Summary
Aqui, apresentamos otimizações para um modelo de transplante de pulmão de rato que servem para melhorar os resultados. Fornecemos um guia de tamanho para manguitos com base no peso corporal, uma estratégia de medida para determinar o4º espaço intercostal, métodos de fechamento de feridas e coleta de líquido e tecido de LBA (lavado broncoalveolar).
Abstract
A partir de nossa experiência com transplante de pulmão de ratos, encontramos várias áreas para melhoria. As informações existentes sobre os métodos de escolha dos tamanhos adequados dos manguitos para a veia pulmonar (VP), artéria pulmonar (AP) ou brônquio (Br) são variadas, tornando a determinação do tamanho adequado do manguito durante o transplante pulmonar de ratos um exercício de tentativa e erro. Ao padronizar a técnica de cuffing para usar o menor manguito efetivo apropriado para o tamanho do vaso ou brônquio, pode-se tornar o procedimento de transplante mais seguro, rápido e bem-sucedido. Como os diâmetros das VP, PA e Br estão relacionados com o peso corporal do rato, apresentamos uma estratégia para a escolha de um tamanho adequado usando um guia baseado no peso. Como o volume pulmonar também está relacionado ao peso corporal, recomendamos que essa relação também seja considerada na escolha do volume de ar adequado para a insuflação pulmonar do doador durante a isquemia quente, bem como para o volume adequado de EEP a ser instilado durante a coleta de líquido no lavado broncoalveolar (LBA). Descrevemos também os métodos de dissecção do4º espaço intercostal, fechamento de feridas e coleta de amostras dos lobos nativos e transplantados.
Introduction
Há mais de três décadas, pesquisadores vêm modificando e aprimorando modelos de transplante pulmonar de ratos para que os dados gerados sejam mais consistentes e reflitam a real condição clínica. No tempo em que nosso laboratório executou esse modelo, determinamos quatro áreas de melhoria: técnicas de cuffing para anastomoses, identificação do4º espaço intercostal do receptor, insuflação pulmonar e fechamento da ferida durante o procedimento do receptor e coleta de amostras para análise.
Modificações na técnica de cuffing para anastomoses podem melhorar todo o procedimento de transplante, encurtando o tempo de manuseio do pulmão doador 1,2,3,4,5,6 e tornando o procedimento de anastomose mais rápido e tecnicamente fácil para o microcirurgião. Embora seja fundamental o uso de manguitos de tamanho adequado para fornecer o sangue e o fluxo aéreo necessários para o pulmão transplantado, há orientações limitadas sobre como se deve escolher o tamanho dos manguitos para a veia pulmonar (VP), artéria pulmonar (AP) ou brônquio (Br)5,7,8,9. Como os diâmetros das VVPP, PA e Br estão relacionados com o peso corporal dos ratos doadores e receptores, propomos que o tamanho do manguito seja baseado no peso corporal. Este relatório fornece um guia de tamanho para manguitos com base no peso corporal de um rato (180 g a mais de 270 g) que serve para otimizar o suprimento de sangue e ar para o pulmão transplantado (Tabela 1).
Enquanto um microcirurgião mais novo pode obter com sucesso e facilidade um pulmão doado durante o procedimento do doador, transplantar o pulmão durante o procedimento do receptor é mais complicado e depende da experiência do microcirurgião. A tentativa de encontrar o4º espaço intercostal para acessar o pulmão esquerdo do receptor é uma das etapas mais difíceis, que guarda alguma subjetividade e pode aumentar o tempo de procedimento. Portanto, introduzimos um método simples e objetivo para auxiliar na identificação da localização do4º espaço intercostal, utilizando medidas do tórax e das palpitações do coração para encontrar a área correta da parede torácica a ser dissecada4,5,6,10,11,12.
Propomos também uma melhora na insuflação pulmonar do doador, que é uma fonte potencial de lesão do órgão. O pulmão doador é desinsuflado até o início da reperfusão. Durante a sutura do4º espaço intercostal, o pulmão doador é comumente insuflado pelo aumento da PEEP de 2 cmH 2O para 6 cmH2O. A fim de minimizar a lesão pulmonar por hiperinsuflação, propomos uma técnica em que três pontos de náilon 6-0 são colocados ao redor da 4ª costela inferior à5ª costela com nós duplos simples. Na hora do fechamento da ferida, as extremidades das três suturas são mantidas com hemostáticos em ambas as mãos, a ferida é fechada de uma só vez puxando para cima de cada lado e a PEEP é imediatamente reduzida para 2 cmH2O. Dessa forma, permite-se que o pulmão se expanda pelo menor tempo possível10.
