Summary
Vi beskriver en xenograft musemodel af brystkræfthjernemetastaser genereret via haleveneinjektion af en endogen HER2-amplificeret inflammatorisk brystkræftcellelinje.
Abstract
Metastatisk spredning til hjernen er en almindelig og ødelæggende manifestation af mange typer kræft. I USA alene diagnosticeres omkring 200.000 patienter med hjernemetastaser hvert år. Der er gjort betydelige fremskridt med at forbedre overlevelsesresultaterne for patienter med primær brystkræft og systemiske maligniteter. Den dystre prognose for patienter med kliniske hjernemetastaser understreger imidlertid det presserende behov for at udvikle nye terapeutiske midler og strategier mod denne dødelige sygdom. Manglen på egnede eksperimentelle modeller har været en af de største forhindringer for fremskridt i vores forståelse af hjernens metastasebiologi og behandling. Heri beskriver vi en xenograft musemodel af hjernemetastase genereret via haleveneinjektion af en endogen HER2-amplificeret cellelinje afledt af inflammatorisk brystkræft (IBC), en sjælden og aggressiv form for brystkræft. Celler blev mærket med firefly luciferase og grønt fluorescensprotein for at overvåge hjernemetastaser og kvantificeret metastatisk byrde ved bioluminescensbilleddannelse, fluorescerende stereomikroskopi og histologisk evaluering. Mus udvikler robust og konsekvent hjernemetastaser, hvilket muliggør undersøgelse af nøglemediatorer i den metastatiske proces og udvikling af præklinisk test af nye behandlingsstrategier.
Introduction
Hjernemetastase er en almindelig og dødelig komplikation af systemiske maligniteter. De fleste hjernemetastaser stammer fra primære tumorer i lunger, bryst eller hud, som tilsammen tegner sig for 67-80% af tilfældene 1,2. Estimater af forekomsten af hjernemetastaser varierer mellem 100.000 og 240.000 tilfælde, og disse tal kan undervurderes, fordi obduktion er sjælden for patienter, der døde af metastatisk kræft3. Patienter med hjernemetastaser har en dårligere prognose og lavere samlet overlevelse i forhold til patienter uden hjernemetastaser4. Nuværende behandlingsmuligheder for hjernemetastaser er stort set palliative og forbedrer ikke overlevelsesresultaterne for de fleste patienter5. Således forbliver hjernemetastase en udfordring, og behovet er fortsat presserende for bedre at forstå mekanismerne for hjernemetastaseprogression for at udvikle mere effektive terapier.
Brugen af eksperimentelle modeller har givet vigtig indsigt i specifikke mekanismer for brystkræftmetastatisk progression til hjernen og tilladt evaluering af effektiviteten af forskellige terapeutiske tilgange 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . Imidlertid kan meget få modeller nøjagtigt og fuldt ud rekapitulere forviklingerne ved hjernens metastaseudvikling. Flere eksperimentelle in vivo-modeller er blevet genereret via podning af kræftceller i mus ved forskellige administrationsveje, herunder ortotopiske, halevene, intrakardie, intracarotidarteriele og intracerebrale injektioner. Hver teknik har fordele og ulemper, som gennemgået andetsteds3. Ingen af disse musemodeller kan imidlertid fuldt ud replikere den kliniske progression af hjernemetastaser.
Hjernemetastaser er særligt almindelige hos patienter med inflammatorisk brystkræft (IBC), en sjælden, men aggressiv variant af primær brystkræft. IBC tegner sig for 1% til 4% af brystkræfttilfældene, men det er ansvarligt for uforholdsmæssigt 10% af brystkræftrelaterede dødsfald i USA17,18. IBC er kendt for hurtigt at metastasere; faktisk har en tredjedel af IBC-patienterne fjern metastase på diagnosetidspunktet19,20. Specifikt for hjernemetastaser har patienter med IBC en højere forekomst af hjernemetastaser end patienter med ikke-IBC21. For nylig demonstrerede vi, at MDA-IBC3-cellelinjen, der stammer fra den ondartede pleurale effusionsvæske hos en patient med ER-/PR-/HER2+ IBC, der rekapitulerer IBC-egenskaber hos musexenotransplantater, har en øget tilbøjelighed til at udvikle hjernemetastaser snarere end lungemetastaser hos mus, når de injiceres af halevenen, hvilket gør denne cellelinje til en god model til at studere udviklingen af hjernemetastaser16.
