Summary
我们描述了通过尾静脉注射内源性HER2扩增的炎性乳腺癌细胞系产生的乳腺癌脑转移的异种移植小鼠模型。
Abstract
转移到大脑是许多类型癌症的常见和破坏性表现。仅在美国，每年就有大约20万名患者被诊断出患有脑转移瘤。在改善原发性乳腺癌和系统性恶性肿瘤患者的生存结局方面取得了重大进展;然而，临床脑转移瘤患者的悲惨预后突出了开发针对这种致命疾病的新型治疗药物和策略的迫切需要。缺乏合适的实验模型一直是阻碍我们对脑转移生物学和治疗的理解的主要障碍之一。在本文中，我们描述了一种异种移植小鼠模型，该模型是通过尾静脉注射源自炎症性乳腺癌（IBC）的内源性HER2扩增细胞系产生的脑转移，这是一种罕见且侵袭性的乳腺癌形式。用萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白标记细胞以监测脑转移，并通过生物发光成像、荧光立体显微镜和组织学评估量化转移负荷。小鼠稳健且一致地发展脑转移，允许研究转移过程中的关键介质并开发新治疗策略的临床前测试。
Introduction
脑转移是系统性恶性肿瘤的常见和致命并发症。大多数脑转移瘤起源于肺、乳腺或皮肤的原发性肿瘤，合计占病例的67-80%1,2。脑转移发生率的估计在 100,000 至 240,000 例之间，这些数字可能被低估了，因为死于转移性癌症的患者很少进行尸检3.与无脑转移的患者相比，脑转移患者的预后更差，总生存期更低4.目前脑转移瘤的治疗方案主要是姑息性的，无法改善大多数患者的生存结果5。因此，脑转移仍然是一个挑战，并且仍然迫切需要更好地了解脑转移进展的机制，以开发更有效的治疗方法。
实验模型的使用为乳腺癌转移到大脑的特定机制提供了重要的见解，并允许评估各种治疗方法的疗效6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 .然而，很少有模型能够准确和完整地概括脑转移发展的复杂性。通过不同的给药途径将癌细胞接种到小鼠体内，已经产生了几种实验性体内模型，包括原位、尾静脉、心内、颈内动脉和脑内注射。每种技术都有优点和缺点，详见其他专题3。然而，这些小鼠模型都不能完全复制脑转移的临床进展。
脑转移在炎症性乳腺癌（IBC）患者中特别常见，IBC是原发性乳腺癌的一种罕见但侵袭性的变体。IBC占乳腺癌病例的1%至4%，但它占美国乳腺癌相关死亡人数的10%不成比例17,18。已知 IBC 会迅速转移;事实上，三分之一的IBC患者在诊断时有远处转移19,20。特异性脑转移，IBC 患者的脑转移发生率高于非IBC 21 患者。最近，我们证明了MDA-IBC3细胞系来源于ER-/PR-/HER2 + IBC患者的恶性胸腔积液，概括了小鼠异种移植物中的IBC特征，当通过尾静脉注射时，小鼠发生脑转移而不是肺转移的倾向增强，使该细胞系成为研究脑转移发展的良好模型16。
在这里，我们描述了通过MDA-IBC3细胞的尾静脉注射产生脑转移并通过立体荧光显微镜和荧光素酶成像评估转移负荷的程序。该方法已被用于发现乳腺癌转移到大脑的关键介质，并测试治疗干预的疗效16,22,23。这种技术的缺点是它不能概括大脑转移过程中的所有步骤。然而，它的主要优点包括稳健性和可重复性，涉及内渗的相关转移生物学，穿越肺部和外渗进入大脑，以及其在技术方面的相对简单性。
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Protocol
此处描述的方法已获得MD安德森癌症中心的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并符合美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南。包括所有步骤在内的原理图工作流程如图 1所示。
1. 细胞制备
注意：在Woodward博士的实验室24中产生的MDA-IBC3（ER-/ PR-/ HER2 +）细胞系用荧光素酶绿色荧光蛋白（Luc-GFP）质粒稳定转导。
- 在补充有 10% 胎牛血清 （FBS）、1 μg/mL 氢化可的松、5 μg/mL 胰岛素和 1% 抗生素-抗丝分裂药的 Ham's F-12 培养基中培养转导细胞。
- 将MDA-IBC3-Luc-GFP细胞在37°C和5%CO2 下在T-75烧瓶中直至汇合。在细胞足够融合以传代之前，每3天更换一次培养基。
- 通过去除培养基，用 10 mL 的 1x Dulbecco（即无钙和无镁）磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 洗涤每个烧瓶，并加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸 （EDTA） 来收获细胞。在37°C孵育3-5分钟，直到细胞分离。
