Summary
Vi beskriver en xenograft musemodell av brystkreft hjernemetastase generert via hale-vene injeksjon av en endogent HER2-forsterket inflammatorisk brystkreftcellelinje.
Abstract
Metastatisk spredning til hjernen er en vanlig og ødeleggende manifestasjon av mange typer kreft. I USA alene, er ca 200.000 pasienter diagnostisert med hjernemetastaser hvert år. Det er gjort betydelige fremskritt når det gjelder å forbedre overlevelsesresultatene for pasienter med primær brystkreft og systemiske maligniteter. Den dystre prognosen for pasienter med kliniske hjernemetastaser fremhever imidlertid det presserende behovet for å utvikle nye terapeutiske midler og strategier mot denne dødelige sykdommen. Mangelen på egnede eksperimentelle modeller har vært en av de største hindringene som hindrer utviklingen av vår forståelse av hjernemetastasebiologi og behandling. Her beskriver vi en xenograft musemodell av hjernemetastase generert via hale-veneinjeksjon av en endogent HER2-forsterket cellelinje avledet fra inflammatorisk brystkreft (IBC), en sjelden og aggressiv form for brystkreft. Celler ble merket med firefly luciferase og grønt fluorescensprotein for å overvåke hjernemetastase, og kvantifisert metastatisk belastning ved bioluminescensavbildning, fluorescerende stereomikroskopi og histologisk evaluering. Mus utvikler robust og konsekvent hjernemetastaser, noe som gjør det mulig å undersøke viktige mediatorer i metastatisk prosess og utvikling av preklinisk testing av nye behandlingsstrategier.
Introduction
Hjernemetastase er en vanlig og dødelig komplikasjon av systemiske maligniteter. De fleste hjernemetastaser stammer fra primære svulster i lunge, bryst eller hud, som samlet står for 67-80% av tilfellene 1,2. Estimater av forekomsten av hjernemetastase varierer mellom 100 000 og 240 000 tilfeller, og disse tallene kan være underestimert fordi obduksjon er sjelden for pasienter som døde av metastatisk kreft3. Pasienter med hjernemetastaser har dårligere prognose og lavere totaloverlevelse sammenlignet med pasienter uten hjernemetastaser4. Nåværende behandlingsalternativer for hjernemetastaser er i stor grad palliative og klarer ikke å forbedre overlevelsesresultatene for de fleste pasienter5. Dermed er hjernemetastase fortsatt en utfordring, og behovet er fortsatt presserende for bedre å forstå mekanismene for hjernemetastaseprogresjon for å utvikle mer effektive terapier.
Bruken av eksperimentelle modeller har gitt viktig innsikt i spesifikke mekanismer for brystkreftmetastatisk progresjon til hjernen og muliggjort evaluering av effekten av ulike terapeutiske tilnærminger 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . Imidlertid kan svært få modeller nøyaktig og fullt ut rekapitulere vanskelighetene med hjernemetastaseutvikling. Flere eksperimentelle in vivo-modeller har blitt generert via inokulering av kreftceller i mus ved forskjellige administrasjonsveier, inkludert ortotopiske, halevene, intrakardiale, intrakarotidarterielle og intracerebrale injeksjoner. Hver teknikk har fordeler og ulemper, som gjennomgått andre steder3. Ingen av disse musemodellene kan imidlertid fullt ut replikere den kliniske utviklingen av hjernemetastase.
Hjernemetastaser er spesielt vanlige hos pasienter med inflammatorisk brystkreft (IBC), en sjelden, men aggressiv variant av primær brystkreft. IBC står for 1% til 4% av brystkrefttilfellene, men det er ansvarlig for uforholdsmessige 10% av brystkreftrelaterte dødsfall i USA17,18. IBC er kjent for å raskt metastasere; faktisk har en tredjedel av IBC-pasientene fjernmetastase på diagnosetidspunktet19,20. Spesielt for hjernemetastase har pasienter med IBC en høyere forekomst av hjernemetastase enn pasienter med ikke-IBC21. Nylig demonstrerte vi at MDA-IBC3-cellelinjen, avledet fra den ondartede pleurale effusjonsvæsken til en pasient med ER-/PR-/HER2+ IBC som rekapitulerer IBC-egenskaper i musxenotransplantater, har en forbedret tilbøyelighet til å utvikle hjernemetastaser i stedet for lungemetastaser hos mus når de injiseres av halevenen, noe som gjør denne cellelinjen til en god modell for å studere utviklingen av hjernemetastase16.
