Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

מודל השתלת ריאה של חולדה של איסכמיה חמה / פגיעה ברפרפוזיה: אופטימיזציות לשיפור התוצאות

Published: October 28, 2021 doi: 10.3791/62445
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 4, 1, 2,4, 1,2
1Department of Surgery Division of Cardiac Surgery, The Ohio State University Wexner Medical Center, 2The Collaboration for Organ Perfusion, Protection, Engineering and Regeneration (COPPER) Laboratory, The Ohio State University College of Medicine, 3William G. Lowrie Department of Chemical and Biomolecular Engineering, College of Engineering, The Ohio State University, 4Comprehensive Transplant Center, The Ohio State University Wexner Medical Center

Summary

כאן, אנו מציגים אופטימיזציות למודל השתלת ריאות של חולדות המשמשות לשיפור התוצאות. אנו מספקים מדריך מידות לאזיקים המבוסס על משקל הגוף, אסטרטגיית מדידה לבירור החלל הבין-קוסטליהרביעי , ושיטות לסגירת פצעים ואיסוף נוזלים ורקמות BAL (שטיפת סימפונות).

Abstract

מניסיוננו עם השתלת ריאות בחולדות, מצאנו מספר תחומים לשיפור. המידע בספרות הקיימת לגבי שיטות לבחירת גדלי שרוול מתאימים לווריד הריאה (PV), לעורק הריאה (PA) או לסימפונות (Br) הוא מגוון, ולכן קביעת גודל השרוול הנכון במהלך השתלת ריאה של חולדה היא תרגיל של ניסוי וטעייה. על ידי סטנדרטיזציה של טכניקת השרוול לשימוש בשרוול היעיל הקטן ביותר המתאים לגודל כלי הדם או הסימפונות, ניתן להפוך את הליך ההשתלה לבטוח, מהיר ומוצלח יותר. מכיוון שהקטרים של PV, PA ו-Br קשורים למשקל הגוף של החולדה, אנו מציגים אסטרטגיה לבחירת גודל מתאים באמצעות מדריך מבוסס משקל. מכיוון שנפח הריאות קשור גם למשקל הגוף, אנו ממליצים לשקול קשר זה גם בעת בחירת נפח האוויר המתאים לניפוח ריאות תורם במהלך איסכמיה חמה, כמו גם לנפח הנכון של PBS שיוחדר במהלך איסוף נוזל שטיפה ברונכואלבאולרי (BAL). אנו מתארים גם שיטות לדיסקציה בין-קוסטלית4 , סגירת פצע ואיסוף דגימות הן מהאונות הילידיות והן מהאונות המושתלות.

Introduction

במשך יותר משלושה עשורים, חוקרים שינו ושיפרו מודלים להשתלות ריאה של חולדות, כך שהנתונים שנוצרו יהיו עקביים יותר וישקפו יותר את המצב הקליני בפועל. בזמן ביצוע מודל זה במעבדה שלנו, קבענו ארבעה תחומי שיפור: טכניקות איזוק לאנסטומוזות, זיהוי החלל הבין-קוסטליהרביעי של הנמען, ניפוח ריאות וסגירת פצעים במהלך ההליך של הנמען, וקצירת דגימות לניתוח.

שינויים בטכניקת השרוול עבור אנסטומוזות יכולים לשפר את הליך ההשתלה כולו על ידי קיצור זמן הטיפול של הריאה התורמת 1,2,3,4,5,6 והפיכת הליך האנסטומוזה למהיר וקל יותר מבחינה טכנית עבור המיקרוכירורג. בעוד שחיוני להשתמש באזיקים בגודל המתאים כדי לספק את זרימת הדם והאוויר הדרושים לריאה המושתלת, קיימת הדרכה מוגבלת לגבי האופן שבו יש לבחור את גודל האזיקים עבור וריד הריאה (PV), עורק הריאה (PA) או הסימפונות (Br)5,7,8,9. מכיוון שהקטרים של PV, PA ו- Br קשורים למשקל הגוף של החולדות התורמות והמקבלות, אנו מציעים שגודל השרוול יתבסס על משקל הגוף. דו"ח זה מספק מדריך גודל לאזיקים המבוסס על משקל הגוף של חולדה (180 גרם עד יותר מ-270 גרם) המשמש לייעול אספקת הדם והאוויר לריאה המושתלת (טבלה 1).

בעוד מיקרוכירורג חדש יותר יכול בהצלחה ובקלות לרכוש ריאה תורם במהלך הליך התורם, השתלת הריאה במהלך ההליך של המקבל היא מסובכת יותר ותלויה בניסיון של המיקרוכירורג. ניסיונות למצוא את החלל הבין-קוסטלי הרביעי כדי לגשת לריאה השמאלית שלהמקבל הוא אחד השלבים הקשים יותר שמחזיק סובייקטיביות מסוימת ויכול להאריך את זמן ההליך. לכן, אנו מציגים שיטה פשוטה ואובייקטיבית לסייע בזיהוי מיקוםהחלל הבין-קוסטלי הרביעי באמצעות מדידות חזה ודפיקות לב כדי למצוא את האזור הנכון קיר החזה לנתח4,5,6,10,11,12.

אנו מציעים גם שיפור בניפוח הריאות של התורם, שהוא מקור פוטנציאלי לפגיעה באיבר. הריאה התורמת מנופחת עד לתחילת הרפרפוזיה. בעת תפירת החלל הבין-קוסטליהרביעי, הריאה התורמת מנופחת בדרך כלל על ידי הגדלת PEEP מ 2 cmH 2 O ל 6cmH2O. על מנת למזער את הפגיעה הריאתית כתוצאה מניפוח יתר, אנו מציעים טכניקה בה שלושה תפרי ניילון 6-0 ממוקמיםסביב הצלע הרביעית נחותהמהצלע החמישית עם קשרים כפולים פשוטים. כאשר מגיע הזמן לסגירת הפצע, הקצוות של שלושת התפרים מוחזקים עם המוסטטים בשתי הידיים, הפצע נסגר בבת אחת על ידי משיכה למעלה מכל צד, ו- PEEP מצטמצם מיד ל 2 ס"מ H2O. בדרך זו, הריאה מותר להרחיב לזמן הקצר ביותר האפשרי10.

