Summary
Nous décrivons un modèle murin xénogreffé de métastases cérébrales du cancer du sein générées par injection veineuse de la queue d’une lignée cellulaire de cancer inflammatoire du sein amplifiée par HER2 de manière endogène.
Abstract
La propagation métastatique au cerveau est une manifestation courante et dévastatrice de nombreux types de cancer. Rien qu’aux États-Unis, environ 200 000 patients reçoivent un diagnostic de métastases cérébrales chaque année. Des progrès significatifs ont été réalisés dans l’amélioration des résultats de survie des patientes atteintes d’un cancer du sein primitif et de tumeurs malignes systémiques; Cependant, le pronostic sombre pour les patients atteints de métastases cérébrales cliniques souligne le besoin urgent de développer de nouveaux agents thérapeutiques et stratégies contre cette maladie mortelle. Le manque de modèles expérimentaux appropriés a été l’un des principaux obstacles à l’avancement de notre compréhension de la biologie et du traitement des métastases cérébrales. Ici, nous décrivons un modèle murin xénogreffé de métastases cérébrales générées par injection veineuse de la queue d’une lignée cellulaire amplifiée endogène HER2 dérivée du cancer inflammatoire du sein (CIS), une forme rare et agressive de cancer du sein. Les cellules ont été marquées avec de la luciférase luciole et de la protéine de fluorescence verte pour surveiller les métastases cérébrales, et quantifiées la charge métastatique par imagerie par bioluminescence, stéréomicroscopie fluorescente et évaluation histologique. Les souris développent de manière robuste et cohérente des métastases cérébrales, ce qui permet d’étudier les médiateurs clés du processus métastatique et de développer des tests précliniques de nouvelles stratégies de traitement.
Introduction
Les métastases cérébrales sont une complication courante et mortelle des tumeurs malignes systémiques. La plupart des métastases cérébrales proviennent de tumeurs primaires du poumon, du sein ou de la peau, qui représentent collectivement 67 à 80 % descas1,2. Les estimations de l’incidence des métastases cérébrales varient entre 100 000 et 240 000 cas, et ces chiffres peuvent être sous-estimés car l’autopsie est rare chez les patients décédés d’un cancer métastatique3. Les patients présentant des métastases cérébrales ont un pronostic plus sombre et une survie globale plus faible par rapport aux patients sans métastases cérébrales4. Les options de traitement actuelles pour les métastases cérébrales sont en grande partie palliatives et ne parviennent pas à améliorer les résultats de survie pour la plupart des patients5. Ainsi, les métastases cérébrales restent un défi, et le besoin demeure pressant de mieux comprendre les mécanismes de progression des métastases cérébrales afin de développer des thérapies plus efficaces.
L’utilisation de modèles expérimentaux a fourni des informations importantes sur les mécanismes spécifiques de la progression métastatique du cancer du sein vers le cerveau et a permis d’évaluer l’efficacité de diverses approches thérapeutiques 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . Cependant, très peu de modèles peuvent récapituler avec précision et intégralité les subtilités du développement des métastases cérébrales. Plusieurs modèles expérimentaux in vivo ont été générés par inoculation de cellules cancéreuses chez la souris par différentes voies d’administration, y compris les injections orthotopiques, veineuses de la queue, intracardiaques, artérielles intracarotides et intracérébrales. Chaque technique présente des avantages et des inconvénients, comme examiné ailleurs3. Aucun de ces modèles murins, cependant, ne peut reproduire complètement la progression clinique des métastases cérébrales.
Les métastases cérébrales sont particulièrement fréquentes chez les patientes atteintes d’un cancer inflammatoire du sein (CIS), une variante rare mais agressive du cancer du sein primitif. Le CIS représente 1% à 4% des cas de cancer du sein, mais il est responsable d’un pourcentage disproportionné de 10% des décès liés au cancer du sein aux États-Unis17,18. Le CIS est connu pour métastaser rapidement; en effet, un tiers des patients atteints de CIS présentent des métastases à distance au moment du diagnostic19,20. En ce qui concerne les métastases cérébrales, les patients atteints de CIS ont une incidence plus élevée de métastases cérébrales que les patients atteints de CIS21. Récemment, nous avons démontré que la lignée cellulaire MDA-IBC3, dérivée du liquide d’épanchement pleural malin d’un patient atteint d’un IBC ER/PR-/HER2+ qui récapitule les caractéristiques du CIS dans les xénogreffes de souris, a une propension accrue à développer des métastases cérébrales plutôt que des métastases pulmonaires chez la souris lorsqu’elles sont injectées par la veine de la queue, faisant de cette lignée cellulaire un bon modèle pour étudier le développement des métastases cérébrales16.
