Summary
Her præsenterer vi optimeringer til en rottelungetransplantationsmodel, der tjener til at forbedre resultaterne. Vi leverer en størrelsesguide til manchetter baseret på kropsvægt, en målestrategi til bestemmelse af det 4. interkostale rum og metoder til sårlukning og BAL (bronchoalveolær skylning) væske og vævsopsamling.
Abstract
Fra vores erfaring med rottelungetransplantation har vi fundet flere områder, der kan forbedres. Oplysninger i den eksisterende litteratur om metoder til valg af passende manchetstørrelser til lungevenen (PV), lungearterien (PA) eller bronchus (Br) varieres, hvilket gør bestemmelsen af korrekt manchetstørrelse under rottelungetransplantation til en øvelse af forsøg og fejl. Ved at standardisere manchetteknikken til at bruge den mindste effektive manchet, der passer til størrelsen på karret eller bronchus, kan man gøre transplantationsproceduren sikrere, hurtigere og mere vellykket. Da diametre på PV, PA og Br er relateret til rottens kropsvægt, præsenterer vi en strategi for at vælge en passende størrelse ved hjælp af en vægtbaseret vejledning. Da lungevolumen også er relateret til kropsvægt, anbefaler vi, at dette forhold også bør overvejes, når man vælger den korrekte luftmængde til donorlungeinflation under varm iskæmi samt til den korrekte mængde PBS, der skal indføres under bronchoalveolær skylning (BAL) væskeopsamling. Vi beskriver også metoder til 4. interkostal rumdissektion, sårlukning og prøveindsamling fra både de indfødte og transplanterede lapper.
Introduction
I over tre årtier har forskere ændret og forbedret rottelungetransplantationsmodeller, så de genererede data er mere konsistente og mere reflekterende for den faktiske kliniske tilstand. I vores laboratoriums tid med at udføre denne model har vi bestemt fire forbedringsområder: manchetteknikker til anastomoser, identifikation af modtagerens 4. interkostale rum, lungeinflation og sårlukning under modtagerens procedure og høst af prøver til analyse.
Modifikationer af manchetteknik til anastomoser kan forbedre hele transplantationsproceduren ved at forkorte håndteringstiden for donorlungen 1,2,3,4,5,6 og gøre anastomoseproceduren hurtigere og teknisk lettere for mikrokirurgen. Selvom det er afgørende at bruge manchetter i den rigtige størrelse til at levere det nødvendige blod og luftstrøm til den transplanterede lunge, er der begrænset vejledning om, hvordan man skal vælge størrelsen på manchetter til lungevenen (PV), lungearterien (PA) eller bronchus (Br) 5,7,8,9. Da diametrene på PV, PA og Br er relateret til donor- og modtagerrotternes kropsvægt, foreslår vi, at manchetstørrelsen baseres på kropsvægt. Denne rapport giver en størrelsesguide til manchetter baseret på en rottes kropsvægt (180 g til over 270 g), der tjener til at optimere blod- og lufttilførslen til den transplanterede lunge (tabel 1).
Mens en nyere mikrokirurg med succes og nemt kan skaffe en donorlunge under donorproceduren, er transplantation af lungen under modtagerens procedure mere kompliceret og afhænger af mikrokirurgens erfaring. Forsøg på at finde det 4. interkostale rum for at få adgang til modtagerens venstre lunge er et af de vanskeligere trin, der indeholder en vis subjektivitet og kan øge proceduretiden. Derfor introducerer vi en enkel og objektiv metode til at hjælpe med at identificere den 4. interkostale rumplacering ved hjælp af brystmålinger og hjertebanken for at finde den korrekte brystvæg til at dissekere 4,5,6,10,11,12.
Vi foreslår også en forbedring af donorlungeinflationen, som er en potentiel kilde til skade på organet. Donorlungen tømmes, indtil reperfusionen starter. Under suturering af det 4. interkostale rum oppustes donorlungen almindeligvis ved at øge PEEP fra 2 cmH 2 O til 6 cmH2O. For at minimere lungeskader fra overinflation foreslår vi en teknik, hvor tre 6-0 nylonsuturer placeres omkring den 4. ribben ringere end den 5. ribben med enkle dobbelte knuder. Når det er tid til sårlukning, holdes enderne af de tre suturer med hæmostater i begge hænder, såret lukkes på én gang ved at trække op på hver side, og PEEP reduceres straks til 2 cmH2O. På denne måde får lungen lov til at udvide sig i kortest mulig tid10.