Her beskriver vi prosedyrene for å generere hjernemetastase via hale-veneinjeksjon av MDA-IBC3-celler og for å evaluere metastatisk belastning via stereofluorescerende mikroskopi og luciferase-avbildning. Denne metoden har blitt brukt til å oppdage viktige mediatorer av brystkreftmetastase til hjernen og for å teste effekten av terapeutiske inngrep 16,22,23. Ulempen med denne teknikken er at den ikke rekapitulerer alle trinnene i hjernens metastatiske prosess. Likevel er dens store fordeler robusthet og reproduserbarhet, involvering av relevant metastasebiologi av intravasasjon, kryssing av lungene og ekstravasasjon i hjernen, og dens relative enkelhet når det gjelder teknikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Metoden beskrevet her er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) av MD Anderson Cancer Center og overholder National Institutes of Health retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr. Den skjematiske arbeidsflyten, med alle trinnene inkludert, presenteres som figur 1.
1. Cell forberedelse
MDA-IBC3 (ER-/PR-/HER2+) cellelinje, generert i Dr. Woodwards laboratorium24, ble stabilt transdusert med et luciferase-grønt fluorescerende protein (Luc-GFP) plasmid.
- Kultur transducerte celler i Hams F-12 media supplert med 10% føtal bovint serum (FBS), 1 μg / ml hydrokortison, 5 μg / ml insulin og 1% antibiotika-antimitotisk.
- Plate MDA-IBC3-Luc-GFP-celler ved 37 °C og 5% CO2 i en T-75 kolbe til de er sammenflytende. Bytt media hver 3. dag før cellene er sammenflytende nok til å passere.
- Høst celler ved å fjerne media, vaske hver kolbe med 10 ml 1x Dulbeccos (dvs. kalsium- og magnesiumfri) fosfatbufret saltvann (DPBS) og tilsett 2 ml 0,25% trypsin-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). Inkuber i 3-5 minutter ved 37 °C til cellene løsner.
- Tilsett 5 ml komplette medier til kolben for å samle cellene og overfør hele innholdet til et 15 ml sentrifugerør (optimalisert til 50 ml sentrifugerør avhengig av totalt antall celler som trengs). Sentrifuge ved 290 x g i 5 min til pelletsceller.
MERK: Komplett media er Hams F-12 media supplert med 10% føtal bovint serum (FBS), 1 μg / ml hydrokortison, 5 μg / ml insulin og 1% antibiotika-antimitotisk. - Kast supernatanten. Vask deretter cellene med 10 ml 1x DPBS. Sentrifuge ved 290 x g i 5 minutter for å pelletere cellene og kaste supernatanten forsiktig. Resuspender cellene med 1 ml fersk 1x DPBS og bland godt ved å pipettere opp og ned.
- For å lage enkeltcellesuspensjoner, filtrer celler gjennom 40 μm sterile cellesiler.
- Beregn celletetthet ved hjelp av en automatisert celleteller.
MERK: For å redusere feil i telling, opprett forskjellige cellefortynninger og tell dem separat, og beregne gjennomsnittsverdien for å bestemme konsentrasjonen av celler (antall celler / ml).- Samle 2 μL cellesuspensjon + 8 μL 1x DPBS for å lage en 1: 5 fortynningsprøve.
- Samle 1 μL cellesuspensjon + 9 μL 1x DPBS for å lage en 1:10 fortynningsprøve.
- Tilsett 10 μL med 0,4% trypanblå flekk. Bland prøveblandingen godt ved å pipetere den opp og ned et par ganger.
- Pipetter forsiktig 10 μL av prøven inn i det halvmåneformede prøvebelastningsområdet på tellekammerets lysbilder. Pass på at det ikke er bobler inni; Vent i 30 s for å la cellene slå seg ned i kammeret før du teller.
