Summary
हम एक अंतर्जात एचईआर 2-प्रवर्धित भड़काऊ स्तन कैंसर सेल लाइन के पूंछ-नस इंजेक्शन के माध्यम से उत्पन्न स्तन कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेसिस के एक जेनोग्राफ्ट माउस मॉडल का वर्णन करते हैं।
Abstract
मस्तिष्क में मेटास्टैटिक प्रसार कई प्रकार के कैंसर का एक सामान्य और विनाशकारी अभिव्यक्ति है। अकेले संयुक्त राज्य अमेरिका में, हर साल लगभग 200,000 रोगियों को मस्तिष्क मेटास्टेस का निदान किया जाता है। प्राथमिक स्तन कैंसर और प्रणालीगत विकृतियों वाले रोगियों के लिए जीवित रहने के परिणामों में सुधार करने में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है; हालांकि, नैदानिक मस्तिष्क मेटास्टेस वाले रोगियों के लिए निराशाजनक पूर्वानुमान इस घातक बीमारी के खिलाफ नए चिकित्सीय एजेंटों और रणनीतियों को विकसित करने की तत्काल आवश्यकता पर प्रकाश डालता है। उपयुक्त प्रयोगात्मक मॉडल की कमी मस्तिष्क मेटास्टेसिस जीव विज्ञान और उपचार की हमारी समझ की प्रगति में बाधा डालने वाली प्रमुख बाधाओं में से एक रही है। यहां, हम मस्तिष्क मेटास्टेसिस के एक जेनोग्राफ्ट माउस मॉडल का वर्णन करते हैं जो भड़काऊ स्तन कैंसर (आईबीसी) से प्राप्त एक अंतर्जात एचईआर 2-प्रवर्धित सेल लाइन के पूंछ-नस इंजेक्शन के माध्यम से उत्पन्न होता है, जो स्तन कैंसर का एक दुर्लभ और आक्रामक रूप है। मस्तिष्क मेटास्टेसिस की निगरानी के लिए कोशिकाओं को जुगनू लूसिफेरस और ग्रीन फ्लोरेसेंस प्रोटीन के साथ लेबल किया गया था, और बायोलुमिनेसेंस इमेजिंग, फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोपी और हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन द्वारा मेटास्टैटिक बोझ की मात्रा निर्धारित की गई थी। चूहे मजबूत और लगातार मस्तिष्क मेटास्टेस विकसित करते हैं, जिससे मेटास्टैटिक प्रक्रिया में प्रमुख मध्यस्थों की जांच और नई उपचार रणनीतियों के प्रीक्लिनिकल परीक्षण के विकास की अनुमति मिलती है।
Introduction
मस्तिष्क मेटास्टेसिस प्रणालीगत विकृतियों की एक सामान्य और घातक जटिलता है। अधिकांश मस्तिष्क मेटास्टेस फेफड़े, स्तन या त्वचा के प्राथमिक ट्यूमर से उत्पन्न होते हैं, जो सामूहिक रूप से 67-80% मामलों के लिए जिम्मेदारहोते हैं। मस्तिष्क मेटास्टेसिस की घटनाओं का अनुमान 100,000 से 240,000 मामलों के बीच भिन्न होता है, और इन संख्याओं को कम करके आंका जा सकता है क्योंकि मेटास्टैटिककैंसर से मरने वाले रोगियों के लिए शव परीक्षा दुर्लभ है। मस्तिष्क मेटास्टेस वाले रोगियों में मस्तिष्क मेटास्टेस के बिना रोगियों के सापेक्ष एक खराब रोग का निदान और कम समग्र अस्तित्व होताहै। मस्तिष्क मेटास्टेस के लिए वर्तमान उपचार विकल्प काफी हद तक उपशामक हैं औरअधिकांश रोगियों के लिए जीवित रहने के परिणामों में सुधार करने में विफल रहते हैं। इस प्रकार, मस्तिष्क मेटास्टेसिस एक चुनौती बनी हुई है, और अधिक प्रभावी उपचार विकसित करने के लिए मस्तिष्क मेटास्टेसिस प्रगति के तंत्र को बेहतर ढंग से समझने की आवश्यकता बनी हुई है।
प्रयोगात्मक मॉडल के उपयोग ने मस्तिष्क में स्तन कैंसर मेटास्टैटिक प्रगति के विशिष्ट तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है और विभिन्नचिकित्सीय दृष्टिकोणों 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 की प्रभावकारिता के मूल्यांकन की अनुमति दी है।. हालांकि, बहुत कम मॉडल मस्तिष्क मेटास्टेसिस विकास की जटिलताओं को सटीक और पूरी तरह से पुन: प्रस्तुत कर सकते हैं। ऑर्थोटोपिक, टेल-वेन, इंट्राकार्डियक, इंट्राकैरोटिड धमनी और इंट्रासेरेब्रल इंजेक्शन सहित प्रशासन के विभिन्न मार्गों द्वारा चूहों में कैंसर कोशिकाओं के टीकाकरण के माध्यम से विवो मॉडल में कई प्रयोगात्मक उत्पन्न किए गए हैं। प्रत्येक तकनीक के फायदे और नुकसान हैं, जैसा कि कहीं और समीक्षा की गईहै। हालांकि, इनमें से कोई भी माउस मॉडल मस्तिष्क मेटास्टेसिस की नैदानिक प्रगति को पूरी तरह से दोहरा नहीं सकता है।
