Summary
Мы описываем модель метастазов рака молочной железы с помощью ксенотрансплантата мыши, полученную путем инъекции в хвостовую вену эндогенной HER2-усиленной воспалительной клеточной линии рака молочной железы.
Abstract
Метастатическое распространение в головной мозг является распространенным и разрушительным проявлением многих видов рака. Только в Соединенных Штатах ежегодно у 200 000 пациентов диагностируются метастазы в головном мозге. Значительный прогресс был достигнут в улучшении показателей выживаемости пациентов с первичным раком молочной железы и системными злокачественными новообразованиями; Тем не менее, неутешительный прогноз для пациентов с клиническими метастазами в головной мозг подчеркивает настоятельную необходимость разработки новых терапевтических средств и стратегий против этого смертельного заболевания. Отсутствие подходящих экспериментальных моделей было одним из основных препятствий, препятствующих прогрессу в понимании биологии и лечения метастазов в мозге. В данной статье мы описываем мышиную модель метастазирования в головной мозг с помощью ксенотрансплантата с помощью инъекции в хвостовую вену эндогенной HER2-амплифицированной клеточной линии, полученной из воспалительного рака молочной железы (IBC), редкой и агрессивной формы рака молочной железы. Клетки были помечены люциферазой светлячков и зеленым флуоресцентным белком для мониторинга метастазов в мозг и количественно оценивали метастатическую нагрузку с помощью биолюминесцентной визуализации, флуоресцентной стереомикроскопии и гистологической оценки. У мышей устойчиво и последовательно развиваются метастазы в головном мозге, что позволяет исследовать ключевые медиаторы метастатического процесса и разрабатывать доклинические испытания новых стратегий лечения.
Introduction
Метастазы в головной мозг являются распространенным и смертельно опасным осложнением системных злокачественных новообразований. Большинство метастазов в головном мозге происходит из первичных опухолей легких, молочной железы или кожи, которые в совокупности составляют 67-80% случаев 1,2. Оценки частоты метастазирования в головной мозг варьируются от 100 000 до 240 000 случаев, и эти цифры могут быть заниженными, поскольку аутопсия редко проводится для пациентов, умерших от метастатическогорака. Пациенты с метастазами в головной мозг имеют худший прогноз и более низкую общую выживаемость по сравнению с пациентами без метастазов в головном мозге4. Современные варианты лечения метастазов в головном мозге в значительной степени паллиативны и не улучшают показатели выживаемости большинства пациентов5. Таким образом, метастазирование в головной мозг остается проблемой, и необходимость лучшего понимания механизмов прогрессирования метастазов в головном мозге для разработки более эффективных методов лечения остается настоятельной.
Использование экспериментальных моделей дало важные сведения о специфических механизмах метастатической прогрессии рака молочной железы в головной мозг и позволило оценить эффективность различных терапевтических подходов 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . Тем не менее, очень немногие модели могут точно и полно повторить тонкости развития метастазов в головном мозге. Несколько экспериментальных моделей in vivo были получены путем инокуляции раковых клеток мышам различными путями введения, включая ортотопические, внутривенные, интракардичные, внутрисонные артериальные и внутримозговые инъекции. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки, как описано в другом месте3. Однако ни одна из этих мышиных моделей не может полностью воспроизвести клиническое прогрессирование метастазов в головном мозге.
Метастазы в головном мозге особенно распространены у пациенток с воспалительным раком молочной железы (МКБ), редким, но агрессивным вариантом первичного рака молочной железы. На IBC приходится от 1% до 4% случаев рака молочной железы, но на него приходится непропорционально много смертей, связанных с раком молочной железы, в Соединенных Штатах17,18. Известно, что IBC быстро метастазирует; действительно, треть пациентов с МКБ имеют отдаленные метастазы на момент постановки диагноза19,20. Что касается метастазов в головной мозг, пациенты с МКБ имеют более высокую частоту метастазирования в головной мозг, чем пациенты с не-МКБ21. Недавно мы продемонстрировали, что клеточная линия MDA-IBC3, полученная из злокачественной плевральной выпотной жидкости пациента с ER-/PR-/HER2+ IBC, которая повторяет характеристики IBC в мышиных ксенотрансплантатах, имеет повышенную склонность к развитию метастазов в головном мозге, а не в легких у мышей при введении через хвостовую вену, что делает эту клеточную линию хорошей моделью для изучения развития метастазов в мозг16.
