Summary
在这里，我们提出了对大鼠肺移植模型的优化，以改善结果。我们提供基于体重的袖带尺寸指南、确定第 4 肋 间隙的测量策略以及伤口闭合和 BAL（支气管肺泡灌洗）液体和组织收集的方法。
Abstract
根据我们在大鼠肺移植方面的经验，我们发现有几个需要改进的领域。现有文献中关于为肺静脉 （PV）、肺动脉 （PA） 或支气管 （Br） 选择合适的袖带尺寸的方法的信息各不相同，因此在大鼠肺移植期间确定适当的袖带尺寸是一项反复试验。通过标准化袖带技术以使用适合血管或支气管大小的最小有效袖带，可以使移植过程更安全、更快、更成功。由于PV，PA和Br的直径与大鼠的体重有关，因此我们提出了一种使用基于重量的指南选择合适的尺寸的策略。由于肺容量也与体重有关，我们建议在为温暖缺血期间供体肺充气选择合适的空气量以及在支气管肺泡灌洗（BAL）液体收集期间滴注适当体积的PBS时，也应考虑这种关系。我们还描述了第 4肋 间隙解剖、伤口闭合以及从天然和移植叶收集样本的方法。
Introduction
三十多年来，研究人员一直在修改和改进大鼠肺移植模型，以使生成的数据更加一致，更能反映实际临床状况。在我们实验室执行该模型的过程中，我们确定了四个改进领域：吻合的袖带技术，识别受体的第4肋间隙， 接受者手术过程中的肺充气和伤口闭合，以及收集样本进行分析。
吻合口的袖带技术修改可以通过缩短供体肺1，2，3，4，5，6的处理时间并使显微外科医生的吻合手术更快，技术上更容易来改善整个移植过程。虽然使用适当尺寸的袖带为移植肺提供必要的血液和气流至关重要，但关于如何为肺静脉 （PV）、肺动脉 （PA） 或支气管 （Br） 选择袖带尺寸的指导有限5，7，8，9。由于PV，PA和Br的直径与供体和受体大鼠的体重有关，我们建议袖带尺寸基于体重。该报告根据大鼠的体重（180克至270克以上）提供了袖带的尺寸指南，用于优化移植肺的血液和空气供应（表1）。
虽然较新的显微外科医生可以在供体手术期间成功且轻松地获得供体肺，但在接受者的手术过程中移植肺更为复杂，并且取决于显微外科医生的经验。尝试找到第 4 个肋间隙以进入接受者的左肺是更困难的步骤之一，具有一定的主观性并可能增加手术时间。因此，我们介绍了一种简单客观的方法，通过胸部测量和心脏的心悸来辅助识别第4肋间隙位置，以找到正确的胸壁区域来解剖4，5，6，10，11，12。
我们还建议改善供体肺充气，这是器官损伤的潜在来源。供体肺放气，直到再灌注开始。在缝合第 4 个肋间隙时，供体肺通常通过将 PEEP 从 2 cmH 2 O 增加到 6 cmH2O 来充气。为了尽量减少过度充气造成的肺损伤，我们提出了一种技术，即在低于第5肋的第4肋周围放置三个6-0尼龙缝合线，并带有简单的双结。当需要缝合伤口时，双手用止血器握住三条缝合线的末端，通过向两侧拉动伤口一次闭合，PEEP立即降低至2cmH2O。通过这种方式，允许肺在尽可能短的时间内扩张10。
在实验结束时，研究人员通常希望从每次移植中收集多种类型的样本以进行多种类型的分析。例如，快速冷冻组织、福尔马林固定组织、用于确定肺水肿的干湿重量比的组织以及支气管软体灌洗液 （BAL） 都可用于评估移植进展。收集BAL液体的传统方法允许从受体的原生叶和供体的移植叶13，14，15混合混合样本。为了克服这个问题，我们提出了一种夹住肺门区域的方法，该方法可以更精确地了解移植和天然肺的状况。此外，用于从肺部两侧收集BAL液的PBS体积很重要，因为BAL液含有许多可溶性因子，例如通过浓度测量的细胞因子和趋化因子。将输注的液体量与估计的肺活量恢复正常化有助于比较。右侧有四个裂片，左侧有一个裂片，大鼠的五个裂片中的每一个都有不同的体积和表面积16。根据Backer等人之前对肺叶体积测量的研究，在整个肺的总体积中，右叶的体积为63%（4400mm 3），左叶的体积为37%（2500mm3）。因此，我们建议用于收集BAL液体的PBS体积应计算为右肺潮气量（7.2mL/kg）乘以63%和左肺37%的两倍。通过使用这种方法，可以更好地控制体重和时间10，16 等变量。
