Summary

Modelo de Lesão de Isquemia/Reperfusão de Pulmão de Rato em Transplante de Pulmão de Rato: Otimizações para Melhorar os Resultados

Published: October 28, 2021
doi:

Summary

Aqui, apresentamos otimizações para um modelo de transplante de pulmão de rato que servem para melhorar os resultados. Fornecemos um guia de tamanho para manguitos com base no peso corporal, uma estratégia de medida para determinar o espaço intercostal, métodos de fechamento de feridas e coleta de líquido e tecido de LBA (lavado broncoalveolar).

Abstract

A partir de nossa experiência com transplante de pulmão de ratos, encontramos várias áreas para melhoria. As informações existentes sobre os métodos de escolha dos tamanhos adequados dos manguitos para a veia pulmonar (VP), artéria pulmonar (AP) ou brônquio (Br) são variadas, tornando a determinação do tamanho adequado do manguito durante o transplante pulmonar de ratos um exercício de tentativa e erro. Ao padronizar a técnica de cuffing para usar o menor manguito efetivo apropriado para o tamanho do vaso ou brônquio, pode-se tornar o procedimento de transplante mais seguro, rápido e bem-sucedido. Como os diâmetros das VP, PA e Br estão relacionados com o peso corporal do rato, apresentamos uma estratégia para a escolha de um tamanho adequado usando um guia baseado no peso. Como o volume pulmonar também está relacionado ao peso corporal, recomendamos que essa relação também seja considerada na escolha do volume de ar adequado para a insuflação pulmonar do doador durante a isquemia quente, bem como para o volume adequado de EEP a ser instilado durante a coleta de líquido no lavado broncoalveolar (LBA). Descrevemos também os métodos de dissecção do espaço intercostal, fechamento de feridas e coleta de amostras dos lobos nativos e transplantados.

Introduction

Há mais de três décadas, pesquisadores vêm modificando e aprimorando modelos de transplante pulmonar de ratos para que os dados gerados sejam mais consistentes e reflitam a real condição clínica. No tempo em que nosso laboratório executou esse modelo, determinamos quatro áreas de melhoria: técnicas de cuffing para anastomoses, identificação do espaço intercostal do receptor, insuflação pulmonar e fechamento da ferida durante o procedimento do receptor e coleta de amostras para análise.

Modificações na técnica de cuffing para anastomoses podem melhorar todo o procedimento de transplante, encurtando o tempo de manuseio do pulmão doador 1,2,3,4,5,6 e tornando o procedimento de anastomose mais rápido e tecnicamente fácil para o microcirurgião. Embora seja fundamental o uso de manguitos de tamanho adequado para fornecer o sangue e o fluxo aéreo necessários para o pulmão transplantado, há orientações limitadas sobre como se deve escolher o tamanho dos manguitos para a veia pulmonar (VP), artéria pulmonar (AP) ou brônquio (Br)5,7,8,9. Como os diâmetros das VVPP, PA e Br estão relacionados com o peso corporal dos ratos doadores e receptores, propomos que o tamanho do manguito seja baseado no peso corporal. Este relatório fornece um guia de tamanho para manguitos com base no peso corporal de um rato (180 g a mais de 270 g) que serve para otimizar o suprimento de sangue e ar para o pulmão transplantado (Tabela 1).

Enquanto um microcirurgião mais novo pode obter com sucesso e facilidade um pulmão doado durante o procedimento do doador, transplantar o pulmão durante o procedimento do receptor é mais complicado e depende da experiência do microcirurgião. A tentativa de encontrar o espaço intercostal para acessar o pulmão esquerdo do receptor é uma das etapas mais difíceis, que guarda alguma subjetividade e pode aumentar o tempo de procedimento. Portanto, introduzimos um método simples e objetivo para auxiliar na identificação da localização do espaço intercostal, utilizando medidas do tórax e das palpitações do coração para encontrar a área correta da parede torácica a ser dissecada4,5,6,10,11,12.

Propomos também uma melhora na insuflação pulmonar do doador, que é uma fonte potencial de lesão do órgão. O pulmão doador é desinsuflado até o início da reperfusão. Durante a sutura do espaço intercostal, o pulmão doador é comumente insuflado pelo aumento da PEEP de 2 cmH 2O para 6 cmH2O. A fim de minimizar a lesão pulmonar por hiperinsuflação, propomos uma técnica em que três pontos de náilon 6-0 são colocados ao redor da 4ª costela inferior à costela com nós duplos simples. Na hora do fechamento da ferida, as extremidades das três suturas são mantidas com hemostáticos em ambas as mãos, a ferida é fechada de uma só vez puxando para cima de cada lado e a PEEP é imediatamente reduzida para 2 cmH2O. Dessa forma, permite-se que o pulmão se expanda pelo menor tempo possível10.

