation gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den folgenden Modifikationenvor 14. Führen Sie nach der GEM-RT-Bereinigung nach Größenauswahl14 durch.
      1. Erhöhen Sie das Volumen von 80% Ethanol um 2 ml.
      2. Bereiten Sie cDNA Amplification Mix auf Eis14 vor. Geben Sie 1 μL 2,5 μM MULTI-seq Primer in die cDNA-Amplifikationsmischung. Vortex für 5 s und Zentrifuge für 5 s in einer Tisch-Minizentrifuge.
    2. Führen Sie eine cDNA-Amplifikationdurch 14. Die cDNA kann zu diesem Zeitpunkt bis zu 72 h bei 4 °C gelagert werden.
    3. Führen Sie eine cDNA-Bereinigung nach Größenauswahl14 durch. Das endogene Transkript cDNA kann zu diesem Zeitpunkt bei 4 °C bis zu 72 h oder bei -20 °C bis zu 4 Wochen gelagert werden.
      1. Verwerfen Sie nicht den Überstand aus der ersten Runde der Größenauswahl . Dieser Bruchteil enthält die Beispiel-Barcodes. Überführen Sie den Überstand in ein neues steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
      2. Lagern Sie den Überstand auf Eis.
    4. Vortex zur Resuspendierung des paramagnetischen Perlen-basierten Größenselektionsreagenzes und Zugabe von 260 μL paramagnetischem Perlen-basiertem Größenselektionsreagenz (endgültig 3,2x) und 180 μL 100% Isopropanol (1,8x) zum Überstand. Die Mischung 10 Mal pipettieren und bei Raumtemperatur 5 min inkubieren.
    5. Legen Sie das Rohr auf ein magnetisches Rack und warten Sie, bis sich die Lösung gelöst hat. Entfernen Sie dann den Überstand und verwerfen Sie ihn.
    6. 500 μL 80% Ethanol in die Perlen geben und 30 s stehen lassen. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand.
      1. Wiederholen Sie dies für insgesamt 2 Wäschen.
    7. Zentrieren Sie die Perlen kurz und kehren Sie zum Magnetgestell zurück. Starten Sie einen Timer für 2 min.
    8. Entfernen Sie das restliche Ethanol mit einer P10-Pipette und trocknen Sie die Perlen auf dem Magnetgestell für den Rest der 2 Minuten an der Luft. Überschreiten Sie nicht 2 min.
    9. Entfernen Sie die Perlen aus dem magnetischen Rack und suspendieren Sie sie im 100-μL-Elutionspuffer (EB). Pipette gründlich zum Aufhängen.
    10. Bei Raumtemperatur 2 min inkubieren.
    11. Kehren Sie zum magnetischen Rack zurück und warten Sie, bis die Lösung geklärt ist.
    12. Überstand in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben.
    13. Wiederholen Sie die Schritte 1.5.4 bis 1.5.12. Halbieren Sie das Volumen des in Schritt 1.5.9 verwendeten Puffer-EB.
    14. Bestimmen Sie die Barcode-DNA-Konzentration und -Größenverteilung mit einem dsDNA-Hochempfindlichkeits-Assay-Kit sowie einem Fluorometer und Fragmentanalysator15,16. Der Barcode cDNA kann zu diesem Zeitpunkt bei 4 °C bis zu 72 h oder bei -20 °C bis zu 4 Wochen gelagert werden.
  6. Aufbau der Barcode-Bibliothek
    1. Bereiten Sie 1 ml 80% Ethanol vor.
    2. Bereiten Sie den Barcode-Bibliotheks-PCR-Mastermix in einem sterilen PCR-Streifenröhrchen vor: Kombinieren Sie 26,25 μL 2x Hotstart-PCR-Ready-Mix, 2,5 μL 10 μM Universal i5-Primer, 2,5 μL 10 μM RPI-Primer, 3,5 ng Barcode-cDNA (Volumen bestimmt durch Konzentration aus Schritt 5.14) und genügend nukleasefreies Wasser, um das endgültige Volumen auf 50 μL zu bringen.
      1. Verwenden Sie einen eindeutigen RPI-Primer für jede Barcode-Bibliothek, wenn mehrere MULTI-seq-Bibliotheken miteinander sequenziert werden.