मस्तिष्क मेटास्टेस विशेष रूप से भड़काऊ स्तन कैंसर (आईबीसी) के रोगियों में आम हैं, जो प्राथमिक स्तन कैंसर का एक दुर्लभ लेकिन आक्रामक संस्करण है। आईबीसी स्तन कैंसर के मामलों के 1% से 4% के लिए जिम्मेदार है, लेकिन यहसंयुक्त राज्य अमेरिका में स्तन कैंसर से संबंधित मौतों के अनुपातहीन 10% के लिए जिम्मेदार है। आईबीसी को तेजी से मेटास्टेसाइज करने के लिए जाना जाता है; वास्तव में, आईबीसी रोगियों के एक तिहाई निदान के समय दूर मेटास्टेसिस19,20 है। मस्तिष्क मेटास्टेसिस के लिए विशिष्ट, आईबीसी वाले रोगियों में गैर-आईबीसी21 वाले रोगियों की तुलना में मस्तिष्क मेटास्टेसिस की अधिक घटनाएं होती हैं। हाल ही में, हमने प्रदर्शित किया कि एमडीए-आईबीसी 3 सेल लाइन, ईआर -/ पीआर - / एचईआर 2 + आईबीसी के साथ एक रोगी के घातक फुफ्फुस बहाव द्रव से प्राप्त होती है, जो माउस जेनोग्राफ्ट्स में आईबीसी विशेषताओं को पुन: उत्पन्न करती है, जिसमें पूंछ-नस द्वारा इंजेक्शन दिए जाने पर चूहों में फेफड़ों के मेटास्टेस के बजाय मस्तिष्क मेटास्टेस विकसित करने की एक बढ़ी हुई प्रवृत्ति होती है, जिससे यह सेल लाइन मस्तिष्क मेटास्टेसिस 16 के विकास का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा मॉडल बन जाती है।
यहां हम एमडीए-आईबीसी 3 कोशिकाओं के पूंछ-शिरा इंजेक्शन के माध्यम से मस्तिष्क मेटास्टेसिस उत्पन्न करने और स्टीरियोफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और ल्यूसिफेरस इमेजिंग के माध्यम से मेटास्टैटिक बोझ का मूल्यांकन करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं। इस विधि का उपयोग मस्तिष्क में स्तन कैंसर मेटास्टेसिस के प्रमुख मध्यस्थों की खोज करने और चिकित्सीय हस्तक्षेप16,22,23 की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए किया गया है। इस तकनीक का नुकसान यह है कि यह मस्तिष्क मेटास्टैटिक प्रक्रिया में सभी चरणों को पुन: उत्पन्न नहीं करता है। फिर भी, इसके प्रमुख लाभों में मजबूती और प्रजनन क्षमता, इंट्रावेशन के प्रासंगिक मेटास्टेसिस जीव विज्ञान की भागीदारी, फेफड़ों को पार करना और मस्तिष्क में बहिर्वाह, और तकनीक के संदर्भ में इसकी सापेक्ष सादगी शामिल है।
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Protocol
यहां वर्णित विधि एमडी एंडरसन कैंसर सेंटर की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित की गई है और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य दिशानिर्देशों के संस्थानों का अनुपालन करती है। योजनाबद्ध वर्कफ़्लो, सभी चरणों के साथ, चित्रा 1 के रूप में प्रस्तुत किया गया है।
1. सेल की तैयारी
वुडवर्ड की प्रयोगशाला24 में उत्पन्न एमडीए-आईबीसी 3 (ईआर-/पीआर-/एचईआर 2+) सेल लाइन को ल्यूसिफेरस-ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ल्यूक-जीएफपी) प्लास्मिड के साथ स्थिर रूप से ट्रांसड्यूस किया गया था।
- हैम के एफ -12 मीडिया में कल्चर ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं को 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1 μg / mL हाइड्रोकार्टिसोन, 5 μg / mL इंसुलिन, और 1% एंटीबायोटिक-एंटीमाइटोटिक के साथ पूरक किया जाता है।
- प्लेट एमडीए-आईबीसी 3-ल्यूक-जीएफपी कोशिकाएं 37 डिग्री सेल्सियस पर और 5% सीओ2 टी -75 फ्लास्क में कंफ्लुएंट होने तक। कोशिकाओं को पारित करने के लिए पर्याप्त रूप से संकुचित होने से पहले हर 3 दिनों में मीडिया बदलें।