В данной статье мы опишем процедуры генерации метастазов в головной мозг с помощью инъекции клеток MDA-IBC3 в хвостовую вену, а также для оценки метастатической нагрузки с помощью стереофлуоресцентной микроскопии и визуализации люциферазы. Этот метод был использован для обнаружения ключевых медиаторов метастазирования рака молочной железы в головной мозг и для проверки эффективности терапевтических вмешательств 16,22,23. Недостатком этой методики является то, что она не повторяет все этапы метастатического процесса в головном мозге. Тем не менее, его основные преимущества включают в себя надежность и воспроизводимость, вовлечение соответствующей биологии метастазирования при интравазации, прохождении через легкие и экстравазации в мозг, а также относительную простоту с точки зрения техники.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Описанный здесь метод был одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Онкологического центра им. М. Д. Андерсона и соответствует рекомендациям Национальных институтов здравоохранения по уходу за лабораторными животными и их использованию. Схематический рабочий процесс со всеми шагами представлен на рисунке 1.
1. Подготовка клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная линия MDA-IBC3 (ER-/PR-/HER2+), сгенерированная в лаборатории24 доктора Вудворда, была стабильно трансдуцирована плазмидой люциферазно-зеленого флуоресцентного белка (Luc-GFP).
- Культура трансдуцированных клеток в среде F-12 Ham, дополненная 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 1 мкг/мл гидрокортизона, 5 мкг/мл инсулина и 1% антибиотик-антибиотик.
- Поместите ячейки MDA-IBC3-Luc-GFP при 37 °C и 5%CO2 в колбу Т-75 до слияния. Меняйте среду каждые 3 дня, прежде чем клетки станут достаточно сливающимися, чтобы их можно было пройти.
- Собирают клетки, удаляя среду, промывая каждую колбу 10 мл 1x фосфатно-солевого буфера (DPBS) Dulbecco (т. е. без кальция и магния) и добавляя 2 мл 0,25% трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Инкубировать 3-5 мин при 37 °C до отделения клеток.
- Добавьте 5 мл полной среды в колбу, чтобы собрать клетки и перенести все содержимое в центрифужную пробирку объемом 15 мл (оптимизированную для центрифужной пробирки объемом 50 мл в зависимости от общего количества необходимых клеток). Центрифуга при 290 x g в течение 5 мин до гранулированных клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полная среда представляет собой среду F-12 от Ham, дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 1 мкг/мл гидрокортизона, 5 мкг/мл инсулина и 1% антибиотика-антибиотика. - Выбросьте надосадочную жидкость. Затем промойте клетки 10 мл 1x DPBS. Центрифуга при 290 x g в течение 5 мин, чтобы гранулировать клетки и осторожно выбросить надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки с 1 мл свежего 1x DPBS и хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз.
- Для получения одноклеточных суспензий фильтруют клетки через стерильные сетчатые фильтры 40 мкм.
- Рассчитайте плотность ячеек с помощью автоматического счетчика ячеек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить погрешности при подсчете, создайте различные разведения клеток и подсчитайте их отдельно, а также рассчитайте среднее значение для определения концентрации клеток (количество клеток/мл).- Соберите 2 мкл клеточной суспензии + 8 мкл 1x DPBS, чтобы получить образец для разведения 1:5.
- Соберите 1 мкл клеточной суспензии + 9 мкл 1x DPBS, чтобы получить образец для разведения 1:10.
- Добавьте 10 мкл 0,4% красителя трипанового синего. Хорошо перемешайте образец смеси, несколько раз пипетируя его вверх и вниз.
- Осторожно замочите пипеткой 10 мкл образца в зону загрузки образца в форме полумесяца на предметных стеклах счетной камеры. Убедитесь, что внутри нет пузырьков; Подождите 30 с, чтобы клетки осели в камере перед подсчетом.
- Разбавьте клетки 1x DPBS до плотности 5 x 105 или 1 x 106 клеток на 100 мкл. Переложите клеточную суспензию в микроцентрифужные пробирки объемом 1,7 мл для инъекции в хвостовую вену. Поместите клетки на лед до инъекции, чтобы сохранить жизнеспособность.
