Summary
여기에서는 결과를 개선하는 데 도움이 되는 쥐 폐 이식 모델에 대한 최적화를 제시합니다. 체중에 따른 커프스 사이즈 가이드, 4차 늑간 공간을 확인하기 위한 측정 전략, 상처 봉합 및 BAL(기관지폐포 세척) 체액 및 조직 수집 방법을 제공합니다.
Abstract
쥐 폐 이식에 대한 우리의 경험에서 우리는 개선해야 할 몇 가지 영역을 발견했습니다. 폐정맥(PV), 폐동맥(PA) 또는 기관지(Br)에 적합한 커프 크기를 선택하는 방법에 관한 기존 문헌의 정보는 다양하므로 쥐 폐 이식 중 적절한 커프 크기를 결정하는 것은 시행착오를 거쳐야 합니다. 혈관이나 기관지의 크기에 적합한 가장 작은 효과적인 커프를 사용하도록 커핑 기술을 표준화함으로써 이식 절차를 보다 안전하고 빠르며 성공적으로 만들 수 있습니다. PV, PA, Br의 직경은 쥐의 체중과 관련이 있기 때문에 체중 기반 가이드를 사용하여 적절한 크기를 선택하는 전략을 제시합니다. 폐 부피는 체중과도 관련이 있기 때문에 온열 허혈 동안 기증자 폐 팽창을 위한 적절한 공기량을 선택할 때와 기관지폐포 세척(BAL) 수액 수집 중에 주입할 적절한 양의 PBS에 대해서도 이 관계를 고려해야 합니다. 우리는 또한 4차 늑간 공간 해부, 상처 봉합 및 천연 엽과 이식된 엽 모두에서 샘플 수집 방법을 설명합니다.
Introduction
삼십 년이 넘는 기간 동안 연구자들은 생성된 데이터가 실제 임상 상태를 보다 일관되고 더 잘 반영할 수 있도록 쥐 폐 이식 모델을 수정하고 개선해 왔습니다. 우리 실험실에서 이 모델을 수행하는 동안 우리는 문합에 대한 커프 기술, 수혜자의 4번째 늑간 공간 식별, 수혜자의 시술 중 폐 팽창 및 상처 봉합, 분석을 위한 샘플 수확의 네 가지 개선 영역을 결정했습니다.
문합에 대한 커핑 기술 수정은 기증자 폐 1,2,3,4,5,6의 처리 시간을 단축하고 미세외과 의사가 문합 절차를 더 빠르고 기술적으로 쉽게 만들어 전체 이식 절차를 개선할 수 있습니다. 이식된 폐에 필요한 혈액과 기류를 공급하기 위해 적절한 크기의 커프를 사용하는 것이 중요하지만 폐정맥(PV), 폐동맥(PA) 또는 기관지(Br)5,7,8,9. PV, PA 및 Br의 직경은 기증자 및 수혜자 쥐의 체중과 관련이 있으므로 커프 크기는 체중을 기준으로 할 것을 제안합니다. 이 보고서는 이식된 폐에 혈액과 공기 공급을 최적화하는 역할을 하는 쥐의 체중(180g에서 270g 이상)을 기준으로 커프의 크기 가이드를 제공합니다(표 1).
새로운 미세외과 의사는 기증자 시술 중에 기증자 폐를 성공적이고 쉽게 조달할 수 있지만 수혜자의 시술 중에 폐를 이식하는 것은 더 복잡하고 미세외과 의사의 경험에 달려 있습니다. 수혜자의 왼쪽 폐에 접근하기 위해 4번째 늑간 공간을 찾으려는 시도는 주관성을 유지하고 시술 시간을 늘릴 수있는 더 어려운 단계 중 하나입니다. 따라서 흉부 측정과 심장의 두근거림을 이용하여4,5,6,10,11,12를 해부할 정확한 부위 흉벽을 찾아늑간 공간 위치를 식별하는 데 도움이 되는 간단하고 객관적인 방법을 소개합니다.
우리는 또한 장기 손상의 잠재적 원인인 기증자 폐 팽창에 대한 개선을 제안합니다. 기증자 폐는 재관류가 시작될 때까지 수축됩니다. 4번째 늑간 공간을 봉합하는 동안 기증자 폐는 일반적으로 PEEP를 2 cmH 2 O에서 6 cmH2O로 증가시켜팽창시킵니다. 과팽창으로 인한 폐 손상을 최소화하기 위해 5번째 갈비뼈보다 아래쪽에 있는 4번째 갈비뼈 주위에 간단한 이중 매듭으로 3개의 6-0 나일론 봉합사를 배치하는 기술을 제안합니다. 상처를 봉합 할 때가되면 3 개의 봉합사의 끝을 양손에 지혈제로 잡고 양쪽을 잡아 당겨 상처를 한꺼번에 봉합하고 PEEP를 즉시 2cmH2O로 줄입니다. 이런 식으로, 폐는 가능한 한 최단 시간 동안 확장 될 수 있습니다10.
