Summary
Her presenterer vi optimaliseringer til en rottelungetransplantasjonsmodell som tjener til å forbedre resultatene. Vi tilbyr en størrelsesguide for mansjetter basert på kroppsvekt, en målestrategi for å fastslå det 4. interkostalrommet, og metoder for sårlukking og BAL (bronkoalveolær skylling) væske- og vevsoppsamling.
Abstract
Fra vår erfaring med rottelungetransplantasjon har vi funnet flere forbedringsområder. Informasjon i eksisterende litteratur om metoder for å velge passende mansjettstørrelser for lungevenen (PV), lungearterien (PA) eller bronkus (Br) er variert, noe som gjør bestemmelsen av riktig mansjettstørrelse under rottelungetransplantasjon til en øvelse og feiling. Ved å standardisere mansjettteknikken for å bruke den minste effektive mansjetten som passer for størrelsen på karet eller bronkusen, kan man gjøre transplantasjonsprosedyren tryggere, raskere og mer vellykket. Siden diametrene til PV, PA og Br er relatert til kroppsvekten til rotta, presenterer vi en strategi for å velge en passende størrelse ved hjelp av en vektbasert guide. Siden lungevolum også er relatert til kroppsvekt, anbefaler vi at dette forholdet også bør vurderes når du velger riktig luftvolum for donorlungeinflasjon under varm iskemi, samt for riktig volum av PBS som skal innsettes under væskeansamling av bronkoalveolær skylling (BAL). Vi beskriver også metoder for interkostal romdisseksjon, sårlukking og prøvetaking fra både de innfødte og transplanterte.
Introduction
I over tre tiår har forskere modifisert og forbedret rottelungetransplantasjonsmodeller slik at dataene som genereres er mer konsistente og mer reflekterende for den faktiske kliniske tilstanden. I laboratoriets tid med å utføre denne modellen har vi bestemt fire forbedringsområder: mansjettteknikker for anastomoser, identifisering av mottakerens 4. interkostalrom, lungeinflasjon og sårlukking under mottakerens prosedyre, og høsting av prøver for analyse.
Modifikasjoner av mansjettteknikk for anastomoser kan forbedre hele transplantasjonsprosedyren ved å forkorte håndteringstiden for donorlungen 1,2,3,4,5,6 og gjøre anastomoseprosedyren raskere og teknisk enklere for mikrokirurgen. Selv om det er viktig å bruke mansjettene av riktig størrelse for å levere nødvendig blod og luftstrøm til den transplanterte lungen, er det begrenset veiledning om hvordan man skal velge størrelsen på mansjettene for lungevenen (PV), lungearterien (PA) eller bronkus (Br) 5,7,8,9. Siden diametrene til PV, PA og Br er relatert til kroppsvekten til donor- og mottakerrottene, foreslår vi at mansjettstørrelsen er basert på kroppsvekt. Denne rapporten gir en størrelsesguide for mansjetter basert på rottens kroppsvekt (180 g til over 270 g) som tjener til å optimalisere blod- og lufttilførselen til den transplanterte lungen (tabell 1).
Mens en nyere mikrokirurg med hell og enkelt kan skaffe en donorlunge under donorprosedyren, er transplantasjon av lungen under mottakerens prosedyre mer komplisert og avhengig av mikrokirurgens erfaring. Forsøk på å finne den 4. interkostalplassen for å få tilgang til mottakerens venstre lunge er en av de vanskeligere trinnene som holder litt subjektivitet og kan øke prosedyretiden. Derfor introduserer vi en enkel og objektiv metode for å hjelpe til med identifiseringen av 4. interkostalromplassering ved å bruke brystmålinger og hjertebank for å finne riktig område brystvegg for å dissekere 4,5,6,10,11,12.
