Summary
Endojen olarak HER2 ile amplifiye edilmiş inflamatuar meme kanseri hücre hattının kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla üretilen meme kanseri beyin metastazının bir ksenogreft fare modelini tanımladık.
Abstract
Beyne metastatik yayılım, birçok kanser türünün yaygın ve yıkıcı bir tezahürüdür. Sadece Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl yaklaşık 200.000 hastaya beyin metastazı teşhisi konmaktadır. Primer meme kanseri ve sistemik maligniteleri olan hastalar için sağkalım sonuçlarının iyileştirilmesinde önemli ilerleme kaydedilmiştir; Bununla birlikte, klinik beyin metastazı olan hastalar için kasvetli prognoz, bu ölümcül hastalığa karşı yeni terapötik ajanlar ve stratejiler geliştirmeye acil ihtiyaç olduğunu vurgulamaktadır. Uygun deneysel modellerin olmaması, beyin metastazı biyolojisi ve tedavisi konusundaki anlayışımızın ilerlemesini engelleyen en büyük engellerden biri olmuştur. Burada, nadir ve agresif bir meme kanseri formu olan inflamatuar meme kanserinden (IBC) türetilen endojen olarak HER2 ile amplifiye edilmiş bir hücre hattının kuyruk veni enjeksiyonu yoluyla üretilen bir ksenogreft fare beyin metastazı modelini açıklıyoruz. Hücreler, beyin metastazını izlemek için ateşböceği lusiferaz ve yeşil floresan proteini ile etiketlendi ve biyolüminesans görüntüleme, floresan stereomikroskopi ve histolojik değerlendirme ile metastatik yükü ölçtü. Fareler sağlam ve tutarlı bir şekilde beyin metastazları geliştirir, bu da metastatik süreçteki anahtar aracıların araştırılmasına ve yeni tedavi stratejilerinin klinik öncesi testlerinin geliştirilmesine olanak tanır.
Introduction
Beyin metastazı, sistemik malignitelerin sık görülen ve ölümcül bir komplikasyonudur. Beyin metastazlarının çoğu, toplu olarak vakaların% 67-80'ini oluşturan akciğer, meme veya cildin primer tümörlerinden kaynaklanır 1,2. Beyin metastazı insidansı tahminleri 100.000 ila 240.000 vaka arasında değişmektedir ve bu sayılar metastatik kanserden ölen hastalar için otopsi nadir olduğu için hafife alınabilir3. Beyin metastazı olan hastalar, beyin metastazı olmayan hastalara göre daha kötü prognoza ve daha düşük genel sağkalıma sahiptir4. Beyin metastazları için mevcut tedavi seçenekleri büyük ölçüde palyatiftir ve çoğu hasta için sağkalım sonuçlarını iyileştirmede başarısızolur 5. Bu nedenle, beyin metastazı bir zorluk olmaya devam etmektedir ve daha etkili tedaviler geliştirmek için beyin metastazı ilerleme mekanizmalarını daha iyi anlama ihtiyacı devam etmektedir.
Deneysel modellerin kullanımı, meme kanserinin beyne metastatik ilerlemesinin spesifik mekanizmaları hakkında önemli bilgiler sağlamış ve çeşitli terapötik yaklaşımların etkinliğinin değerlendirilmesine izin vermiştir 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . Bununla birlikte, çok az sayıda model beyin metastazı gelişiminin inceliklerini doğru ve tam olarak özetleyebilir. Ortotopik, kuyruk damarı, intrakardiyak, intrakarotis arteriyel ve intraserebral enjeksiyonlar dahil olmak üzere farklı uygulama yollarıyla kanser hücrelerinin farelere aşılanması yoluyla birkaç deneysel in vivo model oluşturulmuştur. Her tekniğin avantajları ve dezavantajları vardır, başka bir yerde gözden geçirildiği gibi3. Bununla birlikte, bu fare modellerinin hiçbiri beyin metastazının klinik ilerlemesini tam olarak kopyalayamaz.