실험이 끝나면 연구자는 종종 각 이식에서 다양한 유형의 분석을 위해 여러 유형의 샘플을 수집하려고 합니다. 예를 들어, 스냅 냉동 조직, 포르말린 고정 조직, 폐부종을 결정하기 위한 습윤 대 건조 중량 비율 조직 및 기관지정맥 세척액(BAL)은 모두 이식이 얼마나 잘 진행되었는지 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 기관지폐 기관지폐 수액을 수집하는 전통적인 방법은 수혜자의 천연 엽과 기증자의 이식된 엽 둘 다로부터 혼합된 풀링된 샘플을 허용한다13,14,15. 이를 극복하기 위해 우리는 이식된 폐와 천연 폐의 상태에 대한 보다 정확한 통찰력을 얻을 수 있는 폐문 영역을 클램핑하는 방법을 제시합니다. 또한 폐의 각 측면에서 기관지폐 기관지폐액을 수집하는 데 사용되는 PBS의 양은 농도로 측정되는 사이토카인 및 케모카인과 같은 수많은 용해성 인자를 포함하고 있기 때문에 고려하는 것이 중요합니다. 예상되는 폐활량에 주입 된 체액의 양을 정상화하면 비교에 도움이 될 수 있습니다. 오른쪽에 4개의 엽(葉)이 있고 왼쪽에 1개의 엽(葉)이 있으며, 쥐의 5개 엽(葉)은 각각 다른 부피와 표면적을 가지고 있다(16). Backer et al.의 폐엽 부피 측정에 대한 이전 연구에 따르면, 전체 폐의 총 부피 중 우엽의 부피는 63%(4400mm3)이고 좌엽의 부피는 37%(2500mm3)입니다. 따라서 기관지폐 기관지폐액을 수집하는 데 사용되는 PBS의 부피는 일회 호흡량(7.2mL/kg)의 두 배에 오른쪽 폐의 경우 63%, 왼쪽 폐의 경우 37%를 곱한 값으로 계산하는 것이 좋습니다. 이 접근 방식을 사용하면 체중 및 타이밍10,16과 같은 변수를 더 잘 제어할 수 있습니다.
전체적으로, 이 보고서에서 우리는 절차를 보다 효율적으로 만들고 각 실험에서 보다 정확하고 풍부한 데이터를 생성하는 능력을 높일 수 있는 쥐 폐 이식의 표준 실험 모델에 대한 몇 가지 수정 사항을 보여줄 것입니다.
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Protocol
수컷 Sprague-Dawley 쥐(체중 180-270g)를 상업적으로(예: Envigo) 구입하여 오하이오 주립 대학 동물 시설에서 병원체가 없는 조건에서 사육했습니다. 모든 절차는 NIH 및 National Research Council's Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals에 따라 오하이오 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC 프로토콜 # 2012A00000135-R2)의 승인을 받아 인도적으로 수행되었습니다.
1. 초기 설정
- 수술 장치를 설정합니다.
참고: 이것은 비생존 수술입니다. 생존 수술을 수행하려면 멸균 기구와 장벽 예방 조치를 취해야 합니다.- 심박수/산소 포화도 모니터링 장비와 보온 보드를 42°C로 켭니다.
- 환기 및 마취 기계를 켜서 이소플루란 증발기를 예열합니다.
참고: 일회 호흡량(Td) 7.2mL/kg, 호기말 양압(PEEP) 2cmH2O, 호흡수 80bpm을 사용하십시오. - 마취 주사기에 액체 이소플루란 10mL를 채우고 주사기를 환기 및 마취 기계에 장착합니다.
- 미세외과 의사의 선호도에 맞게 높이와 초점을 조정한 상태에서 수술용 현미경을 켭니다.
- 전기 소작 장치를 켭니다.
- 수술 도구를 준비하고 배치합니다(그림 1).
참고: 모든 수술 도구는 121°C에서 30분 동안 고압증기멸균되었습니다. - 기증자와 수혜자 쥐의 체중을 수집하고 기록합니다.
- 표 1과 쥐의 체중을 사용하여 커프를 만드는 데 사용할 혈관 카테터(20, 18, 16, 14 또는 12G)의 정확한 게이지를 결정합니다.
- 체중에 따른 크기 가이드를 사용하여 폐동맥(PA), 기관지(Br) 및 폐정맥(PV)에 대한 커프를 준비합니다(표 1 및 그림 2).
- 20G, 18G, 16G, 14G 또는 12G 크기의 혈관 카테터(그림 2A-E)를 수술 현미경으로 멸균 표면에 놓습니다.
- 그런 다음 늑골 등 수술 블레이드 #11(그림 2F)을 사용하여 혈관 카테터를 90° 각도로 절단하여 커프 본체 상단에 1mm X 1mm 탭(너비 x 높이)이 있는 2mm 길이의 커프 본체를 형성합니다(그림 2G).