Heri beskriver vi procedurerne for at generere hjernemetastase via haleveneinjektion af MDA-IBC3-celler og for at evaluere den metastatiske byrde via stereofluorescerende mikroskopi og luciferasebilleddannelse. Denne metode er blevet brugt til at opdage nøglemediatorer af brystkræftmetastaser til hjernen og til at teste effekten af terapeutiske indgreb 16,22,23. Ulempen ved denne teknik er, at den ikke rekapitulerer alle trin i hjernens metastatiske proces. Ikke desto mindre omfatter dens største fordele robusthed og reproducerbarhed, involvering af den relevante metastasebiologi ved intravasation, krydsning af lungerne og ekstravasation i hjernen og dens relative enkelhed med hensyn til teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Metoden beskrevet her er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) af MD Anderson Cancer Center og overholder National Institutes of Health Guidelines for Care and Use of Laboratory Animals. Den skematiske arbejdsgang, med alle trin inkluderet, vises som figur 1.
1. Celle forberedelse
BEMÆRK: MDA-IBC3 (ER-/PR-/HER2+) cellelinjen, genereret i Dr. Woodwards laboratorium24, blev stabilt transduceret med et luciferase-grønt fluorescerende protein (Luc-GFP) plasmid.
- Kulturtransducerede celler i Hams F-12 medier suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1 μg/ml hydrocortison, 5 μg/ml insulin og 1% antibiotika-antimitotika.
- Plade MDA-IBC3-Luc-GFP-celler ved 37 °C og 5% CO2 i en T-75-kolbe, indtil de flyder sammen. Skift medie hver 3. dag, før cellerne er sammenflydende nok til at passere.
- Høst celler ved at fjerne medier, vaske hver kolbe med 10 ml 1x Dulbeccos (dvs. calcium- og magnesiumfri) fosfatbufrede saltvand (DPBS) og tilsæt 2 ml 0,25% trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). Der inkuberes i 3-5 minutter ved 37 °C, indtil cellerne løsner sig.
- Der tilsættes 5 ml komplette medier til kolben for at opsamle cellerne og overføre hele indholdet til et 15 ml centrifugerør (optimeret til 50 ml centrifugerør afhængigt af det samlede antal celler, der er behov for). Der centrifugeres ved 290 x g i 5 minutter til pelletceller.
BEMÆRK: Komplette medier er Hams F-12 medier suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1 μg/ml hydrocortison, 5 μg/ml insulin og 1% antibiotika-antimitotika. - Supernatanten kasseres. Vask derefter cellerne med 10 ml 1x DPBS. Der centrifugeres ved 290 x g i 5 minutter for at pelletere cellerne, og supernatanten kasseres forsigtigt. Resuspender cellerne med 1 ml frisk 1x DPBS og bland godt ved pipettering op og ned.
- For at fremstille enkeltcellesuspensioner filtreres celler gennem 40 μm sterile cellefiltre.
- Beregn celletæthed ved hjælp af en automatiseret celletæller.
BEMÆRK: For at reducere fejl i optællingen skal du oprette forskellige cellefortyndinger og tælle dem separat og beregne gennemsnitsværdien for at bestemme koncentrationen af celler (antal celler / ml).- Der opsamles 2 μL cellesuspension + 8 μL 1x DPBS for at lave en 1:5 fortyndingsprøve.
- Der opsamles 1 μL cellesuspension + 9 μL 1x DPBS for at lave en 1:10 fortyndingsprøve.
- Tilsæt 10 μL 0,4% trypanblå plet. Prøveblandingen blandes godt ved at pipettere den op og ned et par gange.
- 10 μL af prøven pipetteres forsigtigt ind i det halvmåneformede prøvelastningsområde på tællekammergliderne. Sørg for, at der ikke er bobler indeni; Vent i 30 s for at lade cellerne slå sig ned i kammeret, før de tæller.
