우리는 내인성 HER2 증폭 염증성 유방암 세포주의 꼬리 정맥 주사를 통해 생성된 유방암 뇌 전이의 이종이식 마우스 모델을 설명합니다.
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방법 논문
염증성 유방암 세포의 꼬리 정맥 주입을 통한 뇌 전이 모델링
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
뇌로의 전이성 확산은 많은 유형의 암에서 흔하고 파괴적인 징후입니다. 미국에서만 매년 약 200,000명의 환자가 뇌 전이 진단을 받습니다. 원발성 유방암 및 전신 악성 종양 환자의 생존 결과를 개선하는 데 상당한 진전이 있었습니다. 그러나 임상적 뇌 전이 환자의 암울한 예후는 이 치명적인 질병에 대한 새로운 치료제와 전략을 개발해야 할 시급한 필요성을 강조합니다. 적절한 실험 모델의 부족은 뇌 전이, 생물학 및 치료에 대한 우리의 이해를 향상시키는 데 방해가 되는 주요 장애물 중 하나였습니다. 여기에서 우리는 희귀하고 공격적인 형태의 유방암인 염증성 유방암(IBC)에서 유래한 내인성 HER2 증폭 세포주의 꼬리 정맥 주입을 통해 생성된 뇌 전이의 이종이식 마우스 모델을 설명합니다. 반딧불이 루시페라아제와 녹색 형광 단백질로 세포를 표지하여 뇌 전이를 모니터링하고 생물발광 영상, 형광 입체현미경 검사 및 조직학적 평가를 통해 전이성 부담을 정량화했습니다. 마우스는 강력하고 일관되게 뇌 전이를 일으켜 전이 과정에서 주요 매개체를 조사하고 새로운 치료 전략에 대한 전임상 테스트를 개발할 수 있습니다.
서론
뇌 전이는 전신 악성 종양의 흔하고 치명적인 합병증입니다. 대부분의 뇌 전이는 폐, 유방 또는 피부의 원발성 종양에서 발생하며, 이는 총체적으로 사례의 67-80 %를 차지합니다 1,2. 뇌 전이 발생률은 100,000건에서 240,000건까지 다양하며, 전이성 암으로 사망한 환자의 경우 부검이 드물기 때문에 이 수치는 과소평가될 수 있다3. 뇌 전이가 있는 환자는 뇌 전이가 없는 환자에 비해 예후가 더 나쁘고 전체 생존율이 낮다4. 뇌 전이에 대한 현재의 치료 옵션은 대체로 완화적이며 대부분의 환자에서 생존 결과를 개선하지 못한다5. 따라서 뇌 전이는 여전히 도전 과제로 남아 있으며 보다 효과적인 치료법을 개발하기 위해 뇌 전이 진행 메커니즘을 더 잘 이해해야 할 필요성이 여전히 시급합니다.
실험 모델의 사용은 뇌로의 유방암 전이성 진행의 특정 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공하고 다양한 치료 접근법의 효능을 평가할 수 있게 했습니다 6,7,8,9,10,11,12,....
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프로토콜
여기에 설명된 방법은 MD Anderson Cancer Center의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 지침을 준수합니다. 모든 단계가 포함된 회로도 워크플로는 그림 1과 같이 표시됩니다.
1. 세포 준비
참고: Woodward 박사의 실험실24에서 생성된 MDA-IBC3(ER-/PR-/HER2+) 세포주는 루시페라아제-녹색 형광 단백질(Luc-GFP) 플라스미드로 안정적으로 형질도입되었습니다.
- 10% 소 태아 혈청(FBS), 1μg/mL 하이드로코르티손, 5μg/mL 인슐린 및 1% 항생제-항유사분열제가 보충된 Ham's F-12 배지에서 형질도입된 세포를 배양합니다.
- MDA-IBC3-Luc-GFP 세포를 T-75 플라스크에서 37°C 및 5%CO2 에서 합류할 때까지 플레이트한다. 세포가 통과할 수 있을 만큼 충분히 합류하기 전에 3일마다 배지를 교체하십시오.<....
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결과
표지된 세포가 전임상 마우스 모델에서 뇌 전이의 모니터링 및 시각화를 용이하게 한다는 근거와 함께, 우리는 MDA-IBC3 세포에 Luc 및 GFP로 태그를 지정하여 생물발광 이미징 및 형광 입체현미경을 사용하여 뇌 전이를 모니터링하고 전이 부담을 정량화했습니다. 표지된 MDA-IBC3 세포를 면역저하된 SCID/베이지색 마우스의 꼬리 정맥에 주입한 결과 뇌 전이가 발생하는 마우스의 비율이 높았습니다(즉, 66.7% 대 100%)16,23,25. 뇌 전이성 병변은 주사 후 빠르면 8주 이내에 루시페라아제 영상(그림 2) 또는 입체형광 현미경(그림 4)을 통해 발견할 수 있습니다. GFP 이미징을 통해 각 전이성 병변의 면적을 감.......