Ved afslutningen af et eksperiment ønsker forskeren ofte at indsamle mange typer prøver til mange typer analyser fra hver transplantation. For eksempel kan snapfrosset væv, formalin fast væv, væv til våd-til-tørvægtsforhold for at bestemme lungeødem og bronchoalvelolær skylning (BAL) væske alle bruges til at vurdere, hvor godt transplantationen gik. Den traditionelle metode til opsamling af BAL-væske giver mulighed for en blandet poolet prøve fra både modtagerens oprindelige lobes og donorens transplanterede lap13,14,15. For at overvinde dette præsenterer vi en metode til at fastspænde hilarområderne, der kan give mere præcis indsigt i de transplanterede og indfødte lungers tilstand. Derudover er mængden af PBS, der bruges til at opsamle BAL-væske fra hver side af lungerne, vigtig at overveje, fordi BAL-væske indeholder adskillige opløselige faktorer såsom cytokiner og kemokiner, der måles ved koncentration. Normalisering af volumenet af væsken indlagt til det estimerede volumen af lungekapacitet kan hjælpe med sammenligning. Med fire lapper på højre side og en lap på venstre side har hver af rottens fem lapper et andet volumen og overfladeareal16. Ifølge en tidligere undersøgelse af volumenmåling af lungelapper af Backer et al. er volumenet af højre lobes af det samlede volumen af hele lungen 63% (4400 mm 3) og venstre lap 37% (2500 mm3). Derfor anbefaler vi, at mængden af PBS, der anvendes til opsamling af BAL-væske, beregnes som to gange tidevandsvolumen (7,2 ml/kg) ganget med 63 % for højre lunge og 37 % for venstre lunge. Ved at bruge denne tilgang kan man bedre kontrollere for variabler som kropsvægt og timing10,16.
Alt i alt vil vi i denne rapport demonstrere nogle få ændringer til den standard eksperimentelle model for rottelungetransplantation, der kan gøre proceduren mere effektiv og øge evnen til at generere mere nøjagtige og rigelige data fra hvert forsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hanrotter fra Sprague-Dawley (180-270 g kropsvægt) blev købt kommercielt (f.eks. Envigo) og blev opstaldet under patogenfrie forhold på The Ohio State University Animal Facility. Alle procedurer blev humant udført i henhold til NIH og National Research Council's Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals og med godkendelse fra Ohio State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC Protocol # 2012A00000135-R2).
1. Første opsætning
- Opsæt kirurgisk udstyr.
BEMÆRK: Dette er en ikke-overlevelsesoperation. Hvis overlevelseskirurgi skal udføres, skal sterile instrumenter og barriereforholdsregler træffes.- Tænd for puls-/iltmætningsovervågningsudstyret og opvarmningstavlen til 42 °C.
- Tænd for ventilations- og anæstesimaskinen for at forvarme isofluranfordamperen.
BEMÆRK: Brug et tidevandsvolumen (Td) på 7,2 ml / kg, et positivt ekspiratorisk tryk (PEEP) på 2 cmH2O og en respirationsfrekvens på 80 bpm. - Fyld anæstesisprøjten med 10 ml flydende isofluran og monter sprøjten på ventilations- og anæstesimaskinen.
- Tænd det kirurgiske mikroskop med højden og fokus justeret til mikrokirurgens præferencer.
- Tænd elektrokauterienheden.
- Forbered og læg kirurgiske værktøjer ud (figur 1).
BEMÆRK: Alle kirurgiske værktøjer blev autoklaveret ved 121 °C i 30 min. - Indsaml og registrer kropsvægt hos donor- og modtagerrotter.
- Brug tabel 1 og rottens kropsvægt til at bestemme den korrekte måler af angiokateter (20, 18, 16, 14 eller 12 G), der skal bruges til at fremstille manchetter.
- Forbered manchetter til lungearterien (PA), bronchus (Br) og lungevenen (PV) ved hjælp af størrelsesguiden baseret på kropsvægt (tabel 1 og figur 2).
- Anbring angiokateter i størrelsen 20 G, 18 G, 16 G, 14 G eller 12 G (figur 2A-E) på en steril overflade under operationsmikroskopet.
- Brug derefter et rib-back kirurgisk blad #11 (figur 2F) til at skære angiokateteret i en 90 ° vinkel for at danne en 2 mm i længden manchetkrop med en 1 mm X 1 mm fane (bredde x højde) øverst på manchethuset (figur 2G).
- Opbevar manchetter i sterilt saltvand, indtil de er klar til brug.
- Forbered løsninger.
- Forbered en blanding af ketamin og xylazin i et sterilt injektionshætteglas ved at tilsætte 1 ml xylazin (100 mg/ml) til 10 ml ketamin (100 mg/ml).
BEMÆRK: Udløbsdatoen for denne cocktail bestemmes ved hjælp af den tidligste udløbsdato for de anvendte komponenter. - Træk den korrekte dosis til rotterne i sprøjterne (0,1 ml ketamin/xylazin-blandingen pr. 100 g rottes kropsvægt; f.eks. for en rotte på 200 g vil der blive leveret 0,2 ml ketamin/xylazin-blanding).