- 向烧瓶中加入 5 mL 完整培养基以收集细胞并将整个内容物转移到 15 mL 离心管中（根据所需细胞总数优化至 50 mL 离心管）。以290 x g 离心5分钟以沉淀细胞。
注意：完整的培养基是补充有 10% 胎牛血清 （FBS）、1 μg/mL 氢化可的松、5 μg/mL 胰岛素和 1% 抗生素-抗有丝分裂药的 Ham's F-12 培养基。 - 弃去上清液。然后用 10 mL 的 1x DPBS 洗涤细胞。以290× g 离心5分钟以沉淀细胞并小心地弃去上清液。用 1 mL 新鲜的 1x DPBS 重悬细胞，并通过上下移液充分混合。
- 要制作单细胞悬液，请通过40μm无菌细胞过滤器过滤细胞。
- 使用自动细胞计数器计算细胞密度。
注意：为减少计数误差，请创建不同的细胞稀释液并分别计数，并计算平均值以确定细胞浓度（细胞数/mL）。- 收集 2 μL 细胞悬液 + 8 μL 1x DPBS 制成 1：5 稀释样品。
- 收集 1 μL 细胞悬液 + 9 μL 1x DPBS 制成 1：10 稀释样品。
- 加入 10 μL 0.4% 台盼蓝染色剂。通过上下移液几次将样品混合物充分混合。
- 将 10 μL 样品轻轻移液到计数室载玻片的半月形样品加载区域中。确保里面没有气泡;等待30秒，让细胞在计数前沉淀在腔室中。
- 用 1x DPBS 稀释细胞至密度为 5 x 105 或 1 x 106 个细胞/100 μL。 将细胞悬液转移到 1.7 mL 微量离心管中进行尾静脉注射。将细胞放在冰上直到注射以保持活力。
2. 尾静脉注射
- 使用4至6周龄的雌性无胸腺SCID/米色小鼠。
- 准备 30 G 注射器以吸取 100 μL 细胞悬液。清除所有气泡。
- 将鼠标放在啮齿动物约束器（直径约1英寸）中，以促进尾静脉注射并防止在注射过程中因运动而受伤。
- 使用酒精化妆棉（由70%乙醇制成）轻轻擦拭小鼠尾巴3-4次，并保持5-10秒，以使尾静脉更清晰可见。
- 将注射器以15-30°的角度插入鼠标尾部。慢慢将细胞悬液推入尾静脉。
- 轻轻取出注射器，用化妆棉夹住尾巴几秒钟，以帮助止血。
- 将小鼠放回笼子并在注射后2-4小时检查它们，以确保没有发生不良反应。
3.脑转移负荷的评估
- 准备稀释的D-荧光素溶液。
注意：储备浓度为 47.6 mM （15.15 mg/mL），使用的浓度为 1.515 mg/mL。- 将 5 mL 的 1x DPBS 加入 D-荧光素瓶中。
- 将 2.5 mL 溶液放入两个 50 mL 锥形管中。
- 再次向 D-荧光素瓶中再加入 5 mL 的 1x DPBS 以冲洗。将 2.5 mL 放入每个 50 mL 锥形管中。
- 将另外 5 mL 的 1x DPBS 放入瓶中并再次冲洗。重复冲洗过程两次。
- 向每个 50 mL 管中加入 1x DPBS，总共 66 mL（每管约 33 mL）。每个试管中应有约33mL的溶液。
- 将试管充分混合，然后将两者混合成无菌过滤装置（150 mL PES 过滤器 0.45 μm）。
- 过滤溶液，然后将过滤后的溶液等分到无菌琥珀色 1.7 mL 微管中。
- 通过荧光素酶成像检测脑转移瘤。
- 通过在冰上解冻D-荧光素，并在注射到小鼠之前涡旋。
- 用酒精化妆棉清洁注射区域，并使用0.5mL胰岛素注射器腹膜内注射每只小鼠100μLD-荧光素，每个笼子一个注射器。
- 10分钟后，使用连接到小动物诱导室的兽医蒸发器用异氟醚（2%O2-2.5%异氟醚）麻醉小鼠5分钟。
- 打开活体成像系统。当来自第一个笼子的小鼠处于麻醉状态时，将D-荧光素注射到下一个笼子中的小鼠中。
- 将小鼠放入体内成像系统机器中，获得腹侧和背侧图像。选择2分钟的曝光时间，然后在现场视图中选择选项E（全身）。按 获取。接下来，保存图像（图2）。
注意：如果图像显示发光饱和，请减少曝光时间。
- 通过GFP成像检测脑转移瘤。
- 脑组织准备。
- 注射细胞后约8-10周或当小鼠因脑转移负荷而奄奄一息时，根据IACUC批准的方案，通过吸入异氟烷过量然后颈椎脱位对小鼠实施安乐死。
- 用异氟醚安乐死后，颈椎脱位后，用70%乙醇溶液喷洒小鼠，并用剪刀去除头部区域和耳朵上的皮毛。接下来，在颈部的颈部区域切开（注意不要将鼠标斩首）。切开头骨并将其拉出。接下来，小心地取出大脑。
- 将收集的大脑放入组织盒中。
- 将暗盒转移到装有冷 1x DPBS 的容器中。
注意：脑样本不应在1x DPBS中保存超过1小时。如果要同时收集几个大脑样本，一次只对几只小鼠实施安乐死（每轮10只）。