- मीडिया को हटाकर कोशिकाओं की कटाई करें, प्रत्येक फ्लास्क को 1x डलबेकको (यानी, कैल्शियम- और मैग्नीशियम-मुक्त) फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) के 10 मिलीलीटर के साथ धोएं, और 0.25% ट्रिप्सिन-एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) के 2 मिलीलीटर जोड़ें। कोशिकाओं को अलग होने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए फ्लास्क में 5 एमएल पूर्ण मीडिया जोड़ें और पूरी सामग्री को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब (आवश्यक कोशिकाओं की कुल संख्या के आधार पर 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए अनुकूलित) में स्थानांतरित करें। पेलेट कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 290 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
नोट: पूर्ण मीडिया हैम का एफ -12 मीडिया 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1 μg / mL हाइड्रोकार्टिसोन, 5 μg / mL इंसुलिन, और 1% एंटीबायोटिक-एंटीमाइटोटिक के साथ पूरक है। - सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। फिर 1x DPBS के 10 mL के साथ कोशिकाओं को धो लें। कोशिकाओं को पेलेट करने और सतह पर तैरनेवाले को सावधानी से छोड़ने के लिए 5 मिनट के लिए 290 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। 1 मिलीलीटर ताजा 1x डीपीबीएस के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह मिलाएं।
- एकल-कोशिका निलंबन बनाने के लिए, 40 μm बाँझ सेल छन्नी के माध्यम से कोशिकाओं को फ़िल्टर करें।
- एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके सेल घनत्व की गणना करें।
नोट: गिनती में त्रुटियों को कम करने के लिए, विभिन्न सेल कमजोर पड़ने बनाएं और उन्हें अलग-अलग गिनें, और कोशिकाओं की एकाग्रता (कोशिकाओं / एमएल की संख्या) निर्धारित करने के लिए औसत मूल्य की गणना करें।- 1: 5 कमजोर पड़ने का नमूना बनाने के लिए सेल निलंबन के 2 μL + 1x DPBS के 8 μL एकत्र करें।
- 1: 10 कमजोर पड़ने का नमूना बनाने के लिए सेल निलंबन + 9 μL 1x DPBS एकत्र करें।
- 0.4% ट्राइपैन ब्लू दाग के 10 μL जोड़ें। नमूना मिश्रण को कुछ बार ऊपर और नीचे करके अच्छी तरह से मिलाएं।
- गिनती कक्ष स्लाइड के आधे चंद्रमा के आकार के नमूना लोडिंग क्षेत्र में नमूने के 10 μL को धीरे से पिपेट करें। सुनिश्चित करें कि अंदर कोई बुलबुले नहीं हैं; गिनती से पहले कोशिकाओं को कक्ष में बसने की अनुमति देने के लिए 30 सेकंड तक प्रतीक्षा करें।
- 1x DPBS वाली कोशिकाओं को 5 x 105 या 1 x 106 कोशिकाओं प्रति 100 μL के घनत्व तक पतला करें। टेल-वेन इंजेक्शन के लिए सेल निलंबन को 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए इंजेक्शन तक बर्फ पर कोशिकाओं को रखें।
2. टेल वेन इंजेक्शन
- बेज चूहों का उपयोग 4- से 6 सप्ताह की मादा एथिमिक एससीआईडी / बेज चूहों का उपयोग करें।
- सेल सस्पेंशन के 100 μL खींचने के लिए 30 G सिरिंज तैयार करें। सभी हवा के बुलबुले हटा दें।
- पूंछ-नस इंजेक्शन की सुविधा और इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान आंदोलन से चोटों को रोकने के लिए एक कृंतक निरोधक (व्यास लगभग 1 इंच) में माउस रखें।
- माउस की पूंछ को धीरे-धीरे 3-4 बार पोंछने के लिए अल्कोहल कॉटन पैड (70% इथेनॉल से बने) का उपयोग करें और पूंछ की नस को अधिक स्पष्ट रूप से दिखाई देने के लिए 5-10 सेकंड तक पकड़ें।
- सिरिंज को माउस की पूंछ में 15-30 ° के कोण पर डालें। धीरे-धीरे सेल निलंबन को पूंछ की नस में धकेलें।
- सिरिंज को धीरे से निकालें और किसी भी रक्तस्राव को रोकने में मदद करने के लिए पूंछ को कुछ सेकंड तक पकड़ने के लिए कपास पैड का उपयोग करें।
- चूहों को उनके पिंजरों में वापस करें और इंजेक्शन के 2-4 घंटे बाद उनकी जांच करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कोई प्रतिकूल प्रभाव नहीं होता है।
3. मस्तिष्क मेटास्टेसिस बोझ का मूल्यांकन
- पतला डी-लूसिफेरिन घोल तैयार करें।
नोट: स्टॉक एकाग्रता 47.6 एमएम (15.15 मिलीग्राम / एमएल) है, और उपयोग के लिए एकाग्रता 1.515 मिलीग्राम /- डी-लूसिफेरिन बोतल में 1x DPBS के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