- Fortynd cellerne med 1x DPBS til en densitet på 5 x 105 eller 1 x 106 celler pr. 100 μL. Overfør cellesuspension til 1,7 ml mikrocentrifugerør til haleveneinjektion. Placer celler på is indtil injektion for at opretholde levedygtigheden.
2. Halevene injektion
- Brug 4- til 6 uger gamle kvindelige athymiske SCID / beige mus.
- Klargør en 30 G sprøjte til at trække 100 μL cellesuspension. Fjern alle luftbobler.
- Placer musen i en gnaverfastholdelse (diameter ca. 1 tomme) for at lette haleveneinjektion og forhindre skader fra bevægelse under injektionsprocessen.
- Brug alkoholbomuldspuder (lavet med 70% ethanol) til forsigtigt at tørre musens hale 3-4 gange og hold den i 5-10 s for at gøre halevenen tydeligere synlig.
- Indsæt sprøjten i musens hale i en vinkel på 15-30°. Skub langsomt cellesuspensionen ind i halevenen.
- Fjern sprøjten forsigtigt og brug vatrondellen til at holde halen i nogle sekunder for at hjælpe med at stoppe enhver blødning.
- Sæt musene tilbage i burene og kontroller dem 2-4 timer efter injektionen for at sikre, at der ikke opstår bivirkninger.
3. Evaluering af hjernemetastasebyrden
- Forbered fortyndet D-luciferin-opløsning.
BEMÆRK: Lagerkoncentrationen er 47,6 mM (15,15 mg/ml), og koncentrationen til brug er 1,515 mg/ml.- Tilsæt 5 ml 1x DPBS til D-luciferinflasken.
- Anbring 2,5 ml af opløsningen i hvert af to 50 ml koniske rør.
- Tilsæt yderligere 5 ml 1x DPBS til D-luciferinflasken igen for at skylle den. Sæt 2,5 ml i hvert 50 ml konisk rør.
- Læg yderligere 5 ml 1x DPBS i flasken og skyl den igen. Gentag skylleprocessen to gange.
- Tilføj 1x DPBS til hvert 50 ml rør til i alt 66 ml (ca. 33 ml pr. Rør). Der skal være ca. 33 ml af opløsningen i hvert rør.
- Bland rørene godt, og kombiner derefter begge i en steril filtreringsenhed (150 ml PES-filter 0,45 μm).
- Opløsningen filtreres, og derefter alikvote den filtrerede opløsning til sterile gule 1,7 ml mikroglas.
- Detektering af hjernemetastaser ved luciferase-billeddannelse.
- Optø D-luciferin ved at holde på is og hvirvel før injektion i musene.
- Rengør injektionsområdet med alkoholiske vatrondeller og injicer 100 μL D-luciferin pr. mus intraperitonealt ved hjælp af en 0,5 ml insulinsprøjte, en sprøjte til hvert bur.
- Efter 10 minutter bedøves musene med isofluran (2% O 2-2,5% isofluran) i 5 minutter ved hjælp af veterinærfordamperen, der er forbundet med det lille dyrs induktionskammer.
- Tænd for in vivo-billedbehandlingssystemet. Mens musene fra det første bur er under bedøvelse, injiceres D-luciferin i musene i det næste bur.
- Sæt mus i in vivo-billeddannelsessystemmaskinen, og få ventrale og dorsale billeder. Vælg en eksponeringstid på 2 min, og vælg indstilling E (hele kroppen) i feltvisningen. Tryk på Ansk. Gem derefter billedet (figur 2).
BEMÆRK: Hvis billedet viser mætning af luminescens, skal du reducere eksponeringstiden.
- Påvisning af hjernemetastaser ved GFP-billeddannelse.
- Forberedelse af hjernevæv.
- Ca. 8-10 uger efter injektion af celler, eller når musene er døende på grund af hjernemetastasebyrden, aflives musene ved indånding af en isofluran overdosis efterfulgt af cervikal dislokation i overensstemmelse med protokoller godkendt af IACUC.
- Efter eutanasi med isofluran efterfulgt af cervikal dislokation sprøjtes musene med en 70% ethanolopløsning og pelsen fjernes fra hovedområdet og ørerne med en saks. Dernæst lav et snit i livmoderhalsområdet i nakken (pas på ikke at halshugge musen). Skær kraniet og træk det ud. Fjern derefter forsigtigt hjernen.