Nous décrivons ici les procédures permettant de générer des métastases cérébrales par injection de cellules MDA-IBC3 dans la veine de la queue et d’évaluer la charge métastatique par microscopie stéréofluorescente et imagerie par luciférase. Cette méthode a été utilisée pour découvrir les médiateurs clés des métastases du cancer du sein au cerveau et pour tester l’efficacité des interventions thérapeutiques 16,22,23. L’inconvénient de cette technique est qu’elle ne récapitule pas toutes les étapes du processus métastatique cérébral. Néanmoins, ses principaux avantages comprennent la robustesse et la reproductibilité, l’implication de la biologie des métastases pertinentes de l’intravasation, la traversée des poumons et l’extravasation dans le cerveau, et sa relative simplicité en termes de technique.
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Protocol
La méthode décrite ici a été approuvée par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du MD Anderson Cancer Center et est conforme aux directives des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Le flux de travail schématique, avec toutes les étapes incluses, est présenté sous forme de figure 1.
1. Préparation cellulaire
REMARQUE : La lignée cellulaire MDA-IBC3 (ER-/PR-/HER2+), générée dans le laboratoire24 du Dr Woodward, a été transduite de façon stable avec un plasmide de la protéine fluorescente vert luciférase (Luc-GFP).
- La culture a transduit des cellules dans les milieux F-12 de Ham, complétées par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 1 μg/mL d’hydrocortisone, 5 μg/mL d’insuline et 1 % d’antibiotiques-antimitotiques.
- Plaquer les cellules MDA-IBC3-Luc-GFP à 37 °C et 5 % de CO2 dans une fiole T-75 jusqu’à confluence. Changez de milieu tous les 3 jours avant que les cellules ne soient suffisamment confluentes pour passer.
- Récolter les cellules en retirant le milieu, en lavant chaque fiole avec 10 ml de 1 solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco (c.-à-d. sans calcium ni magnésium) et en ajoutant 2 mL d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,25 %. Incuber pendant 3-5 min à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se détachent.
- Ajouter 5 mL de média complet dans le ballon pour recueillir les cellules et transférer tout le contenu dans un tube à centrifuger de 15 mL (optimisé pour un tube à centrifuger de 50 mL selon le nombre total de cellules nécessaires). Centrifuger à 290 x g pendant 5 min pour hydrater les granulés.
REMARQUE : Le milieu complet est le milieu F-12 de Ham complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 1 μg/mL d’hydrocortisone, 5 μg/mL d’insuline et 1 % d’antibiotique-antimitotique. - Jetez le surnageant. Ensuite, lavez les cellules avec 10 ml de 1x DPBS. Centrifuger à 290 x g pendant 5 min pour granuler les cellules et jeter soigneusement le surnageant. Remettez les cellules en suspension avec 1 mL de 1x DPBS frais et mélangez bien en pipetant de haut en bas.
- Pour fabriquer des suspensions unicellulaires, filtrez les cellules à travers des crépines à cellules stériles de 40 μm.
- Calculez la densité de cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.
NOTE: Pour réduire les erreurs de comptage, créez différentes dilutions de cellules et comptez-les séparément, et calculez la valeur moyenne pour déterminer la concentration de cellules (nombre de cellules / mL).- Prélever 2 μL de suspension cellulaire + 8 μL de 1x DPBS pour faire un échantillon de dilution 1:5.
- Prélever 1 μL de suspension cellulaire + 9 μL de 1x DPBS pour faire un échantillon de dilution 1:10.
- Ajouter 10 μL de coloration bleue trypan à 0,4%. Bien mélanger le mélange d’échantillons en le pipetant de haut en bas plusieurs fois.
- Pipeter doucement 10 μL de l’échantillon dans la zone de chargement de l’échantillon en forme de demi-lune des lames de la chambre de comptage. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles à l’intérieur; Attendez 30 s pour permettre aux cellules de s’installer dans la chambre avant de compter.
- Diluer les cellules avec 1x DPBS à une densité de 5 x 105 ou 1 x 106 cellules par 100 μL. Transférer la suspension cellulaire dans des tubes microcentrifugeuses de 1,7 mL pour l’injection de la veine résiduelle. Placer les cellules sur la glace jusqu’à l’injection pour maintenir la viabilité.