בסיום ניסוי, החוקר רוצה לעתים קרובות לאסוף סוגים רבים של דגימות עבור סוגים רבים של ניתוח מכל השתלה. לדוגמה, ניתן להשתמש ברקמה קפואה מצמידה, רקמה קבועה פורמלין, רקמה ביחס משקל רטוב ליבש כדי לקבוע בצקת ריאות, ונוזל שטיפה ברונכואלוולרית (BAL) כדי להעריך כמה טוב עברה ההשתלה. השיטה המסורתית לאיסוף נוזל BAL מאפשרת דגימה מעורבת הן מהאונות הטבעיות של המקבל והן מהאונה המושתלת של התורם13,14,15. כדי להתגבר על כך, אנו מציגים שיטה להידוק האזורים ההילאריים שיכולה להניב תובנה מדויקת יותר לגבי מצב הריאות המושתלות והילידיות. בנוסף, חשוב לקחת בחשבון את נפח PBS המשמש לאיסוף נוזל BAL מכל צד של הריאות מכיוון שנוזל BAL מכיל גורמים מסיסים רבים כגון ציטוקינים וכימוקינים הנמדדים על ידי ריכוז. נרמול נפח הנוזל המוחדר לנפח המשוער של קיבולת הריאות יכול לעזור בהשוואה. עם ארבע אונות בצד ימין ואונה אחת בצד שמאל, לכל אחת מחמש האונות של החולדה יש נפח שונה ושטח פנים שונה16. על פי מחקר קודם על מדידת נפח של אונות ריאה על ידי בקר ואחרים, מתוך הנפח הכולל של הריאה כולה נפח האונות הימניות הוא 63% (4400 מ"מ 3) והאונה השמאלית היא 37% (2500 מ"מ3). לכן, אנו ממליצים כי נפח PBS המשמש לאיסוף נוזל BAL יחושב ככפול נפח הגאות (7.2 מ"ל / ק"ג) כפול 63% עבור הריאה הימנית ו -37% עבור הריאה השמאלית. על ידי שימוש בגישה זו, ניתן לשלוט טוב יותר במשתנים כמו משקל גוף ותזמון10,16.

בסך הכל, בדו"ח זה נדגים כמה שינויים במודל הניסויי הסטנדרטי של השתלת ריאות בחולדות שיכולים לייעל את ההליך ולהגדיל את היכולת להפיק נתונים מדויקים ושופעים יותר מכל ניסוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

חולדות ספראג-דולי זכרים (180-270 גרם משקל גוף) נרכשו באופן מסחרי (למשל, Envigo) ושוכנו בתנאים נטולי פתוגנים במתקן בעלי החיים של אוניברסיטת אוהיו. כל ההליכים בוצעו באופן הומני על פי ה-NIH והמדריך של מועצת המחקר הלאומית לטיפול אנושי ושימוש בחיות מעבדה ובאישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אוהיו (פרוטוקול IACUC # 2012A00000135-R2).

1. הגדרה ראשונית

  1. הגדר מכשירים כירורגיים.
    הערה: זהו ניתוח שאינו הישרדותי. אם רוצים לבצע ניתוח הישרדות, יהיה צורך לנקוט במכשירים סטריליים ובאמצעי זהירות מפני מחסום.
    1. הפעל את ציוד ניטור הדופק/ריווי החמצן ואת לוח ההתחממות ל-42°C.
    2. הפעל את מכונת האוורור וההרדמה כדי לחמם מראש את מאייד האיזופלורן.
      הערה: יש להשתמש בנפח גאות ושפל (Td) של 7.2 מ"ל/ק"ג, לחץ תפוגה חיובי (PEEP) של 2 ס"מ ג'2O וקצב נשימה של 80 פעימות לדקה.
    3. מלאו את מזרק ההרדמה ב-10 מ"ל איזופלורן נוזלי והרכיבו את המזרק על מכונת האוורור וההרדמה.
    4. הפעל את המיקרוסקופ הכירורגי כאשר הגובה והמיקוד מותאמים להעדפות המיקרומנתח.
    5. הפעל את המכשיר electrocautery.
  2. הכינו ופרשו כלי ניתוח (איור 1).
    הערה: כל כלי הניתוח היו autoclaved ב 121 ° C במשך 30 דקות.
  3. לאסוף ולתעד את משקל הגוף של חולדות תורמות ומקבלות.
  4. השתמש בטבלה 1 ובמשקל הגוף של החולדה כדי לקבוע את המד הנכון של קטטר אנגיו (20, 18, 16, 14 או 12 גרם) לשימוש ליצירת אזיקים.
  5. הכינו אזיקים לעורק הריאה (PA), לסימפונות (Br) ולווריד הריאה (PV) באמצעות מדריך הגודל המבוסס על משקל הגוף (טבלה 1 ואיור 2).
    1. הניחו צנתר אנגיו בגודל 20 גרם, 18 גרם, 16 גרם, 14 גרם או 12 גרם (איור 2A-E) על משטח סטרילי מתחת למיקרוסקופ הניתוחי.
    2. לאחר מכן השתמשו בלהב כירורגי צלעות-גב #11 (איור 2F) כדי לחתוך את צנתר האנגיו בזווית של 90° וליצור גוף שרוול באורך 2 מ"מ עם לשונית בגודל 1 מ"מ X 1 מ"מ (רוחב x גובה) בחלק העליון של גוף השרוול (איור 2G).
    3. יש לאחסן את האזיקים במי מלח סטריליים עד שהם מוכנים לשימוש.
  6. הכינו פתרונות.
    1. הכינו תערובת של קטמין וקסילזין בבקבוקון הזרקה סטרילי על ידי הוספת 1 מ"ל קסילזין (100 מ"ג/מ"ל) ל-10 מ"ל קטמין (100 מ"ג/מ"ל).
      הערה: תאריך התפוגה של קוקטייל זה נקבע באמצעות תאריך התפוגה המוקדם ביותר של הרכיבים שבהם נעשה שימוש.
    2. שאבו לתוך מזרקים את המינון המתאים לחולדות (0.1 מ"ל של תערובת קטמין/קסילזין לכל 100 גרם של משקל גוף של חולדה; למשל, עבור 200 גרם חולדה, 0.2 מ"ל של תערובת קטמין/קסילזין יסופקו).
      הערה: מינון זה יספק 91 מ"ג/ק"ג קטמין ו-9.1 מ"ג/ק"ג קסילזין לחולדה, ואמור להרדים חולדה למשך 60-80 דקות.
    3. הכינו הפרין שיועבר במינון של 1,000 U/kg.
    4. אחסנו את תמיסת המלח, PBS ותמיסת השימור על קרח (Table of Materials).