- Placer de indsamlede hjerner i vævskassetter.
- Overfør kassetterne til en beholder med kold 1x DPBS.
BEMÆRK: Hjerneprøver bør ikke opbevares i 1x DPBS i mere end 1 time. Hvis der skal indsamles flere hjerneprøver på samme tid, skal du kun aflive nogle få mus ad gangen (10 pr. Runde).
- Stereomikroskopisk billeddannelse.
- Overfør hele hjernen til et 100 cm vævslåg.
- Tænd stereomikroskopet og UV-lyset i position 3 med objektiv 0,5x for at muliggøre visualisering af hele hjernen som vist i figur 3A (rød firkant).
- Tryk på Direkte visning (figur 3A, grøn firkant).
- Fokuser udsigten, mens hjernen er i ventral position.
- Vælg GFP (hvis cellerne er GFP-mærkede) eller TXRED (hvis cellerne er RFP-mærkede) (figur 3A, gul firkant) i softwaren, vælg det korrekte filter på mikroskopet, og tag et billede.
BEMÆRK: Hold SOLA-lyskildeindstillingen på ca. 30%; Hvis GFP er for lys, reduceres, indtil det korrekte signal observeres. - Uden at flytte prøven skal du tænde for det skarpe lys og vælge BF (figur 3A, gul firkant). Tag et billede.
- Gentag de foregående trin med hjernen i dorsal position.
BEMÆRK: Afhængigt af størrelsen kan den samme GFP-positive hjernemetastaselæsion forekomme i både ventrale og dorsale positioner. I så fald skal man undgå dobbelt kvantificering af den samme læsion. Gem billederne med en TIFF-udvidelse (som bevarer alle oplysningerne i billedfilen). - Gem billederne med en TIFF-udvidelse (som bevarer alle oplysningerne i billedfilen).
- Gentag trinnene for alle eksempler.
- Konverter TIFF-billeder til JPEG, så filerne kan åbnes med enhver computer, der ikke har den tilknyttede software installeret (File | Import/eksport | konvertere filer).
- Hvis du vil flette det fluorescerende billede med det lyse feltbillede, skal du åbne begge billeder og gå til Filer | Flet kanaler. Vælg de korrekte komponenter, grøn for GFP og brightfield for BF, og tryk på OK. Gem det flettede billede.
- For at kvantificere hjernetumorområdet skal du bruge det fluorescerende billede. Vælg måling | Manuel måling | Areal. Vælg automatisk markering (figur 3B, grøn firkant), flyt pilen til GFP-positivt område, og klik for automatisk at oprette en markering. Klik igen for at bekræfte valget, og derefter vises alle målinger (figur 3B, rød firkant). Hvis der er mere end ét GFP-positivt område, gentages proceduren.
- Når hjernebilleder er opnået, fortsæt til rutinemæssige vævsfikseringsprotokoller ved hjælp af 10% neutralt bufret formalin.
- Når hjernen er fikset, fortsæt til standard histologisk sektionering efterfulgt af hæmatoxylin og eosinfarvning for at bekræfte tilstedeværelsen af hjernemetastase og immunohistokemisk farvning for at detektere udvalgte markører.
BEMÆRK: Immunocytokemi blev udført på Pathology Core Laboratory ved UT MD Anderson Cancer Center, der har standardiseret protokol for immunohistokemisk farvning af kendte markører.
- Når hjernen er fikset, fortsæt til standard histologisk sektionering efterfulgt af hæmatoxylin og eosinfarvning for at bekræfte tilstedeværelsen af hjernemetastase og immunohistokemisk farvning for at detektere udvalgte markører.