- 사용할 준비가 될 때까지 커프를 멸균 식염수에 보관하십시오.
- 솔루션을 준비합니다.
- 케타민 10mL(100mg/mL)에 자일라진(1mL) 1mL를 첨가하여 멸균 주사 바이알에 케타민과 자일라진의 혼합물을 준비합니다.
알림: 이 칵테일의 만료 날짜는 사용된 구성 요소의 가장 빠른 만료 날짜를 사용하여 결정됩니다. - 쥐에게 적절한 용량을 주사기에 넣습니다(쥐의 체중 100g당 케타민/자일라진 혼합물 0.1mL, 예: 쥐 200g의 경우 케타민/자일라진 혼합물 0.2mL가 전달됨).
참고: 이 용량은 91mg/kg의 케타민과 9.1mg/kg의 자일라진을 쥐에게 전달하며 쥐를 60-80분 동안 진정시켜야 합니다. - 1,000 U/kg의 용량으로 전달될 헤파린을 준비합니다.
- 식염수, PBS 및 보존 용액을 얼음 위에 보관한다(Table of Materials).
- 케타민 10mL(100mg/mL)에 자일라진(1mL) 1mL를 첨가하여 멸균 주사 바이알에 케타민과 자일라진의 혼합물을 준비합니다.
2. 기증자 쥐 준비
- 케타민과 자일라진 혼합물을 복강 주사하고 발가락 핀치에 대한 반응 부족으로 평가할 수 있는 마취 수술면이 발달할 때까지 ~10분 동안 기증자 쥐의 마취를 유도합니다.
- 전자 클리퍼를 사용하여 절개 부위를 면도하십시오.
- 기증자 쥐를 수술 용 온난화 보드에 앙와위 자세로 놓고 베타 딘을 적신 멸균 거즈로 절개 부위를 닦습니다. 그런 다음 70% 이소프로필 알코올 면봉으로 해당 부위를 닦습니다. 3 번 반복하십시오.
- 가위를 사용하여 목 중앙에 3-4cm의 정중선 피부 절개를 하고 집게(출혈을 피하기 위해 가위 대신)를 사용하여 피하 조직과 근육을 조심스럽게 절개합니다.
- 기관내 삽관의 경우 기관 주위에 4-0 실크 봉합사를 끼우고 16G 혈관 카테터를 기관에 삽입합니다. 이중 매듭으로 기관 주위의 봉합사를 단단히 묶은 다음 단일 매듭으로 마무리하여 혈관 카테터를 제자리에 고정합니다.
- 혈관 카테터를 인공 호흡기에 연결하고 1-2 %의 이소 플루 란으로 쥐의 마취 수술면을 유지하십시오.
- 가위를 사용하여 복강근 절개술과 횡단 절개를 결합한 복강경 절개술을 시행합니다.
- 하대정맥(IVC)을 통해 인슐린 주사기로 헤파린(1,000U/kg)을 주사하고 전신 순환을 위해 10분 동안 기다립니다.
참고: 이 헤파린 투여는 기증자 폐의 혈전을 예방합니다. - 흉궁을 따라 절단하여 횡격막을 조심스럽게 해부한 다음 흉골을 따라 목까지 흉강을 노출시킵니다.
3. 기증자 폐 온열 허혈 및 조달
- IVC를 절단하여 기증자 쥐를 안락사시킵니다.
- 폐가 여전히 환기되는 동안, 튜브에 연결된 중력에 의해 28 cmH2O에 매달린 주사기에 20 mL의 보존 용액과 함께 미세 해부 스프링 가위로 오른쪽 및 왼쪽 귓바퀴를 절단하고 폐동맥을 통해 직접 도입되는 18 G 혈관 카테터.
- 기관내관에서 인공호흡기를 분리하고 체중에 따라 적절한 양의 공기로 채워진 5mL 주사기에 연결합니다.
참고: 폐를 팽창시키는 공기의 양은 일회 호흡량의 두 배(Td = 7.2mL/kg)로 계산할 수 있습니다(예: 200g 쥐의 Td는 1.44mL이고 여기에 2를 곱하면 폐를 팽창시키는 데 필요한 공기 2.88mL가 됩니다. - 기증자의 폐를 팽창시킵니다.
- 폐를 팽창시키기 위해 기관에 Yasargil 클램프를 넣고 멸균 된면 거즈로 폐와 심장을 덮으십시오. 식염수로 거즈에 수분을 공급하고 기증자 쥐를 언더 패드로 감싼 다음 온열 수술 보드에 1시간 동안 그대로 두어 폐에 따뜻한 허혈을 유도합니다(그림 3).
- 따뜻한 허혈 1시간 후, 미세 해부 스프링 가위와 집게로 심폐 블록을 절제하고 얼음 위의 멸균 페트리 접시에 얼음처럼 차가운 PBS로 적신 멸균 거즈에 놓습니다.