- दो 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में से प्रत्येक में 2.5 एमएल समाधान रखें।
- इसे कुल्ला करने के लिए फिर से डी-लूसिफेरिन बोतल में 1x डीपीबीएस का एक और 5 मिलीलीटर जोड़ें। प्रत्येक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 2.5 एमएल डालें।
- बोतल में 1x DPBS के एक और 5 मिलीलीटर रखें और इसे फिर से कुल्ला करें। कुल्ला करने की प्रक्रिया को दो बार दोहराएं।
- प्रत्येक 50 एमएल ट्यूब में कुल 66 एमएल (लगभग 33 एमएल प्रति ट्यूब) में 1x डीपीबीएस जोड़ें। प्रत्येक ट्यूब में लगभग 33 एमएल घोल होना चाहिए।
- ट्यूबों को अच्छी तरह से मिलाएं और फिर दोनों को एक बाँझ निस्पंदन इकाई (150 एमएल पीईएस फिल्टर 0.45 μm) में मिलाएं।
- घोल को फ़िल्टर करें और फिर फ़िल्टर किए गए घोल को बाँझ एम्बर 1.7 एमएल माइक्रोट्यूब में एलिकोट करें।
- ल्यूसिफेरस इमेजिंग द्वारा मस्तिष्क मेटास्टेस का पता लगाना।
- चूहों में इंजेक्शन से पहले बर्फ और भंवर पर रखकर डी-लूसिफेरिन को पिघलाएं।
- अल्कोहल कॉटन पैड के साथ इंजेक्शन के क्षेत्र को साफ करें और 0.5 एमएल इंसुलिन सिरिंज, प्रत्येक पिंजरे के लिए एक सिरिंज का उपयोग करके प्रति माउस इंट्रापरिटोनियल रूप से डी-लूसिफेरिन के 100 μL इंजेक्ट करें।
- 10 मिनट के बाद, छोटे पशु प्रेरण कक्ष से जुड़े पशु वेपोराइज़र का उपयोग करके 5 मिनट के लिए आइसोफ्लुरेन (2% ओ 2-2.5% आइसोफ्लुरेन) के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें।
- इन विवो इमेजिंग सिस्टम चालू करें। जबकि पहले पिंजरे से चूहे संज्ञाहरण के तहत हैं, अगले पिंजरे में चूहों में डी-लूसिफेरिन इंजेक्ट करें।
- चूहों को विवो इमेजिंग सिस्टम मशीन में रखें और उदर और पृष्ठीय चित्र प्राप्त करें। 2 मिनट के एक्सपोज़र समय का चयन करें, और फ़ील्ड दृश्य में विकल्प ई (पूरे शरीर) चुनें। प्रेस अधिग्रहण करें. इसके बाद, छवि सहेजें (चित्रा 2)।
नोट: यदि छवि ल्यूमिनेसेंस की संतृप्ति दिखाती है, तो एक्सपोज़र समय कम करें।
- जीएफपी इमेजिंग द्वारा मस्तिष्क मेटास्टेस का पता लगाना।
- मस्तिष्क ऊतक की तैयारी।
- कोशिकाओं के इंजेक्शन के लगभग 8-10 सप्ताह बाद या जब चूहे मस्तिष्क मेटास्टेसिस बोझ के कारण मरणासन्न हो जाते हैं, तो आईएसीयूसी द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार, आइसोफ्लुरेन ओवरडोज के साँस लेने के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद चूहों को इच्छामृत्यु दें।
- इसोफ्लुरेन के साथ इच्छामृत्यु के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद, चूहों को 70% इथेनॉल समाधान के साथ स्प्रे करें और कैंची के साथ सिर क्षेत्र और कानों से फर को हटा दें। इसके बाद, गर्दन के ग्रीवा क्षेत्र में एक कट बनाएं (माउस को हटाने के लिए सावधान रहें)। खोपड़ी को काटें और इसे बाहर खींचें। इसके बाद, मस्तिष्क को ध्यान से हटा दें।
- एकत्रित दिमाग को ऊतक कैसेट में रखें।
- कैसेट को ठंडे 1x डीपीबीएस वाले कंटेनर में स्थानांतरित करें।
नोट: मस्तिष्क के नमूने 1x DPBS में 1 घंटे से अधिक समय तक नहीं रखा जाना चाहिए। यदि एक ही समय में कई मस्तिष्क के नमूने एकत्र किए जाने हैं, तो एक समय में केवल कुछ चूहों (10 प्रति दौर) को इच्छामृत्यु दें।
- स्टीरियोमाइक्रोस्कोपिक इमेजिंग।
- पूरे मस्तिष्क को 100 सेमी ऊतक डिश ढक्कन पर स्थानांतरित करें।
- चित्र 3 ए (लाल वर्ग) में दिखाए गए अनुसार पूरे मस्तिष्क के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देने के लिए लेंस 0.5 x के साथ स्थिति 3 पर स्टीरियोमाइक्रोस्कोप और यूवी प्रकाश चालू करें।
- लाइव व्यू दबाएं (चित्रा 3 ए, हरा वर्ग)।
- दृश्य पर ध्यान केंद्रित करें जबकि मस्तिष्क उदर स्थिति में है।