    3. Unterziehen Sie den Barcode-Bibliotheksmaster-Mix einer Bibliotheksvorbereitungs-PCR: 95 °C für 5 min; 10 Zyklen von 98 °C für 15 s, 60 °C für 30 s, 72 °C für 30 s; 72 °C für 1 min; und dann bei 4 °C halten.
    4. Vortex zur Resuspendierung des paramagnetischen Perlen-basierten Größenselektionsreagenz.
    5. Entfernen Sie das PCR-Produkt aus dem Thermocycler und fügen Sie 80 μL (1,6x) paramagnetisches Perlen-basiertes Größenauswahlreagenz hinzu. Pipette gründlich.
    6. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Stellen Sie den Magnetabscheider in der hohen Position auf und warten Sie, bis sich die Lösung gelöst hat.
    7. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand.
    8. Geben Sie 200 μL 80% Ethanol zu den Perlen und lassen Sie es für 30 s stehen. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand.
      1. Wiederholen Sie Schritt 1.6.8 für insgesamt 2 Wäschen.
    9. Zentrieren Sie das Rohr kurz und legen Sie es in der niedrigen Position auf den Magnetabscheider. Starten Sie einen Timer für 2 min.
    10. Entfernen Sie das restliche Ethanol mit einer P20-Pipette und trocknen Sie die Perlen auf dem Magnetabscheider für den Rest der 2 Minuten an der Luft. Überschreiten Sie nicht 2 min.
    11. Entfernen Sie das Rohr aus dem Magnetabscheider und suspendieren Sie die Perlen in 25 μL Puffer EB. Pipetten gründlich mischen, um die Perlen wieder aufzuhängen.
    12. Inkubiere für 2 min bei Raumtemperatur.
    13. Kehren Sie in der niedrigen Position zum Magnetabscheider zurück und warten Sie, bis sich die Lösung gelöst hat. Überstand in ein neues PCR-Streifenröhrchen überführen.
    14. Quantifizieren Sie die Konzentration der Ausdrucksbibliothek und der Barcode-Bibliothek sowie die Verteilung der Fragmentgröße mit dem adsDNA-Hochempfindlichkeits-Assay-Kit sowie dem Fluorometer und dem Fragmentanalysator.
  7. 3' Konstruktion der Genexpressionsbibliothek
    1. Führen Sie eine 3'-Genexpressionsbibliothekskonstruktion gemäß den Anweisungen des Herstellersdurch 14.
  8. Sequenzierung
    1. Reichen Sie zusätzlich zu der in Schritt 7 amplifizierten endogenen cDNA-Bibliothek die in Schritt 6 amplifizierte Barcode-Bibliothek ein. Der Einfachheit halber reichen Sie diese Bibliotheken separat ein oder fügen Sie als kostengünstige Maßnahme ein Aliquot des Proben-Barcode-Materials mit der endogenen cDNA-Bibliothek hinzu. Streben Sie zwischen 20.000-50.000 cDNA und 3.000-5.000 Barcode-Lesevorgängen pro Zelle an.
    2. Konvertieren Sie die resultierenden sequenzierenden bcl-Dateien in fastq-Dateien von cellranger mkfastq und zählen Sie Matrizen, die von cellranger count daraus generiert wurden.
    3. Deconvolute-Proben nach der Cellranger-Analyse mit dem deMULTIplex r-Paket, das im MULTI-seq GitHub-Repository (https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq) verfügbar ist.

2. Gepaartes scRNA-seq und scATAC-seq

  1. Flash Freeze Tissue für scATAC-seq und Methanolfixierung von Netzhautzellen für scRNA-seq
    1. Medienvorbereitung
      1. Um die Lösungen für die Netzhautdissoziation vorzubereiten, wiederholen Sie die Schritte 1.1.1 und 1.1.4.
      2. Bereiten Sie ein Ethanol-Trockeneisbad in einem kleinen Eiskübel vor.
      3. Bereiten Sie 15 ml 70% Ethanol vor, indem Sie 10,5 ml Ethanol zu 4,5 ml nukleasefreiem Wasser hinzufügen.
      4. Fügen Sie dem Eiskübel genügend Trockeneis hinzu (vorzugsweise in Pelletform), dass 15 ml Flüssigkeit aufsteigen, um das Eis zu bedecken. Fügen Sie die 15 ml Ethanol hinzu.
      5. PBS auf Eis legen und 1 ml Aliquots von 100% Methanol in einen praktischen -20 °C Gefrierschrank.
    2. Probenvorbereitung
      1. Befolgen Sie die Schritte 1.2.1 und 1.2.2, um Netzhäute zu isolieren. Diesmal jedoch legen Sie jede Netzhaut in ein separates Mikrozentrifugenröhrchen.