Na conclusão de um experimento, o pesquisador muitas vezes quer coletar muitos tipos de amostras para muitos tipos de análise de cada transplante. Por exemplo, tecido congelado instantâneo, tecido fixado em formalina, relação entre o peso úmido e seco para determinar o edema pulmonar e o líquido de lavagem broncoalvelolar (LBA) podem ser usados para avaliar o quão bem o transplante foi. O método tradicional de coleta de LBA permite uma amostra mista agrupada dos lobos nativos do receptor e do lobo transplantado do doador13,14,15. Para superar isso, apresentamos um método de clampeamento das áreas hilares que pode fornecer informações mais precisas sobre a condição dos pulmões transplantados e nativos. Além disso, o volume de PBS usado para coletar líquido de LBA de cada lado dos pulmões é importante considerar, pois o líquido de LBA contém inúmeros fatores solúveis, como citocinas e quimiocinas, que são medidos por concentração. A normalização do volume do líquido instilado para o volume estimado da capacidade pulmonar pode ajudar na comparação. Com quatro lóbulos no lado direito e um lobo no lado esquerdo, cada um dos cinco lobos do rato tem um volume e área de superfície diferentes16. De acordo com estudo prévio de Backer et al., de acordo com estudo prévio de Backer et al., do volume total de todo o pulmão o volume dos lobos direitos é de 63% (4400 mm 3) e o lobo esquerdo é de 37% (2500 mm3). Portanto, recomendamos que o volume de EEP utilizado para coletar líquido de LBA seja calculado como o dobro do volume corrente (7,2 mL/kg) multiplicado por 63% para o pulmão direito e 37% para o pulmão esquerdo. Com essa abordagem, pode-se controlar melhor variáveis como peso corporal e tempo10,16.
Ao todo, neste relato demonstraremos algumas modificações no modelo experimental padrão de transplante pulmonar de ratos que podem tornar o procedimento mais eficiente e aumentar a capacidade de gerar dados mais precisos e abundantes de cada experimento.
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Protocol
Ratos machos da raça Sprague-Dawley (180-270 g de peso corporal) foram comprados comercialmente (por exemplo, Envigo) e alojados em condições livres de patógenos no The Ohio State University Animal Facility. Todos os procedimentos foram realizados humanamente de acordo com o NIH e o National Research Council's Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals e com a aprovação do The Ohio State University Institutional Animal Care and Use Committee (Protocolo IACUC # 2012A00000135-R2).
1. Configuração inicial
- Configurar dispositivos cirúrgicos.
NOTA: Esta é uma cirurgia de não-sobrevivência. Para que a cirurgia de sobrevivência seja realizada, instrumentos estéreis e precauções de barreira precisariam ser tomadas.- Ligue o equipamento de monitorização da frequência cardíaca/saturação de oxigénio e a placa de aquecimento a 42 °C.
- Ligue a máquina de ventilação e anestesia para pré-aquecer o evaporador de isoflurano.
OBS: Utilizar volume corrente (Td) de 7,2 mL/kg, pressão expiratória final positiva (PEEP) de 2 cmH2O e frequência respiratória de 80 bpm. - Encha a seringa de anestesia com 10 mL de isoflurano líquido e monte a seringa no aparelho de ventilação e anestesia.
- Ligue o microscópio cirúrgico com a altura e o foco ajustados de acordo com as preferências do microcirurgião.
- Ligue o aparelho de eletrocautério.
- Preparar e dispor as ferramentas cirúrgicas (Figura 1).
OBS: Todos os instrumentais cirúrgicos foram autoclavados a 121 °C por 30 min. - Coletar e registrar o peso corporal de ratos doadores e receptores.
- Use a Tabela 1 e o peso corporal do rato para determinar o calibre correto do cateter angio (20, 18, 16, 14 ou 12 G) a ser usado para fazer manguitos.
- Preparar manguitos para artéria pulmonar (AP), brônquio (Br) e veia pulmonar (VP) usando o guia de tamanho baseado no peso corporal (Tabela 1 e Figura 2).
- Coloque cateter angio-cateter de 20 G, 18 G, 16 G, 14 G ou 12 G (Figura 2A-E) em uma superfície estéril sob o microscópio cirúrgico.