- 立体显微成像。
- 将整个大脑转移到100厘米的组织盘盖上。
- 打开体视显微镜和紫外光，在位置3，镜头0.5倍，以便可视化整个大脑，如图 3A （红色方块）所示。
- 按 实时取景 （图3A，绿色方块）。
- 当大脑处于腹侧位置时聚焦视图。
- 在软件中选择GFP（如果细胞是GFP标记的）或TXRED（如果细胞是RFP标记的）（图3A，黄色方块），在显微镜上选择合适的滤光片，然后拍照。
注意：将 SOLA 光源设置保持在 30% 左右;如果GFP太亮，请降低，直到观察到正确的信号。 - 在不移动样品的情况下，打开亮光并选择BF（图3A，黄色方块）。拍照。
- 重复前面的步骤，大脑处于背侧位置。
注意：根据大小，相同的GFP阳性脑转移病变可以出现在腹侧和背侧位置。在这种情况下，避免对同一病变进行重复定量。使用TIFF扩展名保存图像（将所有信息保存在图片文件中）。 - 使用TIFF扩展名保存图像（将所有信息保存在图片文件中）。
- 对所有样本重复步骤。
- 将 TIFF 图像转换为 JPEG，以便可以使用任何未安装相关软件的计算机打开文件（文件 |导入/导出 |转换文件）。
- 要将荧光图像与明场图像合并，请打开两个图像并转至 “文件”|”合并频道。选择合适的组件，绿色表示GFP，明场表示BF，然后按 OK。保存合并的图像。
- 要量化脑肿瘤区域，请使用荧光图像。选择 度量 |手动测量 |面积。选择自动选择（图3B，绿色方块），将箭头移动到GFP阳性区域并单击以自动创建选择。再次单击以确认选择，然后将显示所有测量值（图3B，红色方块）。如果存在多个GFP阳性区域，请重复该过程。
- 获得脑图像后，使用10%中性缓冲福尔马林进行常规组织固定方案。
- 脑部固定后，进行标准组织学切片，然后进行苏木精和伊红染色，以确认是否存在脑转移，并进行免疫组织化学染色以检测选定的标志物。
注意：免疫细胞化学在UT MD安德森癌症中心的病理学核心实验室进行，该实验室具有已知标志物免疫组织化学染色的标准化方案。
- 脑部固定后，进行标准组织学切片，然后进行苏木精和伊红染色，以确认是否存在脑转移，并进行免疫组织化学染色以检测选定的标志物。
- 脑组织准备。
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Representative Results
基于标记细胞有助于监测和可视化临床前小鼠模型中脑转移的基本原理，我们用Luc和GFP标记MDA-IBC3细胞，以监测脑转移并通过使用生物发光成像和荧光立体显微镜量化转移负荷。将标记的MDA-IBC3细胞注射到免疫功能低下的SCID / 米色小鼠的尾静脉中，导致高比例的小鼠发生脑转移（即66.7%至100%）16,23,25。早在注射后8周，通过荧光素酶成像（图2）或立体荧光显微镜（图4）就可以检测到脑转移性病变。GFP成像使我们能够检测，计数和计算每个转移性病变的面积。成像后，将部分脑转移瘤固定并处理用于苏木精和伊红染色，以验证是否存在脑转移病变（图5A）和免疫组织化学染色以检测特定的蛋白质标志物（图5B，C）。
图 1：通过尾静脉注射产生脑转移的示意图工作流程。 请点击此处查看此图的大图。
图2：小鼠背侧和腹侧位置的荧光素酶图像。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：用于立体显微镜的成像软件的屏幕截图 。 （A） 显示如何获取图像的步骤。左侧的绿色方块显示即时取景按钮;右边的红色方块表示物镜转盘镜头的显微镜位置和变焦位置;黄色方块突出显示过滤器选择。（B）测量肿瘤负荷所涉及的步骤的屏幕截图。左上角的绿色方块表示面积计算的自动选择模式;它下面的红色方块显示了选择脑转移病变后的面积值和其他测量值。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：MDA-IBC3 细胞系尾静脉注射转移的小鼠大脑的立体图像。左边的明场图片与GFP图像（中）合并，然后合并（右）。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图5：显示小鼠MDA-IBC3衍生脑转移瘤染色图像的载玻片 。 （A）苏木精和伊红染色提供脑转移的组织学确认。MDA-IBC3 衍生的脑转移性肿瘤的免疫染色显示 HER2 （B） 和 E-钙粘蛋白 （C） 染色呈阳性。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