Beyin metastazları, primer meme kanserinin nadir fakat agresif bir varyantı olan inflamatuar meme kanseri (IBC) hastalarında özellikle yaygındır. IBC, meme kanseri vakalarının %1 ila %4'ünü oluşturur, ancak Amerika Birleşik Devletleri'nde meme kanserine bağlı ölümlerin orantısız bir şekilde %10'undan sorumludur17,18. IBC'nin hızla metastaz yaptığı bilinmektedir; Gerçekten de, IBC hastalarının üçte birinde tanı anında uzak metastaz vardır19,20. Beyin metastazı spesifik olarak, IBC'li hastalarda beyin metastazı insidansı, IBC olmayan hastalara göre daha yüksektir21. Son zamanlarda, fare ksenogreftlerinde IBC özelliklerini özetleyen ER-/PR-/HER2+ IBC'li bir hastanın malign plevral efüzyon sıvısından türetilen MDA-IBC3 hücre hattının, kuyruk damarı ile enjekte edildiğinde farelerde akciğer metastazlarından ziyade beyin metastazı geliştirme eğiliminin arttığını gösterdik, bu da bu hücre hattını beyin metastazının gelişimini incelemek için iyi bir model haline getirdi16.
Burada, MDA-IBC3 hücrelerinin kuyruk-ven enjeksiyonu ile beyin metastazı oluşturma ve stereofloresan mikroskopi ve lusiferaz görüntüleme ile metastatik yükü değerlendirme prosedürleri açıklanmaktadır. Bu yöntem, meme kanseri metastazının beyne anahtar aracılarını keşfetmek ve terapötik müdahalelerin etkinliğini test etmek için kullanılmıştır 16,22,23. Bu tekniğin dezavantajı, beyin metastatik sürecindeki tüm adımları özetlememesidir. Bununla birlikte, başlıca avantajları arasında sağlamlık ve tekrarlanabilirlik, intravazasyonun ilgili metastaz biyolojisinin katılımı, akciğerleri geçme ve beyne ekstravazasyon ve teknik açıdan göreceli basitliği sayılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan yöntem, MD Anderson Kanser Merkezi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Kılavuzları ile uyumludur. Şematik iş akışı, tüm adımlarla birlikte Şekil 1'de sunulmuştur.
1. Hücre hazırlığı
NOT: Dr. Woodward'ın laboratuvarında24'te üretilen MDA-IBC3 (ER-/PR-/HER2+) hücre hattı, bir lusiferaz-yeşil floresan proteini (Luc-GFP) plazmidi ile stabil bir şekilde transdüksiyona tabi tutuldu.
- %10 fetal sığır serumu (FBS), 1 μg/mL hidrokortizon, 5 μg/mL insülin ve %1 antibiyotik-antimitotik ile takviye edilmiş Ham'ın F-12 ortamındaki kültür transdüksiyonlu hücreler.
- MDA-IBC3-Luc-GFP hücrelerini 37 ° C'de ve% 5 CO2 birleşene kadar bir T-75 şişesinde plakalayın. Hücreler geçiş için yeterince birleşene kadar her 3 günde bir ortamı değiştirin.
- Ortamı çıkararak, her şişeyi 10 mL 1x Dulbecco'nun (yani kalsiyum ve magnezyum içermeyen) fosfat tamponlu salin (DPBS) ile yıkayarak ve 2 mL %0.25 tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyerek hücreleri hasat edin. Hücreler ayrılana kadar 37 ° C'de 3-5 dakika inkübe edin.
- Hücreleri toplamak ve tüm içeriği 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne (ihtiyaç duyulan toplam hücre sayısına bağlı olarak 50 mL santrifüj tüpüne optimize edilmiş) aktarmak için şişeye 5 mL tam ortam ekleyin. Pelet hücrelerine 5 dakika boyunca 290 x g'da santrifüjleyin.
NOT: Komple besiyeri, %10 fetal sığır serumu (FBS), 1 μg/mL hidrokortizon, 5 μg/mL insülin ve %1 antibiyotik-antimitotik ile desteklenmiş Ham'ın F-12 besiyeridir. - Süpernatanı atın. Ardından hücreleri 10 mL 1x DPBS ile yıkayın. Hücreleri peletlemek için 5 dakika boyunca 290 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice atın. Hücreleri 1 mL taze 1x DPBS ile tekrar süspanse edin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
- Tek hücreli süspansiyonlar yapmak için, hücreleri 40 μm steril hücre süzgeçlerinden süzün.