- Fortynn cellene med 1x DPBS til en tetthet på 5 x 10,5 eller 1 x 10,6 celler per 100 μL. Overfør cellesuspensjon til 1,7 ml mikrosentrifugerør for injeksjon i hale-vene. Plasser celler på is til injeksjon for å opprettholde levedyktigheten.
2. Hale vene injeksjon
- Bruk 4- til 6 uker gamle kvinnelige atymiske SCID / Beige mus.
- Klargjør en 30 G sprøyte for å trekke opp 100 mikrol cellesuspensjon. Fjern alle luftbobler.
- Plasser musen i en gnagerholder (diameter ca. 1 tomme) for å lette injeksjon av hale-vene og forhindre bevegelsesskader under injeksjonsprosessen.
- Bruk alkoholbomullsputer (laget med 70% etanol) for å tørke musens hale forsiktig 3-4 ganger og hold i 5-10 s for å gjøre halevenen tydeligere.
- Sett sprøyten inn i musens hale i en vinkel på 15-30°. Skyv cellesuspensjonen sakte inn i halevenen.
- Fjern sprøyten forsiktig og bruk bomullspaden til å holde halen i noen sekunder for å stoppe blødninger.
- Sett musene tilbake i burene og sjekk dem 2-4 timer etter injeksjon for å sikre at ingen bivirkninger oppstår.
3. Evaluering av hjernemetastasebelastning
- Forbered fortynnet D-luciferinoppløsning.
MERK: Lagerkonsentrasjonen er 47,6 mM (15,15 mg / ml), og konsentrasjonen for bruk er 1,515 mg / ml.- Tilsett 5 ml 1x DPBS til D-luciferinflasken.
- Plasser 2,5 ml av oppløsningen i hvert av to 50 ml koniske rør.
- Tilsett ytterligere 5 ml 1x DPBS til D-luciferinflasken igjen for å skylle den. Sett 2,5 ml inn i hvert 50 ml koniske rør.
- Plasser ytterligere 5 ml 1x DPBS i flasken og skyll den igjen. Gjenta skylleprosessen to ganger.
- Legg 1x DPBS til hver 50 ml rør til totalt 66 ml (ca. 33 ml per rør). Det skal være ca. 33 ml av løsningen i hvert rør.
- Bland rørene godt og kombiner deretter begge til en steril filtreringsenhet (150 ml PES-filter 0,45 μm).
- Filtrer oppløsningen og alikoter deretter den filtrerte oppløsningen i sterilt, gult 1,7 ml mikrorør.
- Påvisning av hjernemetastaser ved luciferase-avbildning.
- Tine D-luciferin ved å holde på is, og virvel før injeksjon i musene.
- Rengjør injeksjonsområdet med bomullsputer med alkohol og injiser 100 mikrol D-luciferin per mus intraperitonealt med en 0,5 ml insulinsprøyte, en sprøyte til hvert bur.
- Etter 10 minutter bedøves musene med isofluran (2 %O2- 2,5 % isofluran) i 5 minutter ved bruk av veterinærfordamperen som er koblet til induksjonskammeret til små dyr.
- Slå på in vivo-bildesystemet. Mens musene fra det første buret er under anestesi, injiser D-luciferin i musene i neste bur.
- Sett mus inn i in vivo bildesystemmaskinen og få ventrale og dorsale bilder. Velg en eksponeringstid på 2 minutter, og velg alternativ E (helbrødtekst) i feltvisningen. Trykk på Hent. Deretter lagrer du bildet (figur 2).
MERK: Hvis bildet viser metning av luminescens, reduserer du eksponeringstiden.
- Påvisning av hjernemetastaser ved GFP-avbildning.
- Forberedelse av hjernevev.
- Omtrent 8-10 uker etter injeksjon av celler eller når musene er døende på grunn av hjernemetastasebelastning, avlive musene ved innånding av en isofluranoverdose etterfulgt av cervikal dislokasjon, i samsvar med protokoller godkjent av IACUC.
- Etter eutanasi med isofluran etterfulgt av cervikal dislokasjon, spray musene med en 70% etanoloppløsning og fjern pelsen fra hodeområdet og ørene med saks. Deretter kutter du i nakkeområdet i nakken (vær forsiktig så du ikke halshugger musen). Klipp skallen og trekk den ut. Fjern deretter hjernen forsiktig.
