Summary
هنا ، نقدم تحسينات لنموذج زراعة رئة الفئران التي تعمل على تحسين النتائج. نحن نقدم دليل حجم للأصفاد على أساس وزن الجسم ، واستراتيجية قياس للتأكد من الفضاء الوربي 4 عشر ، وطرق إغلاق الجرح و BAL (غسل القصبات الهوائية) جمع السوائل والأنسجة.
Abstract
من تجربتنا مع زرع رئة الفئران ، وجدنا العديد من المجالات للتحسين. تتنوع المعلومات الواردة في الأدبيات الموجودة فيما يتعلق بطرق اختيار أحجام الكفة المناسبة للوريد الرئوي (PV) أو الشريان الرئوي (PA) أو الشعب الهوائية (Br) ، مما يجعل تحديد حجم الكفة المناسب أثناء زرع رئة الفئران ممارسة للتجربة والخطأ. من خلال توحيد تقنية الكفة لاستخدام أصغر صفعة فعالة مناسبة لحجم الوعاء أو الشعب الهوائية ، يمكن للمرء أن يجعل إجراء الزرع أكثر أمانا وأسرع وأكثر نجاحا. نظرا لأن أقطار PV و PA و Br مرتبطة بوزن جسم الجرذ ، فإننا نقدم استراتيجية لاختيار الحجم المناسب باستخدام دليل قائم على الوزن. نظرا لأن حجم الرئة يرتبط أيضا بوزن الجسم ، فإننا نوصي أيضا بمراعاة هذه العلاقة عند اختيار الحجم المناسب للهواء لتضخم رئة المتبرع أثناء نقص التروية الدافئ وكذلك للحجم المناسب من PBS ليتم غرسه أثناء جمع السوائل في غسل القصبات الهوائية (BAL). نحن نصف أيضا طرق تشريح الفضاء الوربي 4 ، وإغلاق الجرح ، وجمع العينات من كل من الفصوص الأصلية والمزروعة.
Introduction
لأكثر من ثلاثة عقود ، قام الباحثون بتعديل وتحسين نماذج زراعة رئة الفئران بحيث تكون البيانات الناتجة أكثر اتساقا وأكثر انعكاسا للحالة السريرية الفعلية. في وقت إجراء مختبرنا لهذا النموذج ، حددنا أربعة مجالات للتحسين: تقنيات الكفة للمفاغرة ، وتحديد الفضاء الوربي 4 للمتلقي ، وتضخم الرئة وإغلاق الجرح أثناء إجراء المتلقي ، وحصاد العينات للتحليل.
يمكن أن تؤدي تعديلات تقنية الكفة للمفاغرة إلى تحسين عملية الزرع بأكملها عن طريق تقصير وقت معالجة رئة المتبرع1،2،3،4،5،6 وجعل إجراء المفاغرة أسرع وأسهل تقنيا للجراح المجهري. في حين أنه من الأهمية بمكان استخدام الأصفاد ذات الحجم المناسب لتوفير الدم اللازم وتدفق الهواء إلى الرئة المزروعة ، إلا أن هناك إرشادات محدودة بشأن كيفية اختيار حجم الأصفاد للوريد الرئوي (PV) أو الشريان الرئوي (PA) أو الشعب الهوائية (Br) 5،7،8،9. نظرا لأن أقطار PV و PA و Br مرتبطة بوزن جسم الفئران المانحة والمتلقية ، فإننا نقترح أن يعتمد حجم الكفة على وزن الجسم. يقدم هذا التقرير دليلا لحجم الأصفاد بناء على وزن جسم الجرذ (180 جم إلى أكثر من 270 جم) يعمل على تحسين إمداد الدم والهواء إلى الرئة المزروعة (الجدول 1).
في حين أن الجراح المجهري الأحدث يمكنه شراء رئة متبرع بنجاح وسهولة أثناء إجراء المتبرع ، فإن زرع الرئة أثناء إجراء المتلقي أكثر تعقيدا ويعتمد على خبرة الجراح المجهري. تعد محاولات العثور علىالمساحة الوربية 4 للوصول إلى الرئة اليسرى للمتلقي واحدة من أصعب الخطوات التي تحمل بعض الذاتية ويمكن أن تزيد من وقت الإجراء. لذلك ، نقدم طريقة بسيطة وموضوعية للمساعدة في تحديد موقع الفضاء الوربي الرابع باستخدام قياسات الصدر وخفقان القلب للعثور على المنطقة الصحيحة جدار الصدر لتشريح4،5،6،10،11،12.
نقترح أيضا تحسين تضخم الرئة المانحة ، وهو مصدر محتمل لإصابة العضو. يتم تفريغ رئة المتبرع حتى تبدأ إعادة التروية. أثناء خياطة الفضاء الوربي الرابع ، يتم تضخيم رئة المتبرع عادة عن طريق زيادة PEEP من 2 سم H2O إلى 6 cmH2O. من أجل تقليل إصابة الرئة من التضخم المفرط ، نقترح تقنية حيث يتم وضع ثلاث خيوط من النايلون 6-0 حول الضلع 4 السفليمن الضلع الخامس مع عقدة مزدوجة بسيطة. عندما يحين وقت إغلاق الجرح ، يتم تثبيت نهايات الغرز الثلاثة مع مرقئ في كلتا يديه ، ويتم إغلاق الجرح دفعة واحدة عن طريق السحب على كل جانب ، ويتم تقليل PEEP على الفور إلى 2 سمH 2O. بهذه الطريقة ، يسمح للرئة بالتوسع لأقصر وقت ممكن10.