总之，在本报告中，我们将展示对大鼠肺移植标准实验模型的一些修改，这些修改可以使程序更有效，并提高从每个实验中生成更准确和更丰富的数据的能力。
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Protocol
雄性Sprague-Dawley大鼠（体重180-270克）被商业购买（例如，Envigo），并在俄亥俄州立大学动物设施的无病原体条件下饲养。所有程序均根据NIH和国家研究委员会的实验动物人道护理和使用指南进行人道执行，并经俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC协议#2012A00000135-R2）批准。
1. 初始设置
- 设置手术设备。
注意：这是一项非生存性手术。如果要进行生存手术，则需要使用无菌器械和屏障预防措施。- 打开心率/血氧饱和度监测设备和加热板至42°C。
- 打开通气麻醉机预热异氟醚蒸发器。
注意：潮气量 （Td） 为 7.2 mL/kg，呼气末正压 （PEEP） 为 2 cmH2O，呼吸频率为 80 次/分。 - 用10mL液体异氟醚填充麻醉注射器，并将注射器安装到通气和麻醉机上。
- 打开手术显微镜，根据显微外科医生的喜好调整高度和焦点。
- 打开电烙设备。
- 准备并布置手术工具（图1）。
注意：所有手术工具在121°C高压灭菌30分钟。 - 收集和记录供体和受体大鼠的体重。
- 使用 表1 和大鼠的体重来确定用于制作袖带的正确规格的血管导管（20，18，16 14或12G）。
- 使用基于体重的尺寸指南为肺动脉（PA），支气管（Br）和肺静脉（PV）准备袖带（表1 和 图2）。
- 将尺寸为20 G，18 G，16 G，14 G或12 G的血管导管放在手术显微镜下的无菌表面上。
- 然后使用肋背手术刀片#11（图2F）以90°角切割血管导管，形成一个2毫米长的袖带主体，袖带主体顶部有一个1毫米X 1毫米的卡舌（宽x高）（图2G）。
- 将袖带存放在无菌盐水中，直到准备使用。
- 准备解决方案。
- 在无菌注射瓶中加入 1 mL 甲苯噻嗪 （100 mg/mL） 到 10 mL 氯胺酮 （100 mg/mL） 中制备氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物。
注意：此鸡尾酒的有效期 是使用所用成分的最早到期日期确定的。 - 将大鼠的适当剂量吸入注射器中（每100克大鼠体重0.1mL氯胺酮/甲苯噻嗪混合物;例如，对于200g大鼠，将输送0.2mL氯胺酮/甲苯噻嗪混合物）。
注意：该剂量将向大鼠提供91mg / kg氯胺酮和9.1mg / kg甲苯噻嗪，并应使大鼠保持镇静60-80分钟。 - 准备肝素，将以 1，000 U/kg 的剂量给药。
- 将盐水，PBS和保存溶液储存在冰上（材料表）。
- 在无菌注射瓶中加入 1 mL 甲苯噻嗪 （100 mg/mL） 到 10 mL 氯胺酮 （100 mg/mL） 中制备氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物。
2.供体大鼠制备
- 通过腹膜内注射氯胺酮和甲苯噻嗪混合物并等待~10分钟以形成可以通过对脚趾捏缺乏反应来评估的麻醉手术平面，从而诱导供体大鼠的麻醉。
- 使用电子剪刀剃除切口区域。
- 将供体大鼠置于手术加热板上的仰卧位置，并用浸有βdine的无菌纱布擦拭切口区域。然后用70%异丙醇棉签擦拭该区域。重复3次。
- 用剪刀在颈部中部做一个3至4厘米的中线皮肤切口，并用镊子（而不是剪刀）小心地解剖皮下组织和肌肉，以避免出血。
- 对于气管插管，在气管周围穿 4-0 丝缝线，并将 16 G 血管导管插入气管。用双结将缝合线紧紧地绑在气管周围，然后用一个单结结束，以将血管导管固定到位。
- 将血管导管连接到呼吸机，并用1-2%的异氟醚在大鼠中维持手术平面的麻醉。
- 使用剪刀将腹腔胸骨切开术作为中线和横向切口的组合。
- 通过下腔静脉（IVC）用胰岛素注射器注射肝素（1，000U / kg），并允许10分钟进行体循环。