- Otomatik hücre sayacı kullanarak hücre yoğunluğunu hesaplayın.
NOT: Sayımdaki hataları azaltmak için, farklı hücre seyreltmeleri oluşturun ve bunları ayrı ayrı sayın ve hücrelerin konsantrasyonunu (hücre sayısı/mL) belirlemek için ortalama değeri hesaplayın.- 1:5 seyreltme numunesi yapmak için 2 μL hücre süspansiyonu + 8 μL 1x DPBS toplayın.
- 1:10 seyreltme numunesi yapmak için 1 μL hücre süspansiyonu + 9 μL 1x DPBS toplayın.
- 10 μL% 0.4 tripan mavisi lekesi ekleyin. Numune karışımını birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
- Numunenin 10 μL'sini sayım odası slaytlarının yarım ay şeklindeki numune yükleme alanına nazikçe pipetleyin. İçeride kabarcık olmadığından emin olun; Saymadan önce hücrelerin hazneye yerleşmesi için 30 saniye bekleyin.
- Hücreleri 1x DPBS ile 100 μL başına 5 x 105 veya 1 x 106 hücre yoğunluğuna seyreltin. Kuyruk damarı enjeksiyonu için hücre süspansiyonunu 1.7 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Canlılığı korumak için hücreleri enjeksiyona kadar buzun üzerine yerleştirin.
2. Kuyruk damar enjeksiyonu
- 4 ila 6 haftalık dişi timik SCID / Bej fareler kullanın.
- 100 μL hücre süspansiyonu çekmek için 30 G'lik bir şırınga hazırlayın. Tüm hava kabarcıklarını çıkarın.
- Kuyruk damarı enjeksiyonunu kolaylaştırmak ve enjeksiyon işlemi sırasında hareketten kaynaklanan yaralanmaları önlemek için fareyi bir kemirgen tutucuya (yaklaşık 1 inç çapında) yerleştirin.
- Farenin kuyruğunu 3-4 kez nazikçe silmek için alkollü pamuklu pedler (%70 etanolden yapılmış) kullanın ve kuyruk damarını daha net görünür hale getirmek için 5-10 saniye basılı tutun.
- Şırıngayı farenin kuyruğuna 15-30° açıyla yerleştirin. Hücre süspansiyonunu yavaşça kuyruk damarına doğru itin.
- Şırıngayı nazikçe çıkarın ve herhangi bir kanamayı durdurmaya yardımcı olmak için kuyruğu birkaç saniye tutmak için pamuklu pedi kullanın.
- Fareleri kafeslerine geri koyun ve herhangi bir yan etki oluşmadığından emin olmak için enjeksiyondan 2-4 saat sonra kontrol edin.
3. Beyin metastaz yükünün değerlendirilmesi
- Seyreltilmiş D-lusiferin çözeltisi hazırlayın.
NOT: Stok konsantrasyonu 47.6 mM (15.15 mg/mL) ve kullanım konsantrasyonu 1.515 mg/mL'dir.- D-lusiferin şişesine 5 mL 1x DPBS ekleyin.
- İki adet 50 mL'lik konik tüpün her birine 2,5 mL çözelti yerleştirin.
- Durulamak için tekrar D-lusiferin şişesine 5 mL 1x DPBS daha ekleyin. Her 50 mL'lik konik tüpe 2,5 mL koyun.
- Şişeye 5 mL daha 1x DPBS koyun ve tekrar durulayın. Durulama işlemini iki kez tekrarlayın.
- Her 50 mL'lik tüpe toplam 66 mL'ye (tüp başına yaklaşık 33 mL) 1x DPBS ekleyin. Her tüpte yaklaşık 33 mL çözelti bulunmalıdır.
- Tüpleri iyice karıştırın ve ardından her ikisini de steril bir filtreleme ünitesinde (150 mL PES filtresi 0,45 μm) birleştirin.
- Çözeltiyi süzün ve ardından filtrelenmiş çözeltiyi steril kehribar 1.7 mL mikrotüplere ayırın.
- Lusiferaz görüntüleme ile beyin metastazlarını tespit etmek.