2. Инъекция в хвостовую вену
- Используйте мышей с ТКИН/бежевым цветом в возрасте от 4 до 6 недель.
- Подготовьте шприц 30 г для забора 100 мкл клеточной суспензии. Удалите все пузырьки воздуха.
- Поместите мышь в ограничитель для грызунов (диаметр около 1 дюйма), чтобы облегчить инъекцию в хвостовую вену и предотвратить травмы от движения во время процесса инъекции.
- Используйте спиртовые ватные диски (изготовленные из 70% этилового спирта), чтобы аккуратно протереть хвост мыши 3-4 раза и подержать 5-10 с, чтобы хвостовая вена была более хорошо видна.
- Введите шприц в хвост мыши под углом 15-30°. Медленно протолкните клеточную суспензию в хвостовую вену.
- Осторожно извлеките шприц и используйте ватный диск, чтобы удерживать хвост в течение нескольких секунд, чтобы остановить кровотечение.
- Верните мышей в клетки и проверьте их через 2-4 часа после инъекции, чтобы убедиться в отсутствии побочных эффектов.
3. Оценка метастазирования в головном мозге
- Приготовьте разбавленный раствор D-люциферина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация материала составляет 47,6 мМ (15,15 мг/мл), а концентрация для использования составляет 1,515 мг/мл.- Добавьте 5 мл 1x DPBS во флакон с D-люциферином.
- Поместите по 2,5 мл раствора в каждую из двух конических пробирок по 50 мл.
- Добавьте еще 5 мл 1x DPBS во флакон D-люциферина, чтобы промыть его. Налейте 2,5 мл в каждую коническую пробирку объемом 50 мл.
- Налейте во флакон еще 5 мл 1x DPBS и снова промойте. Повторите процесс полоскания дважды.
- Добавьте 1x DPBS в каждую пробирку объемом 50 мл, чтобы в общей сложности получить 66 мл (около 33 мл на пробирку). В каждой пробирке должно быть около 33 мл раствора.
- Хорошо перемешайте пробирки, а затем объедините их в стерильную фильтрационную установку (фильтр PES 150 мл, 0,45 мкм).
- Отфильтруют раствор, а затем аликвотируют отфильтрованный раствор в стерильные янтарные микропробирки по 1,7 мл.
- Выявление метастазов в головном мозге с помощью люциферазной визуализации.
- Разморозьте D-люциферин, держа его на льду, и встряхните перед инъекцией мышам.
- Очистите область инъекции спиртовыми ватными дисками и введите 100 мкл D-люциферина на мышь внутрибрюшинно с помощью инсулинового шприца объемом 0,5 мл, по одному шприцу на каждую клетку.
- Через 10 мин обезболивайте мышей изофлураном (2% O2-2,5% изофлурана) в течение 5 мин с помощью ветеринарного испарителя, подключенного к индукционной камере для мелких животных.
- Включите систему визуализации in vivo. Пока мыши из первой клетки находятся под наркозом, введите D-люциферин мышам в следующей клетке.
- Поместите мышей в систему визуализации in vivo и получите вентральные и дорсальные изображения. Выберите время экспозиции 2 мин, а в поле зрения выберите опцию E (все тело). Нажмите кнопку Получить. Далее сохраните изображение (рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если на изображении видна насыщенность люминесценции, уменьшите время экспозиции.
- Выявление метастазов в головном мозге с помощью GFP-визуализации.
- Подготовка тканей головного мозга.
- Примерно через 8-10 недель после инъекции клеток или когда мыши умирают из-за метастазирования в мозг, усыпляют мышей путем ингаляции передозировки изофлураном с последующим вывихом шейки матки в соответствии с протоколами, утвержденными IACUC.
- После эвтаназии изофлураном с последующим вывихом шейки матки опрыскать мышей 70% раствором этанола и удалить ножницами шерсть с области головы и ушей. Далее сделайте надрез в шейной области шеи (стараясь не обезглавить мышь). Разрежьте череп и вытащите его. Далее аккуратно извлеките мозг.
- Собранные мозги поместите в тканевые кассеты.