2. Injection veineuse de la queue
- Utilisez des souris athymiques SCID/Beige femelles âgées de 4 à 6 semaines.
- Préparez une seringue de 30 G pour aspirer 100 μL de suspension cellulaire. Enlevez toutes les bulles d’air.
- Placez la souris dans un appareil de retenue pour rongeurs (diamètre d’environ 1 pouce) pour faciliter l’injection de la veine de la queue et prévenir les blessures dues au mouvement pendant le processus d’injection.
- Utilisez des tampons de coton à base d’alcool (faits d’éthanol à 70%) pour essuyer doucement la queue de la souris 3-4 fois et maintenez-la pendant 5-10 s pour rendre la veine de la queue plus clairement visible.
- Insérez la seringue dans la queue de la souris à un angle de 15-30°. Poussez lentement la suspension cellulaire dans la veine de la queue.
- Retirez doucement la seringue et utilisez le coton pour tenir la queue pendant quelques secondes afin d’arrêter tout saignement.
- Remettez les souris dans leurs cages et vérifiez-les 2 à 4 heures après l’injection pour vous assurer qu’aucun effet indésirable ne se produit.
3. Évaluation du fardeau des métastases cérébrales
- Préparer une solution de D-luciférine diluée.
NOTA : La concentration stock-stock est de 47,6 mM (15,15 mg/mL) et la concentration utilisée est de 1,515 mg/mL.- Ajouter 5 ml de 1x DPBS dans le flacon de D-luciférine.
- Placer 2,5 mL de la solution dans chacun des deux tubes coniques de 50 mL.
- Ajouter encore 5 ml de 1x DPBS dans le flacon de D-luciférin à nouveau pour le rincer. Mettez 2,5 mL dans chaque tube conique de 50 mL.
- Placez encore 5 ml de 1x DPBS dans le flacon et rincez-le à nouveau. Répétez le processus de rinçage deux fois.
- Ajouter 1x DPBS à chaque tube de 50 mL pour un total de 66 mL (environ 33 mL par tube). Il devrait y avoir environ 33 mL de la solution dans chaque tube.
- Bien mélanger les tubes, puis combiner les deux dans une unité de filtration stérile (filtre PES de 150 ml 0,45 μm).
- Filtrer la solution, puis aliquote la solution filtrée dans des microtubes ambrés stériles de 1,7 mL.
- Détection des métastases cérébrales par imagerie de la luciférase.
- Décongeler la D-luciférine en restant sur la glace, et vortex avant l’injection dans les souris.
- Nettoyez la zone d’injection avec des tampons de coton alcoolique et injectez 100 μL de D-luciférine par souris par voie intrapéritonéale à l’aide d’une seringue à insuline de 0,5 mL, une seringue pour chaque cage.
- Après 10 min, anesthésier les souris avec de l’isoflurane (2% O 2-2,5% d’isoflurane) pendant 5 min à l’aide du vaporisateur vétérinaire connecté à la chambre d’induction du petit animal.
- Activez le système d’imagerie in vivo. Pendant que les souris de la première cage sont sous anesthésie, injectez la D-luciférine dans les souris de la cage suivante.
- Mettez des souris dans la machine du système d’imagerie in vivo et obtenez des images ventrales et dorsales. Sélectionnez un temps d’exposition de 2 min et, dans la vue de champ, choisissez l’option E (corps entier). Appuyez sur Acquérir. Ensuite, enregistrez l’image (Figure 2).
REMARQUE: Si l’image montre une saturation de la luminescence, réduisez le temps d’exposition.
- Détection des métastases cérébrales par imagerie GFP.
- Préparation des tissus cérébraux.
- Environ 8 à 10 semaines après l’injection de cellules ou lorsque les souris sont moribondes en raison de la charge de métastases cérébrales, euthanasier les souris par inhalation d’une surdose d’isoflurane suivie d’une luxation cervicale, conformément aux protocoles approuvés par l’IACUC.
- Après l’euthanasie à l’isoflurane suivie d’une luxation cervicale, vaporisez les souris avec une solution d’éthanol à 70% et retirez la fourrure de la tête et des oreilles avec des ciseaux. Ensuite, faites une incision dans la région cervicale du cou (en prenant soin de ne pas décapiter la souris). Coupez le crâne et retirez-le. Ensuite, retirez soigneusement le cerveau.
- Placez les cerveaux collectés dans des cassettes de tissu.
- Transférer les cassettes dans un récipient avec 1x DPBS froid.