Na conclusão de um experimento, o pesquisador muitas vezes quer coletar muitos tipos de amostras para muitos tipos de análise de cada transplante. Por exemplo, tecido congelado instantâneo, tecido fixado em formalina, relação entre o peso úmido e seco para determinar o edema pulmonar e o líquido de lavagem broncoalvelolar (LBA) podem ser usados para avaliar o quão bem o transplante foi. O método tradicional de coleta de LBA permite uma amostra mista agrupada dos lobos nativos do receptor e do lobo transplantado do doador13,14,15. Para superar isso, apresentamos um método de clampeamento das áreas hilares que pode fornecer informações mais precisas sobre a condição dos pulmões transplantados e nativos. Além disso, o volume de PBS usado para coletar líquido de LBA de cada lado dos pulmões é importante considerar, pois o líquido de LBA contém inúmeros fatores solúveis, como citocinas e quimiocinas, que são medidos por concentração. A normalização do volume do líquido instilado para o volume estimado da capacidade pulmonar pode ajudar na comparação. Com quatro lóbulos no lado direito e um lobo no lado esquerdo, cada um dos cinco lobos do rato tem um volume e área de superfície diferentes16. De acordo com estudo prévio de Backer et al., de acordo com estudo prévio de Backer et al., do volume total de todo o pulmão o volume dos lobos direitos é de 63% (4400 mm 3) e o lobo esquerdo é de 37% (2500 mm3). Portanto, recomendamos que o volume de EEP utilizado para coletar líquido de LBA seja calculado como o dobro do volume corrente (7,2 mL/kg) multiplicado por 63% para o pulmão direito e 37% para o pulmão esquerdo. Com essa abordagem, pode-se controlar melhor variáveis como peso corporal e tempo10,16.

Ao todo, neste relato demonstraremos algumas modificações no modelo experimental padrão de transplante pulmonar de ratos que podem tornar o procedimento mais eficiente e aumentar a capacidade de gerar dados mais precisos e abundantes de cada experimento.

Protocol

Ratos machos da raça Sprague-Dawley (180-270 g de peso corporal) foram comprados comercialmente (por exemplo, Envigo) e alojados em condições livres de patógenos no The Ohio State University Animal Facility. Todos os procedimentos foram realizados humanamente de acordo com o NIH e o National Research Council’s Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals e com a aprovação do The Ohio State University Institutional Animal Care and Use Committee (Protocolo IACUC # 2012A00000135-R2). <p class="jove_titl…

Representative Results

Para mensurar o edema pulmonar, foi calculada a relação peso úmido/seco. O lobo nativo do doador, o lóbulo transplantado e o lobo nativo do receptor foram coletados conforme descrito no protocolo e pesados imediatamente para peso úmido, secos a 60 °C por 48 h e, em seguida, pesados novamente para o peso seco. Um aumento da relação peso úmido/seco seria indicativo de edema pulmonar. Nossos resultados indicam que o lobo transplantado teve um aumento significativo na relação peso úmi…

Discussion

Neste relato, intervimos em várias etapas críticas de um protocolo de transplante pulmonar de ratos para otimizar o procedimento. Embora várias técnicas de cuffing para transplante pulmonar de ratos tenham sido relatadas 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nenhum.

Materials

12 Gauge angio-catheter BD 382277
14 Gauge angio-catheter B. Braun 4251717-02
16 Gauge angio-catheter B. Braun 4252586-02
18 Gauge angio-catheter B. Braun 4251679-02
20 Gauge angio-catheter B. Braun 4252527-02
4-0 silk suture Surgical Specialties Corp. SP116
6-0 nylon suture AD Surgical S-N618R13
7-0 nylon suture AD Surgical S-N718SP13
8-0 nylon suture AD Surgical XXS-N807T6
Betadine Spray Avrio Health L.P UPC 367618160039
Clippers VWR MSPP-023326
Castroviejo micro dissecting spring scissors Roboz Surgical Instrument Co RS-5668
Dumont #5 – Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Electrocautery Macan MV-7A
Endotracheal intubation kit Kent Scientific ETI-MSE
Forceps Fine Science Tools 11027-12
Halsted-mosquito hemostat Roboz Surgical Instrument Co RS-7112
Heparin Fresnius Medical Care C504701
Insulin syringe Life Technologies B328446
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 66794-017-25
Isopropyl Alcohol Swabs BD 326895
Ketamine Hikma Pharmaceuticals PLC NDC 0413-9505-10
Dieffenbach Bulldog Clamp World Precision Instruments WPI14117
Needle holder/Forceps, Curved Micrins MI1542
Needle holder/Forceps, Straight Micrins MI1540
Perfadex Plus (Organ Preservation Solution) XVIVO Perfusion AB REF# 19950
PhysioSuite Kent Scientific PS-MSTAT-RT Used to check SpO2 and heartbeat
Retractor Roboz Surgical Instrument Co RS-6560
Saline PP Pharmaceuticals LLC NDC 63323-186-10
Scissors Fine Science Tools 14090-11
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System Kent Scientific SS-MVG-Module
Sterile  Cotton Gauze Pad Fisherbrand 22-415-469
Surgical Microscope Leica M500-N w/ OHS
Syringe 5mL BD 309646
Vannas-Tubingen Spring Scissors Fine Science Tools 15008-08
Xylazine Korn Pharmaceuticals Corp NDC 59399-110-20
Yasargil Clamp Aesculap, Inc FT351T Used to clamp bronchus
Yasargil Clamp Aesculap, Inc FT261T Used to clamp hilum
Yasargil Clamp Applicator Aesculap, Inc FT484T