- D-lusiferini buz üzerinde tutarak çözün ve farelere enjeksiyondan önce girdap yapın.
- Enjeksiyon alanını alkollü pamuklu pedlerle temizleyin ve her kafes için bir şırınga olmak üzere 0.5 mL'lik bir insülin şırıngası kullanarak intraperitoneal olarak fare başına 100 μL D-lusiferin enjekte edin.
- 10 dakika sonra, küçük hayvan indüksiyon odasına bağlı veteriner buharlaştırıcıyı kullanarak fareleri izofluran (% 2 O 2 -%2.5 izofluran) ile 5 dakika boyunca uyuşturun.
- In vivo görüntüleme sistemini açın. İlk kafesteki fareler anestezi altındayken, D-lusiferin'i bir sonraki kafesteki farelere enjekte edin.
- Fareleri in vivo görüntüleme sistemi makinesine koyun ve ventral ve dorsal görüntüler elde edin. 2 dakikalık bir pozlama süresi seçin ve alan görünümünde E seçeneğini (tüm vücut) seçin. Al'a basın. Ardından, görüntüyü kaydedin (Şekil 2).
NOT: Görüntü lüminesans doygunluğu gösteriyorsa, pozlama süresini azaltın.
- GFP görüntüleme ile beyin metastazlarını tespit etmek.
- Beyin dokusu hazırlığı.
- Hücrelerin enjeksiyonundan yaklaşık 8-10 hafta sonra veya fareler beyin metastaz yükü nedeniyle can çekiştiğinde, IACUC tarafından onaylanan protokollere uygun olarak, bir izofluran doz aşımını soluyarak fareleri ötenazi yapın ve ardından servikal çıkık yapın.
- İzofluran ile ötenaziden ve ardından servikal çıkıktan sonra, farelere% 70 etanol çözeltisi püskürtün ve kürkü baş bölgesinden ve kulaklardan makasla çıkarın. Daha sonra, boynun servikal bölgesinde bir kesim yapın (farenin başını kesmemeye dikkat edin). Kafatasını kesin ve dışarı çekin. Sonra, beyni dikkatlice çıkarın.
- Toplanan beyinleri doku kasetlerine yerleştirin.
- Kasetleri soğuk 1x DPBS'li bir kaba aktarın.
NOT: Beyin örnekleri 1x DPBS'de 1 saatten fazla tutulmamalıdır. Aynı anda birkaç beyin örneği toplanacaksa, bir seferde sadece birkaç fareye ötenazi yapın (tur başına 10).
- Steremikroskobik görüntüleme.
- Tüm beyni 100 cm'lik bir doku kabı kapağına aktarın.
- Şekil 3A'da (kırmızı kare) gösterildiği gibi tüm beynin görselleştirilmesine izin vermek için stereomikroskobu ve UV ışığını 3x lens ile 0.5x konumunda açın.
- Basın Canlı view (Şekil 3A, yeşil kare).
- Beyin ventral pozisyondayken görüşe odaklanın.
- Yazılımda GFP'yi (hücreler GFP etiketliyse) veya TXRED'i (hücreler RFP etiketliyse) (Şekil 3A, sarı kare) seçin, mikroskopta uygun filtreyi seçin ve bir resim çekin.
NOT: SOLA ışık kaynağı ayarını yaklaşık %30'da tutun; GFP çok parlaksa, uygun sinyal gözlemlenene kadar azaltın. - Numuneyi hareket ettirmeden parlak ışığı açın ve BF'yi seçin (Şekil 3A, sarı kare). Bir fotoğraf çekin.
- Beyin sırt pozisyonundayken önceki adımları tekrarlayın.
NOT: Büyüklüğüne bağlı olarak, aynı GFP pozitif beyin metastazı lezyonu hem ventral hem de dorsal pozisyonlarda ortaya çıkabilir. Böyle bir durumda, aynı lezyonun tekrarlanmasından kaçının. Görüntüleri bir TIFF uzantısıyla kaydedin (tüm bilgileri resim dosyasında tutar). - Görüntüleri bir TIFF uzantısıyla kaydedin (tüm bilgileri resim dosyasında tutar).
- Tüm örnekler için adımları tekrarlayın.