注意：这种肝素的给药可防止供体肺中的血栓。 - 沿着胸弓切开，仔细解剖横膈膜，然后沿着胸骨到颈部暴露胸腔。
三、供体肺暖缺血及采购
- 通过切割IVC对供体大鼠实施安乐死。
- 当肺仍在通气时，用微型解剖弹簧剪刀切割左右耳廓，并在悬挂在28 cmH2O的注射器中重力冲洗肺，通过重力连接到管道和直接通过肺动脉引入的18 G血管导管。
- 断开呼吸机与气管插管的连接，并将其连接到 5 mL 注射器，根据体重填充适量的空气。
注意：充气肺部的空气体积可以计算为潮气量的两倍（Td = 7.2 mL / kg），例如，一只200克的大鼠的Td为1.44毫升，乘以2等于充气肺所需的2.88毫升空气。 - 给捐赠者的肺部充气。
- 在气管上放一个Yasargil夹子以保持肺部充气，并用无菌棉纱布覆盖肺部和心脏。用盐水润湿纱布，用垫子包裹供体大鼠，并在加热的手术板上放置1小时以诱导肺部温暖缺血（图3）。
- 温暖缺血1小时后，用微型解剖弹簧剪刀和镊子切除心肺阻滞，并放在用冰冷的PBS蘸有冰冷PBS的无菌纱布上，放在冰上的无菌培养皿上。
注意：当肺部在冰上的培养皿上时，应进行以下所有步骤。 - 用微型解剖弹簧剪刀小心切开肺韧带，将左肺与食道和腔后叶分开。
- 用Vannas-Tubingen弹簧剪刀小心修剪左肺门区域，并采购左PV，PA和Br。
- 将袖带放在 PV、PA 或 Br 上（图 4A-C）。
- 使用蚊子止血器抓住袖带标签。
- 使用细镊子通过适当的袖带体抓住PV，PA或Br的远端，清除袖带周围的额外组织，并使用8-0固定尼龙缝合线。使用Vannas-Tubingen弹簧剪刀修剪袖口周围的额外组织和袖带。
- 在冰上的培养皿上用盐水蘸有纱布覆盖供体肺，直到准备好移植到受体大鼠中（图4D）。
注意：平均冷缺血时间为 84 分钟± 11 分钟 S.D。
4.受体大鼠准备
- 通过腹膜内注射氯胺酮和甲苯噻嗪混合物（每100g大鼠0.1mL）并等待10分钟以与供体大鼠相同的方式诱导受体大鼠的麻醉，可以通过对脚趾捏缺乏反应来评估。
- 使用电子剪刀剃除切口区域。
- 将供体大鼠置于仰卧位，并用浸有倍他定的无菌纱布擦拭切口区域。然后用70%异丙醇棉签擦拭该区域。重复3次。
- 在将大鼠固定在通风机上之前，在大鼠的胸部画线，以准备找到第 4 个 肋间隙。
- 测量从胸骨上切口到剑突的胸部并画一条线（图5A）。
- 在这条线的中间，沿着胸部左侧画一条线，测量从胸骨上切口到剑突的一半测量值（图5A和B）。
- 使用连接到气管插管套件的 LED 灯的光纤电缆，通过可视化使用 16 G 血管导管对受体进行插管。
- 将血管导管连接到呼吸机，并用1-2%异氟醚维持手术平面麻醉。
- 要找到第 4 个 肋间隙，请找到可以感觉到强烈可触及心搏的胸壁区域（图 5C，红色圆圈）。
- 在这个位置，用剪刀切开皮肤，用微型解剖弹簧剪刀切开肌肉，并使用牵开器尽可能宽地打开第 4 个 肋间隙（图 5D 和 E）。
注意：在肌肉解剖过程中使用电烧灼以避免或止血。 - 一旦肋间隙被大开，使用Vannas-Tubingen弹簧剪刀仔细解剖受者左肺周围的韧带，并使用无菌棉签和镊子将肺从胸部区域拉出。
- 将无菌纱布放在左肺周围，并用迪芬巴赫斗牛犬夹住它。
- 在左肺门区域尽可能近端应用Yasargil钳。
5. 吻合术
- 肺静脉 （PV） 吻合术
- 将 7-0 尼龙缝合线放在接受者的 PV 周围。
- 使用Vannas-Tubingen弹簧剪刀切开受体的PV，方法是尽可能远端横向切割上节段静脉和下段静脉，并使用胰岛素注射器用0.2mL肝素化盐水（1U / mL）冲洗血液。
- 将仍然用冰冷的湿无菌纱布包裹的供体肺放入胸腔中。
- 将捐赠者的袖带PV插入接受者的PV，然后用预先定位的7-0尼龙缝合线固定（图6）。
- 支气管 （Br） 吻合术
- 将 7-0 尼龙缝合线放在接受者的 Br 周围。
- 通过用Vannas-Tubingen弹簧剪刀尽可能远距离横向切割上段和下段气道来切开受者的Br。