References

  1. Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 97 (4), 578-581 (1989).
  2. Zhai, W., et al. Simplified rat lung transplantation by using a modified cuff technique. Journal of Investigative Surgery. 21 (1), 33-37 (2008).
  3. Goto, T., et al. Simplified rat lung transplantation using a new cuff technique. Annals of Thoracic Surgery. 93 (6), 2078-2080 (2012).
  4. Guo, H., et al. Improvements of surgical techniques in a rat model of an orthotopic single lung transplant. European Journal of Medical Research. 18, 1 (2013).
  5. Tian, D., Shiiya, H., Sato, M., Nakajima, J. Rat lung transplantation model: modifications of the cuff technique. Annals of Translational Medicine. 8 (6), 407 (2020).
  6. Rajab, T. K. Anastomotic techniques for rat lung transplantation. World Journal of Transplantation. 8 (2), 38-43 (2018).
  7. Reis, A., Giaid, A., Serrick, C., Shennib, H. Improved outcome of rat lung transplantation with modification of the nonsuture external cuff technique. Journal of Heart and Lung Transplantation. 14 (2), 274-279 (1995).
  8. Sugimoto, R., et al. Experimental orthotopic lung transplantation model in rats with cold storage. Surgery Today. 39 (7), 641-645 (2009).
  9. Santana Rodriguez, N., et al. Technical modifications of the orthotopic lung transplantation model in rats with brain-dead donors. Archivos de Bronconeumología. 47 (10), 488-494 (2011).
  10. Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade. Journal of Surgical Research. 194 (2), 659-666 (2015).
  11. Rajab, T. K. Techniques for lung transplantation in the rat. Experimental Lung Research. 45 (9-10), 267-274 (2019).
  12. Iskender, I., et al. Effects of Warm Versus Cold Ischemic Donor Lung Preservation on the Underlying Mechanisms of Injuries During Ischemia and Reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
  13. Lin, X., et al. Five-year update on the mouse model of orthotopic lung transplantation: Scientific uses, tricks of the trade, and tips for success. Journal of Thoracic Disease. 4 (3), 247-258 (2012).
  14. Song, J. A., et al. Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats. Toxicological Research. 26 (3), 203-208 (2010).
  15. Chang, J. E., Kim, H. J., Yi, E., Jheon, S., Kim, K. Reduction of ischemia-reperfusion injury in a rat lung transplantation model by low-concentration GV1001. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (5), 972-979 (2016).
  16. De Backer, J. W., et al. Study of the variability in upper and lower airway morphology in Sprague-Dawley rats using modern micro-CT scan-based segmentation techniques. Anatomical Record. 292 (5), 720-727 (2009).
  17. Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), e52309 (2015).
  18. Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. Journal of Visualized Experiments. (65), e3947 (2012).
  19. Jia, Y., et al. Treatment of acute lung injury by targeting MG53-mediated cell membrane repair. Nature Communications. 5, 4387 (2014).
  20. Kim, J. L., et al. Pegylated-Catalase Is Protective in Lung Ischemic Injury and Oxidative Stress. Annals of Thoracic Surgery. , (2020).
  21. Beal, E. W., et al. D-Ala(2), D-Leu(5)] Enkephalin Improves Liver Preservation During Normothermic Ex Vivo Perfusion. Journal of Surgical Research. 241 (2), 323-335 (2019).
  22. Akateh, C., et al. Intrahepatic Delivery of Pegylated Catalase Is Protective in a Rat Ischemia/Reperfusion Injury Model. Journal of Surgical Research. 238, 152-163 (2019).

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Cite This Article
Lee, Y. G., Kim, J., Palmer, A. F., Reader, B. F., Ma, J., Black, S. M., Whitson, B. A. A Rat Lung Transplantation Model of Warm Ischemia/Reperfusion Injury: Optimizations to Improve Outcomes. J. Vis. Exp. (176), e62445, doi:10.3791/62445 (2021).

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