Vi foreslår også en forbedring av donorlungeinflasjonen, som er en potensiell kilde til skade på organet. Donorlungen deflateres inntil reperfusjonen starter. Under suturering av 4th intercostal plass, blir donorlungen vanligvis oppblåst ved å øke PEEP fra 2 cmH 2 O til 6cmH2O. For å minimere lungeskade fra overinflasjon, foreslår vi en teknikk der tre 6-0 nylonsuturer plasseres rundt den 4. ribben dårligere enn 5-ribben med enkle doble knuter. Når det er tid for sårlukking, holdes endene av de tre suturene med hemostater i begge hender, såret lukkes på en gang ved å trekke opp på hver side, og PEEP reduseres umiddelbart til 2 cmH2O. På denne måten får lungen utvide seg kortest mulig10.
Ved avslutningen av et eksperiment ønsker forskeren ofte å samle inn mange typer prøver for mange typer analyser fra hver transplantasjon. For eksempel kan snap frosset vev, formalin fast vev, vev for våt-til-tørr vektforhold for å bestemme lungeødem, og bronkoalvelolær skylling (BAL) væske alle kan brukes til å vurdere hvor godt transplantasjonen gikk. Den tradisjonelle metoden for å samle BAL-væske tillater en blandet samlet prøve fra både mottakerens innfødte lober og donorens transplanterte lobe13,14,15. For å overvinne dette presenterer vi en metode for å klemme inn hilarområdene som kan gi mer presis innsikt i tilstanden til de transplanterte og innfødte lungene. I tillegg er volumet av PBS som brukes til å samle BAL-væske fra hver side av lungene, viktig å vurdere fordi BAL-væske inneholder mange løselige faktorer som cytokiner og kjemokiner som måles ved konsentrasjon. Normalisering av volumet av væsken som er innpodet til det estimerte volumet av lungekapasitet kan hjelpe til med sammenligning. Med fire fliker på høyre side og en på venstre side, har hver av rottens fem fliker forskjellig volum og overflateareal16. Ifølge en tidligere studie om volummåling av lungelapper av Backer og medarbeidere er volumet av høyre lunge av det totale volumet av hele lungen 63 % (4400 mm 3) og venstre 37 % (2500 mm3). Vi anbefaler derfor at volumet av PBS som brukes til å samle opp BAL-væske beregnes som to ganger tidalvolumet (7,2 ml/kg) multiplisert med 63 % for høyre lunge og 37 % for venstre lunge. Ved å bruke denne tilnærmingen kan man bedre kontrollere for variabler som kroppsvekt og timing10,16.
Alt i alt vil vi i denne rapporten demonstrere noen modifikasjoner av standard eksperimentell modell for rottelungetransplantasjon som kan gjøre prosedyren mer effektiv og øke evnen til å generere mer nøyaktige og rikelig data fra hvert eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mannlige Sprague-Dawley-rotter (180-270 g kroppsvekt) ble kjøpt kommersielt (f.eks. Envigo) og ble plassert under patogenfrie forhold ved Ohio State University Animal Facility. Alle prosedyrer ble humant utført i henhold til NIH og National Research Council's Guide for Humane Care and Use of Laboratory Animals og med godkjenning av The Ohio State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC protokoll # 2012A00000135-R2).
1. Første oppsett
- Sett opp kirurgiske enheter.
MERK: Dette er en ikke-overlevelse kirurgi. Hvis overlevelseskirurgi skal utføres, må sterile instrumenter og barriereforholdsregler tas.- Slå på utstyr for måling av hjertefrekvens/oksygenmetning og varmebrett til 42 °C.
- Slå på ventilasjons- og anestesimaskinen for å forvarme isofluranfordamperen.
MERK: Bruk et tidalvolum (Td) på 7,2 ml / kg, et positivt ende ekspiratorisk trykk (PEEP) på 2 cmH2O og en respirasjonsfrekvens på 80 bpm. - Fyll anestesisprøyten med 10 ml flytende isofluran og monter sprøyten på ventilasjons- og anestesimaskinen.
- Slå på operasjonsmikroskopet med høyden og fokuset tilpasset mikrokirurgens preferanser.
- Slå på elektrokauteriseringsenheten.