BEMÆRK: Denne dosis vil levere 91 mg/kg ketamin og 9,1 mg/kg xylazin til rotten og bør holde en rotte bedøvet i 60-80 min. - Forbered heparin, som vil blive indgivet i en dosis på 1.000 E/kg.
- Opbevar saltvand, PBS og konserveringsopløsning på is (Tabel over materialer).
- Forbered en blanding af ketamin og xylazin i et sterilt injektionshætteglas ved at tilsætte 1 ml xylazin (100 mg/ml) til 10 ml ketamin (100 mg/ml).
2. Forberedelse af donorrotter
- Inducer anæstesi hos donorrotten ved intraperitonealt at injicere ketamin- og xylazinblandingen og vente ~ 10 minutter på, at der udvikles et kirurgisk anæstesiplan, der kan vurderes ved manglende respons på tåklemme.
- Barber snitområdet ved hjælp af elektroniske klippere.
- Placer donorrotten i liggende stilling på det kirurgiske opvarmningsbræt og tør snitområdet med en steril gasbind gennemblødt med betadin. Tør derefter området af med en 70% isopropylalkoholserviet. Gentag 3 gange.
- Lav et 3 til 4 cm midterlinie hudsnit midt på halsen ved hjælp af en saks og dissekere forsigtigt subkutant væv og muskler ved hjælp af tang (i stedet for saks for at undgå blødning).
- Til endotracheal intubation, tråd 4-0 silkesutur rundt om luftrøret og indsæt et 16 G angiokateter i luftrøret. Bind suturen tæt omkring luftrøret med en dobbelt knude, og afslut derefter med en enkelt knude for at holde angiokateteret på plads.
- Tilslut angiokateteret til ventilatoren og oprethold et kirurgisk anæstesiplan hos rotten med 1-2% isofluran.
- Udfør en laparo-sternotomi som en kombineret midterlinje og tværgående snit ved hjælp af en saks.
- Injicer heparin (1.000 E/kg) med en insulinsprøjte via den ringere vena cava (IVC), og lad 10 minutter gå i systemisk cirkulation.
BEMÆRK: Denne administration af heparin forhindrer blodpropper i donorlungen. - Disseker membranen omhyggeligt ved at skære langs brystbuen, og udsæt derefter brysthulen ved at følge brystbenet til nakken.
3. Donor lunge varm iskæmi og indkøb
- Aflive donorrotten ved at skære IVC.
- Mens lungerne stadig ventilerer, skæres både højre og venstre aurikler med mikrodissekerende fjedersaks og tyngdekraftsskyllelunger med 20 ml konserveringsopløsning i en sprøjte, der hænger ved 28 cmH2O ved tyngdekraften forbundet med slangen og et 18 G angiokateter, der indføres direkte gennem lungearterien.
- Afbryd ventilatoren fra endotrachealrøret og tilslut den til en 5 ml sprøjte fyldt med en passende mængde luft baseret på kropsvægt.
BEMÆRK: Luftmængde til at oppuste lungerne kan beregnes som med to gange tidevandsvolumen (Td = 7,2 ml / kg), f.eks. ville en 200 g rotte have en Td på 1,44 ml og multiplicere den med 2 ville svare til 2,88 ml luft, der er nødvendig for at pumpe lungerne op. - Oppust donorens lunger.
- Sæt en Yasargil-klemme på luftrøret for at holde lungerne oppustet, og dæk lungerne og hjertet med sterilt bomuldsgasbind. Fugt gasbindet med saltvand, pakk donorrotten med en underpude, og lad den stå på opvarmningsoperationsbrættet i 1 time for at fremkalde varm iskæmi i lungerne (figur 3).
- Efter 1 times varm iskæmi punkteres hjerte-lungeblokken med mikrodissekerende fjedersaks og tang og anbringes på sterilt gaze fugtet med iskold PBS på en steril petriskål på is.
BEMÆRK: Alle følgende trin skal forekomme, mens lungerne er på petriskålen på is. - Skær forsigtigt lungebånd med mikrodissekerende fjedersaks for at adskille venstre lunge fra spiserøret og post-kavalloben.
- Trim forsigtigt det venstre lungehilarområde med Vannas-Tübingen fjedersaks og anskaf venstre PV, PA og Br.
- Anbring manchetter på PV, PA eller Br (figur 4A-C).
- Brug en myg hemostat til at få fat i manchetfanen.
- Brug fine tang til at gribe den distale ende af PV, PA eller Br gennem den passende manchetkrop, evert det ekstra væv omkring manchetten og fastgør ved hjælp af 8-0 nylon sutur. Brug Vannas-Tübingen fjedersaks til at trimme ekstra væv og manchetten omkring manchetkroppen.