      2. Für die Proben, die für scATAC-seq bestimmt sind, entfernen Sie alle Flüssigkeiten mit einer P200-Pipette aus dem Mikrozentrifugenröhrchen und verschließen Sie das Röhrchen sofort und legen Sie es in ein Ethanol-Trockeneisbad, um die Probe einzufrieren.
      3. Für die Proben, die für scRNA-seq bestimmt sind, um die Zellen zu dissoziieren, wiederholen Sie die Schritte 1.2.3 bis 1.2.15 auf der sezierten Netzhaut.
      4. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 3 min bei Raumtemperatur.
      5. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.
      6. Fügen Sie 1 ml gekühltes PBS hinzu und pipettieren Sie vorsichtig 10 Mal oder bis die Zellen vollständig suspendiert sind.
      7. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4 °C.
        1. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.2.5 bis 2.1.2.7 für insgesamt 2 Wäschen.
      8. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.
      9. Fügen Sie 100 μL gekühltes PBS hinzu und mischen Sie vorsichtig 10x oder bis die Zellen vollständig suspendiert sind.
      10. Beginnen Sie mit dem Wirbeln des Rohrs mit der niedrigsten Geschwindigkeitseinstellung. Fügen Sie 900 μL gekühltes Methanol (-20 ° C) tropfenweise hinzu, während Sie das Rohr weiterhin vorsichtig umwirbeln, um ein Verklumpen der Zellen zu verhindern.
      11. Inkubiere die Zellen auf Eis für 15 min.
      12. Bestimmen Sie die Konzentration der fixierten Zellen mit einem Hämozytometer.
      13. Beurteilen Sie die Wirksamkeit des Fixationsschritts mit Trypanblau. Ein hoher Anteil lebensfähiger Zellen deutet darauf hin, dass mehr Fixationszeit benötigt wird.
      14. Lagern Sie das gefrorene Gewebe und die fixierten Zellen bei -80 °C.
  2. Nuclei Isolation aus schockgefrorenem Gewebe für scATAC-seq
    1. Medienvorbereitung
      1. Bereiten Sie den Lyseverdünnungspuffer vor, indem Sie 9,77 ml nukleasefreies Wasser, 100 μL 1 M Tris-HCl (pH 7,4), 100 μL 1 M NaCl, 30 μL 1 M MgCl2 und 0,1 g BSA kombinieren.
      2. Bereiten Sie den Lyseverdünnungspuffer im Voraus vor, z. B. am Vortag, und lagern Sie ihn bei 4 °C. Am Tag des Protokolls auf Eis legen.
      3. Ausgeglichener 20-facher Kernpuffer vom Hersteller des scATAC-Kits von -20 °C auf Raumtemperatur. Wirbel und Zentrifuge kurz.
      4. Bereiten Sie den 1x-Lysepuffer vor, indem Sie 5% ige Digitoninlösung in einem 65 ° C warmen Wasserbad inkubieren, bis sich der Niederschlag aufgelöst hat. Kombinieren Sie dann 2 ml Lyseverdünnungspuffer, 20 μL 10% Tween-20, 20 μL Nonidet P40 Substitute (kann alternativ als IGEPAL bezeichnet werden) und 4 μL Digitonin.
      5. Lagern Sie den 1x Lysepuffer auf Eis.
      6. Um den 0,1-fachen Lysepuffer vorzubereiten, kombinieren Sie 1,8 ml Lyseverdünnungspuffer mit 200 μL des 1x-Lysepuffers und lagern Sie ihn auf Eis.
      7. Um den Waschpuffer vorzubereiten, kombinieren Sie 2 ml Lyseverdünnungspuffer und 20 μL 10% Tween-20 und lagern Sie sie auf Eis.
      8. Um den verdünnten Kernpuffer herzustellen, kombinieren Sie 950 μL nukleasefreies Wasser mit 50 μL Kernpuffer (20x) und lagern Sie es auf Eis.
    2. Nuklei-Isolierung
      1. Tauen Sie die Probe nicht vor der Lyse auf. 500 μL gekühlten 0,1-fachen Lysepuffer in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das die gefrorene Probe enthält, geben. Sofort 15x mit einem Pelletstößel homogenisieren.