- Переложите кассеты в емкость с холодным 1х ДПБС.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы мозга не должны храниться в 1x DPBS более 1 часа. Если необходимо собрать несколько образцов мозга одновременно, усыпляйте только несколько мышей за раз (10 за раунд).
- Стереомикроскопическая визуализация.
- Перенесите весь мозг на 100-сантиметровую крышку для тканевой посуды.
- Включите стереомикроскоп и ультрафиолетовый свет в положении 3 с линзой 0,5x, чтобы обеспечить визуализацию всего мозга, как показано на рисунке 3A (красный квадрат).
- Нажмите Live view (Рисунок 3A, зеленый квадрат).
- Фокусируйтесь на изображении, когда мозг находится в вентральном положении.
- Выберите GFP (если ячейки помечены GFP ) или TXRED (если ячейки помечены RFP) (рис. 3A, желтый квадрат) в программном обеспечении, выберите соответствующий фильтр на микроскопе и сделайте снимок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте настройку источника света SOLA на уровне около 30%; если GFP слишком яркий, уменьшите его до тех пор, пока не будет наблюдаться надлежащий сигнал. - Не перемещая образец, включите яркий свет и выберите БФ (рисунок 3А, желтый квадрат). Сфотографируйтесь.
- Повторите предыдущие шаги с мозгом в дорсальном положении.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от размера, одно и то же GFP-положительное метастазирование в головном мозге может появляться как в вентральном, так и в дорсальном положениях. В этом случае следует избегать повторного количественного определения одного и того же поражения. Сохраняйте изображения с расширением TIFF (которое сохраняет всю информацию в файле изображения). - Сохраняйте изображения с расширением TIFF (которое сохраняет всю информацию в файле изображения).
- Повторите действия для всех образцов.
- Преобразуйте изображения TIFF в формат JPEG, чтобы их можно было открыть на любом компьютере, на котором не установлено соответствующее программное обеспечение (Файл | Импорт/Экспорт | конвертировать файлы).
- Чтобы объединить флуоресцентное изображение с изображением яркого поля, откройте оба изображения и перейдите в меню Файл | Слияние каналов. Выберите подходящие компоненты, зеленый для GFP и светлое поле для BF, и нажмите Ok. Сохраните объединенное изображение.
- Для количественной оценки площади опухоли головного мозга используют флуоресцентное изображение. Выберите Измерить | Ручное измерение | Площадь. Выберите автоматическое выделение (рис. 3B, зеленый квадрат), переместите стрелку в область GFP-положительного результата и щелкните, чтобы автоматически создать выделение. Нажмите еще раз, чтобы подтвердить выбор, после чего отобразятся все измерения (рис. 3B, красный квадрат). Если присутствует более одной GFP-положительной области, повторите процедуру.
- После получения изображений мозга переходите к рутинным протоколам фиксации тканей с использованием 10% нейтрального буферного формалина.
- После того, как мозг зафиксирован, приступают к стандартному гистологическому срезу с последующим окрашиванием гематоксилином и эозином для подтверждения наличия метастазов в мозг и иммуногистохимическому окрашиванию для обнаружения выбранных маркеров.
ПРИМЕЧАНИЕ: Иммуноцитохимия была проведена в Патологоанатомической лаборатории Онкологического центра им. М. Д. Андерсона при Техасском университете, которая имеет стандартизированный протокол иммуногистохимического окрашивания известных маркеров.
- После того, как мозг зафиксирован, приступают к стандартному гистологическому срезу с последующим окрашиванием гематоксилином и эозином для подтверждения наличия метастазов в мозг и иммуногистохимическому окрашиванию для обнаружения выбранных маркеров.
- Подготовка тканей головного мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Исходя из того, что меченые клетки облегчают мониторинг и визуализацию метастазов в головном мозге на доклинических мышиных моделях, мы пометили клетки MDA-IBC3 с помощью Luc и GFP для мониторинга метастазов в головном мозге и количественной оценки метастатической нагрузки с помощью биолюминесцентной визуализации и флуоресцентной стереомикроскопии. Инъекция меченых клеток MDA-IBC3 в хвостовые вены мышей с иммунодефицитным SCID/Beige привела к высокому проценту развития метастазов в мозг у мышей (т.е. от 66,7% до 100%)16,23,25. Метастатические поражения головного мозга могут быть обнаружены уже через 8 недель после инъекции с помощью люциферазной визуализации (Рисунок 2) или стереофлуоресцентной микроскопии (Рисунок 4). Визуализация GFP позволяет обнаружить, подсчитать и рассчитать площадь каждого метастатического поражения. После визуализации участки метастазов в головном мозге фиксируются формалином и обрабатываются для окрашивания гематоксилином и эозином для подтверждения наличия метастазов в головном мозге (рис. 5А) и иммуногистохимического окрашивания для выявления специфических белковых маркеров (рис. 5В, В).