REMARQUE: Les échantillons de cerveau ne doivent pas être conservés dans 1x DPBS pendant plus de 1 heure. Si plusieurs échantillons de cerveau doivent être prélevés en même temps, euthanasier seulement quelques souris à la fois (10 par tour).
- Imagerie stéréomicroscopique.
- Transférer tout le cerveau sur un couvercle de tissu de 100 cm.
- Allumez le stéréomicroscope et la lumière UV, en position 3 avec la lentille 0,5x, pour permettre la visualisation de l’ensemble du cerveau comme le montre la figure 3A (carré rouge).
- Appuyez sur Live view (Figure 3A, carré vert).
- Concentrez la vue pendant que le cerveau est en position ventrale.
- Sélectionnez GFP (si les cellules sont marquées GFP) ou TXRED (si les cellules sont marquées RFP) (Figure 3A, carré jaune) dans le logiciel, sélectionnez le filtre approprié sur le microscope et prenez une photo.
REMARQUE: Maintenez le réglage de la source lumineuse SOLA à environ 30%; si la GFP est trop brillante, réduire jusqu’à ce que le signal approprié soit observé. - Sans déplacer l’échantillon, allumez la lumière vive et sélectionnez BF (Figure 3A, carré jaune). Prenez une photo.
- Répétez les étapes précédentes avec le cerveau en position dorsale.
REMARQUE: Selon la taille, la même lésion de métastase cérébrale GFP positive peut apparaître dans les positions ventrale et dorsale. Dans un tel cas, éviter la quantification en double de la même lésion. Enregistrez les images avec une extension TIFF (qui conserve toutes les informations dans le fichier image). - Enregistrez les images avec une extension TIFF (qui conserve toutes les informations dans le fichier image).
- Répétez les étapes pour tous les échantillons.
- Convertissez les images TIFF en JPEG afin que les fichiers puissent être ouverts avec n’importe quel ordinateur sur lequel le logiciel associé n’est pas installé (Fichier | Import/Export | convertir des fichiers).
- Pour fusionner l’image fluorescente avec l’image en champ clair, ouvrez les deux images et accédez à Fichier | Fusionner les canaux. Sélectionnez les composants appropriés, vert pour GFP et fond clair pour BF, puis appuyez sur OK. Enregistrez l’image fusionnée.
- Pour quantifier la zone tumorale cérébrale, utilisez l’image fluorescente. Sélectionner une mesure | Mesure manuelle | de la région. Sélectionnez la sélection automatique (Figure 3B, carré vert), déplacez la flèche vers la zone GFP positive et cliquez pour créer automatiquement une sélection. Cliquez à nouveau pour confirmer la sélection, puis toutes les mesures s’afficheront (Figure 3B, carré rouge). Si plus d’une zone positive à la GFP est présente, répétez la procédure.
- Une fois les images cérébrales obtenues, passez aux protocoles de fixation tissulaire de routine en utilisant du formol tamponné neutre à 10%.
- Une fois les cerveaux fixés, procéder à une section histologique standard suivie d’une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine pour confirmer la présence de métastases cérébrales et de coloration immunohistochimique pour détecter les marqueurs sélectionnés.
REMARQUE: L’immunocytochimie a été réalisée au laboratoire de pathologie de base du UT MD Anderson Cancer Center qui a normalisé le protocole pour la coloration immunohistochimique des marqueurs connus.
- Une fois les cerveaux fixés, procéder à une section histologique standard suivie d’une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine pour confirmer la présence de métastases cérébrales et de coloration immunohistochimique pour détecter les marqueurs sélectionnés.
- Préparation des tissus cérébraux.
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Representative Results
Avec la justification que les cellules marquées facilitent la surveillance et la visualisation des métastases cérébrales dans des modèles murins précliniques, nous avons marqué les cellules MDA-IBC3 avec Luc et avec GFP pour surveiller les métastases cérébrales et quantifier la charge métastatique en utilisant l’imagerie par bioluminescence et la stéréomicroscopie fluorescente. L’injection des cellules MDA-IBC3 marquées dans les veines caudales de souris immunodéprimées SCID/Beige a entraîné des pourcentages élevés de métastases cérébrales (c.-à-d. 66,7 % à 100 %)16,23,25. Les lésions métastatiques cérébrales ont pu être détectées dès 8 semaines après l’injection par imagerie par luciférase (Figure 2) ou par microscopie stéréofluorescente (Figure 4). L’imagerie GFP nous permet de détecter, compter et calculer la surface de chaque lésion métastatique. Après l’imagerie, des parties des métastases cérébrales sont fixées au formol et traitées pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine afin de valider la présence de lésions de métastases cérébrales (figure 5A) et pour la coloration immunohistochimique afin de détecter des marqueurs protéiques spécifiques (figure 5B,C).