      2. 5 min auf Eis inkubieren. Bereiten Sie die für die scATAC-Transposition erforderlichen Materialien während dieses Inkubationsschritts17 vor.
      3. Pipetten 10x mit einer 1 ml Pipette mischen und 10 min auf Eis inkubieren. Vollständige Vorbereitung der für die scATAC-Transposition erforderlichen Materialien während dieses Inkubationsschritts, falls noch nicht abgeschlossen. Es ist unnötig, mehr verdünnten Kernpuffer vorzubereiten.
      4. Geben Sie 500 μL gekühlten Waschpuffer zu den lysierten Zellen. Pipettenmischung 5x.
      5. Führen Sie die Suspension durch ein 70 μm Zellsieb in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Filtern Sie ~ 300 μL auf einmal mit einem neuen 70 μm Zellsieb.
      6. Den gesammelten Durchfluss durch ein 40 μm Zellsieb in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben und auf Eis lagern.
      7. Bestimmen Sie die Kernkonzentration mit einem Hämozytometer. Berechnen Sie anhand der Kernkonzentration und des Gesamtvolumens der Zellsuspension die Gesamtzahl der dissoziierten Kerne.
      8. Bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen, ohne das Kernpellet zu stören.
      9. Um den Kernbestand basierend auf der in Schritt 2.2.2.7. ermittelten Gesamtkernzahl zu erzeugen, resuspendieren Sie die Kerne in genügend verdünntem Kernpuffer, um eine gewünschte Kernkonzentration zu erreichen.
        HINWEIS: Die gewünschte Kernkonzentration basiert auf der angestrebten Kernrückgewinnung für das scATAC-seq-Experiment und wird anhand der Nuclei Concentration Guidelines im Protokoll17 des Herstellers bestimmt. Werden beispielsweise letztlich 10.000 Kerne gewünscht, liegt die gewünschte Kernkonzentration für den Kernbestand zwischen 3.080 und 7.700 Kernen/μL. Es könnte am besten sein, die Mitte des Bereichs in der Konzentration anzustreben.
      10. Bestimmen Sie die Kernkonzentration mit einem Hämozytometer.
      11. Fahren Sie sofort mit der scATAC-Transposition unter Verwendung des vorbereitetenKernbestands 17 fort.
  3. Rehydratation von Methanol Fixed Cells zur Verwendung in scRNA-Seq
    1. Medienaufbereitung
      1. Um den Wasch-/Verdünnungspuffer vorzubereiten, lösen Sie 0,01 g BSA in 1 ml PBS auf. Dann fügen Sie 12,5 μL 40 U / μL RNase-Inhibitor hinzu und mischen Sie vorsichtig. Auf Eis lagern.
    2. Zellrehydratation
      1. Zentrifugenmethanol-Festzellen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen bei 3000 x g für 10 min bei 4 °C. Entfernen Sie dann den Überstand.
      2. Fügen Sie dem Mikrozentrifugenröhrchen einen gekühlten 200-μL-Wasch-/Verdünnungspuffer hinzu. Bei 300 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen. Wiederholen Sie dies für insgesamt 2 Wäschen.
        HINWEIS: Bereiten Sie die Materialien vor, die für die Gem-Generierung und das Barcoding in den beiden vorherigen Schrittenerforderlich sind 14.
      3. Um den Zellbestand basierend auf der in 2.1.2.12. berechneten Gesamtzellzahl vorzubereiten, suspendieren Sie die Zellen in genügend Wasch-/Verdünnungspuffer, um die gewünschte Zellkonzentration zu erreichen. Bevorzugte Zellkonzentrationen liegen zwischen 700 und 1200 Zellen/μL.
      4. Bestimmen Sie die Zellkonzentration des Zellbestandes mit einem Hämozytometer.
      5. Fahren Sie sofort mit der Gem-Generierung und dem Barcoding unter Verwendung des Zellmaterials14 fort.
    3. Sequenzierung
      1. Wenn Sie eine Zeitverlaufsanalyse durchführen (wie in der Entwicklung oder Krankheit), sequenzieren Sie mehrere Proben in einem gemultiplexten Lauf (d. h. mehrere Bibliotheken auf einer einzigen Durchflusszelle), um die technischen Variationen zu reduzieren.