该协议包括几个关键步骤。细胞应在冰上保持不超过1小时以保持活力。注射前应使用酒精化妆棉擦拭小鼠的尾巴，注意不要擦得太用力或太频繁，以免损坏尾部皮肤。确保细胞悬液中不存在气泡，以防止小鼠死于血管栓塞。将注射角度保持在45°或更小，以避免刺穿尾部血管，并将至少1/3的针头插入尾静脉，以确保所有细胞注射成功。注射细胞的总体积可以根据小鼠的重量进行调整，但细胞总数应尽可能保持相似。在该协议中，SCID /米色小鼠均为4至6周龄，重量在15至20克之间。对于重量小于15g的小鼠，进样体积可以调节至小于100μL;否则，注入 100 μL。从颅骨中取出后，在通过立体显微镜成像之前，整个大脑必须在1x DPBS中保持不超过1小时，以防止信号减少和组织退化。对于免疫荧光成像，脑组织不应置于福尔马林中，因为它会产生内源性自发荧光，阻碍高质量图像的采集。我们注意到，荧光素酶成像并不总是显示脑转移瘤，尤其是非常小的病变;然而，通过立体显微镜进行的GFP成像可以显示所有病变。此外，GFP成像可以显示1个以上的病变，而荧光素酶成像则不能。
建议的程序可以根据用户喜好稍作修改。首先，可以针对不同的研究调整注射细胞的数量和转移形成的持续时间。其次，通过使用温水扩张静脉或紫外线照亮静脉，可以更清楚地看到小鼠的尾静脉。最后，注射器中针头的尺寸可以是30 G或28 G。
现有脑转移小鼠模型的优点和局限性已在别处回顾3 .我们在这里描述的脑转移模型确实有其局限性和优势。一个限制是它不能概括大脑转移过程的所有步骤，并且不允许询问转移过程的初始阶段，即原发性乳腺癌细胞扩散到循环中。此外，该模型不能用于研究脑转移过程中肿瘤细胞与宿主免疫微环境之间的相互作用或评估免疫治疗应用。然而，与其他脑转移模型相比，该模型有几个优点。首先，与只有一小部分小鼠以不同间隔发生脑转移的自发模型不同，我们的模型提供了持续导致大脑转移的优势，通常在超过70%的小鼠中。其次，尾静脉注射允许细胞主要向肺部传播，随后扩散到大脑，而通过颈内动脉接种允许细胞直接播散到大脑;心内注射允许癌细胞全身分布到大脑以及颅外部位，如肺和骨。因此，我们的模型比常用的心内或颈内注射模型更好地概括了脑转移定植步骤，因为细胞穿过肺毛细血管床并在产生脑损伤之前在循环中存活。最后，通过尾静脉注射乳腺癌细胞在技术上比颈内或心内注射更具挑战性。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢MD安德森放射肿瘤学部门的Christine F. Wogan，MS，ELS对手稿进行科学编辑，以及MD安德森外科组织学核心部门的Carol M. Johnston在苏木精和伊红染色方面的帮助。我们感谢MD安德森的兽医和外科核心对动物研究的支持。这项工作得到了以下资助的支持：Susan G. Komen Career Catalyst Research Grant（CCR16377813 to BGD），American Cancer Society Research Scholar Grant（RSG-19-126-01 to BGD）和德克萨斯州罕见和侵袭性乳腺癌研究计划。还得到了美国国立卫生研究院国家癌症研究所向德克萨斯大学MD安德森癌症中心的癌症中心支持（核心）拨款P30 CA016672的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 1000 µL pipette tip filtered | Genesee Scientific | 23430 | |
| 10 mL Serological Pipets | Genesee Scientific | 12-112 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% |
| Centrifuge tubes 15 mL bulk | Genesee Scientific | 28103 | |
| Corning 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine | GIBICO Inc. USA | MT10080CV | |
| Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Eppendorf centufuge 5810R | Eppendorf | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBICO Inc. USA | 16000044 | 10% |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers (40 μm) | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1 µg/mL |