- सॉफ़्टवेयर में जीएफपी (यदि कोशिकाएं जीएफपी-लेबल हैं) या टीएक्सरेड (यदि कोशिकाएं आरएफपी-लेबल हैं) (चित्रा 3 ए, पीला वर्ग) का चयन करें, माइक्रोस्कोप पर उचित फ़िल्टर का चयन करें, और एक तस्वीर लें।
नोट: सोला प्रकाश स्रोत सेटिंग को लगभग 30% पर रखें; यदि जीएफपी बहुत उज्ज्वल है, तो उचित संकेत देखे जाने तक कम करें। - नमूने को स्थानांतरित किए बिना, उज्ज्वल प्रकाश चालू करें और बीएफ (चित्रा 3 ए, पीला वर्ग) का चयन करें। एक तस्वीर ले लो.
- पृष्ठीय स्थिति में मस्तिष्क के साथ पिछले चरणों को दोहराएं।
नोट: आकार के आधार पर, एक ही जीएफपी पॉजिटिव मस्तिष्क मेटास्टेसिस घाव उदर और पृष्ठीय दोनों स्थितियों में दिखाई दे सकता है। ऐसे मामले में, एक ही घाव के डुप्लिकेट परिमाणीकरण से बचें। छवियों को TIFF एक्सटेंशन के साथ सहेजें (जो चित्र फ़ाइल में सभी जानकारी रखता है)। - छवियों को TIFF एक्सटेंशन के साथ सहेजें (जो चित्र फ़ाइल में सभी जानकारी रखता है)।
- सभी नमूने के लिए चरणों को दोहराएँ।
- TIFF छवियों को JPEG में परिवर्तित करें ताकि फ़ाइलों को किसी भी कंप्यूटर के साथ खोला जा सके जिसमें संबंधित सॉफ़्टवेयर स्थापित नहीं है (फ़ाइल | आयात/निर्यात | फ़ाइलों को कनवर्ट करें)।
- फ्लोरोसेंट छवि को उज्ज्वल क्षेत्र छवि के साथ विलय करने के लिए, दोनों छवियों को खोलें और फ़ाइल पर जाएं चैनलों का विलय करें. उचित घटकों का चयन करें, जीएफपी के लिए हरा और बीएफ के लिए ब्राइटफील्ड, और ठीक दबाएं। मर्ज की गई छवि सहेजें.
- मस्तिष्क ट्यूमर क्षेत्र की मात्रा निर्धारित करने के लिए, फ्लोरोसेंट छवि का उपयोग करें। माप का चयन करें | मैनुअल माप | क्षेत्र। स्वचालित चयन (चित्रा 3 बी, हरा वर्ग) का चयन करें, और तीर को जीएफपी-पॉजिटिव क्षेत्र में ले जाएं और स्वचालित रूप से चयन बनाने के लिए क्लिक करें। चयन की पुष्टि करने के लिए फिर से क्लिक करें और फिर सभी माप दिखाई देंगे (चित्रा 3 बी, लाल वर्ग)। यदि एक से अधिक जीएफपी-पॉजिटिव क्षेत्र मौजूद है, तो प्रक्रिया को दोहराएं।
- मस्तिष्क की छवियां प्राप्त होने के बाद, 10% तटस्थ बफर फॉर्मेलिन का उपयोग करके नियमित ऊतक निर्धारण प्रोटोकॉल के लिए आगे बढ़ें।
- एक बार जब दिमाग ठीक हो जाता है, तो चयनित मार्करों का पता लगाने के लिए मस्तिष्क मेटास्टेसिस और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला होने की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए हेमटोक्सिलिन और ईओसिन धुंधला होने के बाद मानक हिस्टोलॉजिकल सेक्शनिंग के लिए आगे बढ़ें।
नोट: इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री यूटी एमडी एंडरसन कैंसर सेंटर में पैथोलॉजी कोर प्रयोगशाला में किया गया था जिसमें ज्ञात मार्करों के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला होने के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल है।
- एक बार जब दिमाग ठीक हो जाता है, तो चयनित मार्करों का पता लगाने के लिए मस्तिष्क मेटास्टेसिस और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला होने की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए हेमटोक्सिलिन और ईओसिन धुंधला होने के बाद मानक हिस्टोलॉजिकल सेक्शनिंग के लिए आगे बढ़ें।
- मस्तिष्क ऊतक की तैयारी।
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Representative Results