2. הכנת חולדות מתורם

  1. יש להשרות הרדמה בחולדה התורמת על ידי הזרקה תוך צפקית של תערובת קטמין וקסילזין והמתנה ~ 10 דקות להתפתחות מישור כירורגי של הרדמה שניתן להעריך על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן.
  2. יש לגלח את אזור החתך באמצעות קוצצים אלקטרוניים.
  3. הניחו את החולדה התורמת במצב שכיבה על קרש החימום הכירורגי ונגבו את אזור החתך בגזה סטרילית ספוגה בבטדין. לאחר מכן נגבו את האזור עם ספוגית אלכוהול איזופרופיל 70%. חזור על הפעולה 3 פעמים.
  4. בצעו חתך עור בקו האמצע של 3 עד 4 ס"מ באמצע הצוואר באמצעות מספריים ונתחו בזהירות רקמות ושרירים תת עוריים באמצעות מלקחיים (במקום מספריים כדי למנוע דימום).
  5. לאינטובציה אנדוטרכאלית יש להשחיל תפר משי 4-0 סביב קנה הנשימה ולהחדיר צנתר אנגיו 16 גרם לקנה הנשימה. קשרו את התפר סביב קנה הנשימה בחוזקה עם קשר כפול, ולאחר מכן סיימו עם קשר יחיד כדי להחזיק את קטטר האנגיו במקומו.
  6. חבר את קטטר האנגיו למכונת ההנשמה ושמור על מישור כירורגי של הרדמה בחולדה עם 1-2% איזופלורן.
  7. ביצוע לפרו-סטרנטומיה כחתך משולב בקו אמצע וחתך רוחבי באמצעות מספריים.
  8. הזריקו להפרין (1,000 U/kg) מזרק אינסולין דרך הווריד הנבוב התחתון (IVC) והמתינו 10 דקות לזרימת דם מערכתית.
    הערה: מתן זה של הפרין מונע קרישי דם בריאה התורמת.
  9. נתחו את הסרעפת בזהירות על ידי חיתוך לאורך קשת בית החזה, ולאחר מכן חשפו את חלל בית החזה על ידי מעקב אחר עצם החזה לצוואר.

3. ריאות תורם, איסכמיה חמה ורכש

  1. הרדימו את החולדה התורמת על ידי חיתוך IVC.
  2. בזמן שהריאות עדיין מאווררות, חתכו את האוריקים הימניים והשמאליים עם מספריים קפיציים מנתחים מיקרו וכבידה שוטפים את הריאות עם 20 מ"ל של תמיסת שימור במזרק התלוי ב 28 ס"מ H2O על ידי כוח הכבידה המחובר לצינורות וצנתר אנגיו 18 G המוחדר ישירות דרך עורק הריאה.
  3. נתקו את מכונת ההנשמה מהצינור האנדוטרכאלי וחברו אותו למזרק 5 מ"ל מלא בנפח אוויר תקין בהתאם למשקל הגוף.
    הערה: ניתן לחשב את נפח האוויר לניפוח ריאות כמו עם פעמיים מנפח הגאות (Td = 7.2 מ"ל/ק"ג), למשל, לחולדה של 200 גרם יהיה Td של 1.44 מ"ל והכפלתו ב-2 תהיה שווה ל-2.88 מ"ל אוויר הדרוש לניפוח ריאות.
  4. לנפח את ריאות התורם.
  5. שים מהדק Yasargil על קנה הנשימה כדי לשמור על הריאות מנופחות, ולכסות את הריאות ואת הלב עם גזה כותנה סטרילית. לחות את הגזה במי מלח, עטפו את החולדה התורמת עם כרית תחתונה, והשאירו על לוח ניתוח החימום למשך שעה אחת כדי לגרום לאיסכמיה חמה בריאות (איור 3).
  6. לאחר שעה אחת של איסכמיה חמה, הבלו את גוש הלב-ריאה עם מספריים ומלקחיים אביביים מנתחים מיקרו ומניחים על גזה סטרילית ספוגה PBS קר כקרח על צלחת פטרי סטרילית על קרח.
    הערה: כל השלבים הבאים צריכים להתרחש כאשר הריאות נמצאות על צלחת פטרי על קרח.
  7. בזהירות לחתוך רצועות ריאה עם מיקרו לנתח מספריים קפיץ כדי להפריד את הריאה השמאלית מן הוושט ואת האונה שלאחר caval.
  8. חתכו בזהירות את אזור הריאה השמאלית עם מספריים קפיציים Vannas-Tubingen ורכשו את PV, PA ו- Br השמאליים.
  9. הניחו אזיקים על PV, PA או Br (איור 4A-C).
    1. השתמש hemostat יתוש לתפוס את הכרטיסייה שרוול.
    2. השתמש במלקחיים עדינים כדי לתפוס את הקצה הדיסטלי של PV, PA, או Br דרך גוף השרוול המתאים, לנתק את הרקמה הנוספת סביב השרוול, ולאבטח באמצעות 8-0 תפר ניילון. השתמש מספריים קפיץ Vannas-Tubingen כדי לחתוך רקמות נוספות ואת השרוול סביב גוף השרוול.
  10. שמרו על הריאה התורמת מכוסה בגזה ספוגה במי מלח על צלחת הפטרי על קרח עד שהיא מוכנה להשתלה בחולדה המושתלת.
    הערה: זמן איסכמיה קרה ממוצע הוא 84 דקות ± 11 דקות S.D.