알림: 다음 단계는 모두 폐가 얼음 위의 페트리 접시에 있는 동안 이루어져야 합니다. - 미세 해부 스프링 가위로 폐 인대를 조심스럽게 절개하여 왼쪽 폐를 식도와 기근 후 엽에서 분리합니다.
- Vannas-Tubingen 스프링 가위로 왼쪽 폐 폐문 부위를 조심스럽게 다듬고 왼쪽 PV, PA 및 Br을 조달합니다.
- PV, PA 또는 Br에 커프를 놓습니다(그림 4A-C).
- 모기 지혈제를 사용하여 커프 탭을 잡습니다.
- 가는 집게를 사용하여 적절한 커프 본체를 통해 PV, PA 또는 Br의 말단부를 잡고 커프 주변의 여분의 조직을 뒤집고 8-0을 사용하여 고정합니다. 나일론 봉합사. Vannas-Tubingen 스프링 가위를 사용하여 여분의 조직과 커프 본체 주변의 커프를 다듬습니다.
- 기증자 폐를 거즈로 덮고 식염수로 적셔 수혜자 쥐에게 이식할 준비가 될 때까지 얼음 위의 페트리 접시에 올려 둡니다(그림 4D).
참고: 평균 한랭 허혈 시간은 서경 84분± 11분입니다.
4. 수혜자 쥐 준비
- 케타민과 자일라진 혼합물(100 g rat 당 0.1 mL)을 복강 주사하고 발가락 핀치에 대한 반응 부족으로 평가할 수 있는 마취 수술면이 발달할 때까지 10분 동안 기다림으로써 기증자 쥐와 동일한 방법으로 수용자 쥐에게 마취를 유도한다.
- 전자 가위를 사용하여 절개 부위를 면도합니다.
- 기증자 쥐를 앙와위 자세로 놓고 베타 딘을 적신 멸균 거즈로 절개 부위를 닦아냅니다. 그런 다음 70% 이소프로필 알코올 면봉으로 해당 부위를 닦습니다. 3 번 반복하십시오.
- 쥐가 환기 기계에 고정되기 전에 4번째 늑간 공간을 찾을 준비를하기 위해 쥐의 가슴에 선을 그립니다.
- 흉골 상 노치에서 xiphoid 과정까지 가슴을 측정하고 선을 그립니다 (그림 5A).
- 이 선의 중간에 흉골 상 노치에서 xiphoid 과정까지 측정의 절반을 측정하는 가슴의 왼쪽을 따라 선을 그립니다 (그림 5A 및 B).
- 기관내 삽관 키트의 LED 조명에 연결된 광섬유 케이블을 사용하여 시각화를 통해 16G 혈관 카테터를 사용하여 수혜자를 삽관합니다.
- 혈관 카테터를 인공 호흡기에 연결하고 1-2 % 이소 플루 란으로 마취 수술면을 유지하십시오.
- 4번째 늑간 공간을 찾으려면 강한 만져지는 심장 충동이 느껴질 수있는 흉벽 영역을 찾으십시오 (그림 5C, 빨간색 원).
- 이 위치에서 가위로 피부를 절개하고 미세 해부 스프링 가위로 근육을 절개하고 견인기를 사용하여 4번째 늑간 공간을 최대한 넓게 엽니 다.
알림: 근육 절개 중 출혈을 피하거나 멈추기 위해 전기 소작을 사용하십시오. - 늑간 공간이 활짝 열리면 Vannas-Tubingen 스프링 가위를 사용하여 수혜자의 왼쪽 폐 주위의 인대를 조심스럽게 해부하고 멸균 면봉과 집게를 사용하여 폐를 가슴 부위에서 빼냅니다.
- 멸균 거즈를 왼쪽 폐 주위에 놓고 Dieffenbach 불독 클램프로 잡습니다.
- Yasargil cl을 적용amp 가능한 한 근위부로 왼쪽 폐 폐문 부위에.
5. 문합
- 폐정맥(PV) 문합
- 수혜자의 PV 주위에 7-0 나일론 봉합사를 놓습니다.
- Vannas-Tubingen 스프링 가위를 사용하여 상부 및 하부 분절 정맥을 가능한 한 원위부로 절단하여 수혜자의 PV를 절개하고 인슐린 주사기를 사용하여 0.2mL의 헤파린 처리 식염수(1U/mL)로 혈액을 씻어냅니다.
- 얼음처럼 차갑고 젖은 멸균 거즈로 감싼 기증자 폐를 흉강에 넣습니다.
- 기증자의 커프가 달린 PV를 수혜자의 PV에 삽입한 다음 미리 배치된 7-0 나일론 봉합사로 고정합니다(그림 6).
- 기관지 (Br) 문합
- 수혜자의 Br 주위에 7-0 나일론 봉합사를 놓습니다.