इस तर्क के साथ कि लेबल कोशिकाएं प्रीक्लिनिकल माउस मॉडल में मस्तिष्क मेटास्टेसिस की निगरानी और विज़ुअलाइज़ेशन की सुविधा प्रदान करती हैं, हमने मस्तिष्क मेटास्टेस की निगरानी करने और बायोलुमिनेसेंस इमेजिंग और फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोपी का उपयोग करके मेटास्टैटिक बोझ को मापने के लिए ल्यूक और जीएफपी के साथ एमडीए-आईबीसी 3 कोशिकाओं को टैग किया। बेज चूहों की पूंछ की नसों में लेबल एमडीए-आईबीसी 3 कोशिकाओं के इंजेक्शन के परिणामस्वरूप मस्तिष्क मेटास्टेसिस (यानी, 66.7% से 100%) विकसित करने वाले चूहों का उच्च प्रतिशत 16,23,25 था। ल्यूसिफेरस इमेजिंग (चित्रा 2) या स्टीरियोफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4) द्वारा इंजेक्शन के 8 सप्ताह बाद मस्तिष्क मेटास्टैटिक घावों का पता लगाया जा सकता है। जीएफपी इमेजिंग हमें प्रत्येक मेटास्टैटिक घाव के क्षेत्र का पता लगाने, गिनने और गणना करने की अनुमति देता है। इमेजिंग के बाद, मस्तिष्क मेटास्टेसिस के कुछ हिस्सों को फॉर्मलिन-तय किया जाता है और मस्तिष्क मेटास्टेसिस घावों (चित्रा 5 ए) की उपस्थिति को मान्य करने के लिए हेमटोक्सिलिन और ईओसिन धुंधला करने के लिए संसाधित किया जाता है और विशिष्ट प्रोटीन मार्करों (चित्रा 5 बी, सी) का पता लगाने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला किया जाता है।
चित्रा 1: पूंछ-शिरा इंजेक्शन के माध्यम से मस्तिष्क मेटास्टेसिस उत्पन्न करने के लिए योजनाबद्ध वर्कफ़्लो। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: पृष्ठीय और उदर स्थितियों में चूहों की लूसिफेरस छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: स्टीरियोमाइक्रोस्कोपी के लिए उपयोग किए जाने वाले इमेजिंग सॉफ्टवेयर के स्क्रीनशॉट । (ए) छवियों को प्राप्त करने के तरीके को दिखाने वाले कदम। बाईं ओर हरा वर्ग लाइव व्यू बटन दिखाता है; दाईं ओर लाल वर्ग नोजपीस लेंस और ज़ूम स्थिति के लिए माइक्रोस्कोप की स्थिति दिखाता है; और पीला वर्ग फ़िल्टर चयन पर प्रकाश डालता है। (बी) ट्यूमर के बोझ को मापने में शामिल चरणों का स्क्रीनशॉट। ऊपरी बाईं ओर हरा वर्ग क्षेत्र गणना के लिए ऑटो चयन मोड दिखाता है; इसके नीचे लाल वर्ग मस्तिष्क मेटास्टेसिस घाव का चयन करने के बाद क्षेत्र मूल्यों और अन्य मापों को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: एमडीए-आईबीसी 3 सेल लाइन के पूंछ-नस इंजेक्शन से मेटास्टेस के साथ माउस दिमाग की स्टीरियोस्कोपिक छवियां। बाईं ओर ब्राइटफील्ड चित्र को जीएफपी छवि (मध्य) के साथ विलय कर दिया जाता है और फिर विलय (दाएं) कर दिया जाता है। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: चूहों में एमडीए-आईबीसी 3-व्युत्पन्न मस्तिष्क मेटास्टेस की दागदार छवियों को दिखाने वाली स्लाइड । (ए) हेमटोक्सीलिन और ईओसिन दाग मस्तिष्क मेटास्टेसिस की हिस्टोलॉजिकल पुष्टि प्रदान करते हैं। एमडीए-आईबीसी 3-व्युत्पन्न मस्तिष्क मेटास्टैटिक ट्यूमर के इम्यूनोस्टेनिंग एचईआर 2 (बी) और ई-कैडरिन (सी) के लिए सकारात्मक धुंधलापन दिखाते हैं। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं। व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए कोशिकाओं को 1 घंटे से अधिक समय तक बर्फ पर नहीं रखा जाना चाहिए। इंजेक्शन से पहले चूहों की पूंछ को पोंछने के लिए अल्कोहल कॉटन पैड का उपयोग किया जाना चाहिए, पूंछ की त्वचा को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए बहुत जोर से या बहुत बार पोंछने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। सुनिश्चित करें कि सेल निलंबन में कोई हवा के बुलबुले मौजूद नहीं हैं, ताकि चूहों को रक्त वाहिका एम्बोली से मरने से रोका जा सके। पूंछ में रक्त वाहिका को छेदने से बचने के लिए इंजेक्शन के कोण को 45 ° या उससे कम पर बनाए रखें और सभी कोशिकाओं के सफल इंजेक्शन को सुनिश्चित करने के लिए पूंछ-नस में कम से कम 1/3 सुई डालें। इंजेक्शन वाली कोशिकाओं की कुल मात्रा को चूहों के वजन के अनुसार समायोजित किया जा सकता है, लेकिन कोशिकाओं की कुल संख्या को यथासंभव समान रखा जाना चाहिए। बेज चूहे सभी 4 से 6 सप्ताह के थे और उनका वजन 15 से 20 ग्राम के बीच था। 