في ختام التجربة ، غالبا ما يرغب الباحث في جمع العديد من أنواع العينات للعديد من أنواع التحليل من كل عملية زرع. على سبيل المثال ، يمكن استخدام الأنسجة المجمدة المفاجئة ، والأنسجة الثابتة المصنوعة من الفورمالين ، ونسبة الوزن الرطب إلى الجاف لتحديد الوذمة الرئوية ، وسائل غسل القصبات الهوائية (BAL) لتقييم مدى نجاح عملية الزرع. تسمح الطريقة التقليدية لجمع سائل BAL بعينة مجمعة مختلطة من كل من الفصوص الأصلية للمتلقي والفص المزروع للمتبرع13،14،15. للتغلب على هذا ، نقدم طريقة لتثبيت المناطق النقيرية التي يمكن أن تسفر عن رؤية أكثر دقة لحالة الرئتين المزروعة والأصلية. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم مراعاة حجم PBS المستخدم لجمع سائل BAL من كل جانب من الرئتين لأن سائل BAL يحتوي على العديد من العوامل القابلة للذوبان مثل السيتوكينات والكيموكينات التي يتم قياسها بالتركيز. يمكن أن يساعد تطبيع حجم السائل الذي يتم غرسه إلى الحجم المقدر لسعة الرئة في المقارنة. مع وجود أربعة فصوص على الجانب الأيمن وفص واحد على الجانب الأيسر ، يكون لكل فص من فصوص الفئران الخمسة حجم ومساحة سطح مختلفة16. وفقا لدراسة سابقة حول قياس حجم فصوص الرئة من قبل Backer et al. ، من الحجم الكلي للرئة بأكملها ، يبلغ حجم الفصوص اليمنى 63٪ (4400 مم 3) والفص الأيسر 37٪ (2500 مم3). لذلك ، نوصي بحساب حجم PBS المستخدم لجمع سائل BAL على أنه ضعف حجم المد والجزر (7.2 مل / كجم) مضروبا في 63٪ للرئة اليمنى و 37٪ للرئة اليسرى. باستخدام هذا النهج ، يمكن للمرء التحكم بشكل أفضل في المتغيرات مثل وزن الجسم والتوقيت10,16.
إجمالا ، سنعرض في هذا التقرير بعض التعديلات على النموذج التجريبي القياسي لزراعة رئة الفئران والتي يمكن أن تجعل الإجراء أكثر كفاءة وتزيد من القدرة على توليد بيانات أكثر دقة ووفرة من كل تجربة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم شراء ذكور فئران Sprague-Dawley (180-270 جم من وزن الجسم) تجاريا (على سبيل المثال ، Envigo) وتم إيواؤها في ظروف خالية من مسببات الأمراض في مرفق الحيوانات بجامعة ولاية أوهايو. تم تنفيذ جميع الإجراءات بشكل إنساني وفقا للمعاهد الوطنية للصحة ودليل المجلس القومي للبحوث للرعاية الإنسانية واستخدام المختبر وبموافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة ولاية أوهايو (بروتوكول IACUC # 2012A00000135-R2).
1. الإعداد الأولي
- إعداد الأجهزة الجراحية.
ملاحظة: هذه جراحة عدم البقاء على قيد الحياة. إذا كان سيتم إجراء جراحة البقاء على قيد الحياة ، فيجب إجراء أدوات معقمة واحتياطات حاجزة.- قم بتشغيل معدات مراقبة معدل ضربات القلب / تشبع الأكسجين ولوحة الاحترار إلى 42 درجة مئوية.
- قم بتشغيل آلة التهوية والتخدير لتسخين مبخر الأيزوفلوران مسبقا.
ملاحظة: استخدم حجم المد والجزر (Td) من 7.2 مل / كغم ، وضغط الزفير الإيجابي (PEEP) من 2 cmH2O ، ومعدل التنفس من 80 نبضة في الدقيقة. - املأ حقنة التخدير ب 10 مل من الأيزوفلوران السائل وقم بتركيب المحقنة على جهاز التهوية والتخدير.
- قم بتشغيل المجهر الجراحي مع ضبط الارتفاع والتركيز وفقا لتفضيلات الجراح المجهري.
- قم بتشغيل جهاز الكي الكهربائي.
- إعداد ووضع الأدوات الجراحية (الشكل 1).
ملاحظة: تم تعقيم جميع الأدوات الجراحية عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. - جمع وتسجيل وزن الجسم من الفئران المانحة والمتلقية.
- استخدم الجدول 1 ووزن جسم الجرذ لتحديد المقياس الصحيح للقسطرة الوعائية (20 أو 18 أو 16 14 أو 12 جم) لاستخدامها في صنع الأصفاد.
- قم بإعداد الأصفاد للشريان الرئوي (PA) والشعب الهوائية (Br) والوريد الرئوي (PV) باستخدام دليل الحجم بناء على وزن الجسم (الجدول 1 والشكل 2).
- ضع قسطرة وعائية بحجم 20 جم أو 18 جم أو 16 جم أو 14 جم أو 12 جم (الشكل 2A-E) على سطح معقم تحت المجهر الجراحي.
- ثم استخدم شفرة جراحية ضلع الظهر # 11 (الشكل 2F) لقطع قسطرة الأوعية بزاوية 90 درجة لتشكيل جسم الكفة بطول 2 مم مع علامة تبويب 1 مم × 1 مم (العرض × الارتفاع) في الجزء العلوي من جسم الكفة (الشكل 2G).
- قم بتخزين الأصفاد في محلول ملحي معقم حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
- إعداد الحلول.
- تحضير خليط من الكيتامين والزيلازين في قنينة حقن معقمة بإضافة 1 مل من الزيلازين (100 ملغ/مل) إلى 10 مل من الكيتامين (100 ملغ/مل).