- Vannas-Tubingen 스프링 가위로 상부 및 하부 분절 기도를 가능한 한 원위까지 가로로 절단하여 수혜자의 Br을 절개합니다.
- 기증자의 커프가 채워진 Br을 수혜자의 Br에 삽입하고 미리 배치된 7-0 나일론 봉합사로 고정합니다(그림 6).
- 폐동맥(PA) 문합:
- 수혜자의 PA 주위에 7-0 나일론 봉합사를 놓습니다.
- 외래 덮개에서 수혜자의 PA를 절개하고 Vannas-Tubingen 스프링 가위로 혈관 둘레의 절반을 절개한 다음 인슐린 주사기를 사용하여 0.2mL 헤파린 처리 식염수(1U/mL)로 PA의 혈액을 씻어냅니다.
- 기증자의 커프가 채워진 PA를 수혜자의 PA에 삽입하고 미리 배치된 7-0 나일론 봉합사로 고정합니다(그림 6).
6. 재관류
- 이식된 기증자 폐의 재관류 및 환기를 허용하기 위해 문에 있는 Yasargil 클램프를 제거합니다(그림 7).
- 미세 해부 스프링 가위와 집게를 사용하여 수혜자의 원래 왼쪽 폐를 해부합니다.
- 이식 된 왼쪽 폐를 수혜자의 흉부에 조심스럽게 재배치하십시오.
- 6-0 나일론 봉합사를 사용하여 개흉술 절개를 닫습니다.
- 4번째 갈비뼈보다 우수하고 5번째 갈비뼈보다 열등한 갈비뼈 주위에 간단한 이중 매듭이 있는 3개의 6-0 나일론 봉합사를 놓습니다(그림 8A).
- 지혈기를 사용하여 세 개의 봉합사를 함께 모으십시오(그림 8B).
- 환기 설정에서 PEEP를 6cmH2O로 높입니다.
- 상처를 봉합하기 위해 당겨서 세 개의 매듭을 동시에 묶습니다(그림 8C).
- PEEP를 즉시 2cmH2O로 낮추십시오.
- 6-0 나일론 봉합사로 피부를 닫습니다.
참고: 우리 실험실은 이식 후 급성기를 연구하므로 이 모델의 수용자 쥐는 이식 후 3시간 동안 환기 및 마취 상태에서 생존한 다음 샘플을 수집합니다.
7. 실험검체(혈장, 폐조직) 채취
- 대조군 샘플의 경우 3시간 재관류 기간이 시작된 후 기증자의 우엽을 수집합니다.
- 단백질 또는 RNA 발현 분석을 위해 상엽 및 기병엽 후 급속 동결하고, 조직학을 위해 중엽을 보존하고, 습식 대 건조 중량 비율을 위해 하엽을 사용합니다(그림 9A).
- 3시간 재관류 시간이 끝나기 10분 전에 인슐린 주사기로 헤파린(1,000U/kg)을 경정맥에 주사하여 수용자 샘플을 채취할 준비를 합니다.
참고: 이 헤파린 투여는 폐의 혈전을 예방하고 조달 시 보다 철저한 홍조를 허용합니다. - 혈장 수집
- 3시간 재관류 기간이 끝나면 IVC를 통해 주사기로 혈액 1mL를 수집합니다.
- 얼음에 보관한 다음 2,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 혈장을 채취합니다.
- 출혈을 허용하기 위해 IVC를 절단하여 수용자 쥐를 안락사시킵니다.
- 흉궁을 따라 횡격막을 해부하고 흉곽을 해부하여 흉강을 노출시킵니다.
- 원하는 경우 천연 또는 이식된 폐에서 기관지폐 기관지폐액을 수집합니다(선택 사항).
참고: 습식 대 건조 중량 비율 또는 조직학이 폐에서 수행되는 경우 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 기관지폐 수액 수집을 수행해서는 안 됩니다.- 기관 주위에 4-0 실크 봉합사를 끼우고 기관과 삽관 튜브 주위에 단단한 이중 매듭을 묶어 유체 누출을 방지합니다.
- 우엽과 좌엽에서 BAL 유체 수집을 위한 얼음처럼 차가운 PBS의 양을 계산합니다.
참고: 오른쪽 폐의 용적 비율은 63%이고 왼쪽 폐의 용적 비율은 37%입니다16. 따라서 각 측면에 주입할 PBS의 양을 결정하려면 일회 호흡량(Td = 7.2mL/kg)의 두 배에 오른쪽 폐의 경우 63%, 왼쪽 폐의 경우 37%를 곱한 부피로 계산해야 합니다. - 왼쪽 폐 폐문 부위(그림 10A)에 Yasargil 클램프를 놓고 혈관 카테터에 연결된 주사기를 사용하여 계산된 양의 얼음처럼 차가운 PBS를 오른쪽 폐(수혜자의 천연 엽)에 주입하고 주사기 플런저를 부드럽게 위로 당겨 기관폐 지폐액을 수집합니다. 두 번 수행하십시오.