Рисунок 1: Схематический рабочий процесс генерации метастазов в головной мозг с помощью инъекции в хвостовую вену. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Люциферазные изображения мышей в дорсальном и вентральном положениях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Скриншоты программного обеспечения для обработки изображений, используемого для стереомикроскопии . (A) Шаги, показывающие, как получить изображения. Зеленый квадрат слева показывает кнопку просмотра в реальном времени; красным квадратом справа показано положение микроскопа для линзы наконечника и положения зума; А желтый квадрат выделяет выбор фильтра. (B) Скриншот этапов, связанных с измерением опухолевой нагрузки. Зеленый квадрат в левом верхнем углу показывает режим автоматического выбора для вычисления площади; Красный квадрат под ним показывает значения площади и другие измерения после того, как было выбрано метастазирование в мозг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Стереоскопические изображения мозга мышей с метастазами от инъекции в хвостовую вену клеточной линии MDA-IBC3. Изображение светлого поля слева объединяется с изображением GFP (посередине), а затем объединяется (справа). Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Слайды, показывающие окрашенные изображения метастазов в головном мозге, полученных из MDA-IBC3 у мышей . (А) Окрашивание гематоксилином и эозином обеспечивает гистологическое подтверждение метастазирования в головной мозг. Иммуноокрашивание метастатических опухолей головного мозга, полученных из MDA-IBC3, показывает положительное окрашивание на HER2 (B) и E-кадгерин (C). Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол включает в себя несколько критически важных шагов. Клетки следует держать на льду не дольше 1 часа для сохранения жизнеспособности. Для протирания хвостов мышей перед инъекцией следует использовать спиртовые ватные диски, при этом следует следить за тем, чтобы не протирать слишком сильно или слишком часто, чтобы не повредить кожу хвоста. Убедитесь, что в клеточной суспензии нет пузырьков воздуха, чтобы предотвратить гибель мышей от эмболии кровеносных сосудов. Поддерживайте угол инъекции на уровне 45° или меньше, чтобы избежать прокалывания кровеносного сосуда в хвосте, и введите не менее 1/3 иглы в хвостовую вену, чтобы обеспечить успешное введение всех клеток. Общий объем вводимых клеток может быть скорректирован в соответствии с весом мышей, но общее количество клеток должно быть как можно более одинаковым. В этом протоколе все мыши с SCID / Beige были в возрасте от 4 до 6 недель и весили от 15 до 20 г. Для мышей весом менее 15 г объем инъекции может быть скорректирован до менее 100 мкл; в противном случае вводят 100 мкл. После его удаления из черепа весь мозг должен содержаться в 1x DPBS не более 1 часа перед визуализацией с помощью стереоскопической микроскопии, чтобы предотвратить снижение сигнала и дегенерацию тканей. Для иммунофлюоресцентной визуализации ткани мозга не следует помещать в формалин, поскольку он генерирует эндогенную автофлуоресценцию, препятствующую получению высококачественных изображений. Мы отметили, что визуализация люциферазы не всегда выявляет метастазы в мозг, особенно очень маленькие поражения; тем не менее, визуализация GFP с помощью стереомикроскопии может визуализировать все поражения. Более того, визуализация GFP может показать более 1 поражения, в то время как визуализация люциферазы этого не делает.
Предлагаемые процедуры могут быть немного изменены в соответствии с предпочтениями пользователя. Во-первых, количество введенных клеток и продолжительность образования метастазов могут быть скорректированы для разных исследований. Во-вторых, хвостовую вену мышей можно визуализировать более четко, используя теплую воду для расширения вены или ультрафиолетовый свет для освещения вен. Наконец, размер иглы в шприце может быть либо 30 г, либо 28 г.