Figure 1 : Flux de travail schématique pour la génération de métastases cérébrales par injection de la veine de la queue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images de Luciferase de souris en position dorsale et ventrale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Captures d’écran du logiciel d’imagerie utilisé pour la stéréomicroscopie. (A) Étapes montrant comment obtenir des images. Le carré vert à gauche montre le bouton d’affichage en direct; Le carré rouge à droite montre la position du microscope pour la lentille de l’embout nasal et la position du zoom; et le carré jaune met en évidence la sélection du filtre. (B) Capture d’écran des étapes impliquées dans la mesure de la charge tumorale. Le carré vert en haut à gauche indique le mode de sélection automatique pour le calcul de la surface ; Le carré rouge en dessous montre les valeurs de surface et d’autres mesures après la sélection de la lésion de métastase cérébrale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Images stéréoscopiques de cerveaux de souris présentant des métastases provenant de l’injection dans les veines de la queue de la lignée cellulaire MDA-IBC3. L’image en fond clair à gauche est fusionnée avec l’image GFP (au milieu), puis fusionnée (à droite). Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Diapositives montrant des images colorées de métastases cérébrales dérivées de MDA-IBC3 chez la souris. (A) Les colorations à l’hématoxyline et à l’éosine fournissent une confirmation histologique des métastases cérébrales. L’immunomarquage des tumeurs métastatiques cérébrales dérivées de MDA-IBC3 montre une coloration positive pour HER2 (B) et E-cadhérine (C). Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le protocole comprend plusieurs étapes critiques. Les cellules ne doivent pas être conservées sur la glace plus de 1 heure pour maintenir leur viabilité. Des tampons de coton alcoolique doivent être utilisés pour essuyer la queue des souris avant l’injection, en prenant soin de ne pas essuyer trop fort ou trop souvent pour éviter d’endommager la peau de la queue. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est présente dans la suspension cellulaire, pour empêcher les souris de mourir des emboles des vaisseaux sanguins. Maintenez l’angle d’injection à 45° ou moins pour éviter de percer le vaisseau sanguin dans la queue et insérez au moins 1/3 de l’aiguille dans la veine de la queue pour assurer une injection réussie de toutes les cellules. Le volume total des cellules injectées peut être ajusté en fonction du poids des souris, mais le nombre total de cellules doit être maintenu aussi similaire que possible. Dans ce protocole, les souris SCID / Beige étaient toutes âgées de 4 à 6 semaines et pesaient entre 15 et 20 g. Pour les souris pesant moins de 15 g, le volume d’injection pourrait être ajusté à moins de 100 μL; sinon, 100 μL sont injectés. Après son retrait du crâne, tout le cerveau doit être maintenu dans 1x DPBS pendant pas plus de 1 heure avant l’imagerie par microscopie stéréoscopique pour prévenir la réduction du signal et la dégénérescence des tissus. Pour l’imagerie par immunofluorescence, les tissus cérébraux ne doivent pas être placés dans du formol, car cela génère une autofluorescence endogène qui empêche l’acquisition d’images de haute qualité. Nous avons noté que l’imagerie par luciférase ne révèle pas toujours de métastases cérébrales, en particulier de très petites lésions; cependant, l’imagerie GFP par stéréomicroscopie permet de visualiser toutes les lésions. De plus, l’imagerie GFP peut montrer plus de 1 lésion, alors que l’imagerie par luciférase ne le fait pas.
Les procédures proposées peuvent être légèrement modifiées en fonction des préférences de l’utilisateur. Tout d’abord, le nombre de cellules injectées et la durée de formation des métastases ont pu être ajustés pour différentes études. Deuxièmement, la veine de la queue des souris pourrait être visualisée plus clairement en utilisant de l’eau chaude pour dilater la veine ou de la lumière UV pour éclairer les veines. Enfin, la taille de l’aiguille dans la seringue peut être de 30 G ou 28 G.