ملاحظة: يتم تحديد تاريخ انتهاء صلاحية هذا الكوكتيل باستخدام أقرب تاريخ انتهاء صلاحية للمكونات المستخدمة. - اسحب في المحاقن الجرعة المناسبة للفئران (0.1 مل من خليط الكيتامين / الزيلازين لكل 100 غرام من وزن جسم الفئران ؛ على سبيل المثال ، بالنسبة للفأر 200 غرام ، سيتم تسليم 0.2 مل من خليط الكيتامين / الزيلازين).
ملاحظة: ستوفر هذه الجرعة 91 مجم / كجم من الكيتامين و 9.1 مجم / كجم من الزيلازين للفأر ويجب أن تبقي الجرذ مخدرا لمدة 60-80 دقيقة. - تحضير الهيبارين الذي سيتم تسليمه بجرعة 1000 وحدة / كجم.
- قم بتخزين محلول ملحي ، PBS ، ومحلول الحفظ على الثلج (جدول المواد).
- تحضير خليط من الكيتامين والزيلازين في قنينة حقن معقمة بإضافة 1 مل من الزيلازين (100 ملغ/مل) إلى 10 مل من الكيتامين (100 ملغ/مل).
2. إعداد الفئران المانحة
- حث التخدير في الفئران المانحة عن طريق حقن خليط الكيتامين والزيلازين داخل الصفاق والانتظار ~ 10 دقائق لتطوير مستوى جراحي للتخدير يمكن تقييمه من خلال عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم.
- احلق منطقة الشق باستخدام كليبرز إلكتروني.
- ضع الفئران المانحة في وضع ضعيف على لوح التسخين الجراحي وامسح منطقة الشق بشاش معقم منقوع بالبيتادين. ثم امسح المنطقة بمسحة كحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪. كرر 3 مرات.
- قم بعمل شق جلدي في منتصف الرقبة من 3 إلى 4 سم باستخدام المقص وقم بتشريح الأنسجة والعضلات تحت الجلد بعناية باستخدام الملقط (بدلا من المقص لتجنب النزيف).
- للتنبيب الرغامي ، خيط 4-0 خيط حريري حول القصبة الهوائية وأدخل قسطرة وعائية 16 جيجا في القصبة الهوائية. اربط الخيط حول القصبة الهوائية بإحكام بعقدة مزدوجة ، ثم انتهي بعقدة واحدة لتثبيت قسطرة الأوعية الدموية في مكانها.
- قم بتوصيل قسطرة الأوعية الدموية بجهاز التنفس الصناعي والحفاظ على مستوى جراحي للتخدير في الفئران مع 1-2 ٪ من isoflurane.
- إجراء بضع القص البطني كخط وسط مشترك وشق عرضي باستخدام مقص.
- حقن الهيبارين (1000 وحدة / كجم) مع حقنة الأنسولين عن طريق الوريد الأجوف السفلي (IVC) والسماح لمدة 10 دقائق للدورة الدموية الجهازية.
ملاحظة: هذا الإعطاء من الهيبارين يمنع تجلط الدم في الرئة المانحة. - تشريح الحجاب الحاجز بعناية عن طريق قطع على طول القوس الصدري ، ثم كشف التجويف الصدري باتباع القص إلى الرقبة.
3. نقص تروية الرئة الدافئة المانحة والمشتريات
- القتل الرحيم للفأر المتبرع عن طريق قطع IVC.
- بينما لا تزال الرئتان تتهويان ، قم بقطع كل من الأذنين الأيمن والأيسر بمقص زنبركي تشريح دقيق وتدفق الرئتين بالجاذبية بمحلول حفظ 20 مل في حقنة معلقة عند 28 سمH 2O عن طريق الجاذبية المتصلة بالأنابيب وقسطرة وعائية 18 G يتم إدخالها مباشرة من خلال الشريان الرئوي.
- افصل جهاز التنفس الصناعي عن الأنبوب الرغامي وقم بتوصيله بحقنة سعة 5 مل مملوءة بحجم مناسب من الهواء بناء على وزن الجسم.
ملاحظة: يمكن حساب حجم الهواء لتضخيم الرئتين كما هو الحال مع ضعف حجم المد والجزر (Td = 7.2 مل / كجم) ، على سبيل المثال ، سيكون للفأر 200 جرام Td 1.44 مل وضربه في 2 يساوي 2.88 مل من الهواء اللازم لتضخيم الرئتين. - تضخيم رئتي المتبرع.
- ضع مشبك Yasargil على القصبة الهوائية للحفاظ على تضخم الرئتين ، وقم بتغطية الرئتين والقلب بشاش قطني معقم. رطب الشاش بالمحلول الملحي ، ولف الفئران المانحة بوسادة سفلية ، واتركها على لوحة جراحة الاحترار لمدة 1 ساعة للحث على نقص التروية الدافئ في الرئتين (الشكل 3).
- بعد 1 ساعة من نقص التروية الدافئ ، قم باستئصال كتلة القلب والرئة بمقص الربيع المقطعي وملقط التشريح الدقيق وضعه على شاش معقم مبلل ببرنامج تلفزيوني بارد على طبق بتري معقم على الجليد.
ملاحظة: يجب أن تحدث جميع الخطوات التالية أثناء وجود الرئتين على طبق بتري على الجليد. - شق الأربطة الرئوية بعناية باستخدام مقص زنبركي دقيق لفصل الرئة اليسرى عن المريء والفص التالي للأجوف.
- قم بقص منطقة الهيلار اليسرى بعناية باستخدام مقص زنبركي Vannas-Tubingen واشتر PV الأيسر و PA و Br.
- ضع الأصفاد على PV أو PA أو Br (الشكل 4A-C).
- استخدم مرقئ البعوض للاستيلاء على لسان الكفة.