- Em seguida, use uma lâmina cirúrgica costúxula #11 (Figura 2F) para cortar o cateter angio em um ângulo de 90° para formar um corpo de manguito de 2 mm de comprimento com uma aba de 1 mm X 1 mm (largura x altura) na parte superior do corpo do manguito (Figura 2G).
- Guarde os manguitos em soro fisiológico estéril até estar pronto para uso.
- Preparar soluções.
- Preparar uma mistura de cetamina e xilazina num frasco para injetáveis estéril adicionando 1 ml de xilazina (100 mg/ml) a 10 ml de cetamina (100 mg/ml).
NOTA: A data de validade para este cocktail é determinada utilizando a data de validade mais antiga dos componentes utilizados. - Introduzir nas seringas a dosagem adequada para os ratos (0,1 ml da mistura de cetamina/xilazina por 100 g de peso corporal do rato; por exemplo, para um rato de 200 g, seriam administrados 0,2 ml da mistura de cetamina/xilazina).
NOTA: Esta dosagem irá fornecer 91 mg/kg de cetamina e 9,1 mg/kg de xilazina para o rato e deve manter um rato sedado por 60-80 min. - Preparar heparina que será administrada na dose de 1.000 U/kg.
- Armazenar o soro fisiológico, PBS e solução de preservação no gelo (Tabela de Materiais).
- Preparar uma mistura de cetamina e xilazina num frasco para injetáveis estéril adicionando 1 ml de xilazina (100 mg/ml) a 10 ml de cetamina (100 mg/ml).
2. Preparo do rato doador
- Induzir anestesia no rato doador injetando intraperitonealmente a mistura de cetamina e xilazina e aguardando ~10 min para que um plano cirúrgico de anestesia se desenvolva que pode ser avaliado pela falta de resposta ao pinçamento dos dedos.
- Faça a barba na área da incisão com cortadores eletrônicos.
- Coloque o rato doador em decúbito dorsal na prancha de aquecimento cirúrgico e limpe a área da incisão com uma gaze estéril embebida com betadina. Em seguida, limpe a área com um cotonete de álcool isopropílico 70%. Repita 3 vezes.
- Faça uma incisão de 3 a 4 cm na linha média da pele no meio do pescoço usando tesoura e disseque cuidadosamente os tecidos subcutâneos e músculos usando pinça (em vez de tesoura para evitar sangramento).
- Para intubação endotraqueal, fio de seda 4-0 ao redor da traqueia e inserir um cateter angiocateter 16G na traqueia. Amarre a sutura ao redor da traqueia firmemente com um nó duplo e, em seguida, termine com um único nó para manter o cateter angio no lugar.
- Conectar o cateter angio ao ventilador e manter um plano cirúrgico de anestesia no rato com 1-2% de isoflurano.
- Realizar uma laparoesternotomia como uma incisão combinada de linha média e transversal usando tesoura.
- Injetar heparina (1.000 U/kg) com uma seringa de insulina através da veia cava inferior (VCI) e permitir 10 minutos para circulação sistêmica.
NOTA: Esta administração de heparina previne coágulos sanguíneos no pulmão do doador. - Disseque o diafragma cuidadosamente cortando ao longo do arco torácico e, em seguida, exponha a cavidade torácica seguindo o esterno até o pescoço.
3. Isquemia e captação de calor no pulmão do doador
- Eutanasiar o rato doador cortando a VCI.
- Enquanto os pulmões ainda estiverem ventilando, corte as aurículas direita e esquerda com uma tesoura de mola microdissecante e lave os pulmões por gravidade com 20 mL de solução de preservação em uma seringa pendurada a 28 cmH2O por gravidade conectada à tubulação e um cateter angiocateter 18G que é introduzido diretamente pela artéria pulmonar.
- Desconecte o ventilador do tubo endotraqueal e conecte-o a uma seringa de 5 mL preenchida com um volume adequado de ar com base no peso corporal.
NOTA: O volume de ar para inflar os pulmões pode ser calculado como com o dobro do volume corrente (Td = 7,2 mL/kg), por exemplo, um rato de 200 g teria um Td de 1,44 mL e multiplicá-lo por 2 equivaleria a 2,88 mL de ar necessário para inflar os pulmões. - Inflar os pulmões do doador.