알림: 주입된 유체의 70-80% 회복을 예상해야 합니다. - Yasargil cl 제거amp 왼쪽 폐에 있고 cl을 놓습니다.amp 오른쪽 폐 폐문 영역에 있습니다(그림 10B).
- 이식된 좌엽에서 우엽에 채취한 것과 같은 방법으로 기관지폐 지폐액을 채취한 후 우측 폐 폐문골 부위에 클램프를 제거한다.
- 튜브에 부착된 18G 혈관 카테터와28cmH2O에 매달린 20mL의 사전 냉장 보존 용액이 담긴 주사기를 사용하여 PA를 통해 미세 해부 스프링 가위로 오른쪽 및 왼쪽 귓바퀴를 절단하고 중력에 의해 폐를 플러시합니다.
- 수혜자의 폐에서 샘플을 수집합니다.
- 단백질 또는 RNA 발현 분석을 위해 상엽 및 기병후 엽을 스냅 동결하고, 조직학을 위해 중엽을 보존하고, 습윤-건조 중량 비율을 위해 하엽을 사용합니다)(그림 9A).
- 이식된 왼쪽 좌엽을 스냅 냉동을 위해 수집된 위쪽 영역, 조직학을 위한 중간 영역, 습식 대 건조 중량 비율을 위한 아래쪽 영역의 세 부분으로 나눕니다(그림 9B).
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Representative Results
폐부종을 측정하기 위해, 습윤 대 건식 중량비를 계산하였다. 기증자의 천연엽, 이식된 엽 및 수혜자의 천연엽을 프로토콜에 기재된 대로 수집하고, 습윤 중량에 대해 즉시 칭량하고, 60°C에서 48시간 동안 건조시킨 다음, 건조 중량에 대해 다시 칭량하였다. 증가된 습윤 대 건식 중량 비율은 폐부종을 나타냅니다. 우리의 결과는 이식된 엽이 기증자 또는 수혜자의 본래 엽에 비해 습윤 대 건조 중량 비율이 유의하게 증가했음을 나타냅니다(p=0.0050, n=6/그룹; 그림 11).
| 커프의 혈관 카테터 크기 | |||
| 쥐 체중 (g) | 펜실베이니아 | 브롬 | 태양광 발전 |
| 180-200 | 20 그램 | 18 그램 | 16 그램 |
| 200-230 | 18 그램 | 16 그램 | 14 그램 |
| 230-250 | 18 그램 | 14 그램 | 14 그램 |
| 250-270 | 18 그램 | 14 그램 | 12 - 14 그램 |
| 270 이상 | 16 그램 | 14 그램 | 12 그램 |
표 1. 커프스 사이즈 가이드. 폐동맥(PA), 기관지(Br) 또는 폐정맥(PV)의 크기는 체중과 관련이 있습니다. 체중과 어떤 유형의 커프를 만드는지에 따라 권장되는 혈관 카테터 크기가 제공됩니다.
그림 1. 수술 도구. (A) 미세 가위, (B) 겸자, (CE) 미세 수술 겸자, (F) Dumont #5 미세 겸자, (G) Vannas-Tubingen 스프링 가위 및 Castroviejo 미세 해부 가위, (H) Halsted-모기 지혈기, (J) 견인기, (K) Yasargil 클램프, (L) Dieffenbach 불독 클램프, (M) 곡선 지혈기 및 (N) Yasargil 클램프 어플리케이터. 모든 도구는 121°C에서 30분 동안 고압 증기멸균해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 다양한 크기의 혈관 카테터와 늑골 등 수술용 칼날을 사용한 커프 준비 #11. 커프에 대해 선택된 혈관 카테터의 크기는 쥐의 체중과 커프가 폐동맥(PA), 기관지(Br) 또는 폐정맥(PV)용인지 여부를 고려한 커프 크기 가이드(표 1)에 의해 결정됩니다. 혈관-카테터를 (A) 20 G, (B) 18 G, (C) 16 G, (D) 14 G, 또는 (E) 12 G는 프로토콜에 기재된 바와 같이 (F) 늑골-백 수술 블레이드 #11로 절단하고, 필요할 때까지 식염수에 저장한다. (G) 커프 본체 길이는 2mm이고 커프 본체 상단에는 커프 본체를 취급하기 위해 1mm X 1mm 탭(너비 x 높이)이 남아 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 따뜻한 허혈. 폐를 폐동맥을 통해 보존액으로 씻어내고 일회 호흡량의 2배의 공기로 부풀린 다음 언더 패드로 감싸고 수술 보온 보드에 올려 쥐를 정상 체온으로 1시간 동안 유지합니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 기증자 폐 PV, PA 및 Br의 커프. (A) 폐정맥, PV (B) 폐동맥, PA 또는 (C) 기관지, Br을 적절한 크기의 커프를 통해 삽입하고, 뒤집고, 8-0으로 고정합니다. 