Преимущества и ограничения существующих мышиных моделей метастазирования в мозг были рассмотрены в другом месте3 . Модель метастазирования в мозг, которую мы здесь описали, имеет свои ограничения и сильные стороны. Одним из ограничений является то, что она не повторяет все этапы метастатического процесса в головном мозге и не позволяет исследовать начальные стадии метастатического процесса, т.е. диссеминации первичных клеток рака молочной железы в кровоток. Кроме того, эта модель не может быть использована для изучения взаимодействий между опухолевыми клетками и иммунным микроокружением хозяина в процессе метастазирования в мозг или для оценки иммунотерапевтических применений. Тем не менее, эта модель имеет ряд преимуществ перед другими моделями метастазирования в головном мозге. Во-первых, в отличие от спонтанных моделей, в которых метастазы в мозг развиваются только у небольшой части мышей через различные промежутки времени, наша модель имеет преимущество в том, что она постоянно приводит к метастазированию в мозг, как правило, более чем у 70% мышей. Во-вторых, инъекция в хвостовую вену обеспечивает диссеминацию клеток преимущественно в легкие с последующим распространением в мозг, тогда как инокуляция через внутрисонную артерию позволяет клеткам распространяться непосредственно в мозг; Внутрисердечные инъекции позволяют системно распределить раковые клетки по головному мозгу, а также по экстракраниальным участкам, таким как легкие и кости. Таким образом, наша модель повторяет этап метастатической колонизации мозга лучше, чем обычно используемые модели внутрисердечных или интракаротидных инъекций, потому что клетки проходят через ложе капилляров легких и выживают в кровообращении до того, как образуются поражения мозга. Наконец, инъекция клеток рака молочной железы через хвостовую вену технически менее сложна, чем интракаротидная или внутрисердечная инъекция.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Кристин Ф. Воган (Christine F. Wogan), MS, ELS, из отделения радиационной онкологии MD Anderson за научное редактирование рукописи, и Кэрол М. Джонстон (Carol M. Johnston) из Отделения хирургии гистологического центра MD Anderson за помощь в окрашивании гематоксилином и эозином. Мы благодарны Центру ветеринарной медицины и хирургии MD Anderson за их поддержку исследований на животных. Эта работа была поддержана следующими грантами: Грант Сьюзан Г. Комен (Susan G. Komen Career Catalyst Research Research) (CCR16377813 для BGD), грант Американского онкологического общества (RSG-19-126-01 для BGD) и Программа штата Техас по исследованию редкого и агрессивного рака молочной железы. Также частично поддерживается грантом P30 Cancer Center Support (Core) CA016672 от Национального института рака, Национальных институтов здравоохранения до Онкологического центра им. М. Д. Андерсона Техасского университета.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 1000 µL pipette tip filtered | Genesee Scientific | 23430 | |
| 10 mL Serological Pipets | Genesee Scientific | 12-112 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% |
| Centrifuge tubes 15 mL bulk | Genesee Scientific | 28103 | |
| Corning 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine | GIBICO Inc. USA | MT10080CV | |
| Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Eppendorf centufuge 5810R | Eppendorf | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBICO Inc. USA | 16000044 | 10% |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers (40 μm) | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1 µg/mL |
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | 5 µg/mL |
| Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| MDA-IBC3 cell lines | MD Anderson Cancer Center | Generated by Dr. Woodward's lab24 | |
| Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid | System Biosciences | BLIV713PA-1 | |
| microtubes clear sterile 1.7 mL | Genesee Scientific | 24282S | |
| Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 23-401C | |
| TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Tail vein injection | |||
| C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J - SCID/Beige | Envigo | SCID/beige mice | |
| BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm) | BD | 328466 | |
| Plas Labs Broome-Style Rodent Restrainers | Plas Labs 551BSRR | 01-288-32A | Order fromThermo Fisher Scientific |
| Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof) | Thermo Fisher Scientific | 50420872 | 70 % used |
| Imaging | |||
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| Disposable PES Filter Units 0.45 µm | Fisherbrand | FB12566501 | filter system to sterilize the D-luciferin |
| D-Luciferin | Biosynth | L8220-1g | stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL |
| 1.7 mL microtube amber | Genesee Scientific | 24-282AM | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC-14043-704-06 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| IVIS 200 | PerkinElmer | machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine | |
| Plastic Containers with Lids | Fisherbrand | 02-544-127 | |
| Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 1000957 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| Stereomicroscope Imaging | |||
| Stereomicroscope AZ100 | Nikon | model AZ-STGE | software NIS-ELEMENT |
| Formalin 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| TC treated dishes 100x20 mm | Genesee Scientific | 25202 |
References
- Achrol, A. S., et al.