- Plasser de innsamlede hjernene i vevskassetter.
- Overfør kassettene til en beholder med kald 1x DPBS.
MERK: Hjerneprøver bør ikke oppbevares i 1x DPBS i mer enn 1 time. Hvis flere hjerneprøver skal samles inn samtidig, avlives bare noen få mus om gangen (10 per runde).
- Stereomikroskopisk avbildning.
- Overfør hele hjernen til et lokk på 100 cm skål.
- Slå på stereomikroskopet og UV-lyset, i posisjon 3 med linsen 0,5x, for å tillate visualisering av hele hjernen som vist i figur 3A (rød firkant).
- Trykk på Live view (figur 3A, grønn firkant).
- Fokuser utsikten mens hjernen er i ventral stilling.
- Velg GFP (hvis cellene er GFP-merket) eller TXRED (hvis cellene er RFP-merket) (figur 3A, gul firkant) i programvaren, velg riktig filter på mikroskopet, og ta et bilde.
MERK: Hold SOLA lyskildeinnstillingen på ca. 30 %; Hvis GFP er for lys, reduser til riktig signal blir observert. - Uten å flytte prøven, slå på sterkt lys og velg BF (figur 3A, gul firkant). Ta et bilde.
- Gjenta de forrige trinnene med hjernen i dorsalposisjonen.
MERK: Avhengig av størrelsen kan den samme GFP-positive hjernemetastaselesjonen vises i både ventrale og dorsale stillinger. I et slikt tilfelle, unngå duplikatkvantifisering av samme lesjon. Lagre bildene med en TIFF-utvidelse (som beholder all informasjonen i bildefilen). - Lagre bildene med en TIFF-utvidelse (som beholder all informasjonen i bildefilen).
- Gjenta trinnene for alle eksemplene.
- Konverter TIFF-bildene til JPEG slik at filene kan åpnes med hvilken som helst datamaskin som ikke har tilhørende programvare installert (File | Import/eksport | konvertere filer).
- For å slå sammen det fluorescerende bildet med det lyse feltbildet, åpne begge bildene og gå til Fil | Slå sammen kanaler. Velg de riktige komponentene, grønn for GFP og brightfield for BF, og trykk på OK. Lagre det sammenslåtte bildet.
- For å kvantifisere hjernesvulstområdet, bruk det fluorescerende bildet. Velg Mål | Manuell måling | Areal. Velg automatisk valg (figur 3B, grønn firkant), flytt pilen til det GFP-positive området og klikk for å opprette en markering automatisk. Klikk igjen for å bekrefte valget, og deretter vises alle målinger (figur 3B, rød firkant). Hvis mer enn ett GFP-positivt område er til stede, gjenta prosedyren.
- Etter at hjernebilder er oppnådd, fortsett til rutinemessige vevfikseringsprotokoller ved bruk av 10% nøytral bufret formalin.
- Når hjernen er fiksert, fortsett til standard histologisk seksjonering etterfulgt av hematoksylin og eosinfarging for å bekrefte tilstedeværelsen av hjernemetastase og immunhistokjemisk farging for å oppdage utvalgte markører.
MERK: Immunocytokjemi ble utført ved Pathology Core Laboratory ved UT MD Anderson Cancer Center som har standardisert protokoll for immunhistokjemisk farging av kjente markører.
- Når hjernen er fiksert, fortsett til standard histologisk seksjonering etterfulgt av hematoksylin og eosinfarging for å bekrefte tilstedeværelsen av hjernemetastase og immunhistokjemisk farging for å oppdage utvalgte markører.