나일론 봉합사, 및 (D) 얼음 위의 멸균 페트리 접시 위에 얼음-차가운 식염수로 적신 멸균 거즈에 보관한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 제 4 늑간 공간에서 측정 및 해부. (A) 수용자 쥐를 앙와위로 눕히고 흉골상 노치에서 xiphoid process까지 가슴을 측정하고 선을 그립니다. (B) 이 선의 중간 지점에서 왼쪽의 다른 선이 길이의 절반으로 그려집니다. (C) 이 라인을 따라 미세외과 의사는 4번째 늑간 공간(빨간색 원)의 적절한 위치를 보장하기 위해 심장 자극이 가장 강한 영역을 느껴야 합니다. (D) 그런 다음 미세한 가위로 피부와 근육을 해부합니다. (E) 그런 다음 견인기를 사용하여 공간을 넓게 엽니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 문합. 기증자의 커프가 채워진 (A) PV (B) Br 또는 (C) PA를 수혜자의 PV, Br 또는 PA에 삽입한 다음 7-0 나일론 봉합사로 고정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. 재관류. 문합이 완료된 후, 클램프를 제거하여 재관류를 시작할 수 있으며, 수용자 쥐는 환기 및 마취 하에서 3 시간 동안 생존합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8. 상처 봉합. (A) 간단한 이중 매듭이 있는 3개의 6-0 나일론 봉합사가 4번째 갈비뼈보다 우수하고 5번째 갈비 뼈보다 열등한 갈비뼈 주위에 배치됩니다. (B) 양손에 지혈제를 사용하여 3 개의 봉합사를 모으고 환기 설정에서 PEEP를 6cmH2O로 높입니다. (C) 상처를 봉합하기 위해 위로 당겨서 세 개의 매듭을 동시에 묶고 PEEP를 즉시 2cmH2O로 낮추고 6-0 나일론 봉합사로 피부를 닫습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9. 폐 조직 수집. (A) 기증자 또는 수혜자의 천연 엽의 경우, 상엽 및 기과후 엽은 단백질 또는 RNA 발현 분석을 위해 급속 냉동될 수 있고, 중엽은 조직학을 위해 보존될 수 있으며, 하엽은 습윤 대 건조 중량 비율에 사용될 수 있습니다. (B) 이식된 엽의 경우 스냅 냉동의 경우 상부 영역, 조직학의 경우 중간 영역 또는 습윤 대 건조 중량 비율의 경우 하부 영역을 수집합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10. 선택적 BAL 유체 수집을 위한 클램프 적용. 고인 샘플을 피하기 위해 기관지폐 기관폐액은 오른쪽(네이티브) 또는 왼쪽(이식된) 폐에서 채취할 수 있습니다. (A) 왼쪽 폐 폐문 영역을 클램핑하여 오른쪽 엽에서 기관지폐 기관지폐액을 수집할 수 있습니다. (B) 오른쪽 폐 폐문 영역을 클램핑하여 왼쪽 엽에서 기관지폐 기관지폐액을 수집할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11. 습식 대 건조 중량 비율. 습식 대 건식 중량 비율은 폐부종을 측정하기 위해 계산되었으며 이식이 얼마나 잘 진행되었는지를 나타내는 데 사용할 수 있습니다. 공여자의 천연엽, 이식된 엽 또는 수혜자의 천연엽을 프로토콜에 기재된 바와 같이 수집하고, 습윤 중량에 대해 즉시 칭량하고, 60°C에서 48시간 동안 건조시킨 다음, 건조 중량에 대해 다시 칭량하였다. 건조 중량에 대한 습윤 중량의 비율을 취하였다. 이식된 엽에 대한 비율은 기증자 또는 수혜자의 천연 엽에 비해 유의하게 증가하였다. n=6 rats/group 및 bars는 평균 ± SD를 나타냅니다. 통계 분석은 Tukey의 사후 분석과 함께 ANOVA를 사용하여 수행되었습니다. ** p<0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 보고서에서 우리는 절차를 최적화하기 위해 쥐 폐 이식 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계에 개입했습니다. 쥐의 폐 이식을 위한 다양한 커핑기술이 보고되었지만1,2,3,4,5,6,7,8,9,15, 이 과정은 여전히 주관적이고 미세외과 의사가 적용하기 어려울 수 있습니다. 혈액을 공급하기 위한 PV 및 PA의 적절한 크기의 커프 또는 이식된 폐에 공기를 공급하기 위한 Br을 사용해야 한다는 점을 강조했으며, 쥐의 체중에 따라 최적의 커프 크기를 결정하는 보다 객관적인 방법을 제공했습니다. 폐의 따뜻한 허혈을 보다 일관되게 유도하기 위해 폐 팽창, 클램핑 및 1시간 따뜻한 허혈 시간 동안 쥐를 따뜻하게 유지하는 방법에 대한 권장 사항을 제공했습니다. 수혜자의 시술 중에 4번째 늑간 공간을 찾기가 어려울 수 있습니다. 우리는 심장 충동에 대한 측정 및 감각 방법을 사용하여 이 위치를 보다 정확하게 찾을 수 있도록 권장했습니다. 재관류시 상처를 더 잘 봉합하기 위해 봉합사를 처리하고 PEEP를 조정하여 상처를 더 빨리 닫고 폐의 과팽창 및 손상을 예방할 수있는 기술도 보여주었습니다. 마지막으로, 우리는 실험과 다양한 체중에 걸쳐 비교할 수 있는 샘플을 보다 객관적으로 수확할 수 있도록 조직 및 기관지폐 수액 수집을 위한 전략을 제시했습니다.