- استخدم ملقط ناعما للاستيلاء على الطرف البعيد من PV أو PA أو Br من خلال جسم الكفة المناسب ، وحرك الأنسجة الإضافية حول الكفة ، وآمن باستخدام 8-0 خياطة النايلون. استخدم مقص Vannas-Tubingen الربيعي لتقليم الأنسجة الزائدة والكفة حول جسم الكفة.
- احتفظ برئة المتبرع مغطاة بشاش مبلل بمحلول ملحي على طبق بتري على الجليد حتى يصبح جاهزا للزرع في الجرذ المتلقي (الشكل 4 د).
ملاحظة: متوسط وقت نقص تروية البرد هو 84 دقيقة ± 11 دقيقة S.D.
4. إعداد الفئران المتلقي
- تحفيز التخدير في الجرذ المتلقي بنفس طريقة الجرذ المتبرع عن طريق حقن خليط الكيتامين والزيلازين داخل الصفاق (0.1 مل لكل 100 غرام من الفئران) والانتظار لمدة 10 دقائق لتطوير مستوى جراحي من التخدير يمكن تقييمه من خلال عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم.
- احلق منطقة الشق باستخدام كليبرز إلكتروني.
- ضع الفئران المانحة في وضع ضعيف وامسح منطقة الشق بشاش معقم منقوع بالبيتادين. ثم امسح المنطقة بمسحة كحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪. كرر 3 مرات.
- قبل أن يتم تأمين الجرذ على آلة التهوية ، ارسم خطوطا على صدر الجرذ استعدادا لإيجاد الفضاء الوربي 4.
- قم بقياس الصدر من الشق فوق القصي إلى عملية الخنجري وارسم خطا (الشكل 5 أ).
- في منتصف هذا الخط ، ارسم خطا على طول الجانب الأيسر من الصدر يقيس نصف القياس من الشق فوق القصي إلى عملية الخنجري (الشكل 5 أ و ب).
- تنبيب المتلقي باستخدام قسطرة وعائية 16 جيجا عبر التصور باستخدام كابل الألياف الضوئية المتصل بضوء LED من مجموعة التنبيب الرغامي.
- قم بتوصيل قسطرة الأوعية بجهاز التنفس الصناعي والحفاظ على مستوى جراحي للتخدير مع 1-2٪ إيزوفلوران.
- للعثور علىالفضاء الوربي الرابع ، ابحث عن منطقة جدار الصدر حيث يمكن الشعور بنبضة قلبية قوية (الشكل 5C ، الدائرة الحمراء).
- في هذا الموقع ، شق الجلد بالمقص والعضلات بمقص زنبركي تشريح دقيق ، واستخدم المبعثر لفتح الفضاءالوربي الرابع على أوسع نطاق ممكن (الشكل 5D و E).
ملاحظة: استخدم الكي الكهربائي لتجنب أو إيقاف النزيف أثناء تشريح العضلات. - بمجرد فتح المساحة الوربية على نطاق واسع ، قم بتشريح الأربطة حول الرئة اليسرى للمتلقي بعناية باستخدام مقص زنبركي Vannas-Tubingen واسحب الرئة من منطقة الصدر باستخدام مسحات قطنية وملقط معقمة.
- ضع شاشا معقما حول الرئة اليسرى وأمسكه بمشبك بلدغ ديفنباخ.
- ضع مشبك Yasargil على منطقة هيلار الرئة اليسرى بالقرب قدر الإمكان.
5. مفاغرة
- مفاغرة الوريد الرئوي (PV)
- ضع 7-0 خيط نايلون حول PV للمستلم.
- شق PV المتلقي باستخدام مقص زنبرك Vannas-Tubingen عن طريق قطع الأوردة المقطعية العلوية والسفلية بشكل مستعرض قدر الإمكان وطرد الدم ب 0.2 مل من محلول ملحي هيبارين (1 وحدة / مل) باستخدام حقنة الأنسولين.
- ضع رئة المتبرع التي لا تزال ملفوفة بشاش معقم رطب بارد في التجويف الصدري.
- أدخل PV المقيد للمتبرع في PV الخاص بالمستلم ، ثم قم بتثبيته باستخدام خياطة النايلون 7-0 الموضوعة مسبقا (الشكل 6).
- مفاغرة الشعب الهوائية (Br)
- ضع 7-0 خيط نايلون حول Br الخاص بالمستلم.
- شق Br الخاص بالمستلم عن طريق قطع الممرات الهوائية المقطعية العلوية والسفلية بشكل عرضي قدر الإمكان باستخدام مقص زنبركي Vannas-Tubingen.
- أدخل Br المقيد للمتبرع في Br الخاص بالمستلم وقم بتثبيته باستخدام خياطة النايلون 7-0 الموضوعة مسبقا (الشكل 6).
- مفاغرة الشريان الرئوي (PA):
- ضع 7-0 خيط نايلون حول PA للمستلم.
- شق PA للمتلقي من غمده العرضي ، وشق نصف محيط الوعاء بمقص زنبركي Vannas-Tubingen ، ثم اطرد الدم في PA باستخدام 0.2 مل من محلول ملحي هيبارين (1 وحدة / مل) باستخدام حقنة الأنسولين.
- أدخل PA المقيد للمتبرع في PA الخاص بالمستلم وقم بتأمينه باستخدام خياطة النايلون 7-0 الموضوعة مسبقا (الشكل 6).
6. إعادة التروية
- قم بإزالة مشبك Yasargil الموجود على hilum للسماح بإعادة تروية وتهوية رئة المتبرع المزروع (الشكل 7).
- قم بتشريح الرئة اليسرى الأصلية للمتلقي باستخدام مقص وملقط زنبركي دقيق التشريح.
- أعد وضع الرئة اليسرى المزروعة بعناية في صدر المتلقي.
- أغلق شق بضع الصدر باستخدام خياطة 6-0 نايلون.