4. הכנת חולדה מושתלת

  1. השראת הרדמה בחולדה המקבלת באותו אופן כמו החולדה התורמת על ידי הזרקה תוך-צפקית של תערובת קטמין וקסילזין (0.1 מ"ל ל-100 גרם חולדה) והמתנה של 10 דקות להתפתחות מישור כירורגי של הרדמה שניתן להעריך על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן.
  2. יש לגלח את אזור החתך באמצעות קוצצים אלקטרוניים.
  3. הניחו את החולדה התורמת במצב שכיבה ונגבו את אזור החתך בגזה סטרילית ספוגה בבטדין. לאחר מכן נגבו את האזור עם ספוגית אלכוהול איזופרופיל 70%. חזור על הפעולה 3 פעמים.
  4. לפני שהחולדה מאובטחת למכונת האוורור, ציירו קווים על החזה של החולדה כהכנה למציאת החלל הבין-קוסטליהרביעי .
    1. מדדו את החזה מהחריץ העל-סטרנלי ועד לתהליך הקסיפואיד ושרטטו קו (איור 5A).
    2. באמצע הקו הזה, ציירו קו לאורך הצד השמאלי של החזה שמודד מחצית מהמדידה מהחריץ העל-סטרנלי ועד לתהליך הקסיפואיד (איור 5A ו-B).
  5. בצעו אינטובציה למושתל באמצעות צנתר אנגיו 16G באמצעות הדמיה באמצעות כבל סיב אופטי המחובר לאור LED מערכת האינטובציה האנדוטרכאלית.
  6. חבר את קטטר האנגיו למכונת ההנשמה ושמור על מישור כירורגי של הרדמה עם איזופלורן 1-2%.
  7. כדי למצוא את החלל הבין-קוסטליה-4 , מצאו את האזור בדופן בית החזה שבו ניתן לחוש דחף לבבי מוחשי חזק (איור 5C, עיגול אדום).
  8. במיקום זה, חתכו את העור עם מספריים ואת השריר עם מספריים קפיציים מיקרו מנתחים, והשתמשו במשחזר כדי לפתוח את החלל הבין-קוסטליהרביעי בצורה רחבה ככל האפשר (איור 5D ו-E).
    הערה: השתמש בצריבה חשמלית כדי למנוע או לעצור דימום במהלך דיסקציה של השריר.
  9. לאחר פתיחת החלל הבין-קוסטלי לרווחה, נתחו בזהירות את הרצועות סביב הריאה השמאלית של הנמען באמצעות מספריים קפיציים של Vannas-Tubingen ומשכו את הריאה מאזור החזה באמצעות מקלוני צמר גפן סטריליים ומלקחיים.
  10. מניחים גזה סטרילית סביב הריאה השמאלית ומחזיקים אותה עם מהדק בולדוג דיפנבאך.
  11. החל מהדק Yasargil על אזור hilar הריאה השמאלית קרוב ככל האפשר.

5. אנסטומוזות

  1. אנסטומוזה של וריד ריאתי (PV)
    1. מניחים 7-0 תפר ניילון סביב PV של הנמען.
    2. חותכים את PV של המקבל באמצעות מספריים קפיץ Vannas-Tubingen על ידי חיתוך רוחבי של הוורידים המגזריים העליונים והתחתונים בצורה רחוקה ככל האפשר ושטף דם עם 0.2 מ"ל של מלוחים heparinized (1 U / mL) באמצעות מזרק אינסולין.
    3. מניחים את הריאה התורמת עדיין עטופה בגזה סטרילית קרה כקרח רטובה לתוך חלל בית החזה.
    4. הכנס את ה-PV האזוק של התורם לתוך ה-PV של הנמען, ולאחר מכן אבטח באמצעות תפר הניילון 7-0 שהוצב מראש (איור 6).
  2. אנסטומוזה של הסימפונות (Br)
    1. מניחים 7-0 תפר ניילון סביב Br של הנמען.
    2. חותכים את Br של הנמען על ידי חיתוך דרכי הנשימה המגזריות העליונות והתחתונות בצורה רוחבית ככל האפשר עם מספריים קפיציים Vannas-Tübingen.
    3. הכניסו את ה-Br האזוק של התורם ל-Br של המקבל והדקו אותו באמצעות תפר ניילון 7-0 שהוצב מראש (איור 6).
  3. אנסטומוזה של עורק הריאה (PA):
    1. מניחים 7-0 תפר ניילון סביב הרשות הפלסטינית של הנמען.
    2. חותכים את הרשות הפלסטינית של המקבל מנדן ההרפתקה שלה, חותכים מחצית מהיקף הכלי במספריים קפיציים של Vannas-Tubingen, ולאחר מכן שוטפים דם ברשות הפלסטינית עם 0.2 מ"ל מלח הפרין (1 U/mL) באמצעות מזרק אינסולין.
    3. הכניסו את הרשות האזוקה של התורם לתוך הרשות הפלסטינית של המקבל והדקו באמצעות תפר הניילון 7-0 שהוצב מראש (איור 6).