- Coloque uma pinça de Yasargil na traqueia para manter os pulmões inflados e cubra os pulmões e o coração com gaze de algodão estéril. Hidratar a gaze com soro fisiológico, envolver o rato doador com uma compressa inferior e deixar na prancha de aquecimento por 1 h para induzir isquemia quente nos pulmões (Figura 3).
- Após 1 h de isquemia quente, excisar o bloco coração-pulmão com tesoura e pinça de mola microdissecante e colocar em gaze estéril umedecida com PBS gelado em uma placa de Petri estéril sobre gelo.
NOTA: Todas as etapas a seguir devem ocorrer enquanto os pulmões estão na placa de Petri no gelo. - Incisar cuidadosamente os ligamentos pulmonares com tesoura de mola microdissecante para separar o pulmão esquerdo do esôfago e do lobo pós-cava.
- Corte cuidadosamente a área hilar do pulmão esquerdo com tesoura de mola Vannas-Tübingen e obtenha o PV, PA e Br. esquerdos.
- Coloque manguitos em PV, PA ou Br (Figura 4A-C).
- Use um hemostático de mosquito para pegar a guia do manguito.
- Use pinças finas para agarrar a extremidade distal do PV, PA ou Br através do corpo apropriado do manguito, evert o tecido extra ao redor do manguito e fixar usando 8-0 sutura em náilon. Use a tesoura de mola Vannas-Tubingen para aparar o tecido extra e o manguito ao redor do corpo do manguito.
- Manter o pulmão do doador coberto com gaze umedecida com soro fisiológico sobre a placa de Petri sobre gelo até que esteja pronto para ser transplantado no rato receptor (Figura 4D).
NOTA: O tempo médio de isquemia fria é de 84 min ± 11 min S.D.
4. Preparação do rato receptor
- Induzir anestesia no rato receptor da mesma forma que o rato doador, injetando intraperitonealmente a mistura de quetamina e xilazina (0,1 mL por 100 g de rato) e aguardando 10 minutos para que um plano cirúrgico de anestesia se desenvolva que pode ser avaliado pela falta de resposta ao pinçamento dos dedos.
- Raspar a área da incisão usando cortadores eletrônicos.
- Coloque o rato doador em decúbito dorsal e limpe a área da incisão com uma gaze estéril embebida com betadina. Em seguida, limpe a área com um cotonete de álcool isopropílico 70%. Repita 3 vezes.
- Antes de o rato ser preso à máquina de ventilação, desenhe linhas no tórax do rato em preparação para encontrar o4º espaço intercostal.
- Medir o tórax desde a incisura esternal até o processo xifoide e traçar uma linha (Figura 5A).
- No meio dessa linha, traçar uma linha ao longo do lado esquerdo do tórax que mede metade da medida desde a incisura esternal até o processo xifoide (Figuras 5A e B).
- Intubar o receptor com um cateter angiocateter 16G via visualização usando o cabo de fibra óptica conectado a uma luz LED do kit de intubação endotraqueal.
- Conectar o cateter angio ao ventilador e manter um plano cirúrgico de anestesia com isoflurano a 1-2%.
- Para encontrar o4º espaço intercostal, localize a área da parede torácica onde um forte impulso cardíaco palpável pode ser sentido (Figura 5C, círculo vermelho).
- Nesse local, incisar a pele com tesoura e o músculo com uma tesoura de mola microdissecante e utilizar o afastador para abrir o4º espaço intercostal o mais amplamente possível (Figura 5D e E).
OBS: Use cautério elétrico para evitar ou parar o sangramento durante a dissecção muscular. - Uma vez que o espaço intercostal é aberto amplamente, disseque cuidadosamente os ligamentos ao redor do pulmão esquerdo do receptor usando tesoura de mola Vannas-Tubingen e puxe o pulmão para fora da área do tórax usando cotonetes estéreis e pinças.
- Coloque gaze estéril ao redor do pulmão esquerdo e segure-a com uma braçadeira de buldogue Dieffenbach.
- Aplique uma pinça de Yasargil na área hilar do pulmão esquerdo o mais proximalmente possível.
5. Anastomoses
- Anastomose das veias pulmonares (PV)
- Coloque sutura de náilon 7-0 ao redor do PV do receptor.
- Incitar o PV do receptor usando a tesoura de mola Vannas-Tübingen cortando transversalmente as veias segmentares superior e inferior o mais distalmente possível e lavando o sangue com 0,2 mL de solução salina heparinizada (1 U/mL) usando uma seringa de insulina.
- Coloque o pulmão doador ainda envolvido com gaze estéril úmida gelada na cavidade torácica.