- ضع ثلاث خيوط من النايلون 6-0 مع عقدة مزدوجة بسيطة حول الأضلاع أعلى من الضلع 4 وأدنىمن الضلع الخامس (الشكل 8 أ).
- استخدم مرقئ الدم لجمع الغرز الثلاثة معا (الشكل 8 ب).
- قم بزيادة PEEP إلى 6 سمH 2O في إعدادات التهوية.
- اربط العقد الثلاث معا في نفس الوقت عن طريق السحب بعيدا لإغلاق الجرح (الشكل 8 ج).
- تقليل PEEP إلى 2 سمH 2O على الفور.
- أغلق الجلد بخياطة من النايلون 6-0.
ملاحظة: يدرس مختبرنا المرحلة الحادة بعد الزرع ، لذلك يبقى الجرذ المتلقي في هذا النموذج على قيد الحياة لمدة 3 ساعات بعد الزرع تحت التهوية والتخدير ثم يتم جمع العينات.
7. مجموعة من العينات التجريبية (البلازما ، أنسجة الرئة)
- بالنسبة لعينات التحكم ، اجمع الفصوص اليمنى للمتبرع بعد بدء فترة إعادة التروية لمدة 3 ساعات.
- قم بتجميد الفص العلوي والفص بعد التجويف لتحليل تعبير البروتين أو الحمض النووي الريبي ، والحفاظ على الفص الأوسط للأنسجة ، واستخدام الفص السفلي لنسبة الوزن الرطب إلى الجاف (الشكل 9 أ).
- في 10 دقائق قبل نهاية وقت إعادة التروية لمدة 3 ساعات ، استعد لحصاد العينات المتلقية عن طريق حقن الهيبارين (1000 وحدة / كجم) مع حقنة الأنسولين في الوريد الوداجي.
ملاحظة: هذا الإعطاء من الهيبارين يمنع تجلط الدم في الرئتين ويسمح لمسح أكثر شمولا في وقت الشراء. - جمع البلازما
- في نهاية فترة التروية لمدة 3 ساعات ، اجمع 1 مل من الدم باستخدام حقنة عبر IVC.
- تخزينها على الجليد ثم أجهزة الطرد المركزي في 2000 × غرام لمدة 10 دقائق لحصاد البلازما.
- القتل الرحيم للفأر المتلقي عن طريق قطع IVC للسماح بالاستنزاف.
- تشريح الحجاب الحاجز على طول القوس الصدري وفضح التجويف الصدري عن طريق تشريح القفص الصدري.
- اجمع سائل BAL من الرئتين الأصلية أو المزروعة إذا رغبت في ذلك (اختياري).
ملاحظة: إذا تم إجراء نسبة الوزن الرطب إلى الجاف أو الأنسجة على الرئة ، فلا ينبغي إجراء جمع سوائل BAL لأنه يمكن أن يؤثر على النتائج.- خيط 4-0 خيط حريري حول القصبة الهوائية واربط عقدة مزدوجة ضيقة حول القصبة الهوائية وأنبوب التنبيب لمنع تسرب السوائل.
- احسب كمية برنامج تلفزيوني بارد الجليد لجمع سوائل BAL من الفصوص اليمنى والفص الأيسر.
ملاحظة: نسبة الحجم للرئة اليمنى هي 63٪ بينما نسبة الحجم للرئة اليسرى هي 37٪ 16. لذلك ، لتحديد كمية PBS التي يجب غرسها في كل جانب ، يجب حساب الحجم على أنه ضعف حجم المد والجزر (Td = 7.2 مل / كجم) مضروبا في 63٪ للرئة اليمنى و 37٪ للرئة اليسرى. - ضع مشبك Yasargil على منطقة هيلار الرئة اليسرى (الشكل 10 أ) ، وباستخدام حقنة متصلة بالقسطرة الوعائية ، قم بغرس الكمية المحسوبة من برنامج تلفزيوني بارد في الرئة اليمنى (الفصوص الأصلية للمتلقي) وجمع سائل BAL عن طريق السحب برفق على مكبس المحقنة. أداء مرتين.
ملاحظة: ينبغي للمرء أن يتوقع استرداد 70-80 ٪ من السوائل المغروسة. - قم بإزالة مشبك Yasargil على الرئة اليسرى وضع المشبك على منطقة هيلار الرئة اليمنى (الشكل 10B).
- اجمع سائل BAL من الفص الأيسر المزروع بنفس الطريقة التي تم جمعها للفصوص اليمنى ، ثم قم بإزالة المشبك الموجود في منطقة هيلار الرئة اليمنى.
- قم بقص الأذنين الأيمن والأيسر بمقص زنبركي تشريح دقيق وشطف الرئتين عن طريق الجاذبية عبر السلطة الفلسطينية باستخدام قسطرة وعائية 18 جم متصلة بأنبوب وحقنة بها 20 مل من محلول الحفظ المبرد مسبقا معلق عند 28 سم H2O.
- جمع العينات من رئة المتلقي.
- قم بتجميد الفص العلوي والفص بعد التجويف لتحليل تعبير البروتين أو الحمض النووي الريبي ، والحفاظ على الفص الأوسط للأنسجة ، واستخدام الفص السفلي لنسبة الوزن الرطب إلى الجاف) (الشكل 9 أ).