- Forberedelse av hjernevev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med begrunnelsen om at merkede celler letter overvåking og visualisering av hjernemetastase i prekliniske musemodeller, merket vi MDA-IBC3-celler med Luc og med GFP for å overvåke hjernemetastaser og kvantifisere metastatisk byrde ved hjelp av bioluminescensavbildning og fluorescerende stereomikroskopi. Injeksjon av de merkede MDA-IBC3-cellene i haleårene hos immunkompromitterte SCID / Beige mus resulterte i høye prosentandeler av mus som utviklet hjernemetastase (dvs. 66,7% til 100%)16,23,25. Metastaserende lesjoner i hjernen kunne påvises så tidlig som 8 uker etter injeksjon med luciferaseavbildning (figur 2) eller stereofluorescerende mikroskopi (figur 4). GFP-avbildning lar oss oppdage, telle og beregne arealet av hver metastatisk lesjon. Etter avbildning blir deler av hjernemetastasene formalinfiksert og behandlet for hematoksylin- og eosinfarging for å validere tilstedeværelsen av hjernemetastaselesjoner (figur 5A) og for immunhistokjemisk farging for å oppdage spesifikke proteinmarkører (figur 5B,C).
Figur 1 Skjematisk arbeidsflyt for generering av hjernemetastase via hale-vene-injeksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Luciferase-bilder av mus i dorsale og ventrale stillinger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Skjermbilder av bildebehandlingsprogramvare brukt til stereomikroskopi . (A) Trinn som viser hvordan du får tak i bilder. Den grønne firkanten til venstre viser live view-knappen; Den røde firkanten til høyre viser mikroskopets posisjon for nesestykkelinsen og zoomposisjonen; og den gule firkanten fremhever filtervalget. (B) Skjermbilde av trinnene som er involvert i måling av tumorbelastning. Den grønne firkanten øverst til venstre viser automatisk valgmodus for arealberegning; Den røde firkanten under den viser arealverdiene og andre målinger etter at hjernemetastaselesjonen ble valgt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Stereoskopiske bilder av musehjerner med metastaser fra hale-vene-injeksjon av MDA-IBC3-cellelinjen. Lysfeltbildet til venstre slås sammen med GFP-bildet (midten) og slås deretter sammen (høyre). Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Lysbilder som viser fargede bilder av MDA-IBC3-deriverte hjernemetastaser hos mus . (A) Hematoksylin- og eosinflekker gir histologisk bekreftelse på hjernemetastase. Immunfarging av MDA-IBC3-deriverte hjernemetastaserende svulster viser positiv farging for HER2 (B) og E-cadherin (C). Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen inneholder flere kritiske trinn. Celler bør holdes på is i ikke lenger enn 1 time for å opprettholde levedyktighet. Bomullsbind med alkohol bør brukes til å tørke av musens haler før injeksjon, og pass på at du ikke tørker for hardt eller for ofte for å unngå å skade halehuden. Sørg for at det ikke er luftbobler i cellesuspensjonen, for å forhindre at mus dør av blodkarembolier. Oppretthold injeksjonsvinkelen på 45° eller mindre for å unngå å stikke hull i blodkaret i halene, og stikk minst 1/3 av nålen inn i halevenen for å sikre vellykket injeksjon av alle celler. Det totale volumet av injiserte celler kan justeres i henhold til musens vekt, men det totale antall celler skal holdes så like som mulig. I denne protokollen var SCID / Beige musene alle 4 til 6 uker gamle og veide mellom 15 og 20 g. For mus som veier mindre enn 15 g, kan injeksjonsvolumet justeres til mindre enn 100 μL. ellers injiseres 100 μL. Etter fjerning fra skallen, må hele hjernen holdes i 1x DPBS i ikke lenger enn 1 time før avbildning ved stereoskopisk mikroskopi for å forhindre signalreduksjon og vevsdegenerasjon. For immunfluorescensavbildning bør hjernevev ikke plasseres i formalin, fordi det genererer endogen autofluorescens som hindrer oppkjøpet av bilder av høy kvalitet. Vi har bemerket at luciferase-avbildning ikke alltid avslører hjernemetastaser, spesielt svært små lesjoner; GFP-avbildning ved stereomikroskopi kan imidlertid visualisere alle lesjoner. Videre kan GFP-avbildning vise mer enn 1 lesjon, mens luciferase-avbildning ikke gjør det.
De foreslåtte prosedyrene kan endres noe i henhold til brukerens preferanser. For det første kan antall injiserte celler og varigheten av metastasedannelse justeres for forskjellige studier. For det andre kan musens haleåre visualiseres tydeligere ved å bruke varmt vann for å utvide venen eller UV-lys for å belyse venene. Til slutt kan størrelsen på nålen i sprøyten være enten 30 G eller 28 G.