- TIFF görüntülerini JPEG'e dönüştürün, böylece dosyalar ilişkili yazılımın yüklü olmadığı herhangi bir bilgisayarla açılabilir (Dosya | İthalat/İhracat | dosyaları dönüştürün).
- Floresan görüntüyü parlak alan görüntüsüyle birleştirmek için her iki görüntüyü de açın ve Dosya | Kanalları birleştirin. GFP için yeşil ve BF için parlak alan olmak üzere uygun bileşenleri seçin ve Tamam'a basın. Birleştirilen görüntüyü kaydedin.
- Beyin tümörü alanını ölçmek için floresan görüntüyü kullanın. Ölçü Seç | Manuel Ölçüm | Alanı. Otomatik seçimi seçin (Şekil 3B, yeşil kare) ve oku GFP-pozitif alanına getirin ve otomatik olarak bir seçim oluşturmak için tıklayın. Seçimi onaylamak için tekrar tıklayın, ardından tüm ölçümler gösterilecektir (Şekil 3B, kırmızı kare). Birden fazla GFP pozitif alan varsa, prosedürü tekrarlayın.
- Beyin görüntüleri elde edildikten sonra, %10 nötral tamponlu formalin kullanarak rutin doku fiksasyon protokollerine geçin.
- Beyinler sabitlendikten sonra, seçilen belirteçleri tespit etmek için beyin metastazı ve immünohistokimyasal boyamanın varlığını doğrulamak için standart histolojik kesitlemeye ve ardından hematoksilen ve eozin boyamaya devam edin.
NOT: İmmünositokimya, bilinen belirteçlerin immünohistokimyasal boyanması için standart protokole sahip UT MD Anderson Kanser Merkezi'ndeki Patoloji Çekirdek Laboratuvarı'nda gerçekleştirildi.
- Beyinler sabitlendikten sonra, seçilen belirteçleri tespit etmek için beyin metastazı ve immünohistokimyasal boyamanın varlığını doğrulamak için standart histolojik kesitlemeye ve ardından hematoksilen ve eozin boyamaya devam edin.
- Beyin dokusu hazırlığı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etiketli hücrelerin klinik öncesi fare modellerinde beyin metastazının izlenmesini ve görselleştirilmesini kolaylaştırdığı gerekçesiyle, biyolüminesans görüntüleme ve floresan stereomikroskopi kullanarak beyin metastazlarını izlemek ve metastatik yükü ölçmek için MDA-IBC3 hücrelerini Luc ve GFP ile etiketledik. Etiketli MDA-IBC3 hücrelerinin bağışıklığı baskılanmış SCID/Bej farelerin kuyruk damarlarına enjeksiyonu, yüksek oranda beyin metastazı gelişen farelerle sonuçlandı (yani, %66,7 ila %100)16,23,25. Beyin metastatik lezyonları, lusiferaz görüntüleme (Şekil 2) veya stereofloresan mikroskopi (Şekil 4) ile enjeksiyondan 8 hafta sonra tespit edilebilir. GFP görüntüleme, her metastatik lezyonun alanını tespit etmemizi, saymamızı ve hesaplamamızı sağlar. Görüntülemeden sonra, beyin metastazlarının bölümleri formalinle sabitlenir ve beyin metastazı lezyonlarının varlığını doğrulamak için hematoksilen ve eozin boyama (Şekil 5A) ve spesifik protein belirteçlerini saptamak için immünohistokimyasal boyama için işlenir (Şekil 5B, C).