- قسم الفص الأيسر المزروع إلى ثلاثة أجزاء: المنطقة العلوية التي تم جمعها للتجميد المفاجئ ، والمنطقة الوسطى للأنسجة ، والمنطقة السفلية لنسبة الوزن الرطب إلى الجاف (الشكل 9 ب).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
من أجل قياس الوذمة الرئوية ، تم حساب نسبة الوزن الرطب إلى الجاف. تم جمع الفص الأصلي للمتبرع ، والفص المزروع ، والفص الأصلي للمتلقي كما هو موضح في البروتوكول ووزنه على الفور للوزن الرطب ، وتجفيفه عند 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة ، ثم وزنه مرة أخرى للوزن الجاف. زيادة نسبة الوزن الرطب إلى الجاف ستكون مؤشرا على الوذمة الرئوية. تشير نتائجنا إلى أن الفص المزروع لديه زيادة كبيرة في نسبة الوزن الرطب إلى الجاف مقارنة بالفص الأصلي للمتبرع أو المتلقي (p = 0.0050 ، n = 6 / المجموعة ؛ الشكل 11).
| حجم قسطرة الأوعية الدموية للأصفاد | |||
| وزن جسم الجرذ (جم) | ابي | فرع | الكهروضوئيه |
| 180-200 | ٢٠ غرام | ١٨ غرام | ١٦ غرام |
| 200-230 | ١٨ غرام | ١٦ غرام | ١٤ غرام |
| 230-250 | ١٨ غرام | ١٤ غرام | ١٤ غرام |
| 250-270 | ١٨ غرام | ١٤ غرام | 12 - 14 جم |
| أكثر من 270 | ١٦ غرام | ١٤ غرام | ١٢ غرام |
الجدول 1. دليل المقاسات للأصفاد. يرتبط حجم الشريان الرئوي (PA) أو الشعب الهوائية (Br) أو الوريد الرئوي (PV) بوزن الجسم. اعتمادا على وزن الجسم ونوع الكفة التي تقوم بها ، يتم إعطاء حجم قسطرة الأوعية الموصى به.
الشكل 1. الأدوات الجراحية. (أ) مقص ناعم ، (ب) ملقط ، (C-E) ملقط جراحي مجهري ، (F) Dumont # 5 ملقط ناعم ، (G) مقص زنبركي Vannas-Tubingen ومقص تشريح دقيق Castroviejo ، (H) مرقئ البعوض هالستيد ، (J) مبعثر ، (K) مشابك Yasargil ، (L) مشبك البلدغ Dieffenbach ، (M) مرقئ منحني ، و (N) قضيب مشبك Yasargil. يجب تعقيم جميع الأدوات عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. إعداد الكفة بأحجام مختلفة من قسطرة الأوعية الدموية والشفرة الجراحية الضلع # 11. يتم تحديد حجم قسطرة الأوعية الدموية المختارة للسوار من خلال دليل حجم الكفة (الجدول 1) الذي يأخذ في الاعتبار وزن جسم الفئران وما إذا كانت الكفة للشريان الرئوي (PA) أو الشعب الهوائية (Br) أو الوريد الرئوي (PV). يتم قطع القسطرة الوعائية (أ) 20 جم ، (ب) 18 جم ، (ج) 16 جم ، (د) 14 جم ، أو (ه) 12 جم بشفرة جراحية (F) ضلع خلفي # 11 كما هو موضح في البروتوكول ، ويتم تخزينها في محلول ملحي لحين الحاجة. (ز) طول جسم الكفة 2 مم ويترك شريط 1 مم × 1 مم (العرض × الارتفاع) في الجزء العلوي من جسم الكفة للتعامل مع جسم الكفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. نقص التروية الدافئة. يتم مسح الرئتين بمحلول الحفظ من خلال الشريان الرئوي ، ويتم نفخها بضعف حجم المد والجزر من الهواء ، ثم يتم لفها بوسادة سفلية والاحتفاظ بها على لوحة تسخين الجراحة للحفاظ على الفئران في درجة حرارة الجسم الطبيعية لمدة 1 ساعة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. الكفة من الرئة المانحة PV ، PA ، و Br. (أ) الوريد الرئوي ، PV (B) الشريان الرئوي ، PA ، أو (C) الشعب الهوائية ، Br ، يتم إدخاله من خلال صفعة ذات حجم مناسب ، مثبتة ، مثبتة ب 8-0 خياطة النايلون ، و (د) ثم تخزينها على شاش معقم مبلل بمحلول ملحي بارد على طبق بتري معقم على الجليد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. قياس وتشريح في الفضاء الوربي 4. (أ) يوضع الجرذ المتلقي مستلمعا، ويقاس الصدر من الشق فوق القصي إلى عملية الخنجري ويرسم خط. (ب) عند منتصف هذا الخط، يرسم خط آخر إلى الجانب الأيسر بنصف الطول. (ج) على طول هذا الخط ، يجب أن يشعر الجراح المجهري بمنطقة يكون فيها النبض القلبي أقوى لضمان الموقع المناسب للفضاءالوربي 4 (الدائرة الحمراء). (د) ثم يتم تشريح الجلد والعضلات بمقص دقيق. (ه) يستخدم المبعد، بعد ذلك، لفتح المساحة على نطاق واسع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. مفاغرة. يتم إدخال المتبرع المقيد (A) PV (B) Br أو (C) PA في PV أو Br أو PA الخاص بالمستلم ، ثم يتم تثبيته بخياطة نايلون 7-0. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7. التروية. بعد اكتمال المفاغرة ، يمكن بدء إعادة التروية عن طريق إزالة المشبك ، ويبقى الجرذ المتلقي على قيد الحياة لمدة 3 ساعات تحت التهوية والتخدير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8. إغلاق الجرح. (أ) يتم وضع ثلاث خيوط من النايلون 6-0 مع عقدة مزدوجة بسيطة حول الأضلاع أعلى من الضلع 4 وأدنىمن الضلع 5. (ب) استخدم مرقئ في كلتا اليدين لجمع الغرز الثلاثة معا وزيادة PEEP إلى 6 cmH2O في إعدادات التهوية. (ج) اربط العقد الثلاث معا في نفس الوقت عن طريق السحب لأعلى وبعيدا لإغلاق الجرح ، وتقليل PEEP إلى 2 سمH 2O على الفور ، وإغلاق الجلد بخياطة 6-0 نايلون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9. جمع أنسجة الرئة. (أ) بالنسبة للفصوص الأصلية للمتبرع أو المتلقي ، يمكن تجميد الفص العلوي والفص بعد التجويف لتحليل تعبير البروتين أو الحمض النووي