- Hold donorlungen dækket med gaze fugtet med saltvand på petriskålen på is, indtil den er klar til at blive transplanteret til modtagerrotten (figur 4D).
BEMÆRK: Gennemsnitlig kold iskæmi tid er 84 min ± 11 min S.D.
4. Tilberedning af recipientrotter
- Inducer anæstesi hos modtagerrotten på samme måde som donorrotten ved intraperitonealt at injicere ketamin- og xylazinblandingen (0,1 ml pr. 100 g rotte) og vente 10 minutter på, at der udvikles et kirurgisk anæstesiplan, der kan vurderes ved manglende respons på tåklemme.
- Barberingsområdet ved hjælp af elektroniske klippere.
- Placer donorrotten i liggende stilling og tør snitområdet af med en steril gaze gennemblødt med betadin. Tør derefter området af med en 70% isopropylalkoholserviet. Gentag 3 gange.
- Før rotten fastgøres til ventilationsmaskinen, skal du tegne linjer på rottens bryst som forberedelse til at finde det 4. interkostale rum.
- Mål brystet fra det suprasternale hak til xiphoid-processen og tegn en linje (figur 5A).
- I midten af denne linje tegner du en linje langs venstre side af brystet, der måler halvdelen af målingen fra det suprasternale hak til xiphoidprocessen (figur 5A og B).
- Intubere modtageren ved hjælp af et 16 G angiokateter via visualisering ved hjælp af det fiberoptiske kabel, der er forbundet til et LED-lys fra endotracheal intubationssættet.
- Tilslut angiokateteret til ventilatoren og oprethold et kirurgisk anæstesiplan med 1-2% isofluran.
- For at finde det 4. interkostale rum skal du finde det område af brystvæggen, hvor en stærk håndgribelig hjerteimpuls kan mærkes (figur 5C, rød cirkel).
- På dette sted skal du skære huden med en saks og musklen med mikrodissekerende fjedersaks og bruge retraktoren til at åbne det 4. interkostale rum så bredt som muligt (figur 5D og E).
BEMÆRK: Brug elektrisk cautery for at undgå eller stoppe blødning under muskeldissektionen. - Når det interkostale rum er åbnet bredt, skal du forsigtigt dissekere ledbåndene omkring modtagerens venstre lunge ved hjælp af Vannas-Tübingen fjedersaks og trække lungen ud af brystområdet ved hjælp af sterile vatpinde og tang.
- Placer sterilt gaze omkring venstre lunge og hold det med en Dieffenbach bulldog klemme.
- Påfør en Yasargil-klemme på venstre lungehilarområde så tæt som muligt.
5. Anastomoser
- Lungevene (PV) anastomose
- Placer 7-0 nylonsutur omkring modtagerens PV.
- Skær modtagerens PV ved hjælp af Vannas-Tübingen fjedersaks ved tværgående at skære de øvre og nedre segmentale vener så distalt som muligt og skyl blod ud med 0,2 ml hepariniseret saltvand (1 E / ml) ved hjælp af en insulinsprøjte.
- Placer donorlungen stadig indpakket med iskold våd steril gasbind i brysthulen.
- Indsæt donorens manchette-PV i modtagerens PV, og fastgør derefter med den forudplacerede 7-0 nylonsutur (figur 6).
- Bronkial (Br) anastomose
- Placer 7-0 nylonsutur omkring modtagerens Br.
- Skær modtagerens Br ved at klippe de øvre og nedre segmentale luftveje på tværs så distalt som muligt med Vannas-Tübingen fjedersaks.
- Indsæt donorens manchetter Br i modtagerens Br og fastgør med den præpositionerede 7-0 nylonsutur (figur 6).
- Lungearterie (PA) anastomose:
- Placer 7-0 nylonsutur omkring modtagerens PA.
- Skær modtagerens PA fra dens utilsigtede kappe, skær halvdelen af fartøjets omkreds med Vannas-Tübingen fjedersaks, og skyl derefter blod ud i PA med 0,2 ml hepariniseret saltvand (1 U / ml) ved hjælp af en insulinsprøjte.
- Indsæt donorens manchetterede PA i modtagerens PA og fastgør med den præpositionerede 7-0 nylonsutur (figur 6).
6. Reperfusion
- Fjern Yasargil-klemmen på hilum for at muliggøre reperfusion og ventilation af den transplanterede donorlunge (figur 7).
- Dissekere modtagerens oprindelige venstre lunge ved hjælp af mikrodissekerende fjedersaks og pincet.
- Flyt forsigtigt den transplanterede venstre lunge i modtagerens thorax.
- Luk thoracotomi snittet ved hjælp af 6-0 nylon sutur.
- Placer tre 6-0 nylonsuturer med enkle dobbelte knuder omkring ribbenene, der er bedre end det 4. ribben og ringere end det 5. ribben (figur 8A).