6. רפרפוזיה

  1. הסירו את מהדק Yasargil על ההילום כדי לאפשר זילוח מחדש ואוורור של הריאה המושתלת (איור 7).
  2. נתחו את הריאה השמאלית הטבעית של הנמען באמצעות מיקרו ניתוח, מספריים ומלקחיים.
  3. מקם בזהירות מחדש את הריאה השמאלית המושתלת לתוך בית החזה של המושתל.
  4. סגור את חתך בית החזה באמצעות תפר ניילון 6-0.
    1. הניחו שלושה תפרי ניילון 6-0 עם קשרים כפולים פשוטים סביב הצלעות עדיפותעל הצלע הרביעית ונחותותמצלע 5 (איור 8A).
    2. השתמשו בהמוסטטים כדי לאסוף את שלושת התפרים יחד (איור 8B).
    3. הגדל את ה-PEEP ל-6 ס"מ H2O בהגדרות האוורור.
    4. קשרו את כל שלושת הקשרים בו זמנית על-ידי משיכה הצידה כדי לסגור את הפצע (איור 8C).
    5. יש להקטין את ה-PEEP ל-2 ס"מ ג'2O באופן מיידי.
    6. סגור את העור בתפר ניילון 6-0.
      הערה: המעבדה שלנו חוקרת את השלב החריף שלאחר ההשתלה, כך שהחולדה המושתלת במודל זה שורדת 3 שעות לאחר ההשתלה תחת הנשמה והרדמה ולאחר מכן נאספות דגימות.

7. אוסף דגימות ניסיוניות (פלזמה, רקמת ריאה)

  1. עבור דגימות בקרה, לאסוף את האונות הימניות של התורם לאחר 3 שעות reperfusion תקופה הוא החל.
    1. הקפיאו בהצמדה את האונה העליונה ואת האונה הפוסט-קוולית לצורך ניתוח ביטוי חלבונים או רנ"א, שמרו על האונה האמצעית עבור היסטולוגיה, והשתמשו באונה התחתונה עבור יחס משקל רטוב ליבש (איור 9A).
  2. 10 דקות לפני תום זמן הזילוח של 3 שעות, התכוננו לקצור את הדגימות של המקבל על ידי הזרקת הפרין (1,000 U/kg) עם מזרק אינסולין לווריד הצוואר.
    הערה: מתן זה של הפרין מונע קרישי דם בריאות ומאפשר שטיפה יסודית יותר בזמן הרכישה.
  3. אוסף פלזמה
    1. בסוף תקופת הרפרפוזיה של 3 שעות, לאסוף 1 מ"ל של דם עם מזרק באמצעות IVC.
    2. אחסנו על קרח ולאחר מכן צנטריפוגה ב 2,000 x גרם במשך 10 דקות כדי לקצור פלזמה.
  4. הרדימו את החולדה המקבלת על ידי חיתוך IVC כדי לאפשר הרחקה.
  5. נתחו את הסרעפת לאורך קשת בית החזה וחשפו את חלל בית החזה על ידי ניתוח כלוב הצלעות.
  6. יש לאסוף נוזל BAL מהריאות המקוריות או המושתלות במידת הצורך (אופציונלי).
    הערה: אם יחס משקל רטוב ליבש או היסטולוגיה מבוצעת על הריאה, אין לבצע איסוף נוזלי BAL מכיוון שהוא יכול להשפיע על התוצאות.
    1. יש להשחיל תפר משי 4-0 סביב קנה הנשימה ולקשור קשר כפול הדוק סביב קנה הנשימה וצינור האינטובציה למניעת דליפת נוזלים.
    2. חשב את כמות PBS קר כקרח עבור איסוף נוזל BAL מהאונות הימניות והאונה השמאלית.
      הערה: יחס הנפח עבור הריאה הימנית הוא 63% ואילו יחס הנפח עבור הריאה השמאלית הוא 37%16. לכן, כדי לקבוע את כמות PBS להחדיר לכל צד, יש לחשב את נפח הגאות ככפול נפח הגאות (Td = 7.2 מ"ל / ק"ג) כפול 63% עבור הריאה הימנית ו -37% עבור הריאה השמאלית.
    3. הניחו מהדק Yasargil על אזור הריאה השמאלית (איור 10A), ובעזרת מזרק המחובר לצנתר האנגיו, חדירו את הכמות המחושבת של PBS קר כקרח לריאה הימנית (האונות הטבעיות של הנמען) ואספו את נוזל ה-BAL על-ידי משיכה עדינה למעלה על בוכנה המזרק. בצע פעמיים.
      הערה: יש לצפות להתאוששות של 70-80% של נוזל מוחדר.
    4. הסירו את מהדק Yasargil על הריאה השמאלית והניחו את המהדק על אזור הילאר הריאה הימני (איור 10B).
    5. לאסוף נוזל BAL מאונה שמאל מושתל באותו אופן שבו הוא נאסף עבור האונות הימניות, ולאחר מכן להסיר את המהדק על אזור הריאה הילר הימני.
  7. חותכים את האוריקים מימין ומשמאל עם מספריים קפיציים לניתוח מיקרו וסומקים ריאות על ידי כוח הכבידה דרך הרשות באמצעות צנתר אנגיו 18 G המחובר לצינורות ומזרק עם 20 מ"ל של תמיסת שימור מקוררת מראש התלויה ב 28 cmH2O.
  8. איסוף דגימות מהריאה של הנמען.
    1. הקפיאו בהצמדה את האונה העליונה ואת האונה הפוסט-קוולית לצורך ניתוח ביטוי חלבונים או רנ"א, שמרו על האונה האמצעית עבור היסטולוגיה, והשתמשו באונה התחתונה עבור יחס משקל רטוב ליבש) (איור 9A).
    2. חלקו את האונה השמאלית המושתלת השמאלית לשלושה חלקים: האזור העליון שנאסף עבור הקפאת הצמדה, האזור האמצעי עבור היסטולוגיה, והאזור התחתון עבור יחס משקל רטוב ליבש (איור 9B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

על מנת למדוד בצקת ריאות חושב יחס המשקל הרטוב ליבש. האונה הטבעית של התורם, האונה המושתלת והאונה הטבעית של המקבל נאספו כמתואר בפרוטוקול ונשקלו מיד למשקל רטוב, יובשו ב-60 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות, ואז נשקלו שוב למשקל היבש. עלייה ביחס משקל רטוב ליבש תעיד על בצקת ריאות. התוצאות שלנו מצביעות על כך שלאונה המושתלת הייתה עלייה משמעותית ביחס משקל רטוב ליבש בהשוואה לאונה הטבעית של התורם או המקבל (p=0.0050, n=6/group; איור 11).