- 将捐赠者的袖带Br插入受体的Br中，并用预先定位的7-0尼龙缝合线固定（图6）。
- 肺动脉 （PA） 吻合术：
- 将 7-0 尼龙缝合线放在接受者的 PA 周围。
- 从不定鞘切开受者的 PA，用 Vannas-Tubingen 弹簧剪刀切开血管周长的一半，然后使用胰岛素注射器用 0.2 mL 肝素化盐水 （1 U/mL） 冲洗出 PA 中的血液。
- 将供体的袖带 PA 插入接受者的 PA 中，并用预先定位的 7-0 尼龙缝合线固定（图 6）。
6. 再灌注
- 取下肺门上的Yasargil夹，以便对移植的供体肺进行再灌注和通气（图7）。
- 使用微型解剖弹簧剪刀和镊子解剖接受者的原生左肺。
- 小心地将移植的左肺重新定位到受者的胸部。
- 使用6-0尼龙缝合线关闭开胸切口。
- 在肋骨周围放置三个6-0尼龙缝合线，在肋骨上方为第4根，低于第5肋骨（图8A）。
- 使用止血器将三条缝合线聚集在一起（图8B）。
- 在通风设置中将PEEP增加到6 cmH2O。
- 通过拉开以闭合伤口，同时将所有三个结绑在一起（图8C）。
- 立即将 PEEP 降低至 2 cmH2O。
- 用6-0尼龙缝合线关闭皮肤。
注意：我们的实验室研究移植后的急性期，因此该模型中的受体大鼠在通气和麻醉下在移植后存活3小时，然后收集样本。
7. 实验标本（血浆、肺组织）的采集
- 对于对照样品，在开始3小时再灌注期后收集供体的右叶。
- 快速冷冻上叶和腔后叶进行蛋白质或RNA表达分析，保留中叶进行组织学，并使用下叶进行干湿重量比（图9A）。
- 在3h再灌注时间结束前10分钟，准备通过将肝素（1，000U / kg）与胰岛素注射器注射到颈静脉中来收获受体样品。
注意：这种肝素的给药可防止肺部血栓，并允许在采购时更彻底地冲洗。 - 血浆采集
- 在3小时再灌注期结束时，通过IVC用注射器收集1mL血液。
- 储存在冰上，然后以2，000×g离心10分钟以收获血浆。
- 通过切割IVC对受体大鼠实施安乐死，以允许放血。
- 沿胸弓解剖横膈膜，并通过解剖肋骨暴露胸腔。
- 如果需要，从天然或移植的肺中收集BAL液（可选）。
注意：如果正在对肺进行干湿重量比或组织学检查，则不应进行BAL液体收集，因为它会影响结果。- 将4-0丝线缝合在气管周围，并在气管和插管周围打一个紧密的双结，以防止液体泄漏。
- 计算从右叶和左叶收集BAL流体的冰冷PBS量。
注意：右肺的体积比为63%，而左肺的体积比为37%16。因此，为了确定滴注到每侧的PBS量，应将容积计算为右肺潮气量（Td = 7.2 mL/kg）乘以63%和左肺37%的两倍。 - 将Yasargil夹在左肺门区域（图10A），并使用连接到血管导管的注射器，将计算量的冰冷PBS滴入右肺（受体的天然叶），并通过轻轻拉起注射器柱塞来收集BAL液。执行两次。
注意：滴注液体的回收率为70-80%。 - 取下左肺上的Yasargil夹具，并将夹子放在右肺门区域（图10B）。
- 以与从右肺叶收集相同的方式从移植的左叶收集BAL液，然后取下右肺门区域的夹子。
- 用微型解剖弹簧剪刀切割左右耳廓，并使用连接到管路的 18 G 血管导管和带有 20 mL 预冷保存溶液的注射器在 28 cmH2O 下通过重力冲洗肺部。
- 从接受者的肺部收集样本。
- 快速冷冻上叶和腔后叶进行蛋白质或RNA表达分析，保留中叶进行组织学，并使用下叶进行干湿重量比）（图9A）。
- 将左移植的左叶分成三部分：收集的上部区域用于快速冷冻，中间区域用于组织学，下部区域用于干湿重量比（图9B）。
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Representative Results
为了测量肺水肿，计算湿与干重比。按照协议中的描述收集供体的原生叶，移植的叶和受体的天然叶，并立即称量湿重，在60°C干燥48小时，然后再次称量干重。湿重比增加提示肺水肿。我们的结果表明，与供体或受体的原生叶相比，移植叶的干湿重量比确实显着增加（p = 0.0050，n = 6 /组; 图 11）。