- Forberedelse af hjernevæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med begrundelsen om, at mærkede celler letter overvågning og visualisering af hjernemetastaser i prækliniske musemodeller, mærkede vi MDA-IBC3-celler med Luc og med GFP for at overvåge hjernemetastaser og kvantificere den metastatiske byrde ved hjælp af bioluminescensbilleddannelse og fluorescerende stereomikroskopi. Injektion af de mærkede MDA-IBC3-celler i halevenerne hos immunkompromitterede SCID / beige mus resulterede i høje procentdele af mus, der udviklede hjernemetastase (dvs. 66,7% til 100%)16,23,25. Hjernemetastatiske læsioner kunne påvises så tidligt som 8 uger efter injektion ved luciferasebilleddannelse (figur 2) eller stereofluorescerende mikroskopi (figur 4). GFP-billeddannelse giver os mulighed for at detektere, tælle og beregne arealet af hver metastatisk læsion. Efter billeddannelse er dele af hjernemetastaserne formalinfikseret og behandlet til hæmatoxylin- og eosinfarvning for at validere tilstedeværelsen af hjernemetastaselæsioner (figur 5A) og til immunohistokemisk farvning til påvisning af specifikke proteinmarkører (figur 5B, C).
Figur 1: Skematisk arbejdsgang til generering af hjernemetastase via haleveneinjektion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Luciferase-billeder af mus i dorsale og ventrale positioner. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Skærmbilleder af billedbehandlingssoftware, der anvendes til stereomikroskopi . (A) Trin, der viser, hvordan man får billeder. Den grønne firkant til venstre viser Live View-knappen; den røde firkant til højre viser mikroskopets position for næsestykkets linse og zoomposition; Og den gule firkant fremhæver filtervalget. (B) Skærmbillede af de trin, der er involveret i måling af tumorbyrde. Den grønne firkant øverst til venstre viser den automatiske valgtilstand til arealberegning; Den røde firkant under den viser arealværdierne og andre målinger, efter at hjernemetastaselæsionen blev valgt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Stereoskopiske billeder af musehjerner med metastaser fra haleveneinjektion af MDA-IBC3-cellelinjen. Brightfield-billedet til venstre flettes sammen med GFP-billedet (i midten) og flettes derefter (højre). Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Slides, der viser farvede billeder af MDA-IBC3-afledte hjernemetastaser hos mus . (A) Hæmatoxylin og eosinpletter giver histologisk bekræftelse af hjernemetastaser. Immunfarvning af MDA-IBC3-afledte hjernemetastatiske tumorer viser positiv farvning for HER2 (B) og E-cadherin (C). Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen indeholder flere kritiske trin. Celler bør opbevares på is i højst 1 time for at opretholde levedygtigheden. Alkoholiske vatrondeller bør bruges til at tørre musenes haler før injektion, idet man skal passe på ikke at tørre for hårdt eller for ofte for at undgå at beskadige halehuden. Sørg for, at der ikke er luftbobler til stede i cellesuspensionen for at forhindre mus i at dø af blodkaremboli. Hold injektionsvinklen på 45° eller mindre for at undgå at gennembore blodkarret i halerne, og stik mindst 1/3 af nålen ind i halevenen for at sikre en vellykket injektion af alle celler. Det samlede volumen af injicerede celler kan justeres i henhold til musenes vægt, men det samlede antal celler skal holdes så ens som muligt. I denne protokol var SCID / Beige musene alle 4 til 6 uger gamle og vejede mellem 15 og 20 g. For mus, der vejer mindre end 15 g, kan injektionsvolumenet justeres til mindre end 100 μL; Ellers injiceres 100 μL. Efter fjernelse fra kraniet skal hele hjernen opbevares i 1x DPBS i højst 1 time før billeddannelse ved stereoskopisk mikroskopi for at forhindre signalreduktion og vævsdegeneration. Til immunofluorescensbilleddannelse bør hjernevæv ikke placeres i formalin, fordi det genererer endogen autofluorescens, der forhindrer erhvervelsen af billeder af høj kvalitet. Vi har bemærket, at luciferase-billeddannelse ikke altid afslører hjernemetastaser, især meget små læsioner; GFP-billeddannelse ved stereomikroskopi kan dog visualisere alle læsioner. Desuden kan GFP-billeddannelse vise mere end 1 læsion, mens luciferase-billeddannelse ikke gør det.
De foreslåede procedurer kan ændres lidt i henhold til brugerpræferencer. For det første kunne antallet af injicerede celler og varigheden af metastasedannelsen justeres for forskellige undersøgelser. For det andet kunne musenes halevene visualiseres tydeligere ved at bruge varmt vand til at udvide venen eller UV-lys til at belyse venerne. Endelig kan nålens størrelse i sprøjten være enten 30 G eller 28 G.