גודל אנג'יו-קטטר לחפתים
משקל גוף חולדה (גרם) אבא בר PV
180-200 20 גרם 18 גרם 16 גרם
200-230 18 גרם 16 גרם 14 גרם
230-250 18 גרם 14 גרם 14 גרם
250-270 18 גרם 14 גרם 12 - 14 גרם
מעל 270 16 גרם 14 גרם 12 גרם

טבלה 1. מדריך מידות לאזיקים. גודל עורק הריאה (PA), הסימפונות (Br) או וריד הריאה (PV) קשור למשקל הגוף. בהתאם למשקל הגוף ולסוג השרוול שאתם מכינים, ניתן גודל אנגיו-קטטר מומלץ.

Figure 1
איור 1. כלים כירורגיים. (A) מספריים עדינים, (B) מלקחיים, (C-E) מלקחיים מיקרוכירורגיים, (F) Dumont #5 מלקחיים עדינים, (G) מספריים קפיציים Vannas-Tubingen ומספריים לניתוח מיקרו Castroviejo, (H) המוסטט יתוש Halsted, (J) retractor, (K) מהדקים Yasargil, (L) מהדק בולדוג Dieffenbach, (M) hemostats מעוקל, ו (N) מוליך מהדק Yasargil. כל הכלים צריכים להיות autoclaved ב 121 ° C במשך 30 דקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. הכנת שרוול בגדלים שונים של אנגיו-קטטר ולהב כירורגי צלעות גב #11. גודל צנתר האנגיו שנבחר לשרוול נקבע על ידי מדריך גודל השרוול (טבלה 1) שלוקח בחשבון את משקל הגוף של החולדה והאם השרוול מיועד לעורק הריאה (PA), לסימפונות (Br) או לווריד הריאה (PV). צנתרי אנגיו (A) 20 G, (B) 18 G, (C) 16 G, (D) 14 G, או (E) 12 G נחתכים עם (F) צלעות גב כירורגי #11 כמתואר בפרוטוקול, ומאוחסנים במי מלח עד הצורך. (ז) אורך גוף השרוול הוא 2 מ"מ ובחלק העליון של גוף השרוול נותרת לשונית בגודל 1 מ"מ X 1 מ"מ (רוחב x גובה) לטיפול בגוף השרוול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. איסכמיה חמה. הריאות נשטפות בתמיסת השימור דרך עורק הריאה, מנופחות בנפח אוויר כפול מנפח הגאות והשפל, ואז נעטפות בכרית תחתונה ומוחזקות על קרש החימום של הניתוח כדי לשמור על החולדה בטמפרטורת גוף רגילה למשך שעה אחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4. איזוק של ריאות תורם PV, PA, ו Br. (A) וריד ריאתי, PV (B) עורק ריאתי, PA, או (C) ברונכוס, Br, מוכנס דרך שרוול בגודל תקין, קטוע, מאובטח עם 8-0 תפר ניילון, ולאחר מכן (D) מאוחסן על גזה סטרילית ספוגה במי מלח קרים כקרח על צלחת פטרי סטרילית על קרח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5. מדידה וניתוח במרחב הבין-קוסטלי הרביעי. (A) החולדה המקבלת מונחת על הסיפון, והחזה נמדד מהחריץ העל-סטרנלי לתהליך הקסיפואיד ונמתח קו. (B) בנקודת האמצע של הקו הזה משורטט קו נוסף לצד שמאל במחצית האורך. (C) לאורך קו זה, המיקרוכירורג צריך להרגיש לאזור שבו דחף הלב הוא החזק ביותר כדי להבטיח את המיקום הנכון של החלל הבין-קוסטליהרביעי (עיגול אדום). (D) העור והשריר נחתכים לאחר מכן במספריים עדינים. (E) לאחר מכן משתמשים במשחזר כדי לפתוח את החלל לרווחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6. אנסטומוזיס. האזיקים (A) PV (B) Br, או (C) PA של התורם מוחדרים לתוך PV, Br או PA של הנמען, ולאחר מכן מאובטחים באמצעות תפר ניילון 7-0. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7. רפרפוזיה. לאחר השלמת האנסטומוזות, ניתן להתחיל את הרפרפוזיה על ידי הסרת המהדק, והחולדה המושתלת שורדת 3 שעות תחת הנשמה והרדמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8. סגירת פצע. (A) שלושה תפרי ניילון 6-0 עם קשרים כפולים פשוטים ממוקמים סביב הצלעות עדיפותעל הצלע הרביעית ונחותותמהצלע החמישית. (B) השתמש בהמוסטטים בשתי הידיים כדי לאסוף את שלושת התפרים יחד ולהגדיל את ה-PEEP ל-6 ס"מ H2O בהגדרות האוורור. (C) לקשור את כל שלושת הקשרים בו זמנית על ידי משיכה למעלה ומשם כדי לסגור את הפצע, להקטין PEEP ל 2 ס"מ2 O מיד, ולסגור את העור עם תפר ניילון 6-0. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9. איסוף רקמת ריאה. (A) עבור האונות הטבעיות של התורם או הנתרם, האונה העליונה והאונה הפוסט-קוולית ניתנות להקפאה לצורך ניתוח ביטוי חלבונים או רנ"א, האונה האמצעית יכולה להישמר עבור היסטולוגיה, והאונה התחתונה יכולה לשמש ליחס משקל רטוב ליבש. (B) עבור האונה המושתלת, אספו את האזור העליון עבור הקפאת הצמדה, האזור האמצעי עבור היסטולוגיה, או האזור התחתון עבור יחס משקל רטוב ליבש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 10
איור 10. יישום המהדק לאיסוף נוזל BAL סלקטיבי. כדי להימנע מדגימה מאוגמת, נוזל BAL יכול להיאסף מהריאה הימנית (ילידית) או השמאלית (מושתלת). (A) ניתן להדק את אזור הריאה השמאלית כדי לאסוף נוזל BAL מהאונות הימניות. (B) ניתן להדק את אזור הריאה הימנית כדי לאסוף נוזל BAL מהאונה השמאלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 11
איור 11. יחס משקל רטוב ליבש. יחס משקל רטוב ליבש חושב כדי למדוד בצקת ריאות וניתן להשתמש בו כדי לציין כמה טוב עברה ההשתלה. האונה הטבעית של התורם, האונה המושתלת, או האונה הטבעית של המקבל נאספה כמתואר בפרוטוקול ונשקלה מיד למשקל רטוב, יובשה ב 60 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות, ולאחר מכן נשקלה שוב עבור המשקל היבש. נלקח יחס בין משקל רטוב למשקל יבש. היחס בין האונה המושתלת גדל משמעותית בהשוואה לאונות הטבעיות של התורם או הנתרם. n=6 חולדות/קבוצה וסורגים מייצגים ממוצע ± SD. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ANOVA עם ניתוח פוסט-הוק של Tukey. ** עמ<0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בדו"ח זה, התערבנו במספר שלבים קריטיים בפרוטוקול השתלת ריאות של חולדות כדי לייעל את ההליך. בעוד שטכניקות אזיק שונות להשתלת ריאות של חולדות דווחו 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15, התהליך עדיין יכול להיות סובייקטיבי וקשה למיקרוכירורגים ליישם. הדגשנו כי יש להשתמש בגודל הנכון של אזיקים עבור PV ו- PA כדי לספק דם או Br כדי לספק אוויר לריאה המושתלת, וסיפקנו דרך אובייקטיבית יותר לקבוע גודל שרוול אופטימלי בהתבסס על משקל הגוף של החולדה. כדי לגרום באופן עקבי יותר לאיסכמיה חמה של הריאות, נתנו המלצות על ניפוח ריאות, הידוק וכיצד לשמור על חום החולדה במהלך זמן איסכמיה חמה של שעה אחת. במהלך ההליך של הנמען, זה יכול להיות קשה לאתר אתהחלל intercostal 4. המלצנו לאתר עמדה זו בצורה מדויקת יותר על ידי שימוש בשיטת מדידה ותחושה של דחף לבבי. בזמן הרפרפוזיה, כדי לסגור טוב יותר את הפצע, הראינו גם טכניקה של טיפול בתפרים והתאמת PEEP שיכולה לסגור את הפצע מהר יותר ולמנוע ניפוח יתר ופגיעה בריאה. לבסוף, הצגנו אסטרטגיות לאיסוף רקמות ונוזלי BAL המאפשרות קצירת דגימות אובייקטיבית יותר שניתן להשוות בין ניסויים ומשקלי גוף שונים.