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | 5 µg/mL |
| Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| MDA-IBC3 cell lines | MD Anderson Cancer Center | Generated by Dr. Woodward's lab24 | |
| Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid | System Biosciences | BLIV713PA-1 | |
| microtubes clear sterile 1.7 mL | Genesee Scientific | 24282S | |
| Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 23-401C | |
| TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Tail vein injection | |||
| C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J - SCID/Beige | Envigo | SCID/beige mice | |
| BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm) | BD | 328466 | |
| Plas Labs Broome-Style Rodent Restrainers | Plas Labs 551BSRR | 01-288-32A | Order fromThermo Fisher Scientific |
| Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof) | Thermo Fisher Scientific | 50420872 | 70 % used |
| Imaging | |||
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| Disposable PES Filter Units 0.45 µm | Fisherbrand | FB12566501 | filter system to sterilize the D-luciferin |
| D-Luciferin | Biosynth | L8220-1g | stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL |
| 1.7 mL microtube amber | Genesee Scientific | 24-282AM | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC-14043-704-06 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| IVIS 200 | PerkinElmer | machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine | |
| Plastic Containers with Lids | Fisherbrand | 02-544-127 | |
| Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 1000957 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| Stereomicroscope Imaging | |||
| Stereomicroscope AZ100 | Nikon | model AZ-STGE | software NIS-ELEMENT |
| Formalin 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| TC treated dishes 100x20 mm | Genesee Scientific | 25202 |
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