| 袖带血管导管尺寸 | |||
| 大鼠体重（g） | PA | 溴 | 光伏 |
| 180-200 | 20 克 | 18 克 | 16 克 |
| 200-230 | 18 克 | 16 克 | 14 克 |
| 230-250 | 18 克 | 14 克 | 14 克 |
| 250-270 | 18 克 | 14 克 | 12 - 14 克 |
| 超过 270 | 16 克 | 14 克 | 12 克 |
表 1.袖口尺寸指南。 肺动脉 （PA）、支气管 （Br） 或肺静脉 （PV） 的大小与体重有关。根据体重和您制作的袖带类型，给出了推荐的血管导管尺寸。
图1.手术工具。 （A）细剪刀，（B）镊子，（C-E）显微外科钳，（F）杜蒙特#5细镊子，（G）Vannas-Tubingen弹簧剪刀和Castroviejo微型解剖剪刀，（H）Halsted蚊子止血器，（J）牵开器，（K）Yasargil夹，（L）迪芬巴赫斗牛犬夹，（M）弯曲止血器和（N）Yasargil夹式涂抹器。所有工具应在121°C高压灭菌30分钟。 请点击此处查看此图的大图。
图2.使用各种尺寸的血管导管和肋背手术刀片#11进行袖带准备。 为袖带选择的血管导管的大小由袖带尺寸指南（表1）决定，该指南考虑了大鼠的体重以及袖带是用于肺动脉（PA），支气管（Br）还是肺静脉（PV）。血管导管（A）20 G，（B）18 G，（C）16 G，（D）14 G或（E）12 G按照协议中所述用（F）肋背手术刀片#11切割，并储存在盐水中直到需要。（G） 袖口主体长度为 2 毫米，袖口主体顶部留有 1 mm X 1 毫米（宽 x 高）的标签，用于处理袖带主体。 请点击此处查看此图的大图。
图3.温暖缺血。 用保存溶液通过肺动脉冲洗肺，用两倍的潮气量充气，然后用垫子包裹并保持在手术加热板上，以使大鼠保持在正常体温1小时。 请点击此处查看此图的大图。
图4.供体肺 PV、PA 和 Br 的袖带。 （A）肺静脉，PV（B）肺动脉，PA，或（C）支气管，Br，通过适当大小的袖带插入，外翻，用8-0固定尼龙缝合线，然后（D）储存在用冰冷盐水蘸湿的无菌纱布上，放在冰上的无菌培养皿上。 请点击此处查看此图的大图。
图5.在第4肋间隙测量和解剖。 （A）将受体大鼠仰卧，从胸骨上切口到剑突测量胸部并画一条线。（B）在这条线的中点，在长度的一半处绘制另一条左边的线。（C）沿着这条线，显微外科医生应该感觉到心脏冲动最强的区域，以确保第4肋 间隙（红色圆圈）的正确位置。（D）然后用细剪刀解剖皮肤和肌肉。（E）然后使用牵开器来广泛打开空间。 请点击此处查看此图的大图。
图6.吻合。 将供体的袖带 （A） PV （B） Br 或 （C） PA 插入接受者的 PV、Br 或 PA 中，然后用 7-0 尼龙缝合线固定。 请点击此处查看此图的大图。
图7.再灌注。 吻合完成后，可通过取下钳子开始再灌注，受体大鼠在通气和麻醉下存活3小时。 请点击此处查看此图的大图。
图8.伤口闭合。 （A）在肋骨周围放置三条带有简单双结的6-0尼龙缝合线，高于第 4肋骨，低于第 5肋骨。（B）双手使用止血器将三条缝合线聚集在一起，并在通气设置中将PEEP增加到6cmH2O。（C）通过向上拉开同时将所有三个结绑在一起以闭合伤口，立即将PEEP降低至2 cmH2O，并用6-0尼龙缝合线闭合皮肤。 请点击此处查看此图的大图。
图9.肺组织采集。 （A）对于供体或受体的天然叶，可以快速冷冻上叶和腔后叶以进行蛋白质或RNA表达分析，中叶可以保留用于组织学，下叶可用于湿干重量比。（B）对于移植的叶，收集上部区域用于快速冷冻，中间区域用于组织学，或下部区域用于干湿重量比。 请点击此处查看此图的大图。
图 10.夹具用于选择性BAL流体收集的应用。 为了避免混合样本，可以从右肺（天然）或左肺（移植肺）收集BAL液体。（A）可以夹住左肺门区域以收集右肺叶的BAL液体。（B）可以夹住右肺门区域以收集左叶的BAL液。 请点击此处查看此图的大图。