- Forbered og legg ut kirurgiske verktøy (figur 1).
MERK: Alt kirurgisk verktøy ble autoklavert ved 121 °C i 30 minutter. - Samle inn og registrer kroppsvekten til donor- og mottakerrotter.
- Bruk tabell 1 og rottens kroppsvekt for å bestemme riktig måler av angiokateter (20, 18, 16, 14 eller 12 G) som skal brukes til å lage mansjetter.
- Klargjør mansjetter for lungearterie (PA), bronkie (Br) og lungevene (PV) ved hjelp av størrelsesguiden basert på kroppsvekt (tabell 1 og figur 2).
- Plasser angiokateter størrelse 20 G, 18 G, 16 G, 14 G eller 12 G (figur 2A-E) på en steril overflate under kirurgisk mikroskop.
- Bruk deretter et ribberygget kirurgisk blad #11 (figur 2F) til å kutte angiokateteret i 90° vinkel for å danne et 2 mm langt mansjettlegeme med en 1 mm X 1 mm flik (bredde x høyde) øverst på mansjettkroppen (figur 2G).
- Oppbevar mansjettene i sterilt saltvann til de er klare til bruk.
- Forbered løsninger.
- Tilbered en blanding av ketamin og xylazin i et sterilt injeksjonshetteglass ved å tilsette 1 ml xylazin (100 mg/ml) til 10 ml ketamin (100 mg/ml).
MERK: Utløpsdatoen for denne cocktailen bestemmes ved hjelp av den tidligste utløpsdatoen for komponentene som brukes. - Trekk opp riktig dosering for rottene i sprøytene (0,1 ml av ketamin/xylazinblandingen per 100 g rottekroppsvekt, f.eks. for en 200 g rotte, vil 0,2 ml ketamin / xylazinblanding bli gitt).
MERK: Denne dosen vil levere 91 mg / kg ketamin og 9,1 mg / kg xylazin til rotte og bør holde en rotte bedøvet i 60-80 minutter. - Tilbered heparin som skal gis i en dose på 1000 E/kg.
- Oppbevar saltvann, PBS og konserveringsløsning på is (materialfortegnelse).
- Tilbered en blanding av ketamin og xylazin i et sterilt injeksjonshetteglass ved å tilsette 1 ml xylazin (100 mg/ml) til 10 ml ketamin (100 mg/ml).
2. Forberedelse av donorrotter
- Indusere anestesi hos donorrotten ved intraperitonealt å injisere ketamin- og xylazinblandingen og vente ~ 10 min på at et kirurgisk anestesiplan skal utvikle seg som kan vurderes ved manglende respons på tåklemme.
- Barber snittområdet ved hjelp av elektroniske klippere.
- Plasser donorrotten i en liggende stilling på det kirurgiske oppvarmingsbrettet og tørk snittområdet med et sterilt gasbind fuktet med betadin. Tørk deretter området med en 70% isopropylalkoholserviett. Gjenta 3 ganger.
- Lag et 3 til 4 cm midtlinjet hudsnitt midt i nakken ved hjelp av saks og dissekere forsiktig ut subkutant vev og muskler ved hjelp av tang (i stedet for saks for å unngå blødning).
- Ved endotrakeal intubasjon trer du 4-0 silkessutur rundt luftrøret og setter inn et 16 G angiokateter i luftrøret. Bind suturen rundt luftrøret tett med en dobbel knute, og avslutt deretter med en enkelt knute for å holde angiokateteret på plass.
- Koble angiokateteret til ventilatoren og oppretthold et kirurgisk anestesiplan hos rotte med 1-2% isofluran.
- Utfør en laparo-sternotomi som et kombinert midtlinje- og tverrsnitt ved hjelp av saks.
- Injiser heparin (1000 E/kg) med en insulinsprøyte via vena cava inferior (IVC) og la det være 10 minutter for systemisk sirkulasjon.