- Nayak, L., Lee, E. Q., Wen, P. Y.
- Lowery, F. J., Yu, D. Brain metastasis: Unique challenges and open opportunities. Biochimica et Biophysica Acta Review Cancer. 1867 (1), 49-57 (2017).
- Brufsky, A. M., et al. Central nervous system metastases in patients with HER2-positive metastatic breast cancer: incidence, treatment, and survival in patients from registHER. Clinical Cancer Research. 17 (14), 4834-4843 (2011).
- Valiente, M., et al.
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Woditschka, S., et al. DNA double-strand break repair genes and oxidative damage in brain metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (7), (2014).
- Palmieri, D., et al. Vorinostat inhibits brain metastatic colonization in a model of triple-negative breast cancer and induces DNA double-strand breaks. Clinical Cancer Research. 15 (19), 6148-6157 (2009).
- Kim, S. J., et al. Astrocytes upregulate survival genes in tumor cells and induce protection from chemotherapy. Neoplasia. 13 (3), 286-298 (2011).
- Zhang, S., et al. SRC family kinases as novel therapeutic targets to treat breast cancer brain metastases. Cancer Research. 73 (18), 5764-5774 (2013).
- Valiente, M., et al. Serpins promote cancer cell survival and vascular co-option in brain metastasis. Cell. 156 (5), 1002-1016 (2014).
- Gril, B., et al. Effect of lapatinib on the outgrowth of metastatic breast cancer cells to the brain. Journal of the National Cancer Institute. 100 (15), 1092-1103 (2008).
- Gril, B., et al. Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis. Clinical Cancer Research. 17 (1), 142-153 (2011).
- Palmieri, D., et al. Profound prevention of experimental brain metastases of breast cancer by temozolomide in an MGMT-dependent manner. Clinical Cancer Research. 20 (10), 2727-2739 (2014).
- Priego, N., et al. STAT3 labels a subpopulation of reactive astrocytes required for brain metastasis. Nature Medicine. 24 (7), 1024-1035 (2018).
- Debeb, B. G., et al. miR-141-mediated regulation of brain metastasis from breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 108 (8), (2016).
- Chang, S., Parker, S. L., Pham, T., Buzdar, A. U., Hursting, S. D. Inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program of the National Cancer Institute, 1975-1992. Cancer. 82 (12), 2366-2372 (1998).
- Hance, K. W., Anderson, W. F., Devesa, S. S., Young, H. A., Levine, P. H. Trends in inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program at the National Cancer Institute. Journal of National Cancer Institute. 97 (13), 966-975 (2005).
- Dirix, L. Y., Van Dam, P., Prove, A., Vermeulen, P. B. Inflammatory breast cancer: Current understanding. Current Opinion in Oncology. 18 (6), 563-571 (2006).
- Wang, Z., et al. Pattern of distant metastases in inflammatory breast cancer - A large-cohort retrospective study. Journal of Cancer. 11 (2), 292-300 (2020).
- Uemura, M. I., et al. Development of CNS metastases and survival in patients with inflammatory breast cancer. Cancer. 124 (11), 2299-2305 (2018).
- Smith, D. L., Debeb, B. G., Thames, H. D., Woodward, W. A. Computational modeling of micrometastatic breast cancer radiation dose response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 96 (1), 179-187 (2016).
- Fukumura, K., et al. Multi-omic molecular profiling reveals potentially targetable abnormalities shared across multiple histologies of brain metastasis. Acta Neuropathol. , (2021).
- Klopp, A. H., et al. Mesenchymal stem cells promote mammosphere formation and decrease E-cadherin in normal and malignant breast cells. PLoS One. 5 (8), 12180 (2010).
- Villodre, E. S., et al. Abstract P3-01-10: Ndrg1-egfr axis in inflammatory breast cancer tumorigenesis and brain metastasis. Cancer Research. 80 (4), 10 (2020).