- Inserir o PV com balonete do doador no PV do receptor e, em seguida, fixar com o fio de náilon 7-0 pré-posicionado (Figura 6).
- Anastomose brônquica (Br)
- Coloque sutura de náilon 7-0 ao redor do Br. do receptor.
- Incisar o Br do receptor cortando as vias aéreas segmentares superior e inferior transversalmente o mais distalmente possível com tesoura de mola Vannas-Tubingen.
- Inserir o Br balonetado do doador no Br do receptor e fixar com fio de náilon 7-0 pré-posicionado (Figura 6).
- Anastomose da artéria pulmonar (AP):
- Coloque sutura de náilon 7-0 ao redor do AP do receptor.
- Incisar o AP do receptor a partir de sua bainha adventícia, incidir metade da circunferência do vaso com tesoura de mola Vannas-Tubingen e, em seguida, liberar o sangue no AP com 0,2 mL de solução salina heparinizada (1 U/mL) usando uma seringa de insulina.
- Inserir o PA braçado do doador no PA do receptor e fixar com fio de náilon 7-0 pré-posicionado (Figura 6).
6. Reperfusão
- Retirar a pinça de Yasargil no hilo para permitir a reperfusão e ventilação do pulmão doado transplantado (Figura 7).
- Dissecar o pulmão esquerdo nativo do receptor usando uma tesoura de mola microdissecante e pinça.
- Reposicionar cuidadosamente o pulmão esquerdo transplantado no tórax do receptor.
- Fechar a incisão da toracotomia com fio de náilon 6-0.
- Colocar três pontos de náilon 6-0 com nós duplos simples ao redor das costelas, superior à 4ª costela e inferior à5ª costela (Figura 8A).
- Utilizar hemostáticos para reunir as três suturas (Figura 8B).
- Aumentar a PEEP para 6 cmH2O nos ajustes de ventilação.
- Amarre os três nós ao mesmo tempo, afastando-se para fechar a ferida (Figura 8C).
- Diminua a PEEP para 2 cmH2O imediatamente.
- Fechar a pele com fio de náilon 6-0.
NOTA: Nosso laboratório estuda a fase aguda pós-transplante, de modo que o rato receptor neste modelo é sobrevivido por 3 h pós-transplante sob ventilação e anestesia e, em seguida, amostras são coletadas.
7. Coleta de espécimes experimentais (plasma, tecido pulmonar)
- Para amostras controle, coletar os lobos direitos do doador após o início do período de reperfusão de 3 h.
- Congelar o lobo superior e o lobo pós-cava para análises de expressão de proteína ou RNA, preservar o lobo médio para histologia e usar o lobo inferior para relação de peso úmido para seco (Figura 9A).
- Aos 10 minutos antes do término do tempo de reperfusão de 3h, prepare-se para colher as amostras receptoras injetando heparina (1.000 U/kg) com uma seringa de insulina na veia jugular.
NOTA: Esta administração de heparina previne coágulos sanguíneos nos pulmões e permite uma lavagem mais completa no momento da obtenção. - Coleta de plasma
- Ao final do período de reperfusão de 3 h, coletar 1 mL de sangue com uma seringa através da VCI.
- Armazenar no gelo e, em seguida, centrifugar a 2.000 x g por 10 min para colher o plasma.
- Eutanasiar o rato receptor cortando a VCI para permitir a exsanguinação.
- Dissecar o diafragma ao longo do arco torácico e expor a cavidade torácica dissecando a caixa torácica.
- Coletar líquido de LBA dos pulmões nativos ou transplantados, se desejado (opcional).
NOTA: Se a relação peso úmido/seco ou histologia estiver sendo realizada no pulmão, a coleta de líquido de LBA não deve ser realizada, pois pode afetar os resultados.- Rosque a sutura de seda 4-0 ao redor da traqueia e amarre um nó duplo apertado ao redor da traqueia e do tubo de intubação para evitar vazamento de líquido.
- Calcular a quantidade de PBS gelado para a coleta de LBA dos lobos direito e esquerdo.