המגבלה המשמעותית ביותר של הטכניקות המתוארות היא עקומת הלמידה התלולה למדי של פעולת ההשתלה בכלל. עקומת הלמידה היא עקומת למידה שניתן להפחית באמצעות תרגול כירורגי עקבי ומסקירת טכניקות לפתרון בעיות בספרות. מגבלה נוספת היא שמודל זה חוקר את השלב החריף של IRI והשתלות שבו מתרחשים לראשונה שינויים ביוכימיים, שהוא מוקד המעבדה שלנו. מחקרים עתידיים צריכים לבדוק את פטנטיות הסימפונות וכלי הדם בלוחות זמנים ארוכים יותר לאחר ההשתלה.

בסך הכל, מודל בר-קיימא להשתלת בעלי חיים קטנים הוא קריטי להערכת התערבויות טיפוליות להשתלה ולפגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה (IRI). מודל השתלת הריאה של חולדות, במיוחד, שימושי כנספח לחקר זילוח ריאות Ex vivo של בעלי חיים קטנים (EVLP)17. זוהי גם חלופה מעשית יותר להשתלת ריאות מורין, מכיוון שהגודל האנטומי הגדול יותר מאפשר לחוקר להשיג רקמה מספקת לניתוחים מעמיקים יותר18. בנוסף, המודל חיוני לקביעת הכדאיות של השתלות ריאה של תורם לאחר התערבות טיפולית עם מולקולות קטנות חדשניות וטיפולי חלבון 19,20,21,22 או לתורם, לאיבר התורם באמצעות EVLP 17, או למקבל ומספק דרך רבת עוצמה לאסוף נתונים in vivo. האופטימיזציות שאנו מתארים בדו"ח זה חשובות למיקרוכירורגים שמטרתם להפחית את עקומת הלמידה שלהם ולהסיר סובייקטיביות מסוימת. על ידי שימוש באלגוריתם סטנדרטי לגודל שרוול ריאות, הגישה הניתוחית יכולה להיות יעילה ואובייקטיבית יותר. בתום תקופת ההשתלה, הגישה המובנית המתוארת לאיסוף נוזלים ורקמות BAL מספקת גם שימוש אחראי בבעלי חיים וניצול יעיל של זמנו של המיקרוכירורג על ידי מקסום ההשפעה של הנתונים שנאספו לכל ניסוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

BAW, YGL ו- JLK נתמכים באמצעות מענק המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R01HL143000. BAW נתמך באמצעות מענק משרד ההגנה (DOD) W81XWH1810787. SMB נתמך באמצעות מענק NIH R01DK123475. JM נתמך באמצעות מענקי NIH AR061385, AR070752, DK106394 ו- AG056919 וכן באמצעות מענק מחלקת ההגנה W81XWH-18-1-0787.