MERK: Denne administrasjonen av heparin forhindrer blodpropp i donorlungen. - Dissekere membranen forsiktig ved å kutte langs thoraxbuen, og deretter avsløre thoraxhulen ved å følge brystbenet til nakken.
3. Donor lunge varm iskemi og anskaffelser
- Avlive donorrotta ved å kutte IVC.
- Mens lungene fortsatt ventilerer, kutt både høyre og venstre aurikler med mikrodissekerende fjærsaks og tyngdekraftspyling med 20 ml konserveringsløsning i en sprøyte som henger ved 28 cmH2O ved tyngdekraften koblet til slangen og et 18 G angiokateter som føres direkte gjennom lungearterien.
- Koble ventilatoren fra endotrakealslangen og koble den til en 5 ml sprøyte fylt med et riktig volum luft basert på kroppsvekt.
MERK: Volumet av luft for å blåse opp lungene kan beregnes som med to ganger tidevannsvolum (Td = 7,2 ml / kg), for eksempel vil en 200 g rotte ha en Td på 1,44 ml og multiplisere den med 2 vil tilsvare 2,88 ml luft som trengs for å blåse opp lungene. - Blås opp donorens lunger.
- Sett en Yasargil klemme på luftrøret for å holde lungene oppblåst, og dekke lungene og hjertet med sterilt bomullsgassbind. Fukt gasbindet med saltvann, pakk donorrotten med en underpute, og la den stå på oppvarmingsoperasjonsbrettet i 1 time for å indusere varm iskemi i lungene (figur 3).
- Etter 1 time varm iskemi, skjær hjerte-lungeblokken med mikrodissekerende vårsaks og tang og legg på sterilt gasbind fuktet med iskald PBS på en steril petriskål på is.
MERK: Alle de følgende trinnene skal skje mens lungene er på petriskålen på is. - Forsiktig snitt lungebånd med mikrodissekerende fjærsaks for å skille venstre lunge fra spiserøret og post-kavallappen.
- Trim forsiktig det venstre lungehilar området med Vannas-Tubingen vårsaks og anskaffer venstre PV, PA og Br.
- Plasser mansjetter på PV, PA eller Br (figur 4A-C).
- Bruk en mygghemostat for å ta tak i mansjettfanen.
- Bruk fin tang for å ta tak i den distale enden av PV, PA eller Br gjennom riktig mansjettkropp, evert det ekstra vevet rundt mansjetten, og fest med 8-0 nylonsutur. Bruk Vannas-Tubingen fjærsaks til å trimme ekstra vev og mansjetten rundt mansjettkroppen.
- Hold donorlungen dekket med gasbind fuktet med saltvann på petriskålen på is til den er klar til å transplanteres inn i mottakerrotta (figur 4D).
MERK: Gjennomsnittlig kald iskemitid er 84 min ± 11 min SD
4. Mottaker rotte forberedelse
- Indusere anestesi hos mottakerrotten på samme måte som donorrotten ved intraperitonealt å injisere ketamin- og xylazinblandingen (0,1 ml per 100 g rotte) og vente 10 minutter på at det utvikles et kirurgisk anestesiplan som kan vurderes ved manglende respons på tåklemme.
- Barbere snittområdet ved hjelp av elektroniske klippere.
- Plasser donorrotten i liggende stilling og tørk snittområdet med et sterilt gasbind fuktet med betadin. Tørk deretter området med en 70% isopropylalkoholserviett. Gjenta 3 ganger.
- Før rotta er festet til ventilasjonsmaskinen, tegn linjer på rottens bryst som forberedelse til å finne det 4.
- Mål brystet fra det suprasternale hakket til xiphoidprosessen og tegn en linje (figur 5A).
- På midten av denne linjen tegner du en linje langs venstre side av brystet som måler halvparten av målingen fra det suprasternale hakket til xiphoidprosessen (figur 5A og B).
- Intuber mottakeren ved hjelp av et 16 G angiokateter via visualisering ved hjelp av fiberoptisk kabel koblet til et LED-lys fra endotrakeal intubasjonssett.