15 ग्राम से कम वजन वाले चूहों के लिए, इंजेक्शन की मात्रा को 100 μL से कम में समायोजित किया जा सकता है; अन्यथा, 100 μL इंजेक्शन दिया जाता है। खोपड़ी से इसे हटाने के बाद, सिग्नल में कमी और ऊतक अध: पतन को रोकने के लिए स्टीरियोस्कोपिक माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग से पहले पूरे मस्तिष्क को 1x DPBS में 1x DPBS में 1 घंटे से अधिक समय तक नहीं रखा जाना चाहिए। इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए, मस्तिष्क के ऊतकों को फॉर्मेलिन में नहीं रखा जाना चाहिए, क्योंकि यह अंतर्जात ऑटोफ्लोरेसेंस उत्पन्न करता है जो उच्च गुणवत्ता वाली छवियों के अधिग्रहण में बाधा डालता है। हमने ध्यान दिया है कि ल्यूसिफेरस इमेजिंग हमेशा मस्तिष्क मेटास्टेस को प्रकट नहीं करती है, विशेष रूप से बहुत छोटे घाव; हालांकि, स्टीरियोमाइक्रोस्कोपी द्वारा जीएफपी इमेजिंग सभी घावों की कल्पना कर सकती है। इसके अलावा, जीएफपी इमेजिंग 1 से अधिक घाव दिखा सकती है, जबकि ल्यूसिफेरस इमेजिंग नहीं करती है।
प्रस्तावित प्रक्रियाओं को उपयोगकर्ता वरीयताओं के अनुसार थोड़ा संशोधित किया जा सकता है। सबसे पहले, इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या और मेटास्टेसिस गठन की अवधि को विभिन्न अध्ययनों के लिए समायोजित किया जा सकता है। दूसरा, नसों को रोशन करने के लिए नस या यूवी प्रकाश को पतला करने के लिए गर्म पानी का उपयोग करके चूहों की पूंछ की नस को अधिक स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। अंत में, सिरिंज में सुई का आकार 30 ग्राम या 28 ग्राम हो सकता है।
मस्तिष्क मेटास्टेसिस के मौजूदा माउस मॉडल के फायदे और सीमाओं की समीक्षा कहीं और की गईहै । हमारे द्वारा यहां वर्णित मस्तिष्क मेटास्टेसिस मॉडल की अपनी सीमाएं और ताकत हैं। एक सीमा यह है कि यह मस्तिष्क मेटास्टैटिक प्रक्रिया के सभी चरणों को पुन: उत्पन्न नहीं करता है और मेटास्टैटिक प्रक्रिया के प्रारंभिक चरणों की पूछताछ की अनुमति नहीं देता है, यानी, परिसंचरण में प्राथमिक स्तन कैंसर कोशिकाओं का प्रसार। इसके अलावा, इस मॉडल का उपयोग मस्तिष्क मेटास्टेसिस की प्रक्रिया के दौरान ट्यूमर कोशिकाओं और मेजबान प्रतिरक्षा माइक्रोएन्वायरमेंट के बीच बातचीत का अध्ययन करने या इम्यूनोथेराप्यूटिक अनुप्रयोगों का मूल्यांकन करने के लिए नहीं किया जा सकता है। हालांकि, इस मॉडल में अन्य मस्तिष्क मेटास्टेसिस मॉडल पर कई फायदे हैं। सबसे पहले, सहज मॉडल के विपरीत जिसमें चूहों का केवल एक छोटा सा अंश परिवर्तनीय अंतराल पर मस्तिष्क मेटास्टेस विकसित करता है, हमारा मॉडल मस्तिष्क को मेटास्टेसिस के लिए लगातार अग्रणी होने का लाभ प्रदान करता है, आमतौर पर 70% से अधिक चूहों में। दूसरा, पूंछ-नस इंजेक्शन मुख्य रूप से मस्तिष्क में प्रसार के साथ फेफड़ों में कोशिकाओं के प्रसार की अनुमति देता है, जबकि इंट्राकैरोटिड धमनी के माध्यम से टीकाकरण कोशिकाओं को सीधे मस्तिष्क में प्रसारित करने की अनुमति देता है; इंट्राकार्डियक इंजेक्शन मस्तिष्क के साथ-साथ फेफड़ों और हड्डी जैसे एक्स्ट्राक्रैनियल साइटों के लिए कैंसर कोशिकाओं के प्रणालीगत वितरण की अनुमति देते हैं। इस प्रकार, हमारा मॉडल आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले इंट्राकार्डियक या इंट्राकैरोटिड इंजेक्शन मॉडल की तुलना में मस्तिष्क मेटास्टैटिक औपनिवेशीकरण कदम को बेहतर बनाता है क्योंकि कोशिकाएं फेफड़ों के केशिका बेड को पार करती हैं और मस्तिष्क के घावों को उत्पन्न करने से पहले परिसंचरण में जीवित रहती हैं। अंत में, पूंछ की नस के माध्यम से स्तन कैंसर कोशिकाओं का इंजेक्शन तकनीकी रूप से इंट्राकैरोटिड या इंट्राकार्डियक इंजेक्शन की तुलना में कम चुनौतीपूर्ण है।
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Disclosures
लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