Fordele og begrænsninger ved eksisterende musemodeller af hjernemetastaser er blevet gennemgået andetsteds3 . Den hjernemetastasemodel, vi beskrev her, har sine begrænsninger og styrker. En begrænsning er, at det ikke rekapitulerer alle trin i hjernens metastatiske proces og ikke tillader forhør af de indledende faser af den metastatiske proces, dvs. spredning af primære brystkræftceller i kredsløbet. Denne model kan heller ikke bruges til at studere interaktionerne mellem tumorceller og værtsimmunmikromiljøet under processen med hjernemetastase eller til at evaluere immunterapeutiske anvendelser. Denne model har imidlertid flere fordele i forhold til andre hjernemetastasemodeller. For det første, i modsætning til spontane modeller, hvor kun en lille brøkdel af musene udvikler hjernemetastaser med variable intervaller, tilbyder vores model fordelen ved konsekvent at føre til metastaser til hjernen, typisk hos mere end 70% af musene. For det andet tillader haleveneinjektion spredning af celler primært til lungen med efterfølgende spredning til hjernen, mens podning via intracarotidarterien tillader celler at sprede sig direkte til hjernen; Intrakardiale injektioner tillader systemisk distribution af kræftcellerne til hjernen såvel som til ekstrakranielle steder såsom lunge og knogle. Således rekapitulerer vores model hjernens metastatiske koloniseringstrin bedre end de almindeligt anvendte intrakardiale eller intracarotidinjektionsmodeller, fordi cellerne krydser lungekapillærsengene og overlever i cirkulationen, før de genererer hjernelæsioner. Endelig er injektion af brystkræftceller via halevenen teknisk mindre udfordrende end intracarotid eller intrakardial injektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Christine F. Wogan, MS, ELS, fra MD Anderson's Division of Radiation Oncology for videnskabelig redigering af manuskriptet og Carol M. Johnston fra MD Anderson's Division of Surgery Histology Core for hjælp med hæmatoxylin og eosinfarvning. Vi er taknemmelige over for Veterinary Medicine and Surgery Core hos MD Anderson for deres støtte til dyreforsøgene. Dette arbejde blev støttet af følgende bevillinger: Susan G. Komen Career Catalyst Research grant (CCR16377813 til BGD), American Cancer Society Research Scholar grant (RSG-19–126–01 til BGD) og State of Texas Rare and Aggressive Breast Cancer Research Program. Også delvist støttet af Cancer Center Support (Core) Grant P30 CA016672 fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, til University of Texas MD Anderson Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 1000 µL pipette tip filtered | Genesee Scientific | 23430 | |
| 10 mL Serological Pipets | Genesee Scientific | 12-112 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% |
| Centrifuge tubes 15 mL bulk | Genesee Scientific | 28103 | |
| Corning 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine | GIBICO Inc. USA | MT10080CV | |
| Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Eppendorf centufuge 5810R | Eppendorf | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBICO Inc. USA | 16000044 | 10% |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers (40 μm) | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1 µg/mL |
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | 5 µg/mL |
| Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| MDA-IBC3 cell lines | MD Anderson Cancer Center | Generated by Dr. Woodward's lab24 | |
| Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid | System Biosciences | BLIV713PA-1 | |
| microtubes clear sterile 1.7 mL | Genesee Scientific | 24282S | |
| Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 23-401C | |
| TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Tail vein injection | |||
| C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J - SCID/Beige | Envigo | SCID/beige mice | |
| BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm) | BD | 328466 | |
| Plas Labs Broome-Style Rodent Restrainers | Plas Labs 551BSRR | 01-288-32A | Order fromThermo Fisher Scientific |
| Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof) | Thermo Fisher Scientific | 50420872 | 70 % used |
| Imaging | |||
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| Disposable PES Filter Units 0.45 µm | Fisherbrand | FB12566501 | filter system to sterilize the D-luciferin |
| D-Luciferin | Biosynth | L8220-1g | stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL |
| 1.7 mL microtube amber | Genesee Scientific | 24-282AM | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC-14043-704-06 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| IVIS 200 | PerkinElmer | machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine | |
| Plastic Containers with Lids | Fisherbrand | 02-544-127 | |
| Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 1000957 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| Stereomicroscope Imaging | |||
| Stereomicroscope AZ100 | Nikon | model AZ-STGE | software NIS-ELEMENT |
| Formalin 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| TC treated dishes 100x20 mm | Genesee Scientific | 25202 |
References
- Achrol, A. S., et al.