- Koble angiokateteret til ventilatoren og oppretthold et kirurgisk anestesiplan med 1-2% isofluran.
- For å finne det 4. interkostalrommet, finn området av brystveggen der en sterk palpabel hjerteimpuls kan føles (figur 5C, rød sirkel).
- På dette stedet, snitt huden med saks og muskelen med mikrodissekerende fjærsaks, og bruk retractoren til å åpne det 4. interkostalrommet så bredt som mulig (figur 5D og E).
MERK: Bruk elektrisk cautery for å unngå eller stoppe blødning under muskeldisseksjon. - Når interkostalrommet er åpnet vidt, dissekerer du forsiktig leddbåndene rundt mottakerens venstre lunge ved hjelp av Vannas-Tubingen vårsaks og trekker lungen ut av brystområdet ved hjelp av sterile bomullspinner og tang.
- Plasser sterilt gasbind rundt venstre lunge og hold den med en Dieffenbach bulldogklemme.
- Påfør en Yasargil klemme på venstre lunge hilar området så proximally som mulig.
5. Anastomoser
- Lungevene (PV) anastomose
- Plasser 7-0 nylon sutur rundt mottakerens PV.
- Snitt mottakerens PV ved hjelp av Vannas-Tubingen fjærsaks ved å skjære de øvre og nedre segmentvenene på tvers så distalt som mulig og skyll ut blod med 0,2 ml heparinisert saltvann (1 U / ml) ved hjelp av en insulinsprøyte.
- Plasser donorlungen fortsatt innpakket med iskaldt, vått, sterilt gasbind i brysthulen.
- Sett donorens mansjettet PV inn i mottakerens PV, og fest deretter med den forhåndsplasserte 7-0 nylonsuturen (figur 6).
- Bronkial (Br) anastomose
- Plasser 7-0 nylon sutur rundt mottakerens Br.
- Snitt mottakerens Br ved å kutte øvre og nedre segmentale luftveier på tvers så distalt som mulig med Vannas-Tubingen fjærsaks.
- Sett donorens håndjern Br inn i mottakerens Br og fest med den forhåndsplasserte 7-0 nylonsuturen (figur 6).
- Lungearterie (PA) anastomose:
- Plasser 7-0 nylon sutur rundt mottakerens PA.
- Snitt mottakerens PA fra utilsiktet kappe, snitt halvparten av fartøyets omkrets med Vannas-Tubingen fjærsaks, og skyll deretter ut blod i PA med 0,2 ml heparinisert saltvann (1 U / ml) ved hjelp av en insulinsprøyte.
- Sett donorens PA i håndjern inn i mottakerens PA og fest den med den forhåndsplasserte 7-0 nylonsuturen (figur 6).
6. Reperfusjon
- Fjern Yasargil-klemmen på hilum for å muliggjøre reperfusjon og ventilasjon av den transplanterte donorlungen (figur 7).
- Dissekere mottakerens opprinnelige venstre lunge ved hjelp av mikrodissekerende vårsaks og tang.
- Forsiktig reposisjonere den transplanterte venstre lunge inn i mottakerens thorax.
- Lukk torakotomisnittet ved å bruke 6-0 nylonsutur.
- Plasser tre 6-0 nylonsuturer med enkle doble knuter rundt ribbeina som er bedre enn 4-ribben og dårligere enn 5-ribben (figur 8A).
- Bruk hemostater til å samle de tre suturene sammen (figur 8B).
- Øk PEEP til 6 cmH2O i ventilasjonsinnstillingene.
- Bind sammen alle tre knutene samtidig ved å trekke seg bort for å lukke såret (figur 8C).
- Reduser PEEP til 2 cmH2O umiddelbart.
- Lukk huden med 6-0 nylonsutur.
MERK: Vårt laboratorium studerer akuttfasen etter transplantasjonen, slik at mottakerrotten i denne modellen overlever i 3 timer etter transplantasjon under ventilasjon og anestesi, og deretter samles prøver inn.