हम पांडुलिपि के वैज्ञानिक संपादन के लिए एमडी एंडरसन डिवीजन ऑफ रेडिएशन ऑन्कोलॉजी के क्रिस्टीन एफ वोगन, एमएस, ईएलएस, और एमडी एंडरसन डिवीजन ऑफ सर्जरी हिस्टोलॉजी कोर से कैरोल एम जॉनसन को हेमटोक्सीलिन और ईओसिन स्टेनिंग के साथ मदद के लिए धन्यवाद देते हैं। हम एमडी एंडरसन में पशु चिकित्सा और सर्जरी कोर के लिए पशु अध्ययन के लिए उनके समर्थन के लिए आभारी हैं। कोमेन करियर उत्प्रेरक अनुसंधान अनुदान (बीजीडी को CCR16377813), अमेरिकन कैंसर सोसाइटी रिसर्च स्कॉलर अनुदान (बीजीडी को आरएसजी -19-126-01), और टेक्सास दुर्लभ और आक्रामक स्तन कैंसर अनुसंधान कार्यक्रम की स्थिति। इसके अलावा नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ से कैंसर सेंटर सपोर्ट (कोर) ग्रांट पी 30 CA016672 द्वारा टेक्सास विश्वविद्यालय के एमडी एंडरसन कैंसर सेंटर को भी समर्थित किया गया है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 1000 µL pipette tip filtered | Genesee Scientific | 23430 | |
| 10 mL Serological Pipets | Genesee Scientific | 12-112 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% |
| Centrifuge tubes 15 mL bulk | Genesee Scientific | 28103 | |
| Corning 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine | GIBICO Inc. USA | MT10080CV | |
| Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Eppendorf centufuge 5810R | Eppendorf | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBICO Inc. USA | 16000044 | 10% |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers (40 μm) | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1 µg/mL |
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | 5 µg/mL |
| Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| MDA-IBC3 cell lines | MD Anderson Cancer Center | Generated by Dr. Woodward's lab24 | |
| Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid | System Biosciences | BLIV713PA-1 | |
| microtubes clear sterile 1.7 mL | Genesee Scientific | 24282S | |
| Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 23-401C | |
| TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Tail vein injection | |||
| C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J - SCID/Beige | Envigo | SCID/beige mice | |
| BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm) | BD | 328466 | |
| Plas Labs Broome-Style Rodent Restrainers | Plas Labs 551BSRR | 01-288-32A | Order fromThermo Fisher Scientific |
| Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof) | Thermo Fisher Scientific | 50420872 | 70 % used |
| Imaging | |||
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| Disposable PES Filter Units 0.45 µm | Fisherbrand | FB12566501 | filter system to sterilize the D-luciferin |
| D-Luciferin | Biosynth | L8220-1g | stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL |
| 1.7 mL microtube amber | Genesee Scientific | 24-282AM | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC-14043-704-06 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| IVIS 200 | PerkinElmer | machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine | |
| Plastic Containers with Lids | Fisherbrand | 02-544-127 | |
| Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 1000957 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| Stereomicroscope Imaging | |||
| Stereomicroscope AZ100 | Nikon | model AZ-STGE | software NIS-ELEMENT |
| Formalin 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| TC treated dishes 100x20 mm | Genesee Scientific | 25202 |
References
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