Acknowledgments

ללא.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 Gauge angio-catheter BD 382277
14 Gauge angio-catheter B. Braun 4251717-02
16 Gauge angio-catheter B. Braun 4252586-02
18 Gauge angio-catheter B. Braun 4251679-02
20 Gauge angio-catheter B. Braun 4252527-02
4-0 silk suture Surgical Specialties Corp. SP116
6-0 nylon suture AD Surgical S-N618R13
7-0 nylon suture AD Surgical S-N718SP13
8-0 nylon suture AD Surgical XXS-N807T6
Betadine Spray Avrio Health L.P UPC 367618160039
Clippers VWR MSPP-023326
Castroviejo micro dissecting spring scissors Roboz Surgical Instrument Co RS-5668
Dumont #5 - Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Electrocautery Macan MV-7A
Endotracheal intubation kit Kent Scientific ETI-MSE
Forceps Fine Science Tools 11027-12
Halsted-mosquito hemostat Roboz Surgical Instrument Co RS-7112
Heparin Fresnius Medical Care C504701
Insulin syringe Life Technologies B328446
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 66794-017-25
Isopropyl Alcohol Swabs BD 326895
Ketamine Hikma Pharmaceuticals PLC NDC 0413-9505-10
Dieffenbach Bulldog Clamp World Precision Instruments WPI14117
Needle holder/Forceps, Curved Micrins MI1542
Needle holder/Forceps, Straight Micrins MI1540
Perfadex Plus (Organ Preservation Solution) XVIVO Perfusion AB REF# 19950
PhysioSuite Kent Scientific PS-MSTAT-RT Used to check SpO2 and heartbeat
Retractor Roboz Surgical Instrument Co RS-6560
Saline PP Pharmaceuticals LLC NDC 63323-186-10
Scissors Fine Science Tools 14090-11
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System Kent Scientific SS-MVG-Module
Sterile  Cotton Gauze Pad Fisherbrand 22-415-469
Surgical Microscope Leica M500-N w/ OHS
Syringe 5mL BD 309646
Vannas-Tubingen Spring Scissors Fine Science Tools 15008-08
Xylazine Korn Pharmaceuticals Corp NDC 59399-110-20
Yasargil Clamp Aesculap, Inc FT351T Used to clamp bronchus
Yasargil Clamp Aesculap, Inc FT261T Used to clamp hilum
Yasargil Clamp Applicator Aesculap, Inc FT484T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 97 (4), 578-581 (1989).
  2. Zhai, W., et al. Simplified rat lung transplantation by using a modified cuff technique. Journal of Investigative Surgery. 21 (1), 33-37 (2008).
  3. Goto, T., et al. Simplified rat lung transplantation using a new cuff technique. Annals of Thoracic Surgery. 93 (6), 2078-2080 (2012).
  4. Guo, H., et al. Improvements of surgical techniques in a rat model of an orthotopic single lung transplant. European Journal of Medical Research. 18, 1 (2013).
  5. Tian, D., Shiiya, H., Sato, M., Nakajima, J. Rat lung transplantation model: modifications of the cuff technique. Annals of Translational Medicine. 8 (6), 407 (2020).
  6. Rajab, T. K. Anastomotic techniques for rat lung transplantation. World Journal of Transplantation. 8 (2), 38-43 (2018).
  7. Reis, A., Giaid, A., Serrick, C., Shennib, H. Improved outcome of rat lung transplantation with modification of the nonsuture external cuff technique. Journal of Heart and Lung Transplantation. 14 (2), 274-279 (1995).
  8. Sugimoto, R., et al. Experimental orthotopic lung transplantation model in rats with cold storage. Surgery Today. 39 (7), 641-645 (2009).
  9. Santana Rodriguez, N., et al. Technical modifications of the orthotopic lung transplantation model in rats with brain-dead donors. Archivos de Bronconeumología. 47 (10), 488-494 (2011).
  10. Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade. Journal of Surgical Research. 194 (2), 659-666 (2015).
  11. Rajab, T. K. Techniques for lung transplantation in the rat. Experimental Lung Research. 45 (9-10), 267-274 (2019).
  12. Iskender, I., et al. Effects of Warm Versus Cold Ischemic Donor Lung Preservation on the Underlying Mechanisms of Injuries During Ischemia and Reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
  13. Lin, X., et al. Five-year update on the mouse model of orthotopic lung transplantation: Scientific uses, tricks of the trade, and tips for success. Journal of Thoracic Disease. 4 (3), 247-258 (2012).
  14. Song, J. A., et al. Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats. Toxicological Research. 26 (3), 203-208 (2010).
  15. Chang, J. E., Kim, H. J., Yi, E., Jheon, S., Kim, K. Reduction of ischemia-reperfusion injury in a rat lung transplantation model by low-concentration GV1001. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (5), 972-979 (2016).
  16. De Backer, J. W., et al. Study of the variability in upper and lower airway morphology in Sprague-Dawley rats using modern micro-CT scan-based segmentation techniques. Anatomical Record. 292 (5), Hoboken. 720-727 (2009).
  17. Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), e52309 (2015).
  18. Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. Journal of Visualized Experiments. (65), e3947 (2012).
  19. Jia, Y., et al. Treatment of acute lung injury by targeting MG53-mediated cell membrane repair. Nature Communications. 5, 4387 (2014).
  20. Kim, J. L., et al. Pegylated-Catalase Is Protective in Lung Ischemic Injury and Oxidative Stress. Annals of Thoracic Surgery. , (2020).
  21. Beal, E. W., et al. D-Ala(2), D-Leu(5)] Enkephalin Improves Liver Preservation During Normothermic Ex Vivo Perfusion. Journal of Surgical Research. 241 (2), 323-335 (2019).
  22. Akateh, C., et al. Intrahepatic Delivery of Pegylated Catalase Is Protective in a Rat Ischemia/Reperfusion Injury Model. Journal of Surgical Research. 238, 152-163 (2019).

Tags

רפואה גיליון 176
מודל השתלת ריאה של חולדה של איסכמיה חמה / פגיעה ברפרפוזיה: אופטימיזציות לשיפור התוצאות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, Y. G., Kim, J. L., Palmer, A.… More

Lee, Y. G., Kim, J. L., Palmer, A. F., Reader, B. F., Ma, J., Black, S. M., Whitson, B. A. A Rat Lung Transplantation Model of Warm Ischemia/Reperfusion Injury: Optimizations to Improve Outcomes. J. Vis. Exp. (176), e62445, doi:10.3791/62445 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter