Summary
Describimos un modelo de xenoinjerto de ratón de metástasis cerebral de cáncer de mama generado mediante inyección en la vena de cola de una línea celular de cáncer de mama inflamatorio amplificada endógenamente por HER2.
Abstract
La diseminación metastásica al cerebro es una manifestación común y devastadora de muchos tipos de cáncer. Solo en los Estados Unidos, alrededor de 200,000 pacientes son diagnosticados con metástasis cerebrales cada año. Se han logrado avances significativos en la mejora de los resultados de supervivencia de las pacientes con cáncer de mama primario y neoplasias malignas sistémicas; Sin embargo, el sombrío pronóstico de los pacientes con metástasis cerebrales clínicas pone de manifiesto la necesidad urgente de desarrollar nuevos agentes terapéuticos y estrategias contra esta enfermedad mortal. La falta de modelos experimentales adecuados ha sido uno de los principales obstáculos que han impedido avanzar en nuestra comprensión de la biología y el tratamiento de las metástasis cerebrales. En este trabajo describimos un modelo de xenoinjerto de metástasis cerebral generada mediante inyección en la vena de cola de una línea celular amplificada endógenamente por HER2 derivada del cáncer de mama inflamatorio (IBC), una forma rara y agresiva de cáncer de mama. Las células se marcaron con luciferasa de luciérnaga y proteína de fluorescencia verde para monitorear la metástasis cerebral, y se cuantificó la carga metastásica mediante imágenes de bioluminiscencia, microscopía estereoscópica fluorescente y evaluación histológica. Los ratones desarrollan metástasis cerebrales de forma robusta y consistente, lo que permite la investigación de mediadores clave en el proceso metastásico y el desarrollo de pruebas preclínicas de nuevas estrategias de tratamiento.
Introduction
La metástasis cerebral es una complicación común y mortal de las neoplasias malignas sistémicas. La mayoría de las metástasis cerebrales se originan en tumores primarios de pulmón, mama o piel, que en conjunto representan el 67-80% de los casos 1,2. Las estimaciones de la incidencia de metástasis cerebrales varían entre 100.000 y 240.000 casos, y estas cifras pueden estar subestimadas porque la autopsia es poco frecuente en pacientes que murieron de cáncer metastásico3. Los pacientes con metástasis cerebrales tienen un peor pronóstico y una menor supervivencia global en relación con los pacientes sin metástasis cerebrales4. Las opciones de tratamiento actuales para las metástasis cerebrales son en gran medida paliativas y no mejoran los resultados de supervivencia de la mayoría de los pacientes5. Por lo tanto, la metástasis cerebral sigue siendo un desafío, y la necesidad sigue siendo apremiante de comprender mejor los mecanismos de progresión de la metástasis cerebral para desarrollar terapias más efectivas.
El uso de modelos experimentales ha proporcionado información importante sobre los mecanismos específicos de la progresión metastásica del cáncer de mama al cerebro y ha permitido evaluar la eficacia de diversos enfoques terapéuticos 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . Sin embargo, muy pocos modelos pueden recapitular de manera precisa y completa las complejidades del desarrollo de metástasis cerebrales. Se han generado varios modelos experimentales in vivo mediante la inoculación de células cancerosas en ratones mediante diferentes vías de administración, incluidas las inyecciones ortotópicas, de vena de cola, intracardíacas, intracarotídeas, arteriales intracarótidas e intracerebrales. Cada técnica tiene ventajas y desventajas, como se revisó en otro lugar3. Sin embargo, ninguno de estos modelos de ratón puede replicar completamente la progresión clínica de la metástasis cerebral.
Las metástasis cerebrales son particularmente comunes en pacientes con cáncer de mama inflamatorio (IBC, por sus siglas en inglés), una variante rara pero agresiva del cáncer de mama primario. El IBC representa entre el 1% y el 4% de los casos de cáncer de mama, pero es responsable de un desproporcionado 10% de las muertes relacionadas con el cáncer de mama en los Estados Unidos17,18. Se sabe que el IBC hace metástasis rápidamente; de hecho, un tercio de los pacientes con IBC tienen metástasis a distancia en el momento del diagnóstico19,20. Específicamente para la metástasis cerebral, los pacientes con IBC tienen una mayor incidencia de metástasis cerebral que los pacientes con IBCno 21. Recientemente, demostramos que la línea celular MDA-IBC3, derivada del líquido de derrame pleural maligno de un paciente con IBC ER-/PR-/HER2+ que recapitula las características de IBC en xenoinjertos de ratón, tiene una mayor propensión a desarrollar metástasis cerebrales en lugar de metástasis pulmonares en ratones cuando se inyecta por vena de cola, lo que convierte a esta línea celular en un buen modelo para estudiar el desarrollo de metástasis cerebrales16.