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토론
프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 세포는 생존력을 유지하기 위해 1시간 이상 얼음 위에 보관하지 않아야 합니다. 알코올 면봉은 주사하기 전에 생쥐의 꼬리를 닦는 데 사용해야하며 꼬리 피부가 손상되지 않도록 너무 세게 또는 너무 자주 닦지 않도록주의해야합니다. 쥐가 혈관색전증으로 죽는 것을 방지하기 위해 세포 현탁액에 기포가 없는지 확인하십시오. 꼬리의 혈관이 뚫리지 않도록 주입 각도를 45° 이하로 유지하고 바늘의 1/3 이상을 꼬리 정맥에 삽입하여 모든 세포를 성공적으로 주입합니다. 주입된 세포의 총 부피는 마우스의 무게에 따라 조절할 수 있지만 총 세포 수는 가능한 한 유사하게 유지해야 합니다. 이 프로토콜에서, SCID/베이지색 마우스는 모두 4 내지 6주령이었고, 체중은 15 내지 20 g이었다. 체중이 15g 미만인 마우스의 경우 주입량을 100μL 미만으로 조정할 수 있습니다. 그렇지 않으면 100μL가 주입됩니다. 두개골에서 제거한 후 신호 감소 및 조직 변성을 방지하기 위해 입체 현미경으로 이미징하기.......
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
원고의 과학적 편집을 위해 MD Anderson 방사선 종양학 부서의 Christine F. Wogan, MS, ELS와 헤마톡실린 및 에오신 염색에 도움을 준 MD Anderson 외과 조직학 코어 부서의 Carol M. Johnston에게 감사드립니다. 동물 연구에 대한 지원에 대해 MD Anderson의 수의학 및 외과 핵심에 감사드립니다. 이 작업은 Susan G. Komen Career Catalyst Research 보조금(BGD에 CCR16377813), American Cancer Society Research Scholar 보조금(RSG-19–126–01 to BGD) 및 텍사스 주 희귀 및 공격적인 유방암 연구 프로그램에 의해 지원되었습니다. 또한 국립 암 연구소 (National Cancer Institute), 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 암 센터 지원 (Core) 보조금 P30 CA016672에서 텍사스 대학교 MD 앤더슨 암 센터까지 부분적으로 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 세포 배양 | |||
| 1000 µ L 피펫 팁 필터링 | Genesee Scientific | 23430 | |
| 10 mL 혈청학적 피펫 | Genesee Scientific | 12-112 | |
| 항생제-항진균제 | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% |
| 원심분리기 튜브 15 mL 벌크 | Genesee Scientific | 28103 | |
| Corning 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine | GIBICO Inc. USA | MT10080CV | |
| Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Eppendorf centufuge 5810R | Eppendorf | ||
| 소 태아 세럼 (FBS) | GIBICO Inc. USA | 16000044 | 10% |
| Fisherbrand 멸균 세포 스트레이너 (40 μ m) | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| 하이드로 코르티손 | 시그마 - 알드리치 | H0888 | 1 &마이크로; g/mL |
| 인슐린 | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | 5 &마이크로; g/mL |
| 인비트로젠 Countess 세포 계수 챔버 슬라이드 | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| MDA-IBC3 세포주 | MD Anderson Cancer Center | Dr. Woodward의 실험실에서 생성됨24 | |
| Luciferase– 녹색 형광 단백질(Luc– GFP) 플라스미드 | 시스템 Biosciences | BLIV713PA-1 | |
| 마이크로튜브, 투명 멸균, 1.7mL | Genesee Scientific | 24282S, | |
| Olympus 10 µ L 리치 배리어 팁, 낮은 바인딩, 랙, 멸균 | Genesee Scientific | 23-401C | |
| TC 처리 플라스크(T75), 250mL, Vent | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Trypan Blue Stain(0.4%), Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA(0.25%), 페놀 레드 | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Tail vein injection | |||
| C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J - SCID/베이지 | Envigo | SCID/베이지 마우스 | |
| BD 인슐린 주사기 BD 초미세 바늘 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm) | BD | 328466 | |
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| 1.7mL 마이크로튜브 앰버 | Genesee Scientific | 24-282AM | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC-14043-704-06 | 마취기용 액체 마취제 |
| 아이비스 200 | PerkinElmer | 기계는 루시페라제 이미징을 위한 것으로, 동시에 최대 5마리의 마우스 이미징, 마취기 | |
| 플라스틱 용기와 뚜껑이 있는 기계 포함 | Fisherbrand | 02-544-127 | |
| 조직 카세트 | Thermo Scientific | 1000957 | |
| Webcol 알코올 준비 | Covidien | 6818 | |
| Stereomicroscope Imaging | |||
| Stereomicroscope AZ100 | 니콘 | 모델 AZ-STGE | 소프트웨어 NIS-ELEMENT |
| 포르말린 10% | 피셔 케미컬 | SF100-4 | |
| TC 처리 접시 100x20mm | Genesee Scientific | 25202 |
참고문헌
- Achrol, A. S., et al. Brain metastases. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 5(2019).
- Nayak, L., Lee, E. Q., Wen, P. Y. Epidemiology of brain metastases. Current Oncology Report. 14 (1), 48-54 (2012).
- Lowery, F. J., Yu, D.
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