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Representative Results

Dieser Workflow legt eine Strategie für die Untersuchung von Entwicklungsphänotypen und regulatorischen Prozessen unter Verwendung der Einzelzellsequenzierung fest. MULTI-seq-Probenmultiplexing ermöglicht einen ersten kostengünstigen Phänotypisierungsassay, während die gepaarte Entnahme und Fixierung von Proben für scRNA-seq und scATAC-seq eine eingehendere Untersuchung ermöglicht (Abbildung 1).

MULTI-seq barcoding ermöglicht die kombinierte Sequenzierung mehrerer Proben und deren anschließende rechnerische Entfaltung. Die Ursprungsprobe kann für jede Zelle anhand ihres Barcode-Ausdrucks bestimmt werden (Abbildung 2A). Diese kombinierten Proben können als einzelner Datensatz zum Zwecke der Zellclusterbildung und Zelltypidentifizierung analysiert werden (Abbildung 2B). Da jede Zelle vor der GEM-Generierung barcodiert wird, haben Zelldubletten eine hohe Wahrscheinlichkeit, Expression für mehrere MULTI-seq-Barcodes zu zeigen, und eine Mehrheit der Dubletten kann daher vor dem Clustering und der Zelltypidentifizierung identifiziert und entfernt werden (Abbildung 2C). Die Erhöhung der Anzahl der Zellen, die im GEM-Erzeugungsschritt verwendet werden, erhöht den Anteil der gefundenen Dubletten. scATAC-seq kann verwendet werden, um einen Datensatz mit Zelltypen zu generieren, die mit denen von scRNA-seq übereinstimmen (Abbildung 2D). Die Paarung von scRNA-seq-Genexpression und scATAC-seq-DNA-Zugänglichkeitsinformationen ermöglicht die Rekonstruktion von genregulatorischen Netzwerken.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Verwendung von MULTI-Seq in der Erstanalyse, gefolgt von einer separaten scRNA-Seq- und scATAC-Seq-Analyse zur eingehenden Charakterisierung von Phänotypen, Behandlungen oder Krankheitszuständen von Interesse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: UMAP-dimensionale Reduktionsdarstellungen von MULTI-seq-Daten für eine allelische Reihe von P0 Sstr2-Knockout-Mäusen , die (a) die Dekonvolution des Genotyps für jede Zelle im Datensatz und (b) die Identifizierung von Zelltypen im Datensatz demonstrieren. Das Überladen von Zellen während der GEM-Generierung und des Barcoding-Schritts führt zu einer Zunahme der Zelldubletten wie in (c), die die Daten von (a) und (b) vor der Entfernung und dem Reclustering von Dubletten anzeigen. In (d) wurden scATAC-Seq-Daten von GFP-positiven Zellen, die bei E16 aus retinalen Explantaten erhalten wurden, mit einem GFP-exprimierenden Kontrollplasmid bei E14 elektropoliert. Zelltypen werden basierend auf der Zugänglichkeit von zelltypspezifischen Genen annotiert. Diese Zahl wurde von Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling modifiziert. bioRxiv 2020.09.26.314104 (2020) doi:10.1101/2020.09.26.31410418 und originale, unveröffentlichte Daten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Die Leistungsfähigkeit von MULTI-seq ergibt sich aus der nahtlosen Integration von Daten aus mehreren experimentellen Bedingungen oder Modellen und dem enormen Nutzen in Bezug auf Kosten und Begrenzung der Chargeneffekte. Die Verwendung von MULTI-seq bietet eine beispiellose Phänotypisierungstiefe im Labor. Nicht-genetische Multiplexing-Methoden wie Zell-Hashing oder Nuclei-Hashing öffneten die Tür zu gemultiplexten Proben durch die Verwendung von barcodierten Antikörpern 7,19,20. Dies hängt jedoch von der Verfügbarkeit hochaffiner Antikörper ab, die Oberflächenproteine erkennen, die auf Zellen oder ihren Kernen exprimiert werden, was nicht möglich sein wird, wenn diese Antikörper nicht verfügbar sind oder die Zellen keine geeigneten Zelloberflächen- oder Kernantigeneexprimieren 7. Da MULTI-seq lipidmodifizierte Oligo-Barcodes verwendet, um stabil in die Zellen oder ihre Kerne einzuarbeiten, können Forscher transkriptomische Daten von bis zu 96 frischen oder festen Proben auf billigere und breiter anwendbare Weise sammeln6.