图 11.干湿重量比。 计算湿与干重比以测量肺水肿，并可用于指示移植的进展情况。如方案所述收集供体的天然叶，移植的叶或受体的天然叶，并立即称量湿重，在60°C下干燥48小时，然后再次称量干重。取湿重与干重的比值。与供体或受体的原生叶相比，移植叶的比例显着增加。n=6只大鼠/组，条形图代表SD±平均值。 使用方差分析与Tukey的事后分析进行统计分析。** 第<0.01页。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在本报告中，我们在大鼠肺移植方案中的几个关键步骤进行了干预，以优化程序。虽然已经报道了用于大鼠肺移植的各种袖带技术1，2，3，4，5，6，7，8，9，15，但该过程仍然是主观的，并且对于显微外科医生来说很难应用。我们强调应该使用适当的袖带尺寸，让PV和PA提供血液或Br为移植的肺提供空气，并且我们提供了一种更客观的方法来根据大鼠的体重确定最佳袖带尺寸。为了更一致地诱导肺部温暖缺血，我们给出了肺充气，钳夹以及如何在1小时温暖缺血期间保持大鼠温暖的建议。在接受者的手术过程中，可能很难找到第 4 个肋间隙。我们建议通过采用测量和感觉心动的方法更准确地定位该位置。在再灌注时，为了更好地闭合伤口，我们还展示了一种处理缝合线和调整PEEP的技术，可以更快地闭合伤口并防止过度充气和肺部损伤。最后，我们提出了组织和BAL液收集策略，可以更客观地收获样品，这些样品可以在实验和不同体重之间进行比较。
所描述技术的最大限制是移植手术的学习曲线相当陡峭。学习曲线可以通过持续的外科实践和回顾文献中的故障排除技术来缩短。另一个限制是该模型研究IRI和移植的急性期，其中首先发生生化变化，这是我们实验室的重点。未来的研究应在移植后更长的时间范围内测试支气管和血管通畅性。
总体而言，可行的小动物移植模型对于评估移植和缺血再灌注损伤（IRI）的治疗干预措施至关重要。特别是大鼠肺移植模型可作为研究小动物离体肺灌注（EVLP）的辅助手段17。它也是鼠肺移植的更可行的替代方案，因为较大的解剖尺寸使研究人员能够获得足够的组织进行更深入的分析18。此外，该模型对于确定供体肺同种异体移植物在使用新型小分子和蛋白质疗法19，20，21，22进行治疗干预后的活力至关重要，无论是供体还是通过EVLP17对供体器官，还是对受体，并提供了收集体内数据的强大途径。我们在本报告中描述的优化对于旨在减少学习曲线并消除一些主观性的显微外科医生来说很重要。通过利用标准化的肺袖带尺寸算法，手术方法可以简化且更客观。在移植再灌注期结束时，所描述的BAL液体和组织收集的结构化方法还提供了负责任地使用动物，并通过最大化每个实验收集的数据的影响来有效利用显微外科医生的时间。
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Disclosures
BAW，YGL和JLK通过美国国立卫生研究院（NIH）拨款R01HL143000提供支持。BAW通过国防部（DOD）拨款W81XWH1810787提供支持。SMB通过NIH拨款R01DK123475提供支持。JM通过NIH拨款AR061385，AR070752，DK106394和AG056919以及国防部拨款W81XWH-18-1-0787提供支持。
Acknowledgments
没有。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Gauge angio-catheter | BD | 382277 | |
| 14 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251717-02 | |
| 16 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252586-02 | |
| 18 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251679-02 | |
| 20 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252527-02 | |
| 4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| 6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
| 7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
| 8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
| Betadine Spray | Avrio Health L.P | UPC 367618160039 | |
| Clippers | VWR | MSPP-023326 | |
| Castroviejo micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5668 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Electrocautery | Macan | MV-7A | |
| Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Halsted-mosquito hemostat | Roboz Surgical Instrument Co | RS-7112 | |
| Heparin | Fresnius Medical Care | C504701 | |
| Insulin syringe | Life Technologies | B328446 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropyl Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| Ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
| Dieffenbach Bulldog Clamp | World Precision Instruments | WPI14117 | |
| Needle holder/Forceps, Curved | Micrins | MI1542 | |
| Needle holder/Forceps, Straight | Micrins | MI1540 | |
| Perfadex Plus (Organ Preservation Solution) | XVIVO Perfusion AB | REF# 19950 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | Used to check SpO2 and heartbeat |
| Retractor | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6560 | |
| Saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Syringe 5mL | BD | 309646 | |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT351T | Used to clamp bronchus |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT261T | Used to clamp hilum |
| Yasargil Clamp Applicator | Aesculap, Inc | FT484T |
References
- Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 97 (4), 578-581 (1989).
