Summary
우리는 내인성 HER2 증폭 염증성 유방암 세포주의 꼬리 정맥 주사를 통해 생성된 유방암 뇌 전이의 이종이식 마우스 모델을 설명합니다.
Abstract
뇌로의 전이성 확산은 많은 유형의 암에서 흔하고 파괴적인 징후입니다. 미국에서만 매년 약 200,000명의 환자가 뇌 전이 진단을 받습니다. 원발성 유방암 및 전신 악성 종양 환자의 생존 결과를 개선하는 데 상당한 진전이 있었습니다. 그러나 임상적 뇌 전이 환자의 암울한 예후는 이 치명적인 질병에 대한 새로운 치료제와 전략을 개발해야 할 시급한 필요성을 강조합니다. 적절한 실험 모델의 부족은 뇌 전이, 생물학 및 치료에 대한 우리의 이해를 향상시키는 데 방해가 되는 주요 장애물 중 하나였습니다. 여기에서 우리는 희귀하고 공격적인 형태의 유방암인 염증성 유방암(IBC)에서 유래한 내인성 HER2 증폭 세포주의 꼬리 정맥 주입을 통해 생성된 뇌 전이의 이종이식 마우스 모델을 설명합니다. 반딧불이 루시페라아제와 녹색 형광 단백질로 세포를 표지하여 뇌 전이를 모니터링하고 생물발광 영상, 형광 입체현미경 검사 및 조직학적 평가를 통해 전이성 부담을 정량화했습니다. 마우스는 강력하고 일관되게 뇌 전이를 일으켜 전이 과정에서 주요 매개체를 조사하고 새로운 치료 전략에 대한 전임상 테스트를 개발할 수 있습니다.
Introduction
뇌 전이는 전신 악성 종양의 흔하고 치명적인 합병증입니다. 대부분의 뇌 전이는 폐, 유방 또는 피부의 원발성 종양에서 발생하며, 이는 총체적으로 사례의 67-80 %를 차지합니다 1,2. 뇌 전이 발생률은 100,000건에서 240,000건까지 다양하며, 전이성 암으로 사망한 환자의 경우 부검이 드물기 때문에 이 수치는 과소평가될 수 있다3. 뇌 전이가 있는 환자는 뇌 전이가 없는 환자에 비해 예후가 더 나쁘고 전체 생존율이 낮다4. 뇌 전이에 대한 현재의 치료 옵션은 대체로 완화적이며 대부분의 환자에서 생존 결과를 개선하지 못한다5. 따라서 뇌 전이는 여전히 도전 과제로 남아 있으며 보다 효과적인 치료법을 개발하기 위해 뇌 전이 진행 메커니즘을 더 잘 이해해야 할 필요성이 여전히 시급합니다.
실험 모델의 사용은 뇌로의 유방암 전이성 진행의 특정 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공하고 다양한 치료 접근법의 효능을 평가할 수 있게 했습니다 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . 그러나 뇌 전이 발달의 복잡성을 정확하고 완전하게 요약할 수 있는 모델은 거의 없습니다. 여러 실험 생체 내 모델이 동소, 꼬리 정맥, 심장 내, 경동맥 내 및 뇌내 주사를 포함한 다양한 투여 경로에 의해 암세포를 마우스에 접종하여 생성되었습니다. 각 기술에는 다른 곳에서 검토한 바와 같이 장점과 단점이 있습니다3. 그러나 이러한 마우스 모델 중 어느 것도 뇌 전이의 임상 진행을 완전히 복제할 수 없습니다.
뇌 전이는 드물지만 공격적인 원발성 유방암 변종인 염증성 유방암(IBC) 환자에게 특히 흔합니다. IBC는 유방암 사례의 1 %에서 4 %를 차지하지만 미국에서 유방암 관련 사망의 10 %를 차지합니다17,18. IBC는 빠르게 전이되는 것으로 알려져 있습니다. 실제로, IBC 환자의 3 분의 1은 진단 당시 원격 전이가 있습니다19,20. 뇌 전이와 관련하여, IBC 환자는 비 IBC 환자보다 뇌 전이 발생률이 더 높습니다21. 최근에, 우리는 생쥐 이종이식편에서 IBC 특성을 요약하는 ER-/PR-/HER2+ IBC 환자의 악성 흉막삼출액에서 유래한 MDA-IBC3 세포주가 꼬리 정맥에 의해 주사될 때 생쥐에서 폐 전이보다는 뇌 전이가 발생하는 경향이 향상되어 이 세포주가 뇌 전이의 발달을 연구하는 데 좋은 모델이 됨을 입증했다16.
여기에서 우리는 MDA-IBC3 세포의 꼬리 정맥 주입을 통해 뇌 전이를 생성하고 입체 형광 현미경 및 루시페라아제 이미징을 통해 전이 부담을 평가하는 절차를 설명합니다. 이 방법은 유방암의 뇌 전이의 주요 매개체를 발견하고 치료 적 개입의 효능을 테스트하는 데 사용되었습니다 16,22,23. 이 기술의 단점은 뇌 전이 과정의 모든 단계를 요약하지 않는다는 것입니다. 그럼에도 불구하고 주요 이점으로는 견고성과 재현성, 혈관 내 관련 전이 생물학의 참여, 폐 통과 및 뇌로의 유출, 기술 측면에서 상대적 단순성 등이 있습니다.
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Protocol
여기에 설명된 방법은 MD Anderson Cancer Center의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 지침을 준수합니다. 모든 단계가 포함된 회로도 워크플로는 그림 1과 같이 표시됩니다.
1. 세포 준비
참고: Woodward 박사의 실험실24에서 생성된 MDA-IBC3(ER-/PR-/HER2+) 세포주는 루시페라아제-녹색 형광 단백질(Luc-GFP) 플라스미드로 안정적으로 형질도입되었습니다.
- 10% 소 태아 혈청(FBS), 1μg/mL 하이드로코르티손, 5μg/mL 인슐린 및 1% 항생제-항유사분열제가 보충된 Ham's F-12 배지에서 형질도입된 세포를 배양합니다.
- MDA-IBC3-Luc-GFP 세포를 T-75 플라스크에서 37°C 및 5%CO2 에서 합류할 때까지 플레이트한다. 세포가 통과할 수 있을 만큼 충분히 합류하기 전에 3일마다 배지를 교체하십시오.
- 배지를 제거하고 각 플라스크를 1x Dulbecco's(즉, 칼슘 및 마그네슘이 없는) 인산염 완충 식염수(DPBS) 10mL로 세척하고 0.25% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 2mL를 추가하여 세포를 수확합니다. 세포가 분리될 때까지 37°C에서 3-5분 동안 배양합니다.
- 플라스크에 5mL의 완전한 배지를 추가하여 세포를 수집하고 전체 내용물을 15mL 원심분리기 튜브(필요한 총 세포 수에 따라 50mL 원심분리기 튜브에 최적화됨)로 옮깁니다. 펠렛 셀을 위해 290 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
참고: 완전한 배지는 10% 소 태아 혈청(FBS), 1μg/mL 하이드로코르티손, 5μg/mL 인슐린 및 1% 항생제-유사분열제가 보충된 Ham의 F-12 배지입니다. - 상청액을 버리십시오. 그런 다음 1x DPBS 10mL로 세포를 세척합니다. 290 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화하고 상층액을 조심스럽게 버립니다. 신선한 1x DPBS 1mL로 세포를 재현탁하고 위아래로 피펫팅하여 잘 섞습니다.
- 단일 세포 현탁액을 만들려면 40μm 멸균 세포 스트레이너를 통해 세포를 여과합니다.
- 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 밀도를 계산합니다.
알림: 계수 오류를 줄이려면 다른 세포 희석액을 만들어 별도로 계산하고 평균값을 계산하여 세포 농도(세포 수/mL)를 결정합니다.- 2 μL의 세포 현탁액 + 8 μL의 1x DPBS를 수집하여 1:5 희석 샘플을 만듭니다.
- 1 μL의 세포 현탁액 + 9 μL의 1x DPBS를 수집하여 1:10 희석 샘플을 만듭니다.
- 0.4% 트리판 블루 염색 10μL를 추가합니다. 샘플 혼합물을 위아래로 몇 번 피펫팅하여 잘 섞습니다.
- 10 μL의 시료를 계수 챔버 슬라이드의 반달 모양의 시료 로딩 영역에 부드럽게 피펫팅합니다. 내부에 기포가 없는지 확인하십시오. 계수하기 전에 세포가 챔버에 정착할 수 있도록 30초 동안 기다리십시오.
- 세포를 1x DPBS로 100μL당 5 x 105 또는 1 x 106 세포의 밀도로 희석합니다. 꼬리 정맥 주입을 위해 세포 현탁액을 1.7mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 생존력을 유지하기 위해 주사 할 때까지 세포를 얼음 위에 놓습니다.
2. 꼬리 정맥 주사
- 4-6주 된 암컷 무흉선 SCID/베이지색 마우스를 사용합니다.
- 30G 주사기를 준비하여 100μL의 세포 현탁액을 채취합니다. 모든 기포를 제거하십시오.
- 꼬리 정맥 주사를 용이하게 하고 주사 과정에서 부상이 움직이지 않도록 설치류 억제기(직경 약 1인치)에 마우스를 놓습니다.
- 알코올 화장솜(70% 에탄올로 만든)을 사용하여 쥐의 꼬리를 3-4회 부드럽게 닦고 5-10초 동안 유지하여 꼬리 정맥이 더 선명하게 보이도록 합니다.
- 주사기를 마우스 꼬리에 15-30° 각도로 삽입합니다. 세포 현탁액을 꼬리 정맥으로 천천히 밀어 넣습니다.
- 주사기를 부드럽게 제거하고 면봉을 사용하여 꼬리를 몇 초 동안 잡고 출혈을 멈춥니다.
- 마우스를 케이지로 돌려보내고 주사 후 2-4시간 후에 확인하여 부작용이 발생하지 않는지 확인합니다.
3. 뇌 전이 부담 평가
- 희석된 D-루시페린 용액을 준비합니다.
참고: 스톡 농도는 47.6mM(15.15mg/mL)이고 사용 농도는 1.515mg/mL입니다.- D-루시페린 병에 5mL의 1x DPBS를 추가합니다.
- 2.5mL의 용액을 두 개의 50mL 원뿔형 튜브에 각각 넣습니다.
- D-luciferin 병에 5mL의 1x DPBS를 다시 추가하여 헹굽니다. 각 50mL 원뿔형 튜브에 2.5mL를 넣습니다.
- 5x DPBS의 또 다른 1mL를 병에 넣고 다시 헹굽니다. 헹굼 과정을 두 번 반복하십시오.
- 각 50mL 튜브에 1x DPBS를 추가하여 총 66mL(튜브당 약 33mL)를 만듭니다. 각 튜브에는 약 33mL의 용액이 있어야 합니다.
- 튜브를 잘 섞은 다음 멸균 여과 장치(150mL PES 필터 0.45μm)에 결합합니다.
- 용액을 여과한 다음 여과된 용액을 멸균된 호박색 1.7mL 마이크로튜브에 분취합니다.
- 루시페라아제 영상으로 뇌 전이를 감지합니다.
- 얼음을 유지하여 D-luciferin을 해동하고 마우스에 주입하기 전에 소용돌이칩니다.
- 알코올 화장솜으로 주사 부위를 깨끗이 닦고 각 케이지에 주사기 1개씩 0.5mL 인슐린 주사기를 사용하여 마우스당 D-루시페린 100μL를 복강 주사합니다.
- 10분 후, 소동물 유도 챔버에 연결된 동물용 기화기를 이용하여 마우스를 이소플루란(2% O 2-2.5% 이소플루란)으로 5분 동안 마취시킨다.
- 생체 내 이미징 시스템을 켭니다. 첫 번째 케이지의 마우스가 마취 상태에있는 동안 D- 루시페린을 다음 케이지의 마우스에 주입하십시오.
- 마우스를 생체 내 이미징 시스템 기계에 넣고 복부 및 등쪽 이미지를 얻습니다. 노출 시간을 2분으로 선택하고 필드 뷰에서 옵션 E(전신)를 선택합니다. 획득을 누릅니다. 그런 다음 이미지를 저장합니다(그림 2).
알림: 이미지에 발광 채도가 표시되면 노출 시간을 줄이십시오.
- GFP 영상으로 뇌 전이를 감지합니다.
- 뇌 조직 준비.
- 세포 주사 후 약 8-10주 후 또는 뇌 전이 부담으로 인해 마우스가 빈사 상태일 때 IACUC에서 승인한 프로토콜에 따라 이소플루란 과다 복용 후 자궁경부 탈구를 흡입하여 마우스를 안락사시킵니다.
- 이소플루란으로 안락사시킨 후 자궁경부 탈구를 한 후 생쥐에게 70% 에탄올 용액을 뿌리고 가위로 머리 부분과 귀에서 털을 제거합니다. 다음으로, 목의 자궁 경부를 절개하십시오 (마우스를 참수하지 않도록주의하십시오). 두개골을 자르고 빼냅니다. 그런 다음 조심스럽게 뇌를 제거하십시오.
- 수집 된 뇌를 조직 카세트에 넣습니다.
- 카세트를 차가운 1x DPBS가 있는 용기로 옮깁니다.
참고: 뇌 샘플은 1시간 이상 1x DPBS에 보관해서는 안 됩니다. 여러 개의 뇌 샘플을 동시에 수집해야 하는 경우 한 번에 몇 마리의 생쥐만 안락사시킵니다(라운드당 10마리).
- 입체 현미경 이미징.
- 뇌 전체를 100cm 티슈 접시 뚜껑에 옮깁니다.
- 그림 3A(빨간색 사각형)와 같이 전체 뇌를 시각화할 수 있도록 렌즈 0.5x로 위치 3에서 실체현미경과 UV 광선을 켭니다.
- 라이브 뷰(Live view)를 누릅니다(그림 3A, 녹색 사각형).
- 뇌가 복부 위치에 있는 동안 시야에 초점을 맞춥니다.
- 소프트웨어에서 GFP(세포가 GFP 표지된 경우) 또는 TXRED (세포가 RFP 표지된 경우)(그림 3A, 노란색 사각형)를 선택하고 현미경에서 적절한 필터를 선택한 다음 사진을 찍습니다.
알림: SOLA 광원 설정을 약 30%로 유지하십시오. GFP가 너무 밝으면 적절한 신호가 관찰될 때까지 줄이십시오. - s를 이동하지 않고ample, 밝은 조명을 켜고 BF를 선택합니다(그림 3A, 노란색 사각형). 사진을 찍습니다.
- 뇌를 등쪽 위치에 놓고 이전 단계를 반복하십시오.
참고: 크기에 따라 동일한 GFP 양성 뇌 전이 병변이 복부 및 등쪽 위치 모두에 나타날 수 있습니다. 이 경우 동일한 병변의 중복 정량화를 피하십시오. TIFF 확장자(그림 파일의 모든 정보 유지)로 이미지를 저장합니다. - TIFF 확장자(그림 파일의 모든 정보 유지)로 이미지를 저장합니다.
- 모든 샘플에 대해 단계를 반복합니다.
- TIFF 이미지를 JPEG로 변환하여 관련 소프트웨어가 설치되지 않은 컴퓨터에서 파일을 열 수 있도록 합니다(파일 | 가져오기/내보내기 | 파일 변환).
- 형광 이미지를 명시야 이미지와 병합하려면 두 이미지를 모두 열고 파일 | 채널을 병합합니다. 적절한 구성 요소(GFP의 경우 녹색, BF의 경우 명시야)를 선택하고 확인을 누릅니다. 병합된 이미지를 저장합니다.
- 뇌종양 영역을 정량화하려면 형광 이미지를 사용하십시오. 측정값 선택 | 수동 측정 | 지역. 자동 선택(그림 3B, 녹색 사각형)을 선택하고 화살표를 GFP 양수 영역으로 이동한 다음 클릭하여 자동으로 선택 항목을 만듭니다. 다시 클릭하여 선택을 확인하면 모든 측정값이 표시됩니다(그림 3B, 빨간색 사각형). 하나 이상의 GFP 양성 영역이 있는 경우 절차를 반복합니다.
- 뇌 이미지를 얻은 후 10% 중성 완충 포르말린을 사용하여 일상적인 조직 고정 프로토콜을 진행합니다.
- 뇌가 고정되면 표준 조직학적 절편술을 진행한 후 헤마톡실린 및 에오신 염색을 진행하여 뇌 전이의 존재를 확인하고 면역조직화학적 염색을 통해 선택된 마커를 검출합니다.
참고: 면역세포화학은 알려진 마커의 면역조직화학적 염색을 위한 표준화된 프로토콜이 있는 UT MD Anderson Cancer Center의 병리학 핵심 실험실에서 수행되었습니다.
- 뇌가 고정되면 표준 조직학적 절편술을 진행한 후 헤마톡실린 및 에오신 염색을 진행하여 뇌 전이의 존재를 확인하고 면역조직화학적 염색을 통해 선택된 마커를 검출합니다.
- 뇌 조직 준비.
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Representative Results
표지된 세포가 전임상 마우스 모델에서 뇌 전이의 모니터링 및 시각화를 용이하게 한다는 근거와 함께, 우리는 MDA-IBC3 세포에 Luc 및 GFP로 태그를 지정하여 생물발광 이미징 및 형광 입체현미경을 사용하여 뇌 전이를 모니터링하고 전이 부담을 정량화했습니다. 표지된 MDA-IBC3 세포를 면역저하된 SCID/베이지색 마우스의 꼬리 정맥에 주입한 결과 뇌 전이가 발생하는 마우스의 비율이 높았습니다(즉, 66.7% 대 100%)16,23,25. 뇌 전이성 병변은 주사 후 빠르면 8주 이내에 루시페라아제 영상(그림 2) 또는 입체형광 현미경(그림 4)을 통해 발견할 수 있습니다. GFP 이미징을 통해 각 전이성 병변의 면적을 감지, 계산 및 계산할 수 있습니다. 이미징 후 뇌 전이의 일부를 포르말린으로 고정하고 헤마톡실린 및 에오신 염색을 위해 처리하여 뇌 전이 병변의 존재를 검증하고(그림 5A) 특정 단백질 마커를 검출하기 위한 면역조직화학적 염색(그림 5B, C)을 처리합니다.
그림 1: 꼬리 정맥 주입을 통한 뇌 전이를 생성하기 위한 도식적 워크플로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 등쪽과 복부 위치에 있는 쥐의 루시페라아제 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 입체현미경에 사용되는 이미징 소프트웨어의 스크린샷 . (A) 이미지를 얻는 방법을 보여주는 단계. 왼쪽의 녹색 사각형은 라이브 뷰 버튼을 보여줍니다. 오른쪽의 빨간색 사각형은 노즈피스 렌즈에 대한 현미경의 위치와 줌 위치를 보여줍니다. 노란색 사각형은 필터 선택을 강조 표시합니다. (B) 종양 부담 측정과 관련된 단계의 스크린샷. 왼쪽 상단의 녹색 사각형은 면적 계산을 위한 자동 선택 모드를 보여줍니다. 그 아래의 빨간색 사각형은 뇌 전이 병변이 선택된 후의 면적 값과 기타 측정값을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: MDA-IBC3 세포주의 꼬리 정맥 주입으로 전이된 마우스 뇌의 입체 이미지. 왼쪽의 명시야 사진은 GFP 이미지(가운데)와 병합된 다음 병합(오른쪽)됩니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 생쥐에서 MDA-IBC3 유래 뇌 전이의 염색된 이미지를 보여주는 슬라이드. (A) 헤마톡실린 및 에오신 염색은 뇌 전이의 조직학적 확인을 제공합니다. MDA-IBC3 유래 뇌 전이성 종양의 면역염색은 HER2(B) 및 E-cadherin(C)에 대해 양성 염색을 보여줍니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 세포는 생존력을 유지하기 위해 1시간 이상 얼음 위에 보관하지 않아야 합니다. 알코올 면봉은 주사하기 전에 생쥐의 꼬리를 닦는 데 사용해야하며 꼬리 피부가 손상되지 않도록 너무 세게 또는 너무 자주 닦지 않도록주의해야합니다. 쥐가 혈관색전증으로 죽는 것을 방지하기 위해 세포 현탁액에 기포가 없는지 확인하십시오. 꼬리의 혈관이 뚫리지 않도록 주입 각도를 45° 이하로 유지하고 바늘의 1/3 이상을 꼬리 정맥에 삽입하여 모든 세포를 성공적으로 주입합니다. 주입된 세포의 총 부피는 마우스의 무게에 따라 조절할 수 있지만 총 세포 수는 가능한 한 유사하게 유지해야 합니다. 이 프로토콜에서, SCID/베이지색 마우스는 모두 4 내지 6주령이었고, 체중은 15 내지 20 g이었다. 체중이 15g 미만인 마우스의 경우 주입량을 100μL 미만으로 조정할 수 있습니다. 그렇지 않으면 100μL가 주입됩니다. 두개골에서 제거한 후 신호 감소 및 조직 변성을 방지하기 위해 입체 현미경으로 이미징하기 전에 전체 뇌를 1x DPBS에 1시간 이상 보관해야 합니다. 면역 형광 이미징의 경우, 뇌 조직은 고품질 이미지 획득을 방해하는 내인성 자가 형광을 생성하기 때문에 포르말린에 배치해서는 안 됩니다. 우리는 루시페라아제 영상이 항상 뇌 전이, 특히 매우 작은 병변을 드러내는 것은 아니라는 점에 주목했습니다. 그러나 입체현미경에 의한 GFP 영상은 모든 병변을 시각화할 수 있습니다. 또한 GFP 영상은 1개 이상의 병변을 보여줄 수 있지만 루시페라아제 영상은 그렇지 않습니다.
제안된 절차는 사용자 선호도에 따라 약간 수정될 수 있습니다. 첫째, 주입된 세포의 수와 전이 형성 기간은 다른 연구에 맞게 조정될 수 있습니다. 둘째, 생쥐의 꼬리 정맥은 따뜻한 물을 사용하여 정맥을 확장하거나 자외선을 사용하여 정맥을 비추면 더 명확하게 시각화 될 수 있습니다. 마지막으로 주사기의 바늘 크기는 30G 또는 28G이 될 수 있습니다.
뇌 전이의 기존 마우스 모델의 장점과 한계는 다른 곳에서 검토되었습니다3 . 여기서 설명한 뇌 전이 모델에는 한계와 장점이 있습니다. 한 가지 한계는 뇌 전이 과정의 모든 단계를 요약하지 않고 전이 과정의 초기 단계, 즉 원발성 유방암 세포가 순환계로 전파되는 것을 조사하는 것을 허용하지 않는다는 것입니다. 또한 이 모델은 뇌 전이 과정에서 종양 세포와 숙주 면역 미세환경 간의 상호 작용을 연구하거나 면역 요법 적용을 평가하는 데 사용할 수 없습니다. 그러나 이 모델은 다른 뇌 전이 모델에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 생쥐의 극히 일부만이 다양한 간격으로 뇌 전이를 일으키는 자발적인 모델과 달리, 우리 모델은 일반적으로 생쥐의 70% 이상에서 지속적으로 뇌로 전이되는 이점을 제공합니다. 둘째, 꼬리 정맥 주사는 세포가 주로 폐로 보급되어 뇌로 퍼지는 반면, 경동맥을 통한 접종은 세포가 뇌로 직접 전파되도록 합니다. 심장 내 주사는 암세포가 뇌뿐만 아니라 폐 및 뼈와 같은 두개 외 부위로 전신적으로 분포 할 수 있도록합니다. 따라서 우리 모델은 세포가 폐 모세혈관 침대를 가로질러 뇌 병변을 생성하기 전에 순환계에서 생존하기 때문에 일반적으로 사용되는 심장 내 또는 경동맥 내 주사 모델보다 뇌 전이 집락 형성 단계를 더 잘 요약합니다. 마지막으로, 꼬리 정맥을 통한 유방암 세포 주입은 경동맥 내 또는 심장 내 주사보다 기술적으로 덜 어렵습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
원고의 과학적 편집을 위해 MD Anderson 방사선 종양학 부서의 Christine F. Wogan, MS, ELS와 헤마톡실린 및 에오신 염색에 도움을 준 MD Anderson 외과 조직학 코어 부서의 Carol M. Johnston에게 감사드립니다. 동물 연구에 대한 지원에 대해 MD Anderson의 수의학 및 외과 핵심에 감사드립니다. 이 작업은 Susan G. Komen Career Catalyst Research 보조금(BGD에 CCR16377813), American Cancer Society Research Scholar 보조금(RSG-19–126–01 to BGD) 및 텍사스 주 희귀 및 공격적인 유방암 연구 프로그램에 의해 지원되었습니다. 또한 국립 암 연구소 (National Cancer Institute), 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 암 센터 지원 (Core) 보조금 P30 CA016672에서 텍사스 대학교 MD 앤더슨 암 센터까지 부분적으로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 1000 µL pipette tip filtered | Genesee Scientific | 23430 | |
| 10 mL Serological Pipets | Genesee Scientific | 12-112 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% |
| Centrifuge tubes 15 mL bulk | Genesee Scientific | 28103 | |
| Corning 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine | GIBICO Inc. USA | MT10080CV | |
| Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Eppendorf centufuge 5810R | Eppendorf | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBICO Inc. USA | 16000044 | 10% |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers (40 μm) | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1 µg/mL |
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | 5 µg/mL |
| Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| MDA-IBC3 cell lines | MD Anderson Cancer Center | Generated by Dr. Woodward's lab24 | |
| Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid | System Biosciences | BLIV713PA-1 | |
| microtubes clear sterile 1.7 mL | Genesee Scientific | 24282S | |
| Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 23-401C | |
| TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Tail vein injection | |||
| C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J - SCID/Beige | Envigo | SCID/beige mice | |
| BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm) | BD | 328466 | |
| Plas Labs Broome-Style Rodent Restrainers | Plas Labs 551BSRR | 01-288-32A | Order fromThermo Fisher Scientific |
| Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof) | Thermo Fisher Scientific | 50420872 | 70 % used |
| Imaging | |||
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| Disposable PES Filter Units 0.45 µm | Fisherbrand | FB12566501 | filter system to sterilize the D-luciferin |
| D-Luciferin | Biosynth | L8220-1g | stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL |
| 1.7 mL microtube amber | Genesee Scientific | 24-282AM | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC-14043-704-06 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| IVIS 200 | PerkinElmer | machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine | |
| Plastic Containers with Lids | Fisherbrand | 02-544-127 | |
| Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 1000957 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| Stereomicroscope Imaging | |||
| Stereomicroscope AZ100 | Nikon | model AZ-STGE | software NIS-ELEMENT |
| Formalin 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| TC treated dishes 100x20 mm | Genesee Scientific | 25202 |
References
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