- Brug hæmostater til at samle de tre suturer sammen (figur 8B).
- Forøg PEEP til 6 cmH2O i ventilationsindstillingerne.
- Bind alle tre knuder sammen på samme tid ved at trække væk for at lukke såret (figur 8C).
- Sænk PEEP til 2 cmH2O med det samme.
- Luk huden med 6-0 nylonsutur.
OBS: Vores laboratorium undersøger den akutte fase efter transplantation, så modtagerrotten i denne model overleves i 3 timer efter transplantation under ventilation og anæstesi, hvorefter der indsamles prøver.
7. Indsamling af eksperimentelle prøver (plasma, lungevæv)
- For kontrolprøver indsamles donorens højre lobes efter 3 timers reperfusionsperiode er indledt.
- Snap-frys den overlegne lap og post-caval lap til protein- eller RNA-ekspressionsanalyser, bevar den midterste lap til histologi, og brug den ringere lap til våd-til-tørvægt-forhold (figur 9A).
- 10 minutter før afslutningen af 3 timers reperfusionstid skal du forberede høsten af modtagerprøverne ved at injicere heparin (1.000 E/kg) med en insulinsprøjte i halsvenen.
BEMÆRK: Denne administration af heparin forhindrer blodpropper i lungerne og giver mulighed for en mere grundig skylning på tidspunktet for indkøb. - Plasma indsamling
- Ved afslutningen af 3 timers reperfusionsperioden indsamles 1 ml blod med en sprøjte via IVC.
- Opbevares på is og centrifugeres derefter ved 2.000 x g i 10 minutter for at høste plasma.
- Aflive modtagerrotten ved at skære IVC for at muliggøre ekssanguination.
- Disseker membranen langs brystbuen og udsæt brysthulen ved at dissekere ribbenburet.
- Opsaml BAL-væske fra de indfødte eller transplanterede lunger, hvis det ønskes (valgfrit).
BEMÆRK: Hvis våd-til-tør vægtforhold eller histologi udføres på lungen, bør BAL-væskeopsamling ikke udføres, da det kan påvirke resultaterne.- Tråd 4-0 silkesutur omkring luftrøret og bind en stram dobbeltknude omkring luftrøret og intubationsrøret for at forhindre væskelækage.
- Beregn mængden af iskold PBS til BAL-væskeopsamling fra højre lobes og venstre lap.
BEMÆRK: Volumenforholdet for højre lunge er 63%, mens volumenforholdet for venstre lunge er 37%16. For at bestemme mængden af PBS, der skal indføres i hver side, skal volumenet derfor beregnes som to gange tidevandsvolumenet (Td = 7,2 ml / kg) ganget med 63% for højre lunge og 37% for venstre lunge. - Anbring en Yasargil-klemme på venstre lungehilarområde (figur 10A), og indfør den beregnede mængde iskold PBS i højre lunge (modtagerens oprindelige lapper) med en sprøjte forbundet til angiokateteret, og opsaml BAL-væsken ved at trække forsigtigt op i sprøjtestemplet. Udfør to gange.
BEMÆRK: Man skal forvente 70-80% genvinding af indpodet væske. - Fjern Yasargil-klemmen på venstre lunge, og placer klemmen på højre lungehilarområde (figur 10B).
- Opsaml BAL-væske fra transplanteret venstre lap på samme måde som den blev opsamlet til højre lobes, og fjern derefter klemmen på højre lungehilarområde.
- Højre og venstre aurikler klippes med mikrodissekerende fjedersaks, og lungerne skylles efter tyngdekraften gennem PA ved hjælp af et 18 G angiokateter fastgjort til slangen og en sprøjte med 20 ml forkølet konserveringsopløsning, der hænger ved 28 cmH2O.
- Saml prøver fra modtagerens lunge.
- Snap-frys den overlegne lap og post-caval lap til protein- eller RNA-ekspressionsanalyser, bevar den midterste lap til histologi, og brug den ringere lap til våd-til-tørvægt-forhold) (figur 9A).
- Opdel den venstre transplanterede venstre lap i tre dele: den øvre region indsamlet til snapfrossen, den midterste region til histologi og den nedre region til våd-til-tørvægtsforhold (figur 9B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at måle lungeødem blev forholdet mellem våd og tør vægt beregnet. Donorens oprindelige lap, den transplanterede lap og modtagerens oprindelige lap blev indsamlet som beskrevet i protokollen og vejede straks for vådvægt, tørrede ved 60 °C i 48 timer og vejede derefter igen for tørvægten. Et øget våd-til-tørvægt-forhold ville være tegn på lungeødem. Vores resultater indikerer, at den transplanterede lap havde en signifikant stigning i våd-til-tørvægt-forhold sammenlignet med donorens eller modtagerens oprindelige lap (p = 0,0050, n = 6 / gruppe; Figur 11).