Şekil 1: Kuyruk-ven enjeksiyonu yoluyla beyin metastazı oluşturmak için şematik iş akışı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Dorsal ve ventral pozisyonlardaki farelerin lusiferaz görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Stereomikroskopi için kullanılan görüntüleme yazılımının ekran görüntüleri . (A) Görüntülerin nasıl elde edileceğini gösteren adımlar. Soldaki yeşil kare canlı görüntü düğmesini gösterir; sağdaki kırmızı kare, burun merceği için mikroskobun konumunu ve yakınlaştırma konumunu gösterir; ve sarı kare filtre seçimini vurgular. (B) Tümör yükünün ölçülmesinde yer alan adımların ekran görüntüsü. Sol üstteki yeşil kare, alan hesaplaması için otomatik seçim modunu gösterir; Altındaki kırmızı kare, beyin metastazı lezyonu seçildikten sonraki alan değerlerini ve diğer ölçümleri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: MDA-IBC3 hücre hattının kuyruk damarı enjeksiyonundan metastazlı fare beyinlerinin stereoskopik görüntüleri. Soldaki parlak alan resmi, GFP görüntüsüyle (ortada) birleştirilir ve ardından birleştirilir (sağda). Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Farelerde MDA-IBC3 kaynaklı beyin metastazlarının boyanmış görüntülerini gösteren slaytlar . (A) Hematoksilen ve eozin boyaları beyin metastazının histolojik olarak doğrulanmasını sağlar. MDA-IBC3 kaynaklı beyin metastatik tümörlerinin immün boyaması, HER2 (B) ve E-kaderin (C) için pozitif boyama gösterir. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokol birkaç kritik adım içerir. Canlılığı korumak için hücreler 1 saatten fazla buz üzerinde tutulmamalıdır. Enjeksiyondan önce farelerin kuyruklarını silmek için alkollü pamuklu pedler kullanılmalı, kuyruk derisine zarar vermemek için çok sert veya çok sık silmemeye özen gösterilmelidir. Farelerin kan damarı embolisinden ölmesini önlemek için hücre süspansiyonunda hava kabarcığı bulunmadığından emin olun. Kuyruklardaki kan damarının delinmesini önlemek için enjeksiyon açısını 45 ° veya daha düşük tutun ve tüm hücrelerin başarılı bir şekilde enjeksiyonunu sağlamak için iğnenin en az 1 / 3'ünü kuyruk damarına sokun. Enjekte edilen hücrelerin toplam hacmi farelerin ağırlığına göre ayarlanabilir, ancak toplam hücre sayısı mümkün olduğunca benzer tutulmalıdır. Bu protokolde, SCID / Bej farelerin tümü 4 ila 6 haftalıktı ve 15 ila 20 g ağırlığındaydı. 15 g'dan daha hafif olan fareler için enjeksiyon hacmi 100 μL'nin altına ayarlanabilir; aksi takdirde 100 μL enjekte edilir. Kafatasından çıkarıldıktan sonra, sinyal azalmasını ve doku dejenerasyonunu önlemek için stereoskopik mikroskopi ile görüntülemeden önce tüm beyin 1 saatten fazla 1x DPBS'de tutulmamalıdır. İmmünofloresan görüntüleme için, beyin dokuları formalin içine yerleştirilmemelidir, çünkü yüksek kaliteli görüntülerin elde edilmesini engelleyen endojen otofloresan üretir. Lusiferaz görüntülemenin her zaman beyin metastazlarını, özellikle de çok küçük lezyonları ortaya çıkarmadığını belirtmiştik; bununla birlikte, stereomikroskopi ile GFP görüntüleme tüm lezyonları görüntüleyebilir. Ayrıca, GFP görüntüleme 1'den fazla lezyon gösterebilirken, lusiferaz görüntüleme göstermez.
Önerilen prosedürler kullanıcı tercihlerine göre biraz değiştirilebilir. İlk olarak, enjekte edilen hücrelerin sayısı ve metastaz oluşum süresi farklı çalışmalar için ayarlanabilir. İkincisi, farelerin kuyruk damarı, damarı genişletmek için ılık su veya damarları aydınlatmak için UV ışığı kullanılarak daha net bir şekilde görselleştirilebilir. Son olarak, şırıngadaki iğnenin boyutu 30 G veya 28 G olabilir.