NOTA: A relação de volume para o pulmão direito é de 63% enquanto a relação de volume para o pulmão esquerdo é de 37%16. Portanto, para determinar a quantidade de PBS a ser instilada em cada lado, o volume deve ser calculado como o dobro do volume corrente (Td = 7,2 mL/kg) multiplicado por 63% para o pulmão direito e 37% para o pulmão esquerdo. - Coloque uma pinça de Yasargil na área hilar do pulmão esquerdo (Figura 10A) e, com uma seringa conectada ao cateter angio, instile a quantidade calculada de PBS gelada no pulmão direito (lóbulos nativos do receptor) e colete o líquido de LBA puxando suavemente o êmbolo da seringa. Execute duas vezes.
NOTA: Deve-se esperar 70-80% de recuperação do fluido instilado. - Retirar a pinça de Yasargil no pulmão esquerdo e colocá-la na área hilar do pulmão direito (Figura 10B).
- Coletar líquido de LBA do lobo esquerdo transplantado da mesma forma que foi coletado para os lobos direitos e, em seguida, remover a pinça na área hilar do pulmão direito.
- Cortar as aurículas direita e esquerda com uma tesoura de mola microdissecante e lavar os pulmões por gravidade através do AP usando um cateter angiocateter 18 G acoplado à tubulação e uma seringa com 20 mL de solução de preservação pré-refrigerada pendurada a 28 cmH2O.
- Coletar amostras do pulmão do receptor.
- Congelar o lobo superior e o lobo pós-cava para análises de expressão de proteína ou RNA, preservar o lobo médio para histologia e usar o lobo inferior para relação peso úmido/seco) (Figura 9A).
- Divida-se o lobo esquerdo transplantado em três partes: a região superior coletada para congelamento instantâneo, a região média para histologia e a região inferior para relação peso úmido/seco (Figura 9B).
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Representative Results
Para mensurar o edema pulmonar, foi calculada a relação peso úmido/seco. O lobo nativo do doador, o lóbulo transplantado e o lobo nativo do receptor foram coletados conforme descrito no protocolo e pesados imediatamente para peso úmido, secos a 60 °C por 48 h e, em seguida, pesados novamente para o peso seco. Um aumento da relação peso úmido/seco seria indicativo de edema pulmonar. Nossos resultados indicam que o lobo transplantado teve um aumento significativo na relação peso úmido/seco em comparação com o lobo nativo do doador ou receptor (p=0,0050, n=6/grupo; Gráfico 11).
| Tamanho do cateter angio para manguitos | |||
| Peso corporal do rato (g) | PAPAI | Br | PV |
| 180-200 | 20 g | 18 G | 16 G |
| 200-230 | 18 G | 16 G | 14 G |
| 230-250 | 18 G | 14 G | 14 G |
| 250-270 | 18 G | 14 G | 12 - 14 G |
| Mais de 270 | 16 G | 14 G | 12 G |
Tabela 1. Guia de tamanho para punhos. O tamanho da artéria pulmonar (AP), brônquio (Br) ou veia pulmonar (VP) está relacionado ao peso corporal. Dependendo do peso corporal e do tipo de manguito que você está fazendo, o tamanho recomendado do cateter angio é dado.
Gráfico 1. Ferramentas cirúrgicas. (A) Tesoura fina, (B) pinça, (C-E) pinça microcirúrgica, (F) pinça fina Dumont #5, (G) tesoura de mola Vannas-Tubingen e tesoura microdissecante Castroviejo, (H) hemostático de mosquito Halsted, (J) afastador, (K) grampos de Yasargil, (L) braçadeira de buldogue de Dieffenbach, (M) hemostáticos curvos e (N) aplicador de pinça de Yasargil. Todas as ferramentas devem ser autoclavadas a 121 °C por 30 min. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 2. Preparo do manguito com vários tamanhos de cateter angio e lâmina cirúrgica costela #11. O tamanho do cateter angio escolhido para o manguito é determinado pelo guia de tamanho do manguito (Tabela 1), que leva em consideração o peso corporal do rato e se o manguito é para a artéria pulmonar (AP), brônquio (Br) ou veia pulmonar (VP). Os cateteres (A) 20 G, (B) 18 G, (C) 16 G, (D) 14 G ou (E) 12 G são cortados com uma lâmina cirúrgica (F) costela #11, conforme descrito no protocolo, e armazenados em soro fisiológico até que seja necessário. (G) O comprimento do corpo do manguito é de 2 mm e uma aba de 1 mm X 1 mm (largura x altura) é deixada na parte superior do corpo do manguito para o manuseio do corpo do manguito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 3. Isquemia quente. Os pulmões são lavados com a solução de preservação através da artéria pulmonar, inflados com o dobro do volume corrente de ar e, em seguida, envolvidos com uma almofada inferior e mantidos na placa de aquecimento da cirurgia para manter o rato em temperatura corporal normal por 1 h. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 4. Abalonete de pulmão de doadores PV, PA e Br. (A) Veia pulmonar, PV (B) artéria pulmonar, AP, ou (C) brônquio, Br, é inserido através de um manguito de tamanho adequado, evertido, fixado com 8-0 fio de nylon, e (D) então armazenado em gaze estéril umedecida com soro fisiológico gelado sobre placa de Petri estéril sobre gelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 5. Medição e dissecação no 4º espaço intercostal. (A) O rato receptor é colocado em decúbito dorsal, e o tórax é medido da incisura supraesternal até o processo xifoide e uma linha é traçada. (B) No ponto médio dessa linha, outra linha do lado esquerdo é traçada na metade do comprimento. (C) Nessa linha, o microcirurgião deve sentir uma área onde o impulso cardíaco é mais forte para garantir a localização adequada do4º espaço intercostal (círculo vermelho). (D) A pele e o músculo são então dissecados com tesoura fina. (E) O afastador é então usado para abrir o espaço amplamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 6. Anastomose. O (A) PV (B) Br, ou (C) PA do doador é inserido no PV, Br, ou PA do receptor e, em seguida, fixado com fio de náilon 7-0. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 7. Reperfusão. Após o término das anastomoses, pode-se iniciar a reperfusão com a remoção da pinça, e o rato receptor sobrevive por 3 h sob ventilação e anestesia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 8. Fechamento de ferida. (A) Três pontos de náilon 6-0 com nós duplos simples são colocados ao redor das costelas superior à 4ª costela e inferior à5ª costela. (B) Utilizar hemostáticos em ambas as mãos para reunir as três suturas e aumentar a PEEP para 6 cmH2O nos ajustes ventilatórios. (C) Amarrar os três nós ao mesmo tempo, puxando para cima e para longe para fechar a ferida, diminuir a PEEP para 2 cmH2O imediatamente e fechar a pele com fio de náilon 6-0. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 9. Coleta de tecido pulmonar. (A) Para os lobos nativos do doador ou receptor, o lobo superior e o lobo pós-cava podem ser congelados por encaixe para análises de expressão de proteína ou RNA, o lobo médio pode ser preservado para histologia e o lobo inferior pode ser usado para relação peso úmido/seco. (B) Para o lóbulo transplantado, coletar a região superior para congelamento instantâneo, região média para histologia ou região inferior para relação peso úmido/seco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10. Aplicação da pinça para coleta seletiva de LBA. Para evitar uma amostra agrupada, o líquido de LBA pode ser coletado do pulmão direito (nativo) ou esquerdo (transplantado). (A) A área hilar do pulmão esquerdo pode ser pinçada para coletar líquido de LBA dos lobos direitos. (B) A área hilar do pulmão direito pode ser pinçada para coletar líquido de LBA do lobo esquerdo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 11. Relação peso-seco/úmido. A razão entre o peso seco e úmido foi calculada para medir o edema pulmonar e pode ser usada para indicar o desempenho do transplante. O lobo nativo do doador, o lóbulo transplantado ou o lobo nativo do receptor foram coletados conforme descrito no protocolo e pesados imediatamente para peso úmido, secos a 60 °C por 48 h e, em seguida, pesados novamente para o peso seco. Foi realizada uma relação entre peso úmido e peso seco. A proporção para o lobo transplantado foi significativamente aumentada em comparação com os lobos nativos do doador ou receptor. n=6 ratos/grupo e as barras representam a média ± DP. A análise estatística foi realizada por ANOVA com análise post-hoc de Tukey. ** pág<0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste relato, intervimos em várias etapas críticas de um protocolo de transplante pulmonar de ratos para otimizar o procedimento. Embora várias técnicas de cuffing para transplante pulmonar de ratos tenham sido relatadas 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15, o processo ainda pode ser subjetivo e de difícil aplicação para microcirurgiões. Enfatizamos que o tamanho adequado dos manguitos para PV e PA para fornecer sangue ou Br para fornecer ar para o pulmão transplantado deve ser usado, e fornecemos uma maneira mais objetiva de determinar o tamanho ideal do manguito com base no peso corporal do rato. Para induzir de forma mais consistente isquemia quente dos pulmões, temos dado recomendações de insuflação pulmonar, clampeamento e como manter o rato aquecido durante o tempo de isquemia quente de 1 hora. Durante o procedimento do receptor, pode ser difícil localizar o4º espaço intercostal. Recomendamos que se possa localizar com maior precisão essa posição empregando um método de mensuração e sensação do impulso cardíaco. No momento da reperfusão, para melhor fechamento da ferida, mostramos também uma técnica de manuseio de suturas e ajuste da PEEP que pode fechar mais rapidamente a ferida e evitar a hiperinsuflação e lesão do pulmão. Finalmente, apresentamos estratégias para coleta de tecidos e LBA que permitem uma coleta mais objetiva de amostras que podem ser comparadas entre experimentos e diferentes pesos corporais.