Im Anschluss an die anfängliche MULTI-Seq-Phänotypisierung mit gepaartem scRNA-Seq und scATAC-Seq wird vorgeschlagen und vorgestellt, um ein Verständnis der genomischen Organisation zu erlangen, die mit den transkriptomischen Datenübereinstimmt 1. Dies gibt nicht nur eine Vorstellung von den Heterochromatin- und Euchromatinregionen, sondern auch ein wertvolles Verständnis der Transkriptionsfaktornetzwerke, die die Genexpression antreiben. Ein multi-omic-Ansatz kann verwendet werden, um die dynamischen Chromatinveränderungen aufzudecken, die an Schlüsselpunkten von Zellschicksalsentscheidungen stattfinden, und zelluläre Trajektorien in Entwicklung und Krankheit zu bestimmen 1,21,22. Dies kann erreicht werden, indem die Daten bioinformatisch Pseudotime, cis-regulatorischen Wechselwirkungen und Footprinting-Analysen 5,23,24,25 unterzogen werden. Das Fixieren der Proben und das Sequenzieren mehrerer Proben in einem gemultiplexten Lauf reduziert die Quellen des Batch-Effekts und ermöglicht den Vergleich zwischen Stichproben, z. B. durch ein Zeitkursexperiment. Die Anzahl der benötigten Gewebeproben hängt vom Umfang des Experiments ab. Bei der Untersuchung der Phänotypen, die mit embryonalen Zeitpunkten assoziiert sind, sind einzelne Netzhäute oft ausreichend und können Hunderttausende von Zellen liefern. Eine einzelne Netzhaut liefert möglicherweise nicht genügend Zellen in komplexeren experimentellen Schemata: Ex-vivo-Elektroporationen von Netzhautexplantaten, Untersuchung seltener Zellpopulationen oder genetische Modelle mit unzureichender CRE-Aktivierung. Während eine einzelne Netzhaut einige hundert Zellen liefern kann, erfassen diese nicht die volle Gewebekomplexität. Für solche Experimente ist eine Optimierung erforderlich, die auf den Bedürfnissen eines Forschers basiert. Mit diesen Techniken kann man einen Einblick gewinnen, wie die in MULTI-seq analysierten Gene während dynamischer Prozesse wie Entwicklung und Krankheit reguliert werden.

Die Regulation von genregulatorischen Netzwerken steht im Mittelpunkt des Verständnisses zellulärer Prozesse und wie sie zur Entwicklung und Krankheit beitragen 1,26,27. Der hier vorgestellte Workflow kann genutzt werden, um diese genregulatorischen Netzwerke in bestimmten Zelltypen zu identifizieren. Dieses Protokoll wurde jedoch für die Verwendung mit Netzhautgewebe der Maus optimiert. Die Optimierung verschiedener Schritte, wie Lyse- oder Dissoziationszeit, Zentrifugationsgeschwindigkeiten / -zeiten und Anzahl der Filtrationsschritte, kann erforderlich sein, um die Anzahl der Zellen oder Kerne zu maximieren und die Zelltrümmer in Zellsuspensionen von anderen Gewebetypen, Ex-vivo-Proben oder Spezies zu minimieren, unabhängig davon, ob die Proben frisch, gefroren oder in Methanol fixiert sind. Die Methanol-Fixierungszeit muss möglicherweise erhöht werden, wenn Proben hohe Konzentrationen lebensfähiger Zellen mit trypanblauer Färbung aufweisen. Die MULTI-seq-Technik führt viele zusätzliche Waschschritte gegenüber herkömmlichem scRNA-seq ein. Um die versehentliche Entsorgung wertvoller Zellen oder DNA zu vermeiden, ist es ratsam, die Zentrifugationsgeschwindigkeiten zu optimieren und Überstände beizubehalten, die normalerweise bei der Zellbarcodierung, der Bereinigung nach GEM RT und der Konstruktion von Barcode-Bibliotheken auf Eis verworfen würden, bis dieser Schritt als erfolgreich verifiziert wurde. Eine Einschränkung von MULTI-seq ist die begrenzte Anzahl von Zellen und damit Proben, die aus einer einzigen Vertiefung im GEM-Generierungsschritt sequenziert werden können. Es wird empfohlen, während dieses Schritts nicht zu versuchen, Zellen übermäßig zu überlasten, um eine erhebliche Zunahme der Dublettenzellerfassung zu vermeiden. Vermeiden Sie es, ein GEM mit mehr als 20.000 Zellen gut zu laden. Vielmehr können mehrere Vertiefungen aus einer einzigen kombinierten Suspension hergestellt und während der Sequenzierung gemultiplext werden. Dies erfordert die Vorbereitung eines ausreichend großen Zellsuspensionsvolumens für die GEM-Generierung und das Hinzufügen von Replikaten zu den Schritten 5, 6 und 7 und erhöht die Kosten für die Sequenzierung, da mehr Gesamtlesevorgänge für mehr Zellen erforderlich sind. Bei richtiger Optimierung ermöglicht dieser Workflow eine kosten- und zeiteffiziente Identifizierung von zelltypspezifischen Phänotypen und genregulatorischen Netzwerken.