| Angiokateterstørrelse til manchetter | |||
| Rottens kropsvægt (g) | PA | Br | PV |
| 180-200 | 20 g | 18 g | 16 g |
| 200-230 | 18 g | 16 g | 14 g |
| 230-250 | 18 g | 14 g | 14 g |
| 250-270 | 18 g | 14 g | 12 - 14 G |
| Over 270 | 16 g | 14 g | 12 g |
Tabel 1. Størrelsesguide til manchetter. Størrelsen af lungearterien (PA), bronchus (Br) eller lungevenen (PV) er relateret til kropsvægt. Afhængigt af kropsvægten og hvilken type manchet du laver, gives den anbefalede angiokateterstørrelse.
Figur 1. Kirurgiske værktøjer. (A) Fin saks, (B) tang, (C-E) mikrokirurgisk tang, (F) Dumont #5 fine tang, (G) Vannas-Tübingen fjedersaks og Castroviejo mikrodissekerende saks, (H) Halsted-myg hæmostat, (J) retraktor, (K) Yasargil klemmer, (L) Dieffenbach bulldog klemme, (M) buede hæmostater og (N) Yasargil klemmeapplikator. Alle værktøjer skal autoklaveres ved 121 °C i 30 min. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Manchetforberedelse med forskellige størrelser angiokateter og rib-back kirurgisk blad #11. Størrelsen af det angiokateter, der vælges til manchetten, bestemmes af manchetstørrelsesguiden (tabel 1), der tager højde for rottens kropsvægt, og om manchetten er til lungearterien (PA), bronchus (Br) eller lungevenen (PV). Angiokatetrene (A) 20 G, (B) 18 G, (C) 16 G, (D) 14 G eller (E) 12 G skæres med et (F) rib-back kirurgisk blad #11 som beskrevet i protokollen og opbevares i saltvand, indtil det er nødvendigt. (G) Manchetens kropslængde er 2 mm, og en 1 mm X 1 mm flig (bredde x højde) er tilbage øverst på manchetkroppen til håndtering af manchetkroppen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Varm iskæmi. Lungerne skylles med konserveringsopløsningen gennem lungearterien, pustes op med to gange tidevandsvolumen af luft og pakkes derefter med en underpude og opbevares på operationsopvarmningsbrættet for at holde rotten ved normal kropstemperatur i 1 time. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Manchettering af donor lunge PV, PA og Br. (A) Lungevene, PV (B) lungearterie, PA eller (C) bronchus, Br, indsættes gennem en manchet af korrekt størrelse, everted, sikret med 8-0 nylonsutur, og (D) derefter opbevaret på sterilt gaze fugtet med iskold saltvand på en steril petriskål på is. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5. Måling og dissekering i det 4. interkostale rum. (A) Modtagerrotten lægges på ryggen, og brystet måles fra det suprasternale hak til xiphoid-processen, og der trækkes en linje. (B) I midten af denne linje trækkes en anden linje til venstre side i halvdelen af længden. (C) På denne linje skal mikrokirurgen føle for et område, hvor hjerteimpulsen er stærkest for at sikre den korrekte placering af det 4. interkostale rum (rød cirkel). (D) Hud og muskler dissekeres derefter med en fin saks. (E) Retractoren bruges derefter til at åbne rummet bredt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6. Anastomose. Donorens manchetter (A) PV (B) Br eller (C) PA indsættes i modtagerens PV, Br eller PA, og fastgøres derefter med 7-0 nylonsutur. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7. Reperfusion. Når anastomoserne er færdige, kan reperfusion startes ved at fjerne klemmen, og modtagerrotten overleves i 3 timer under ventilation og anæstesi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8. Sårlukning. (A) Tre 6-0 nylonsuturer med enkle dobbelte knuder placeres omkring ribbenene, der er bedre end det 4. ribben og ringere end det 5. ribben. (B) Brug hæmostater i begge hænder til at samle de tre suturer sammen og øge PEEP til 6 cmH2O i ventilationsindstillingerne. (C) Bind alle tre knuder sammen på samme tid ved at trække op og væk for at lukke såret, reducer PEEP til 2 cmH2O med det samme og luk huden med 6-0 nylonsutur. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9. Lungevæv samling. (A) For donorens eller modtagerens oprindelige lapper kan den overlegne lap og post-kavallap snapfryses til protein- eller RNA-ekspressionsanalyser, den midterste lap kan bevares til histologi, og den ringere lap kan bruges til våd-til-tørvægt-forhold. (B) For den transplanterede lap indsamles den øvre region for snapfrossen, den midterste region for histologi eller den nedre region for våd-til-tørvægt-forholdet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10. Påføring af klemmen til selektiv BAL-væskeopsamling. For at undgå en samlet prøve kan BAL-væske opsamles fra enten højre (native) eller venstre (transplanteret) lunge. (A) Det venstre lungehilarområde kan fastspændes for at opsamle BAL-væske fra højre lapper. (B) Det højre lungehilarområde kan fastspændes for at opsamle BAL-væske fra venstre lap. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 11. Våd-til-tør vægtforhold. Våd-til-tør vægtforhold blev beregnet til at måle lungeødem og kan bruges til at indikere, hvor godt transplantationen gik. Donorens oprindelige lap, den transplanterede lap eller modtagerens oprindelige lap blev indsamlet som beskrevet i protokollen og vejede straks for vådvægt, tørrede ved 60 °C i 48 timer og vejede derefter igen for tørvægten. Der blev taget et forhold mellem vådvægt og tørvægt. Forholdet for den transplanterede lap blev signifikant øget sammenlignet med donorens eller modtagerens oprindelige lapper. n = 6 rotter / gruppe og søjler repræsenterer gennemsnit ± SD. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af ANOVA med Tukeys post-hoc analyse. ** s<0.01. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne rapport har vi grebet ind på flere kritiske trin i en rottelungetransplantationsprotokol for at optimere proceduren. Mens forskellige manchetteknikker til rottelungetransplantation er blevet rapporteret 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15, kan processen stadig være subjektiv og svær for mikrokirurger at anvende. Vi har lagt vægt på, at den korrekte størrelse manchetter til PV og PA til at give blod eller Br til at give luft ind i den transplanterede lunge skal bruges, og vi har givet en mere objektiv måde at bestemme optimal manchetstørrelse baseret på rottens kropsvægt. For mere konsekvent at fremkalde varm iskæmi i lungerne har vi givet anbefalinger om lungeinflation, fastspænding og hvordan man holder rotten varm i løbet af den 1 time varme iskæmitid. Under modtagerens procedure kan det være svært at finde det 4. interkostale rum. Vi har anbefalet, at man mere præcist kan lokalisere denne position ved at anvende en metode til måling og følelse af hjerteimpuls. På tidspunktet for reperfusion, for bedre at lukke såret, viste vi også en teknik til håndtering af suturer og justering af PEEP, der hurtigere kan lukke såret og forhindre overinflation og lungeskade. Endelig har vi præsenteret strategier for vævs- og BAL-væskeopsamling, der giver mulighed for en mere objektiv høst af prøver, der kan sammenlignes på tværs af eksperimenter og forskellige kropsvægte.
Den væsentligste begrænsning af de beskrevne teknikker er den ret stejle indlæringskurve for transplantationsoperationen generelt. Læringskurven er en, der kan reduceres med konsekvent kirurgisk praksis og fra gennemgang af fejlfindingsteknikker i litteraturen. En anden begrænsning er, at denne model studerer den akutte fase af IRI og transplantation, hvor biokemiske ændringer først forekommer, hvilket er fokus for vores laboratorium. Fremtidige undersøgelser bør teste bronkial og vaskulær patency på længere tidslinjer efter transplantation.
Samlet set er en levedygtig lille dyretransplantationsmodel afgørende for evaluering af terapeutiske interventioner til transplantation og iskæmi-reperfusionsskade (IRI). Især rottelungetransplantationsmodellen er nyttig som supplement til at studere ex vivo lungeperfusion (EVLP) hos små dyr17. Det er også et mere levedygtigt alternativ til murine lungetransplantation, fordi den større anatomiske størrelse gør det muligt for forskeren at få tilstrækkeligt væv til mere dybtgående analyser18. Derudover er modellen afgørende for at bestemme levedygtigheden af donorlungetransplantater efter terapeutisk intervention med nye små molekyler og proteinterapi 19,20,21,22 enten til donoren, til donororganet gennem EVLP 17 eller til modtageren og giver en stærk mulighed for at indsamle in vivo-data. De optimeringer, som vi beskriver i denne rapport, er vigtige for mikrokirurger, der sigter mod at mindske deres indlæringskurve og fjerne en vis subjektivitet. Ved at bruge en standardiseret algoritme til størrelse på lungemanchetter kan den kirurgiske tilgang strømlines og være mere objektiv. Ved afslutningen af transplantationsreperfusionsperioden giver den beskrevne strukturerede tilgang til BAL-væske- og vævsindsamling også ansvarlig brug af dyr og effektiv brug af mikrokirurgens tid ved at maksimere virkningen af data indsamlet pr. Forsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
BAW, YGL og JLK støttes gennem National Institutes of Health (NIH) tilskud R01HL143000. BAW støttes gennem Department of Defense (DOD) tilskud W81XWH1810787. SMB er støttet gennem NIH bevilling R01DK123475. JM støttes gennem NIH-tilskud AR061385, AR070752, DK106394 og AG056919 samt af DOD-bevilling W81XWH-18-1-0787.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Gauge angio-catheter | BD | 382277 | |
| 14 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251717-02 | |
| 16 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252586-02 | |
| 18 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251679-02 | |
| 20 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252527-02 | |
| 4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| 6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
| 7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
| 8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
| Betadine Spray | Avrio Health L.P | UPC 367618160039 | |
| Clippers | VWR | MSPP-023326 | |
| Castroviejo micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5668 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Electrocautery | Macan | MV-7A | |
| Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Halsted-mosquito hemostat | Roboz Surgical Instrument Co | RS-7112 | |
| Heparin | Fresnius Medical Care | C504701 | |
| Insulin syringe | Life Technologies | B328446 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropyl Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| Ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
| Dieffenbach Bulldog Clamp | World Precision Instruments | WPI14117 | |
| Needle holder/Forceps, Curved | Micrins | MI1542 | |
| Needle holder/Forceps, Straight | Micrins | MI1540 | |
| Perfadex Plus (Organ Preservation Solution) | XVIVO Perfusion AB | REF# 19950 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | Used to check SpO2 and heartbeat |
| Retractor | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6560 | |
| Saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Syringe 5mL | BD | 309646 | |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT351T | Used to clamp bronchus |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT261T | Used to clamp hilum |
| Yasargil Clamp Applicator | Aesculap, Inc | FT484T |
References
- Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 97 (4), 578-581 (1989).