A limitação mais significativa das técnicas descritas é a curva de aprendizado bastante íngreme da operação de transplante em geral. A curva de aprendizado é aquela que pode ser reduzida com a prática cirúrgica consistente e com a revisão de técnicas de solução de problemas na literatura. Outra limitação é que esse modelo estuda a fase aguda da IRI e do transplante, onde as alterações bioquímicas estão ocorrendo pela primeira vez, que é o foco do nosso laboratório. Estudos futuros devem testar a permeabilidade brônquica e vascular em prazos mais longos pós-transplante.
Em geral, um modelo viável de transplante de pequenos animais é fundamental para avaliar intervenções terapêuticas para transplante e lesão de isquemia-reperfusão (IRI). O modelo de transplante pulmonar de ratos, em particular, é útil como adjuvante no estudo da perfusão pulmonar ex vivo (PPEV) de pequenos animais17. É também uma alternativa mais viável ao transplante pulmonar murino, pois o maior tamanho anatômico permite ao pesquisador obter tecido suficiente para análises mais aprofundadas18. Além disso, o modelo é essencial para determinar a viabilidade de aloenxertos pulmonares de doadores após intervenção terapêutica com novas pequenas moléculas e terapêuticas proteicas 19,20,21,22 tanto para o doador, para o órgão doado por meio da PPEV 17 ou para o receptor e fornece uma via poderosa para a coleta de dados in vivo. As otimizações que descrevemos neste relato são importantes para microcirurgiões que visam diminuir sua curva de aprendizado e remover alguma subjetividade. Ao utilizar um algoritmo padronizado de tamanho do manguito pulmonar, a abordagem cirúrgica pode ser simplificada e mais objetiva. Ao término do período de reperfusão do transplante, a abordagem estruturada descrita para a coleta de líquido de LBA e tecidos também proporciona o uso responsável dos animais e o uso eficiente do tempo do microcirurgião, maximizando o impacto dos dados coletados por experimento.
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Disclosures
BAW, YGL e JLK são apoiados através da concessão R01HL143000 do National Institutes of Health (NIH). A BAW é apoiada através da concessão W81XWH1810787 do Departamento de Defesa (DOD). O SMB é apoiado através da concessão NIH R01DK123475. A JM é apoiada por meio de concessões do NIH AR061385, AR070752, DK106394 e AG056919, bem como pela concessão do DOD W81XWH-18-1-0787.
Acknowledgments
Nenhum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Gauge angio-catheter | BD | 382277 | |
| 14 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251717-02 | |
| 16 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252586-02 | |
| 18 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251679-02 | |
| 20 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252527-02 | |
| 4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| 6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
| 7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
| 8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
| Betadine Spray | Avrio Health L.P | UPC 367618160039 | |
| Clippers | VWR | MSPP-023326 | |
| Castroviejo micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5668 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Electrocautery | Macan | MV-7A | |
| Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Halsted-mosquito hemostat | Roboz Surgical Instrument Co | RS-7112 | |
| Heparin | Fresnius Medical Care | C504701 | |
| Insulin syringe | Life Technologies | B328446 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropyl Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| Ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
| Dieffenbach Bulldog Clamp | World Precision Instruments | WPI14117 | |
| Needle holder/Forceps, Curved | Micrins | MI1542 | |
| Needle holder/Forceps, Straight | Micrins | MI1540 | |
| Perfadex Plus (Organ Preservation Solution) | XVIVO Perfusion AB | REF# 19950 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | Used to check SpO2 and heartbeat |
| Retractor | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6560 | |
| Saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Syringe 5mL | BD | 309646 | |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT351T | Used to clamp bronchus |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT261T | Used to clamp hilum |
| Yasargil Clamp Applicator | Aesculap, Inc | FT484T |
References
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