En este trabajo describimos los procedimientos para generar metástasis cerebrales mediante inyección en la vena de cola de células MDA-IBC3 y para evaluar la carga metastásica mediante microscopía estereofluorescente e imágenes de luciferasa. Este método se ha utilizado para descubrir mediadores clave de la metástasis del cáncer de mama en el cerebro y para probar la eficacia de las intervenciones terapéuticas 16,22,23. La desventaja de esta técnica es que no recapitula todos los pasos del proceso metastásico cerebral. Sin embargo, sus principales ventajas incluyen la robustez y reproducibilidad, la implicación de la biología de metástasis relevante de la intravasación, el atravesamiento de los pulmones y la extravasación en el cerebro, y su relativa simplicidad en términos de técnica.
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Protocol
El método descrito aquí ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés) del MD Anderson Cancer Center y cumple con las Pautas de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El flujo de trabajo esquemático, con todos los pasos incluidos, se presenta como Figura 1.
1. Preparación celular
NOTA: La línea celular MDA-IBC3 (ER-/PR-/HER2+), generada en el laboratorio24 del Dr. Woodward, se transdució de forma estable con un plásmido de proteína fluorescente verde luciferasa (Luc-GFP).
- El cultivo transdució células en medios F-12 de Ham suplementados con suero fetal bovino (FBS) al 10%, 1 μg/mL de hidrocortisona, 5 μg/mL de insulina y 1% antibiótico-antimitótico.
- Plaquetar celdas MDA-IBC3-Luc-GFP a 37 °C y 5% de CO2 en un matraz T-75 hasta que confluyan. Cambie el medio cada 3 días antes de que las células sean lo suficientemente confluentes como para pasar.
- Recoja las células retirando los medios, lavando cada matraz con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) 1x de Dulbecco (es decir, sin calcio ni magnesio) y agregando 2 ml de ácido tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,25 %. Incubar durante 3-5 min a 37 °C hasta que las células se desprendan.
- Agregue 5 ml de medio completo al matraz para recolectar las células y transferir todo el contenido a un tubo de centrífuga de 15 ml (optimizado para un tubo de centrífuga de 50 ml dependiendo del número total de células necesarias). Centrifugar a 290 x g durante 5 min a las células de pellets.
NOTA: El medio completo es el medio F-12 de Ham suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1 μg/mL de hidrocortisona, 5 μg/mL de insulina y 1% de antibiótico-antimitótico. - Deseche el sobrenadante. A continuación, lave las células con 10 ml de 1x DPBS. Centrifugar a 290 x g durante 5 min para granular las células y desechar el sobrenadante con cuidado. Vuelva a suspender las células con 1 ml de DPBS 1x fresco y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Para hacer suspensiones unicelulares, filtre las células a través de filtros celulares estériles de 40 μm.
- Calcule la densidad de celdas mediante un contador de celdas automatizado.
NOTA: Para reducir los errores en el recuento, cree diferentes diluciones de células y cuéntelas por separado, y calcule el valor medio para determinar la concentración de células (número de células/mL).- Recoja 2 μL de suspensión celular + 8 μL de 1x DPBS para hacer una muestra de dilución 1:5.
- Recoja 1 μL de suspensión celular + 9 μL de 1x DPBS para hacer una muestra de dilución 1:10.
- Añadir 10 μL de tinte azul de tripano al 0,4%. Mezcle bien la mezcla de muestra pipeteándola hacia arriba y hacia abajo varias veces.
- Pipetear suavemente 10 μL de la muestra en el área de carga de muestras en forma de media luna de los portaobjetos de la cámara de recuento. Asegúrese de que no haya burbujas en el interior; Espere 30 s para permitir que las celdas se asienten en la cámara antes de contar.
- Diluir las células con 1x DPBS hasta una densidad de 5 x 105 o 1 x 106 células por 100 μL. Transfiera la suspensión celular a tubos de microcentrífuga de 1,7 ml para la inyección en la vena de cola. Coloque las células en hielo hasta la inyección para mantener la viabilidad.
2. Inyección en la vena de la cola
- Use ratones hembra SCID/Beige atímicos de 4 a 6 semanas de edad.
- Prepare una jeringa de 30 G para extraer 100 μL de suspensión celular. Retire todas las burbujas de aire.
- Coloque el ratón en un bloqueador de roedores (diámetro de aproximadamente 1 pulgada) para facilitar la inyección de la vena de la cola y evitar lesiones por el movimiento durante el proceso de inyección.
- Use almohadillas de algodón con alcohol (hechas con etanol al 70%) para limpiar suavemente la cola del ratón 3-4 veces y manténgala presionada durante 5-10 segundos para que la vena de la cola sea más claramente visible.
- Inserte la jeringa en la cola del ratón en un ángulo de 15-30°. Empuje lentamente la suspensión celular hacia la vena de la cola.
- Retire la jeringa con cuidado y use la almohadilla de algodón para sostener la cola durante unos segundos para ayudar a detener el sangrado.
- Regrese a los ratones a sus jaulas y revíselos 2-4 h después de la inyección para asegurarse de que no se produzcan efectos adversos.
3. Evaluación de la carga de metástasis cerebral
- Prepare una solución diluida de D-luciferina.
NOTA: La concentración de material es de 47,6 mM (15,15 mg/mL) y la concentración para su uso es de 1,515 mg/mL.- Agregue 5 ml de 1x DPBS al frasco de D-luciferina.
- Coloque 2,5 ml de la solución en cada uno de los dos tubos cónicos de 50 ml.
- Agregue otros 5 ml de 1x DPBS al frasco de D-luciferina nuevamente para enjuagarlo. Coloque 2,5 ml en cada tubo cónico de 50 ml.
- Coloque otros 5 ml de 1x DPBS en la botella y enjuáguela nuevamente. Repita el proceso de enjuague dos veces.
- Agregue 1x DPBS a cada tubo de 50 ml hasta un total de 66 ml (aproximadamente 33 ml por tubo). Debe haber aproximadamente 33 ml de la solución en cada tubo.
- Mezcle bien los tubos y luego combine ambos en una unidad de filtración estéril (filtro PES de 150 ml, 0,45 μm).
- Filtre la solución y luego alícula la solución filtrada en microtubos estériles de color ámbar de 1,7 ml.
- Detección de metástasis cerebrales mediante imágenes de luciferasa.
- Descongele la D-luciferina manteniéndola en hielo y vórtice antes de inyectarla en los ratones.
- Limpie el área de la inyección con almohadillas de algodón con alcohol e inyecte 100 μl de D-luciferina por ratón por vía intraperitoneal utilizando una jeringa de insulina de 0,5 ml, una jeringa por cada jaula.
- Después de 10 minutos, anestesiar a los ratones con isoflurano (2% O2-2,5% de isoflurano) durante 5 minutos utilizando el vaporizador veterinario conectado a la cámara de inducción de pequeños animales.
- Encienda el sistema de imágenes in vivo. Mientras los ratones de la primera jaula están bajo anestesia, inyecte la D-luciferina en los ratones de la siguiente jaula.
- Coloque ratones en la máquina del sistema de imágenes in vivo y obtenga imágenes ventrales y dorsales. Seleccione un tiempo de exposición de 2 minutos y, en la vista de campo, elija la opción E (cuerpo entero). Presione Adquirir. A continuación, guarde la imagen (Figura 2).
NOTA: Si la imagen muestra saturación de luminiscencia, reduzca el tiempo de exposición.
- Detección de metástasis cerebrales mediante imágenes de GFP.
- Preparación del tejido cerebral.
- Alrededor de 8-10 semanas después de la inyección de células o cuando los ratones estén moribundos debido a la carga de metástasis cerebral, eutanasiar a los ratones por inhalación de una sobredosis de isoflurano seguida de una luxación cervical, de acuerdo con los protocolos aprobados por la IACUC.
- Después de la eutanasia con isoflurano seguida de una luxación cervical, rocíe a los ratones con una solución de etanol al 70% y retire el pelo del área de la cabeza y las orejas con unas tijeras. A continuación, haz un corte en la zona cervical del cuello (teniendo cuidado de no decapitar al ratón). Corta el cráneo y sácalo. A continuación, extirpe con cuidado el cerebro.
- Coloque los cerebros recolectados en casetes de pañuelos.
- Transfiera los casetes a un recipiente con 1x DPBS frío.
NOTA: Las muestras de cerebro no deben conservarse en 1x DPBS durante más de 1 h. Si se van a recolectar varias muestras de cerebro al mismo tiempo, eutanasiar solo a unos pocos ratones a la vez (10 por ronda).
- Imágenes estereomicroscópicas.
- Transfiera todo el cerebro a una tapa de plato de papel de 100 cm.
- Encienda el microscopio estereoscópico y la luz ultravioleta, en la posición 3 con lente 0.5x, para permitir la visualización de todo el cerebro como se muestra en la Figura 3A (cuadrado rojo).
- Presione Live view (Figura 3A, cuadrado verde).
- Enfoca la vista mientras el cerebro está en posición ventral.
- Seleccione GFP (si las células están marcadas con GFP ) o TXRED (si las células están marcadas con RFP) (Figura 3A, cuadrado amarillo) en el software, seleccione el filtro adecuado en el microscopio y tome una fotografía.
NOTA: Mantenga la configuración de la fuente de luz SOLA en aproximadamente el 30%; si el GFP es demasiado brillante, reduzca hasta que se observe la señal adecuada. - Sin mover la muestra, encienda la luz brillante y seleccione BF (Figura 3A, cuadrado amarillo). Toma una foto.
- Repite los pasos anteriores con el cerebro en posición dorsal.
NOTA: Dependiendo del tamaño, la misma lesión de metástasis cerebral GFP positiva puede aparecer tanto en posición ventral como dorsal. En tal caso, evite la cuantificación duplicada de la misma lesión. Guarde las imágenes con una extensión TIFF (que mantiene toda la información en el archivo de imagen). - Guarde las imágenes con una extensión TIFF (que mantiene toda la información en el archivo de imagen).
- Repita los pasos para todas las muestras.
- Convierta las imágenes TIFF a JPEG para que los archivos se puedan abrir con cualquier ordenador que no tenga instalado el software asociado (Archivo | Importación/Exportación | convertir archivos).
- Para fusionar la imagen fluorescente con la imagen de campo claro, abra ambas imágenes y vaya a Archivo | Fusionar canales. Seleccione los componentes adecuados, verde para GFP y campo claro para BF, y presione Aceptar. Guarde la imagen combinada.
- Para cuantificar el área del tumor cerebral, use la imagen fluorescente. Seleccionar medida | Medición manual | Área. Seleccione la selección automática (Figura 3B, cuadrado verde) y mueva la flecha al área GFP-positiva y haga clic para crear automáticamente una selección. Haga clic de nuevo para confirmar la selección y luego se mostrarán todas las mediciones (Figura 3B, cuadrado rojo). Si hay más de un área positiva para GFP, repita el procedimiento.
- Después de obtener las imágenes cerebrales, proceda a los protocolos de fijación de tejidos de rutina utilizando formalina tamponada neutra al 10%.
- Una vez fijados los cerebros, se procede a la sección histológica estándar seguida de la tinción de hematoxilina y eosina para confirmar la presencia de metástasis cerebrales y la tinción inmunohistoquímica para detectar marcadores seleccionados.
NOTA: La inmunocitoquímica se realizó en el Laboratorio Central de Patología del Centro Oncológico MD Anderson de la Universidad de Texas que cuenta con un protocolo estandarizado para la tinción inmunohistoquímica de marcadores conocidos.
- Una vez fijados los cerebros, se procede a la sección histológica estándar seguida de la tinción de hematoxilina y eosina para confirmar la presencia de metástasis cerebrales y la tinción inmunohistoquímica para detectar marcadores seleccionados.
- Preparación del tejido cerebral.
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Representative Results
Con el argumento de que las células marcadas facilitan la monitorización y visualización de las metástasis cerebrales en modelos preclínicos de ratón, marcamos las células MDA-IBC3 con Luc y con GFP para monitorizar las metástasis cerebrales y cuantificar la carga metastásica mediante el uso de imágenes de bioluminiscencia y estereomicroscopía fluorescente. La inyección de las células MDA-IBC3 marcadas en las venas de la cola de ratones inmunocomprometidos SCID/Beige dio lugar a altos porcentajes de ratones que desarrollaron metástasis cerebrales (es decir, del 66,7 % al 100 %)16,23,25. Las lesiones metastásicas cerebrales podían detectarse tan pronto como 8 semanas después de la inyección mediante imágenes de luciferasa (Figura 2) o microscopía estereofluorescente (Figura 4). La GFP nos permite detectar, contar y calcular el área de cada lesión metastásica. Después de la obtención de imágenes, se fijan partes de las metástasis cerebrales con formalina y se procesan para la tinción con hematoxilina y eosina para validar la presencia de lesiones de metástasis cerebrales (Figura 5A) y para la tinción inmunohistoquímica para detectar marcadores proteicos específicos (Figura 5B,C).
Figura 1: Flujo de trabajo esquemático para generar metástasis cerebrales mediante inyección en la vena de cola. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes de luciferasas de ratones en posición dorsal y ventral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Capturas de pantalla del software de imágenes utilizado para la microscopía estereoscópica . (A) Pasos que muestran cómo obtener imágenes. El cuadrado verde de la izquierda muestra el botón de visualización en vivo; el cuadrado rojo de la derecha muestra la posición del microscopio para la lente del revólver y la posición del zoom; y el cuadrado amarillo resalta la selección del filtro. (B) Captura de pantalla de los pasos involucrados en la medición de la carga tumoral. El cuadrado verde en la parte superior izquierda muestra el modo de selección automática para el cálculo del área; El cuadrado rojo debajo de él muestra los valores del área y otras medidas después de seleccionar la lesión de metástasis cerebral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes estereoscópicas de cerebros de ratón con metástasis procedentes de la inyección en la vena de cola de la línea celular MDA-IBC3. La imagen de campo claro de la izquierda se fusiona con la imagen GFP (centro) y luego se fusiona (derecha). Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Diapositivas que muestran imágenes teñidas de metástasis cerebrales derivadas de MDA-IBC3 en ratones . (A) Las tinciones de hematoxilina y eosina proporcionan confirmación histológica de metástasis cerebrales. La inmunotinción de los tumores cerebrales metastásicos derivados de MDA-IBC3 muestra tinción positiva para HER2 (B) y E-cadherina (C). Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo incluye varios pasos críticos. Las células deben mantenerse en hielo durante no más de 1 hora para mantener la viabilidad. Se deben usar almohadillas de algodón con alcohol para limpiar las colas de los ratones antes de la inyección, teniendo cuidado de no limpiar con demasiada fuerza o con demasiada frecuencia para evitar dañar la piel de la cola. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la suspensión celular, para evitar que los ratones mueran por émbolos en los vasos sanguíneos. Mantenga el ángulo de inyección a 45° o menos para evitar perforar el vaso sanguíneo en las colas e inserte al menos 1/3 de la aguja en la vena de la cola para garantizar una inyección exitosa de todas las células. El volumen total de células inyectadas se puede ajustar de acuerdo con el peso de los ratones, pero el número total de células debe mantenerse lo más similar posible. En este protocolo, los ratones SCID/Beige tenían entre 4 y 6 semanas de edad y pesaban entre 15 y 20 g. Para ratones que pesan menos de 15 g, el volumen de inyección podría ajustarse a menos de 100 μL; de lo contrario, se inyectan 100 μL. Después de su extracción del cráneo, todo el cerebro debe mantenerse en 1x DPBS durante no más de 1 hora antes de obtener imágenes por microscopía estereoscópica para evitar la reducción de la señal y la degeneración del tejido. Para las imágenes de inmunofluorescencia, los tejidos cerebrales no deben colocarse en formol, ya que genera una autofluorescencia endógena que dificulta la adquisición de imágenes de alta calidad. Hemos observado que las imágenes de luciferasa no siempre revelan metástasis cerebrales, especialmente lesiones muy pequeñas; sin embargo, las imágenes de GFP por microscopía estereoscópica pueden visualizar todas las lesiones. Además, las imágenes de GFP pueden mostrar más de 1 lesión, mientras que las imágenes de luciferasa no lo hacen.
Los procedimientos propuestos pueden modificarse ligeramente según las preferencias del usuario. En primer lugar, el número de células inyectadas y la duración de la formación de metástasis podrían ajustarse para diferentes estudios. En segundo lugar, la vena de la cola de los ratones se pudo visualizar más claramente mediante el uso de agua tibia para dilatar la vena o luz ultravioleta para iluminar las venas. Finalmente, el tamaño de la aguja en la jeringa puede ser de 30 G o 28 G.
Las ventajas y limitaciones de los modelos murinos existentes de metástasis cerebral han sido revisadas en otro lugar3 . El modelo de metástasis cerebral que describimos aquí tiene sus limitaciones y fortalezas. Una limitación es que no recapitula todos los pasos del proceso metastásico cerebral y no permite interrogar las etapas iniciales del proceso metastásico, es decir, la diseminación de células primarias de cáncer de mama a la circulación. Además, este modelo no se puede utilizar para estudiar las interacciones entre las células tumorales y el microambiente inmune del huésped durante el proceso de metástasis cerebral o para evaluar aplicaciones inmunoterapéuticas. Sin embargo, este modelo tiene varias ventajas sobre otros modelos de metástasis cerebrales. En primer lugar, a diferencia de los modelos espontáneos en los que solo una pequeña fracción de los ratones desarrollan metástasis cerebrales a intervalos variables, nuestro modelo ofrece la ventaja de conducir consistentemente a metástasis en el cerebro, típicamente en más del 70% de los ratones. En segundo lugar, la inyección en la vena de cola permite la diseminación de células principalmente al pulmón con la posterior propagación al cerebro, mientras que la inoculación a través de la arteria intracarótida permite que las células se diseminen directamente al cerebro; Las inyecciones intracardíacas permiten la distribución sistémica de las células cancerosas al cerebro, así como a sitios extracraneales como el pulmón y los huesos. Por lo tanto, nuestro modelo recapitula el paso de colonización metastásica cerebral mejor que los modelos de inyección intracardíaca o intracarotídea comúnmente utilizados, ya que las células atraviesan los lechos capilares pulmonares y sobreviven en la circulación antes de generar lesiones cerebrales. Por último, la inyección de células de cáncer de mama a través de la vena de la cola es técnicamente menos difícil que la inyección intracarotídea o intracardíaca.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a Christine F. Wogan, MS, ELS, de la División de Oncología Radioterápica del MD Anderson por la edición científica del manuscrito, y a Carol M. Johnston, del Núcleo de Histología de la División de Cirugía del MD Anderson, por su ayuda con la tinción de hematoxilina y eosina. Agradecemos al Núcleo de Medicina y Cirugía Veterinaria del MD Anderson por su apoyo a los estudios con animales. Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones: Beca de Investigación Susan G. Komen Career Catalyst (CCR16377813 a BGD), Beca de Investigación de la Sociedad Americana Contra El Cáncer (RSG-19-126-01 a BGD) y el Programa de Investigación de Cáncer de Mama Raro y Agresivo del Estado de Texas. También cuenta con el apoyo parcial de la Subvención P30 de Apoyo al Centro Oncológico (Core) CA016672 del Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de la Salud, al Centro Oncológico MD Anderson de la Universidad de Texas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 1000 µL pipette tip filtered | Genesee Scientific | 23430 | |
| 10 mL Serological Pipets | Genesee Scientific | 12-112 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% |
| Centrifuge tubes 15 mL bulk | Genesee Scientific | 28103 | |
| Corning 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine | GIBICO Inc. USA | MT10080CV | |
| Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Eppendorf centufuge 5810R | Eppendorf | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBICO Inc. USA | 16000044 | 10% |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers (40 μm) | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1 µg/mL |
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | 5 µg/mL |
| Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| MDA-IBC3 cell lines | MD Anderson Cancer Center | Generated by Dr. Woodward's lab24 | |
| Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid | System Biosciences | BLIV713PA-1 | |
| microtubes clear sterile 1.7 mL | Genesee Scientific | 24282S | |
| Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 23-401C | |
| TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Tail vein injection | |||
| C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J - SCID/Beige | Envigo | SCID/beige mice | |
| BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm) | BD | 328466 | |
| Plas Labs Broome-Style Rodent Restrainers | Plas Labs 551BSRR | 01-288-32A | Order fromThermo Fisher Scientific |
| Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof) | Thermo Fisher Scientific | 50420872 | 70 % used |
| Imaging | |||
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| Disposable PES Filter Units 0.45 µm | Fisherbrand | FB12566501 | filter system to sterilize the D-luciferin |
| D-Luciferin | Biosynth | L8220-1g | stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL |
| 1.7 mL microtube amber | Genesee Scientific | 24-282AM | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC-14043-704-06 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| IVIS 200 | PerkinElmer | machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine | |
| Plastic Containers with Lids | Fisherbrand | 02-544-127 | |
| Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 1000957 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| Stereomicroscope Imaging | |||
| Stereomicroscope AZ100 | Nikon | model AZ-STGE | software NIS-ELEMENT |
| Formalin 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| TC treated dishes 100x20 mm | Genesee Scientific | 25202 |
References
- Achrol, A. S., et al.
- Nayak, L., Lee, E. Q., Wen, P. Y.
- Lowery, F. J., Yu, D. Brain metastasis: Unique challenges and open opportunities. Biochimica et Biophysica Acta Review Cancer. 1867 (1), 49-57 (2017).
- Brufsky, A. M., et al. Central nervous system metastases in patients with HER2-positive metastatic breast cancer: incidence, treatment, and survival in patients from registHER. Clinical Cancer Research. 17 (14), 4834-4843 (2011).
- Valiente, M., et al.
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Woditschka, S., et al. DNA double-strand break repair genes and oxidative damage in brain metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (7), (2014).
- Palmieri, D., et al. Vorinostat inhibits brain metastatic colonization in a model of triple-negative breast cancer and induces DNA double-strand breaks. Clinical Cancer Research. 15 (19), 6148-6157 (2009).
- Kim, S. J., et al. Astrocytes upregulate survival genes in tumor cells and induce protection from chemotherapy. Neoplasia. 13 (3), 286-298 (2011).
- Zhang, S., et al. SRC family kinases as novel therapeutic targets to treat breast cancer brain metastases. Cancer Research. 73 (18), 5764-5774 (2013).
- Valiente, M., et al. Serpins promote cancer cell survival and vascular co-option in brain metastasis. Cell. 156 (5), 1002-1016 (2014).
- Gril, B., et al. Effect of lapatinib on the outgrowth of metastatic breast cancer cells to the brain. Journal of the National Cancer Institute. 100 (15), 1092-1103 (2008).
- Gril, B., et al. Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis. Clinical Cancer Research. 17 (1), 142-153 (2011).
- Palmieri, D., et al. Profound prevention of experimental brain metastases of breast cancer by temozolomide in an MGMT-dependent manner. Clinical Cancer Research. 20 (10), 2727-2739 (2014).
- Priego, N., et al. STAT3 labels a subpopulation of reactive astrocytes required for brain metastasis. Nature Medicine. 24 (7), 1024-1035 (2018).
- Debeb, B. G., et al. miR-141-mediated regulation of brain metastasis from breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 108 (8), (2016).
- Chang, S., Parker, S. L., Pham, T., Buzdar, A. U., Hursting, S. D. Inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program of the National Cancer Institute, 1975-1992. Cancer. 82 (12), 2366-2372 (1998).
- Hance, K. W., Anderson, W. F., Devesa, S. S., Young, H. A., Levine, P. H. Trends in inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program at the National Cancer Institute. Journal of National Cancer Institute. 97 (13), 966-975 (2005).
- Dirix, L. Y., Van Dam, P., Prove, A., Vermeulen, P. B. Inflammatory breast cancer: Current understanding. Current Opinion in Oncology. 18 (6), 563-571 (2006).
- Wang, Z., et al. Pattern of distant metastases in inflammatory breast cancer - A large-cohort retrospective study. Journal of Cancer. 11 (2), 292-300 (2020).
- Uemura, M. I., et al. Development of CNS metastases and survival in patients with inflammatory breast cancer. Cancer. 124 (11), 2299-2305 (2018).
- Smith, D. L., Debeb, B. G., Thames, H. D., Woodward, W. A. Computational modeling of micrometastatic breast cancer radiation dose response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 96 (1), 179-187 (2016).
- Fukumura, K., et al. Multi-omic molecular profiling reveals potentially targetable abnormalities shared across multiple histologies of brain metastasis. Acta Neuropathol. , (2021).
- Klopp, A. H., et al. Mesenchymal stem cells promote mammosphere formation and decrease E-cadherin in normal and malignant breast cells. PLoS One. 5 (8), 12180 (2010).
- Villodre, E. S., et al. Abstract P3-01-10: Ndrg1-egfr axis in inflammatory breast cancer tumorigenesis and brain metastasis. Cancer Research. 80 (4), 10 (2020).