Les avantages et les limites des modèles murins existants de métastases cérébrales ont été examinés ailleurs[3 ]. Le modèle de métastases cérébrales que nous avons décrit ici a ses limites et ses forces. Une limitation est qu’il ne récapitule pas toutes les étapes du processus métastatique cérébral et ne permet pas d’interroger les étapes initiales du processus métastatique, c’est-à-dire la dissémination des cellules cancéreuses primaires du sein dans la circulation. En outre, ce modèle ne peut pas être utilisé pour étudier les interactions entre les cellules tumorales et le microenvironnement immunitaire de l’hôte au cours du processus de métastases cérébrales ou pour évaluer des applications immunothérapeutiques. Cependant, ce modèle présente plusieurs avantages par rapport aux autres modèles de métastases cérébrales. Tout d’abord, contrairement aux modèles spontanés dans lesquels seule une petite fraction des souris développe des métastases cérébrales à intervalles variables, notre modèle offre l’avantage de conduire systématiquement à des métastases au cerveau, généralement chez plus de 70% des souris. Deuxièmement, l’injection de la veine de queue permet la dissémination des cellules principalement vers les poumons avec une propagation ultérieure au cerveau, tandis que l’inoculation via l’artère intracarotide permet aux cellules de se propager directement au cerveau; Les injections intracardiaques permettent la distribution systémique des cellules cancéreuses au cerveau ainsi qu’aux sites extracrâniens tels que les poumons et les os. Ainsi, notre modèle récapitule mieux l’étape de colonisation métastatique cérébrale que les modèles d’injection intracardiaque ou intracarotidienne couramment utilisés car les cellules traversent les lits capillaires pulmonaires et survivent dans la circulation avant de générer des lésions cérébrales. Enfin, l’injection de cellules cancéreuses du sein par la veine de la queue est techniquement moins difficile que l’injection intracarotidienne ou intracardiaque.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions Christine F. Wogan, MS, ELS, de la Division de radio-oncologie de MD Anderson pour la révision scientifique du manuscrit, et Carol M. Johnston de la Division d’histologie chirurgicale de MD Anderson pour son aide avec la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine. Nous sommes reconnaissants envers le noyau de médecine et de chirurgie vétérinaires de MD Anderson pour son soutien aux études sur les animaux. Ces travaux ont été financés par les subventions suivantes : Susan G. Komen Career Catalyst Research grant (CCR16377813 à BGD), American Cancer Society Research Scholar grant (RSG-19–126–01 à BGD) et State of Texas Rare and Aggressive Breast Cancer Research Program. Également soutenu en partie par Cancer Center Support (Core) Grant P30 CA016672 du National Cancer Institute, National Institutes of Health, au MD Anderson Cancer Center de l’Université du Texas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 1000 µL pipette tip filtered | Genesee Scientific | 23430 | |
| 10 mL Serological Pipets | Genesee Scientific | 12-112 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% |
| Centrifuge tubes 15 mL bulk | Genesee Scientific | 28103 | |
| Corning 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine | GIBICO Inc. USA | MT10080CV | |
| Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Eppendorf centufuge 5810R | Eppendorf | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBICO Inc. USA | 16000044 | 10% |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers (40 μm) | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1 µg/mL |
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | 5 µg/mL |
| Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| MDA-IBC3 cell lines | MD Anderson Cancer Center | Generated by Dr. Woodward's lab24 | |
| Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid | System Biosciences | BLIV713PA-1 | |
| microtubes clear sterile 1.7 mL | Genesee Scientific | 24282S | |
| Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 23-401C | |
| TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Tail vein injection | |||
| C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J - SCID/Beige | Envigo | SCID/beige mice | |
| BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm) | BD | 328466 | |
| Plas Labs Broome-Style Rodent Restrainers | Plas Labs 551BSRR | 01-288-32A | Order fromThermo Fisher Scientific |
| Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof) | Thermo Fisher Scientific | 50420872 | 70 % used |
| Imaging | |||
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| Disposable PES Filter Units 0.45 µm | Fisherbrand | FB12566501 | filter system to sterilize the D-luciferin |
| D-Luciferin | Biosynth | L8220-1g | stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL |
| 1.7 mL microtube amber | Genesee Scientific | 24-282AM | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC-14043-704-06 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| IVIS 200 | PerkinElmer | machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine | |
| Plastic Containers with Lids | Fisherbrand | 02-544-127 | |
| Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 1000957 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| Stereomicroscope Imaging | |||
| Stereomicroscope AZ100 | Nikon | model AZ-STGE | software NIS-ELEMENT |
| Formalin 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| TC treated dishes 100x20 mm | Genesee Scientific | 25202 |
References
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