Beyin metastazının mevcut fare modellerinin avantajları ve sınırlamaları başka bir yerde gözden geçirilmiştir3 . Burada tanımladığımız beyin metastazı modelinin sınırlamaları ve güçlü yönleri vardır. Bir sınırlama, beyin metastatik sürecinin tüm adımlarını özetlememesi ve metastatik sürecin ilk aşamalarının, yani birincil meme kanseri hücrelerinin dolaşıma yayılmasının sorgulanmasına izin vermemesidir. Ayrıca, bu model, beyin metastazı sürecinde tümör hücreleri ile konakçı immün mikroçevre arasındaki etkileşimleri incelemek veya immünoterapötik uygulamaları değerlendirmek için kullanılamaz. Bununla birlikte, bu modelin diğer beyin metastazı modellerine göre birçok avantajı vardır. Birincisi, farelerin sadece küçük bir kısmının değişken aralıklarla beyin metastazı geliştirdiği spontan modellerin aksine, modelimiz, tipik olarak farelerin% 70'inden fazlasında, sürekli olarak beyne metastaza yol açma avantajını sunar. İkincisi, kuyruk damarı enjeksiyonu, hücrelerin öncelikle akciğere yayılmasına ve daha sonra beyne yayılmasına izin verirken, intrakarotis arter yoluyla aşılama, hücrelerin doğrudan beyne yayılmasına izin verir; İntrakardiyak enjeksiyonlar, kanser hücrelerinin beyne ve ayrıca akciğer ve kemik gibi ekstrakraniyal bölgelere sistemik dağılımını sağlar. Bu nedenle, modelimiz beyin metastatik kolonizasyon basamağını yaygın olarak kullanılan intrakardiyak veya intrakarotis enjeksiyon modellerinden daha iyi özetlemektedir, çünkü hücreler akciğer kılcal yataklarından geçer ve beyin lezyonları oluşturmadan önce dolaşımda hayatta kalır. Son olarak, meme kanseri hücrelerinin kuyruk damarı yoluyla enjeksiyonu, intrakarotis veya intrakardiyak enjeksiyondan teknik olarak daha az zordur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Makalenin bilimsel düzenlemesi için MD Anderson'ın Radyasyon Onkolojisi Bölümü'nden Christine F. Wogan'a ve hematoksilen ve eozin boyama konusunda yardım için MD Anderson'ın Cerrahi Histoloji Çekirdeği Bölümü'nden Carol M. Johnston'a teşekkür ederiz. MD Anderson'daki Veterinerlik ve Cerrahi Merkezine hayvan çalışmalarına verdikleri destek için müteşekkiriz. Bu çalışma aşağıdaki hibelerle desteklenmiştir: Susan G. Komen Kariyer Katalizörü Araştırma hibesi (BGD'ye CCR16377813), Amerikan Kanser Derneği Araştırma Bursu hibesi (RSG-19-126-01'den BGD'ye) ve Teksas Eyaleti Nadir ve Agresif Meme Kanseri Araştırma Programı. Ayrıca, Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden Teksas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi'ne CA016672 Kanser Merkezi Destek (Çekirdek) Hibe P30 tarafından kısmen desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| 1000 µL pipette tip filtered | Genesee Scientific | 23430 | |
| 10 mL Serological Pipets | Genesee Scientific | 12-112 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% |
| Centrifuge tubes 15 mL bulk | Genesee Scientific | 28103 | |
| Corning 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine | GIBICO Inc. USA | MT10080CV | |
| Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Eppendorf centufuge 5810R | Eppendorf | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBICO Inc. USA | 16000044 | 10% |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers (40 μm) | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1 µg/mL |
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | 5 µg/mL |
| Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| MDA-IBC3 cell lines | MD Anderson Cancer Center | Generated by Dr. Woodward's lab24 | |
| Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid | System Biosciences | BLIV713PA-1 | |
| microtubes clear sterile 1.7 mL | Genesee Scientific | 24282S | |
| Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 23-401C | |
| TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Tail vein injection | |||
| C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J - SCID/Beige | Envigo | SCID/beige mice | |
| BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm) | BD | 328466 | |
| Plas Labs Broome-Style Rodent Restrainers | Plas Labs 551BSRR | 01-288-32A | Order fromThermo Fisher Scientific |
| Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof) | Thermo Fisher Scientific | 50420872 | 70 % used |
| Imaging | |||
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| Disposable PES Filter Units 0.45 µm | Fisherbrand | FB12566501 | filter system to sterilize the D-luciferin |
| D-Luciferin | Biosynth | L8220-1g | stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL |
| 1.7 mL microtube amber | Genesee Scientific | 24-282AM | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC-14043-704-06 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| IVIS 200 | PerkinElmer | machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine | |
| Plastic Containers with Lids | Fisherbrand | 02-544-127 | |
| Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 1000957 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| Stereomicroscope Imaging | |||
| Stereomicroscope AZ100 | Nikon | model AZ-STGE | software NIS-ELEMENT |
| Formalin 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| TC treated dishes 100x20 mm | Genesee Scientific | 25202 |
References
- Achrol, A. S., et al.