- Zhai, W., et al. Simplified rat lung transplantation by using a modified cuff technique. Journal of Investigative Surgery. 21 (1), 33-37 (2008).
- Goto, T., et al. Simplified rat lung transplantation using a new cuff technique. Annals of Thoracic Surgery. 93 (6), 2078-2080 (2012).
- Guo, H., et al. Improvements of surgical techniques in a rat model of an orthotopic single lung transplant. European Journal of Medical Research. 18, 1 (2013).
- Tian, D., Shiiya, H., Sato, M., Nakajima, J. Rat lung transplantation model: modifications of the cuff technique. Annals of Translational Medicine. 8 (6), 407 (2020).
- Rajab, T. K. Anastomotic techniques for rat lung transplantation. World Journal of Transplantation. 8 (2), 38-43 (2018).
- Reis, A., Giaid, A., Serrick, C., Shennib, H. Improved outcome of rat lung transplantation with modification of the nonsuture external cuff technique. Journal of Heart and Lung Transplantation. 14 (2), 274-279 (1995).
- Sugimoto, R., et al. Experimental orthotopic lung transplantation model in rats with cold storage. Surgery Today. 39 (7), 641-645 (2009).
- Santana Rodriguez, N., et al. Technical modifications of the orthotopic lung transplantation model in rats with brain-dead donors. Archivos de Bronconeumología. 47 (10), 488-494 (2011).
- Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade. Journal of Surgical Research. 194 (2), 659-666 (2015).
- Rajab, T. K. Techniques for lung transplantation in the rat. Experimental Lung Research. 45 (9-10), 267-274 (2019).
- Iskender, I., et al. Effects of Warm Versus Cold Ischemic Donor Lung Preservation on the Underlying Mechanisms of Injuries During Ischemia and Reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
- Lin, X., et al. Five-year update on the mouse model of orthotopic lung transplantation: Scientific uses, tricks of the trade, and tips for success. Journal of Thoracic Disease. 4 (3), 247-258 (2012).
- Song, J. A., et al. Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats. Toxicological Research. 26 (3), 203-208 (2010).
- Chang, J. E., Kim, H. J., Yi, E., Jheon, S., Kim, K. Reduction of ischemia-reperfusion injury in a rat lung transplantation model by low-concentration GV1001. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (5), 972-979 (2016).
- De Backer, J. W., et al. Study of the variability in upper and lower airway morphology in Sprague-Dawley rats using modern micro-CT scan-based segmentation techniques. Anatomical Record. 292 (5), Hoboken. 720-727 (2009).
- Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), e52309 (2015).
- Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. Journal of Visualized Experiments. (65), e3947 (2012).
- Jia, Y., et al. Treatment of acute lung injury by targeting MG53-mediated cell membrane repair. Nature Communications. 5, 4387 (2014).
- Kim, J. L., et al. Pegylated-Catalase Is Protective in Lung Ischemic Injury and Oxidative Stress. Annals of Thoracic Surgery. , (2020).
- Beal, E. W., et al. D-Ala(2), D-Leu(5)] Enkephalin Improves Liver Preservation During Normothermic Ex Vivo Perfusion. Journal of Surgical Research. 241 (2), 323-335 (2019).
- Akateh, C., et al. Intrahepatic Delivery of Pegylated Catalase Is Protective in a Rat Ischemia/Reperfusion Injury Model. Journal of Surgical Research. 238, 152-163 (2019).