Fordelene og begrensningene ved eksisterende musemodeller av hjernemetastase har blitt gjennomgått andre steder3 . Hjernemetastasemodellen vi beskrev her har sine begrensninger og styrker. En begrensning er at den ikke rekapitulerer alle trinnene i hjernens metastatiske prosess og ikke tillater forhør av de første stadiene av metastatisk prosess, dvs. spredning av primære brystkreftceller i sirkulasjonen. Også denne modellen kan ikke brukes til å studere samspillet mellom tumorceller og vertsimmunmikromiljøet under prosessen med hjernemetastase eller for å evaluere immunoterapeutiske applikasjoner. Denne modellen har imidlertid flere fordeler i forhold til andre hjernemetastasemodeller. For det første, i motsetning til spontane modeller der bare en liten brøkdel av musene utvikler hjernemetastaser med varierende intervaller, gir modellen vår fordelen av konsekvent å føre til metastase til hjernen, vanligvis hos mer enn 70% av musene. For det andre tillater hale-veneinjeksjon spredning av celler primært til lungen med påfølgende spredning til hjernen, mens inokulering via intrakarotisarterien tillater celler å spre seg direkte til hjernen; Intrakardiale injeksjoner tillater systemisk fordeling av kreftcellene til hjernen, så vel som til ekstrakranielle steder som lunge og bein. Dermed rekapitulerer vår modell hjernens metastatiske koloniseringstrinn bedre enn de vanlige intrakardiale eller intrakarotidinjeksjonsmodellene fordi cellene krysser lungekapillærsengene og overlever i sirkulasjonen før de genererer hjerneskader. Endelig er injeksjon av brystkreftceller via halevenen teknisk mindre utfordrende enn intrakarotid eller intrakardial injeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Christine F. Wogan, MS, ELS, fra MD Anderson's Division of Radiation Oncology for vitenskapelig redigering av manuskriptet, og Carol M. Johnston fra MD Anderson's Division of Surgery Histology Core for hjelp med hematoksylin og eosinfarging. Vi er takknemlige for Veterinary Medicine and Surgery Core ved MD Anderson for deres støtte til dyreforsøkene. Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskudd: Susan G. Komen Career Catalyst Research grant (CCR16377813 til BGD), American Cancer Society Research Scholar stipend (RSG-19-126-01 til BGD), og State of Texas sjeldne og aggressive brystkreftforskningsprogram. Også støttet delvis av Cancer Center Support (Core) Grant P30 CA016672 fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, til University of Texas MD Anderson Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 1000 µL pipette tip filtered | Genesee Scientific | 23430 | |
| 10 mL Serological Pipets | Genesee Scientific | 12-112 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% |
| Centrifuge tubes 15 mL bulk | Genesee Scientific | 28103 | |
| Corning 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine | GIBICO Inc. USA | MT10080CV | |
| Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Eppendorf centufuge 5810R | Eppendorf | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBICO Inc. USA | 16000044 | 10% |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers (40 μm) | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1 µg/mL |
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | 5 µg/mL |
| Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| MDA-IBC3 cell lines | MD Anderson Cancer Center | Generated by Dr. Woodward's lab24 | |
| Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid | System Biosciences | BLIV713PA-1 | |
| microtubes clear sterile 1.7 mL | Genesee Scientific | 24282S | |
| Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 23-401C | |
| TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Tail vein injection | |||
| C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J - SCID/Beige | Envigo | SCID/beige mice | |
| BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm) | BD | 328466 | |
| Plas Labs Broome-Style Rodent Restrainers | Plas Labs 551BSRR | 01-288-32A | Order fromThermo Fisher Scientific |
| Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof) | Thermo Fisher Scientific | 50420872 | 70 % used |
| Imaging | |||
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| Disposable PES Filter Units 0.45 µm | Fisherbrand | FB12566501 | filter system to sterilize the D-luciferin |
| D-Luciferin | Biosynth | L8220-1g | stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL |
| 1.7 mL microtube amber | Genesee Scientific | 24-282AM | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC-14043-704-06 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| IVIS 200 | PerkinElmer | machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine | |
| Plastic Containers with Lids | Fisherbrand | 02-544-127 | |
| Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 1000957 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| Stereomicroscope Imaging | |||
| Stereomicroscope AZ100 | Nikon | model AZ-STGE | software NIS-ELEMENT |
| Formalin 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| TC treated dishes 100x20 mm | Genesee Scientific | 25202 |
References
- Achrol, A. S., et al.