- Nayak, L., Lee, E. Q., Wen, P. Y.
- Lowery, F. J., Yu, D. Brain metastasis: Unique challenges and open opportunities. Biochimica et Biophysica Acta Review Cancer. 1867 (1), 49-57 (2017).
- Brufsky, A. M., et al. Central nervous system metastases in patients with HER2-positive metastatic breast cancer: incidence, treatment, and survival in patients from registHER. Clinical Cancer Research. 17 (14), 4834-4843 (2011).
- Valiente, M., et al.
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Woditschka, S., et al. DNA double-strand break repair genes and oxidative damage in brain metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (7), (2014).
- Palmieri, D., et al. Vorinostat inhibits brain metastatic colonization in a model of triple-negative breast cancer and induces DNA double-strand breaks. Clinical Cancer Research. 15 (19), 6148-6157 (2009).
- Kim, S. J., et al. Astrocytes upregulate survival genes in tumor cells and induce protection from chemotherapy. Neoplasia. 13 (3), 286-298 (2011).
- Zhang, S., et al. SRC family kinases as novel therapeutic targets to treat breast cancer brain metastases. Cancer Research. 73 (18), 5764-5774 (2013).
- Valiente, M., et al. Serpins promote cancer cell survival and vascular co-option in brain metastasis. Cell. 156 (5), 1002-1016 (2014).
- Gril, B., et al. Effect of lapatinib on the outgrowth of metastatic breast cancer cells to the brain. Journal of the National Cancer Institute. 100 (15), 1092-1103 (2008).
- Gril, B., et al. Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis. Clinical Cancer Research. 17 (1), 142-153 (2011).
- Palmieri, D., et al. Profound prevention of experimental brain metastases of breast cancer by temozolomide in an MGMT-dependent manner. Clinical Cancer Research. 20 (10), 2727-2739 (2014).
- Priego, N., et al. STAT3 labels a subpopulation of reactive astrocytes required for brain metastasis. Nature Medicine. 24 (7), 1024-1035 (2018).
- Debeb, B. G., et al. miR-141-mediated regulation of brain metastasis from breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 108 (8), (2016).
- Chang, S., Parker, S. L., Pham, T., Buzdar, A. U., Hursting, S. D. Inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program of the National Cancer Institute, 1975-1992. Cancer. 82 (12), 2366-2372 (1998).
- Hance, K. W., Anderson, W. F., Devesa, S. S., Young, H. A., Levine, P. H. Trends in inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program at the National Cancer Institute. Journal of National Cancer Institute. 97 (13), 966-975 (2005).
- Dirix, L. Y., Van Dam, P., Prove, A., Vermeulen, P. B. Inflammatory breast cancer: Current understanding. Current Opinion in Oncology. 18 (6), 563-571 (2006).
- Wang, Z., et al. Pattern of distant metastases in inflammatory breast cancer - A large-cohort retrospective study. Journal of Cancer. 11 (2), 292-300 (2020).
- Uemura, M. I., et al. Development of CNS metastases and survival in patients with inflammatory breast cancer. Cancer. 124 (11), 2299-2305 (2018).
- Smith, D. L., Debeb, B. G., Thames, H. D., Woodward, W. A. Computational modeling of micrometastatic breast cancer radiation dose response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 96 (1), 179-187 (2016).
- Fukumura, K., et al. Multi-omic molecular profiling reveals potentially targetable abnormalities shared across multiple histologies of brain metastasis. Acta Neuropathol. , (2021).
- Klopp, A. H., et al. Mesenchymal stem cells promote mammosphere formation and decrease E-cadherin in normal and malignant breast cells. PLoS One. 5 (8), 12180 (2010).
- Villodre, E. S., et al. Abstract P3-01-10: Ndrg1-egfr axis in inflammatory breast cancer tumorigenesis and brain metastasis. Cancer Research. 80 (4), 10 (2020).