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Disclosures

Nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Wir danken Linda Orzolek von der Johns Hopkins Transcriptomics and Deep Sequencing Core für die Hilfe bei der Sequenzierung der produzierten Bibliotheken und Lizhi Jiang für die Durchführung der Ex-vivo-Netzhautexplantate .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips
10% Tween 20 Bio-Rad 1662404
100 µM Barcode Solution Request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
100% Ethanol Millipore Sigma E7023-500ML
100% Methanol Millipore Sigma 322415-100ML
10x Chip Holder 10x Genomics 1000195
10x Chromium controller & Accessory Kit 10x Genomics PN-120263
15mL Centrifuge Tube Quality Biological P886-229411
40 µm FlowMi Cell Strainer Bel-Art H13680-0040
50 µM Anchor Solution Sigma or request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
50 µM Co-Anchor Solution Sigma or request from Gartner lab https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested
=true
5200 Fragment Analyzer system Agilent M5310AA
70 um FlowMi cell strainer Bel-Art H13680-0070
Allegra X-12R Centrifuge VWR BK392302
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647
Chromium Next GEM Chip G 10x Genomics PN-1000120
Chromium Next GEM Chip H 10x Genomics PN-1000161
Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 10x Genomics PN-1000175
Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 10x Genomics PN-1000121
Digitonin Fisher Scientific BN2006
Dissection microscope Leica
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431021
Dry Ice
EVA Foam Ice Pan Tequipment 04393-54
FA 12-Capillary Array Short, 33 cm Agilent A2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp Water Bath Fisher Scientific 15-460-20Q
Forma CO2 Water Jacketed Incubator ThermoFisher Scientific 3110
Glycerol 50% Aqueous solution Ricca Chemical Company 3290-32
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber Fisher Scientific 02-671-51B
Illumina NextSeq or NovaSeq Illumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMix HiFi 7958927001
Low TE Buffer Quality Biological 351-324-721
Magnesium Chloride Solution 1 M Sigma-Aldrich M1028
Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes Millipore Sigma 20-400
Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes 10x Genomics NC1469069
MULTI-seq Primer Sigma or IDT See sequence list
MyFuge Mini Centrifuge Benchmark Scientific C1008
Nonidet P40 Substitute Sigma-Aldrich 74385
Nuclease-free water Fisher Scientific AM9937
P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes Eppendorf
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150
PBS pH 7.4 (1X) Fisher Scientific 10010-023
Qiagen Buffer EB Qiagen 19086
Refridgerated Centrifuge 5424 R Eppendorf 2231000655
RNase-free Disposable Pellet Pestles Fisher Scientific 12-141-368
RNasin Plus RNase Inhibitor Promega N2615
RPI primer Sigma or IDT See sequence list
Single Index Kit N, Set A 10x Genomics PN-1000212
Single Index Kit T Set A 10x Genomics PN-1000213
Sodium Chloride Solution 5 M Sigma-Aldrich 59222C
SPRIselect Reagent Kit Beckman Coulter B23318
Standard Disposable Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
TempAssure PCR 8-tube strip USA Scientific 1402-4700
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 Sigma-Aldrich T2194
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) Corning 25-900-CI
Universal I5 primer Sigma or IDT See sequence list
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems 4375786
Vortex Mixer VWR 10153-838

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neuroscience Ausgabe 169 Entwicklung Krankheit scRNA-Seq scATAC-Seq MULTI-Seq Multiplex Chromatin
Multiplexe Analyse der retinalen Genexpression und der Chromatinzugänglichkeit mittels scRNA-seq und scATAC-seq
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Weir, K., Leavey, P., Santiago, C.,… More

Weir, K., Leavey, P., Santiago, C., Blackshaw, S. Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq. J. Vis. Exp. (169), e62239, doi:10.3791/62239 (2021).

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