- Zhai, W., et al. Simplified rat lung transplantation by using a modified cuff technique. Journal of Investigative Surgery. 21 (1), 33-37 (2008).
- Goto, T., et al. Simplified rat lung transplantation using a new cuff technique. Annals of Thoracic Surgery. 93 (6), 2078-2080 (2012).
- Guo, H., et al. Improvements of surgical techniques in a rat model of an orthotopic single lung transplant. European Journal of Medical Research. 18, 1 (2013).
- Tian, D., Shiiya, H., Sato, M., Nakajima, J. Rat lung transplantation model: modifications of the cuff technique. Annals of Translational Medicine. 8 (6), 407 (2020).
- Rajab, T. K. Anastomotic techniques for rat lung transplantation. World Journal of Transplantation. 8 (2), 38-43 (2018).
- Reis, A., Giaid, A., Serrick, C., Shennib, H. Improved outcome of rat lung transplantation with modification of the nonsuture external cuff technique. Journal of Heart and Lung Transplantation. 14 (2), 274-279 (1995).
- Sugimoto, R., et al. Experimental orthotopic lung transplantation model in rats with cold storage. Surgery Today. 39 (7), 641-645 (2009).
- Santana Rodriguez, N., et al. Technical modifications of the orthotopic lung transplantation model in rats with brain-dead donors. Archivos de Bronconeumología. 47 (10), 488-494 (2011).
- Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade. Journal of Surgical Research. 194 (2), 659-666 (2015).
- Rajab, T. K. Techniques for lung transplantation in the rat. Experimental Lung Research. 45 (9-10), 267-274 (2019).
- Iskender, I., et al. Effects of Warm Versus Cold Ischemic Donor Lung Preservation on the Underlying Mechanisms of Injuries During Ischemia and Reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
- Lin, X., et al. Five-year update on the mouse model of orthotopic lung transplantation: Scientific uses, tricks of the trade, and tips for success. Journal of Thoracic Disease. 4 (3), 247-258 (2012).
- Song, J. A., et al. Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats. Toxicological Research. 26 (3), 203-208 (2010).
- Chang, J. E., Kim, H. J., Yi, E., Jheon, S., Kim, K. Reduction of ischemia-reperfusion injury in a rat lung transplantation model by low-concentration GV1001. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (5), 972-979 (2016).
- De Backer, J. W., et al. Study of the variability in upper and lower airway morphology in Sprague-Dawley rats using modern micro-CT scan-based segmentation techniques. Anatomical Record. 292 (5), Hoboken. 720-727 (2009).
- Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), e52309 (2015).
- Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. Journal of Visualized Experiments. (65), e3947 (2012).
- Jia, Y., et al. Treatment of acute lung injury by targeting MG53-mediated cell membrane repair. Nature Communications. 5, 4387 (2014).
- Kim, J. L., et al. Pegylated-Catalase Is Protective in Lung Ischemic Injury and Oxidative Stress. Annals of Thoracic Surgery. , (2020).
- Beal, E. W., et al. D-Ala(2), D-Leu(5)] Enkephalin Improves Liver Preservation During Normothermic Ex Vivo Perfusion. Journal of Surgical Research. 241 (2), 323-335 (2019).
- Akateh, C., et al. Intrahepatic Delivery of Pegylated Catalase Is Protective in a Rat Ischemia/Reperfusion Injury Model. Journal of Surgical Research. 238, 152-163 (2019).