- Nayak, L., Lee, E. Q., Wen, P. Y.
- Lowery, F. J., Yu, D. Brain metastasis: Unique challenges and open opportunities. Biochimica et Biophysica Acta Review Cancer. 1867 (1), 49-57 (2017).
- Brufsky, A. M., et al. Central nervous system metastases in patients with HER2-positive metastatic breast cancer: incidence, treatment, and survival in patients from registHER. Clinical Cancer Research. 17 (14), 4834-4843 (2011).
- Valiente, M., et al.
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Woditschka, S., et al. DNA double-strand break repair genes and oxidative damage in brain metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (7), (2014).
- Palmieri, D., et al. Vorinostat inhibits brain metastatic colonization in a model of triple-negative breast cancer and induces DNA double-strand breaks. Clinical Cancer Research. 15 (19), 6148-6157 (2009).
- Kim, S. J., et al. Astrocytes upregulate survival genes in tumor cells and induce protection from chemotherapy. Neoplasia. 13 (3), 286-298 (2011).
- Zhang, S., et al. SRC family kinases as novel therapeutic targets to treat breast cancer brain metastases. Cancer Research. 73 (18), 5764-5774 (2013).
- Valiente, M., et al. Serpins promote cancer cell survival and vascular co-option in brain metastasis. Cell. 156 (5), 1002-1016 (2014).
- Gril, B., et al. Effect of lapatinib on the outgrowth of metastatic breast cancer cells to the brain. Journal of the National Cancer Institute. 100 (15), 1092-1103 (2008).
- Gril, B., et al. Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis. Clinical Cancer Research. 17 (1), 142-153 (2011).
- Palmieri, D., et al. Profound prevention of experimental brain metastases of breast cancer by temozolomide in an MGMT-dependent manner. Clinical Cancer Research. 20 (10), 2727-2739 (2014).
- Priego, N., et al. STAT3 labels a subpopulation of reactive astrocytes required for brain metastasis. Nature Medicine. 24 (7), 1024-1035 (2018).
- Debeb, B. G., et al. miR-141-mediated regulation of brain metastasis from breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 108 (8), (2016).
- Chang, S., Parker, S. L., Pham, T., Buzdar, A. U., Hursting, S. D. Inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program of the National Cancer Institute, 1975-1992. Cancer. 82 (12), 2366-2372 (1998).
- Hance, K. W., Anderson, W. F., Devesa, S. S., Young, H. A., Levine, P. H. Trends in inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program at the National Cancer Institute. Journal of National Cancer Institute. 97 (13), 966-975 (2005).
- Dirix, L. Y., Van Dam, P., Prove, A., Vermeulen, P. B. Inflammatory breast cancer: Current understanding. Current Opinion in Oncology. 18 (6), 563-571 (2006).
- Wang, Z., et al. Pattern of distant metastases in inflammatory breast cancer - A large-cohort retrospective study. Journal of Cancer. 11 (2), 292-300 (2020).
- Uemura, M. I., et al. Development of CNS metastases and survival in patients with inflammatory breast cancer. Cancer. 124 (11), 2299-2305 (2018).
- Smith, D. L., Debeb, B. G., Thames, H. D., Woodward, W. A. Computational modeling of micrometastatic breast cancer radiation dose response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 96 (1), 179-187 (2016).
- Fukumura, K., et al. Multi-omic molecular profiling reveals potentially targetable abnormalities shared across multiple histologies of brain metastasis. Acta Neuropathol. , (2021).
- Klopp, A. H., et al. Mesenchymal stem cells promote mammosphere formation and decrease E-cadherin in normal and malignant breast cells. PLoS One. 5 (8), 12180 (2010).
- Villodre, E. S., et al. Abstract P3-01-10: Ndrg1-egfr axis in inflammatory breast cancer tumorigenesis and brain metastasis. Cancer Research. 80 (4), 10 (2020).