الريبي ، ويمكن الحفاظ على الفص الأوسط للأنسجة ، ويمكن استخدام الفص السفلي لنسبة الوزن الرطب إلى الجاف. (ب) بالنسبة للفص المزروع ، اجمع المنطقة العلوية للتجميد المفاجئ ، أو المنطقة الوسطى للأنسجة ، أو المنطقة السفلية لنسبة الوزن الرطب إلى الجاف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10. تطبيق المشبك لجمع السوائل BAL الانتقائية. لتجنب العينة المجمعة ، يمكن جمع سائل BAL إما من الرئة اليمنى (الأصلية) أو اليسرى (المزروعة). (أ) يمكن تثبيت منطقة النقيض في الرئة اليسرى لتجميع سائل BAL من الفص الأيمن. (ب) يمكن تثبيت منطقة النقيرة اليمنى في الرئة لتجميع سائل BAL من الفص الأيسر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 11. نسبة الوزن الرطب إلى الجاف. تم حساب نسبة الوزن الرطب إلى الجاف لقياس الوذمة الرئوية ويمكن استخدامها للإشارة إلى مدى نجاح عملية الزرع. تم جمع الفص الأصلي للمتبرع أو الفص المزروع أو الفص الأصلي للمتلقي كما هو موضح في البروتوكول ووزنه على الفور للوزن الرطب ، وتجفيفه عند 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة ، ثم وزنه مرة أخرى للوزن الجاف. تم أخذ نسبة الوزن الرطب إلى الوزن الجاف. زادت نسبة الفص المزروع بشكل كبير مقارنة بالفصوص الأصلية للمتبرع أو المتلقي. n = 6 الفئران / المجموعة والأشرطة تمثل متوسط ± SD. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA مع تحليل Tukey البعدي. ** ص<0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا التقرير ، تدخلنا في عدة خطوات حاسمة في بروتوكول زرع رئة الفئران لتحسين الإجراء. في حين تم الإبلاغ عن تقنيات الكفة المختلفة لزراعة رئة الفئران1،2،3،4،5،6،7،8،9،15 ، يمكن أن تظل العملية ذاتية ويصعب على الجراحين المجهريين تطبيقها. لقد أكدنا أنه يجب استخدام الحجم المناسب للأصفاد ل PV و PA لتوفير الدم أو Br لتوفير الهواء في الرئة المزروعة ، وقد قدمنا طريقة أكثر موضوعية لتحديد حجم الكفة الأمثل بناء على وزن جسم الفئران. للحث على نقص التروية الدافئ للرئتين بشكل أكثر اتساقا ، قدمنا توصيات لتضخم الرئة ، والتثبيت ، وكيفية الحفاظ على دفء الفئران خلال فترة نقص التروية الدافئة 1 ساعة. أثناء إجراء المستلم ، قد يكون من الصعب تحديد موقع الفضاء الوربي 4. لقد أوصينا بأنه يمكن للمرء تحديد موقع هذا الموقف بدقة أكبر من خلال استخدام طريقة قياس والشعور بالنبضات القلبية. في وقت إعادة التروية ، لإغلاق الجرح بشكل أفضل ، أظهرنا أيضا تقنية للتعامل مع الغرز وضبط PEEP التي يمكن أن تغلق الجرح بسرعة أكبر وتمنع التضخم الزائد وإصابة الرئة. أخيرا ، قدمنا استراتيجيات لجمع الأنسجة وسوائل BAL التي تسمح بحصاد أكثر موضوعية للعينات التي يمكن مقارنتها عبر التجارب وأوزان الجسم المختلفة.
أهم قيود التقنيات الموصوفة هو منحنى التعلم الحاد إلى حد ما لعملية الزرع بشكل عام. منحنى التعلم هو الذي يمكن تقليله من خلال الممارسة الجراحية المتسقة ومن مراجعة تقنيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها في الأدبيات. قيد آخر هو أن هذا النموذج يدرس المرحلة الحادة من IRI والزرع حيث تحدث التغيرات الكيميائية الحيوية لأول مرة ، وهو محور مختبرنا. يجب أن تختبر الدراسات المستقبلية سالكية الشعب الهوائية والأوعية الدموية في جداول زمنية أطول بعد الزرع.
بشكل عام ، يعد نموذج زرع الحيوانات الصغيرة القابل للتطبيق أمرا بالغ الأهمية لتقييم التدخلات العلاجية للزرع وإصابة نقص التروية (IRI). نموذج زرع رئة الفئران ، على وجه الخصوص ، مفيد كعامل مساعد لدراسة تروية الرئة خارج الجسم الحي للحيوانات الصغيرة (EVLP) 17. كما أنه بديل أكثر قابلية للتطبيق لزرع رئة الفئران ، لأن الحجم التشريحي الأكبر يسمح للباحث بالحصول على أنسجة كافية لإجراء تحليلات أكثر تعمقا18. بالإضافة إلى ذلك ، يعد النموذج ضروريا لتحديد صلاحية الطعم الخيفي للرئة المتبرع بعد التدخل العلاجي بجزيئات صغيرة جديدة وعلاجات بروتينية19،20،21،22 إما للمتبرع أو للعضو المتبرع من خلال EVLP17 أو للمتلقي ويوفر وسيلة قوية لجمع البيانات في الجسم الحي. التحسينات التي وصفناها في هذا التقرير مهمة للجراحين المجهريين الذين يهدفون إلى تقليل منحنى التعلم لديهم وإزالة بعض الذاتية. من خلال استخدام خوارزمية موحدة لحجم الكفة الرئوية ، يمكن تبسيط النهج الجراحي وأكثر موضوعية. في ختام فترة إعادة ضخ الدم ، يوفر النهج المنظم الموصوف لجمع السوائل والأنسجة BAL أيضا استخداما مسؤولا للحيوانات واستخداما فعالا لوقت الجراح المجهري من خلال تعظيم تأثير البيانات التي تم جمعها لكل تجربة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يتم دعم BAW و YGL و JLK من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01HL143000. يتم دعم BAW من خلال منحة وزارة الدفاع (DOD) W81XWH1810787. يتم دعم SMB من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R01DK123475. يتم دعم JM من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة AR061385 و AR070752 و DK106394 و AG056919 وكذلك من خلال منحة وزارة الدفاع W81XWH-18-1-0787.