- Nayak, L., Lee, E. Q., Wen, P. Y.
- Lowery, F. J., Yu, D. Brain metastasis: Unique challenges and open opportunities. Biochimica et Biophysica Acta Review Cancer. 1867 (1), 49-57 (2017).
- Brufsky, A. M., et al. Central nervous system metastases in patients with HER2-positive metastatic breast cancer: incidence, treatment, and survival in patients from registHER. Clinical Cancer Research. 17 (14), 4834-4843 (2011).
- Valiente, M., et al.
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Woditschka, S., et al. DNA double-strand break repair genes and oxidative damage in brain metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (7), (2014).
- Palmieri, D., et al. Vorinostat inhibits brain metastatic colonization in a model of triple-negative breast cancer and induces DNA double-strand breaks. Clinical Cancer Research. 15 (19), 6148-6157 (2009).
- Kim, S. J., et al. Astrocytes upregulate survival genes in tumor cells and induce protection from chemotherapy. Neoplasia. 13 (3), 286-298 (2011).
- Zhang, S., et al. SRC family kinases as novel therapeutic targets to treat breast cancer brain metastases. Cancer Research. 73 (18), 5764-5774 (2013).
- Valiente, M., et al. Serpins promote cancer cell survival and vascular co-option in brain metastasis. Cell. 156 (5), 1002-1016 (2014).
- Gril, B., et al. Effect of lapatinib on the outgrowth of metastatic breast cancer cells to the brain. Journal of the National Cancer Institute. 100 (15), 1092-1103 (2008).
- Gril, B., et al. Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis. Clinical Cancer Research. 17 (1), 142-153 (2011).
- Palmieri, D., et al. Profound prevention of experimental brain metastases of breast cancer by temozolomide in an MGMT-dependent manner. Clinical Cancer Research. 20 (10), 2727-2739 (2014).
- Priego, N., et al. STAT3 labels a subpopulation of reactive astrocytes required for brain metastasis. Nature Medicine. 24 (7), 1024-1035 (2018).
- Debeb, B. G., et al. miR-141-mediated regulation of brain metastasis from breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 108 (8), (2016).
- Chang, S., Parker, S. L., Pham, T., Buzdar, A. U., Hursting, S. D. Inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program of the National Cancer Institute, 1975-1992. Cancer. 82 (12), 2366-2372 (1998).
- Hance, K. W., Anderson, W. F., Devesa, S. S., Young, H. A., Levine, P. H. Trends in inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program at the National Cancer Institute. Journal of National Cancer Institute. 97 (13), 966-975 (2005).
- Dirix, L. Y., Van Dam, P., Prove, A., Vermeulen, P. B. Inflammatory breast cancer: Current understanding. Current Opinion in Oncology. 18 (6), 563-571 (2006).
- Wang, Z., et al. Pattern of distant metastases in inflammatory breast cancer - A large-cohort retrospective study. Journal of Cancer. 11 (2), 292-300 (2020).
- Uemura, M. I., et al. Development of CNS metastases and survival in patients with inflammatory breast cancer. Cancer. 124 (11), 2299-2305 (2018).
- Smith, D. L., Debeb, B. G., Thames, H. D., Woodward, W. A. Computational modeling of micrometastatic breast cancer radiation dose response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 96 (1), 179-187 (2016).
- Fukumura, K., et al. Multi-omic molecular profiling reveals potentially targetable abnormalities shared across multiple histologies of brain metastasis. Acta Neuropathol. , (2021).
- Klopp, A. H., et al. Mesenchymal stem cells promote mammosphere formation and decrease E-cadherin in normal and malignant breast cells. PLoS One. 5 (8), 12180 (2010).
- Villodre, E. S., et al. Abstract P3-01-10: Ndrg1-egfr axis in inflammatory breast cancer tumorigenesis and brain metastasis. Cancer Research. 80 (4), 10 (2020).