설명 된 기술의 가장 중요한 한계는 일반적으로 이식 수술의 다소 가파른 학습 곡선입니다. 학습 곡선은 일관된 외과 실습과 문헌의 문제 해결 기술 검토를 통해 줄일 수 있는 곡선입니다. 또 다른 한계는 이 모델이 우리 실험실의 초점인 생화학적 변화가 처음 발생하는 IRI 및 이식의 급성기를 연구한다는 것입니다. 향후 연구에서는 이식 후 더 긴 일정에서 기관지 및 혈관 개통을 테스트해야 합니다.
전반적으로, 실행 가능한 소동물 이식 모델은 이식 및 허혈-재관류 손상(IRI)에 대한 치료적 개입을 평가하는 데 중요합니다. 특히 쥐 폐 이식 모델은 생체 외 폐 관류(EVLP)17를 연구하기 위한 보조제로서 유용합니다. 또한 해부학적 크기가 클수록 연구자가 보다 심층적인 분석을 위한 충분한 조직을 얻을 수 있기 때문에 쥐 폐 이식에 대한 더 실행 가능한 대안이기도 합니다18. 추가적으로, 이 모델은 새로운 소분자 및 단백질 치료제 19,20,21,22를 사용하여 기증자, EVLP 17을 통해 기증자 기관 또는 수혜자에게 치료적 개입 후 기증자 폐 동종이식편의 생존 가능성을 결정하는 데 필수적이며 생체 내 데이터를 수집할 수 있는 강력한 방법을 제공합니다. 이 보고서에서 설명하는 최적화는 학습 곡선을 줄이고 일부 주관성을 제거하는 것을 목표로 하는 미세외과 의사에게 중요합니다. 표준화된 폐 커핑 크기 알고리즘을 활용하여 수술 접근 방식을 간소화하고 보다 객관적으로 만들 수 있습니다. 이식 재관류 기간이 끝나면 기관지폐 기관지폐 수액 및 조직 수집에 대한 구조화된 접근 방식은 실험당 수집된 데이터의 영향을 극대화하여 동물의 책임감 있는 사용과 미세외과 의사의 시간을 효율적으로 사용할 수 있도록 합니다.
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Disclosures
BAW, YGL 및 JLK는 NIH(National Institutes of Health) 보조금 R01HL143000을 통해 지원됩니다. BAW는 국방부(DOD) 보조금 W81XWH1810787을 통해 지원됩니다. SMB는 NIH 보조금 R01DK123475를 통해 지원됩니다. JM은 NIH 보조금 AR061385, AR070752, DK106394 및 AG056919와 국방부 보조금 W81XWH-18-1-0787을 통해 지원됩니다.
Acknowledgments
없음.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Gauge angio-catheter | BD | 382277 | |
| 14 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251717-02 | |
| 16 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252586-02 | |
| 18 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251679-02 | |
| 20 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252527-02 | |
| 4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| 6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
| 7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
| 8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
| Betadine Spray | Avrio Health L.P | UPC 367618160039 | |
| Clippers | VWR | MSPP-023326 | |
| Castroviejo micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5668 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Electrocautery | Macan | MV-7A | |
| Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Halsted-mosquito hemostat | Roboz Surgical Instrument Co | RS-7112 | |
| Heparin | Fresnius Medical Care | C504701 | |
| Insulin syringe | Life Technologies | B328446 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropyl Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| Ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
| Dieffenbach Bulldog Clamp | World Precision Instruments | WPI14117 | |
| Needle holder/Forceps, Curved | Micrins | MI1542 | |
| Needle holder/Forceps, Straight | Micrins | MI1540 | |
| Perfadex Plus (Organ Preservation Solution) | XVIVO Perfusion AB | REF# 19950 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | Used to check SpO2 and heartbeat |
| Retractor | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6560 | |
| Saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Syringe 5mL | BD | 309646 | |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT351T | Used to clamp bronchus |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT261T | Used to clamp hilum |
| Yasargil Clamp Applicator | Aesculap, Inc | FT484T |
References
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