Acknowledgments
اي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Gauge angio-catheter | BD | 382277 | |
| 14 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251717-02 | |
| 16 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252586-02 | |
| 18 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251679-02 | |
| 20 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252527-02 | |
| 4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| 6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
| 7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
| 8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
| Betadine Spray | Avrio Health L.P | UPC 367618160039 | |
| Clippers | VWR | MSPP-023326 | |
| Castroviejo micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5668 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Electrocautery | Macan | MV-7A | |
| Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Halsted-mosquito hemostat | Roboz Surgical Instrument Co | RS-7112 | |
| Heparin | Fresnius Medical Care | C504701 | |
| Insulin syringe | Life Technologies | B328446 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropyl Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| Ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
| Dieffenbach Bulldog Clamp | World Precision Instruments | WPI14117 | |
| Needle holder/Forceps, Curved | Micrins | MI1542 | |
| Needle holder/Forceps, Straight | Micrins | MI1540 | |
| Perfadex Plus (Organ Preservation Solution) | XVIVO Perfusion AB | REF# 19950 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | Used to check SpO2 and heartbeat |
| Retractor | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6560 | |
| Saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Syringe 5mL | BD | 309646 | |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT351T | Used to clamp bronchus |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT261T | Used to clamp hilum |
| Yasargil Clamp Applicator | Aesculap, Inc | FT484T |
References
- Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 97 (4), 578-581 (1989).
- Zhai, W., et al. Simplified rat lung transplantation by using a modified cuff technique. Journal of Investigative Surgery. 21 (1), 33-37 (2008).
- Goto, T., et al. Simplified rat lung transplantation using a new cuff technique. Annals of Thoracic Surgery. 93 (6), 2078-2080 (2012).
- Guo, H., et al. Improvements of surgical techniques in a rat model of an orthotopic single lung transplant. European Journal of Medical Research. 18, 1 (2013).
- Tian, D., Shiiya, H., Sato, M., Nakajima, J. Rat lung transplantation model: modifications of the cuff technique. Annals of Translational Medicine. 8 (6), 407 (2020).
- Rajab, T. K. Anastomotic techniques for rat lung transplantation. World Journal of Transplantation. 8 (2), 38-43 (2018).
- Reis, A., Giaid, A., Serrick, C., Shennib, H. Improved outcome of rat lung transplantation with modification of the nonsuture external cuff technique. Journal of Heart and Lung Transplantation. 14 (2), 274-279 (1995).
- Sugimoto, R., et al. Experimental orthotopic lung transplantation model in rats with cold storage. Surgery Today. 39 (7), 641-645 (2009).
- Santana Rodriguez, N., et al. Technical modifications of the orthotopic lung transplantation model in rats with brain-dead donors. Archivos de Bronconeumología. 47 (10), 488-494 (2011).
- Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade. Journal of Surgical Research. 194 (2), 659-666 (2015).
- Rajab, T. K. Techniques for lung transplantation in the rat. Experimental Lung Research. 45 (9-10), 267-274 (2019).
- Iskender, I., et al. Effects of Warm Versus Cold Ischemic Donor Lung Preservation on the Underlying Mechanisms of Injuries During Ischemia and Reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
- Lin, X., et al. Five-year update on the mouse model of orthotopic lung transplantation: Scientific uses, tricks of the trade, and tips for success. Journal of Thoracic Disease. 4 (3), 247-258 (2012).
- Song, J. A., et al. Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats. Toxicological Research. 26 (3), 203-208 (2010).
- Chang, J. E., Kim, H. J., Yi, E., Jheon, S., Kim, K. Reduction of ischemia-reperfusion injury in a rat lung transplantation model by low-concentration GV1001. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (5), 972-979 (2016).
- De Backer, J. W., et al. Study of the variability in upper and lower airway morphology in Sprague-Dawley rats using modern micro-CT scan-based segmentation techniques. Anatomical Record. 292 (5), Hoboken. 720-727 (2009).
- Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), e52309 (2015).
- Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. Journal of Visualized Experiments. (65), e3947 (2012).
- Jia, Y., et al. Treatment of acute lung injury by targeting MG53-mediated cell membrane repair. Nature Communications. 5, 4387 (2014).
- Kim, J. L., et al. Pegylated-Catalase Is Protective in Lung Ischemic Injury and Oxidative Stress. Annals of Thoracic Surgery. , (2020).
- Beal, E. W., et al. D-Ala(2), D-Leu(5)] Enkephalin Improves Liver Preservation During Normothermic Ex Vivo Perfusion. Journal of Surgical Research. 241 (2), 323-335 (2019).
- Akateh, C., et al. Intrahepatic Delivery of Pegylated Catalase Is Protective in a Rat Ischemia/Reperfusion Injury Model. Journal of Surgical Research. 238, 152-163 (2019).