7. Innsamling av eksperimentelle prøver (plasma, lungevev)
- For kontrollprøver, samle donorens høyre lobes etter at 3 timers reperfusjonsperioden er initiert.
- Snap-frys overlappen og postkavallappen for protein- eller RNA-ekspresjonsanalyser, bevar midtlappen for histologi, og bruk den nedre for våt-til-tørrvektforhold (figur 9A).
- Ved 10 minutter før slutten av 3 timers reperfusjonstid, forbered deg på å høste mottakerprøvene ved å injisere heparin (1000 E / kg) med en insulinsprøyte i halsvenen.
MERK: Denne administrasjonen av heparin forhindrer blodpropp i lungene og muliggjør en grundigere spyling på anskaffelsestidspunktet. - Plasma samling
- På slutten av 3 timers reperfusjonsperioden, samle 1 ml blod med en sprøyte via IVC.
- Oppbevares på is og sentrifugeres deretter ved 2000 x g i 10 minutter for å høste plasma.
- Avlive mottakerrotta ved å kutte IVC for å tillate ekssanguinering.
- Dissekere membranen langs thoraxbuen og avsløre thoraxhulen ved å dissekere ut ribbeholderen.
- Samle BAL-væske fra de innfødte eller transplanterte lungene om ønskelig (valgfritt).
MERK: Hvis våt-til-tørr vektforhold eller histologi utføres på lungen, bør BAL væskesamling ikke utføres siden det kan påvirke resultatene.- Tråd 4-0 silkesutur rundt luftrøret og bind en stram dobbel knute rundt luftrøret og intubasjonsrøret for å forhindre væskelekkasje.
- Beregn mengden iskald PBS for BAL-væskeoppsamling fra høyre lobes og venstre lobe.
MERK: Volumforholdet for høyre lunge er 63% mens volumforholdet for venstre lunge er 37%16. For å bestemme mengden PBS som skal dryppes inn på hver side, bør volumet derfor beregnes som to ganger tidalvolumet (Td = 7,2 ml/kg) multiplisert med 63 % for høyre lunge og 37 % for venstre lunge. - Plasser en Yasargil-klemme på venstre lungehillarområde (figur 10A), og med en sprøyte koblet til angiokateteret, drypp den beregnede mengden iskald PBS inn i høyre lunge (mottakerens innfødte) og samle BAL-væsken ved å trekke forsiktig opp sprøytestempelet. Utfør to ganger.
MERK: Man bør forvente 70-80% utvinning av innpodet væske. - Fjern Yasargil-klemmen på venstre lunge og plasser klemmen på høyre lungehilar område (figur 10B).
- Samle BAL-væske fra transplantert venstre lobe på samme måte som det ble samlet for høyre lober, og fjern deretter klemmen på høyre lungehillarområde.
- Skjær høyre og venstre aurikler med mikrodissekerende fjærsaks og skyll lungene ved hjelp av tyngdekraften gjennom PA ved hjelp av et 18 G angiokateter festet til slangen og en sprøyte med 20 ml forkjølt konserveringsløsning som henger ved 28 cmH2O.
- Samle prøver fra mottakerens lunge.
- Snap-fryse overlappen og postkavallappen for protein- eller RNA-ekspresjonsanalyser, bevare midtlappen for histologi og bruke den nedre for våt-til-tørrvekt-forhold) (figur 9A).
- Del venstre transplanterte venstre lobe i tre deler: den øvre regionen samlet for snap-frossen, den midterste regionen for histologi og den nedre regionen for våt-til-tørrvektforhold (figur 9B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å måle lungeødem ble våt-til-tørrvektforholdet beregnet. Donorens stedegne, den transplanterte og mottakerens opprinnelige ble samlet inn som beskrevet i protokollen og veid umiddelbart for våtvekt, tørket ved 60 °C i 48 timer og veide deretter igjen for tørrvekten. Et økt våt-til-tørr vektforhold vil være en indikasjon på lungeødem. Våre resultater indikerer at den transplanterte hadde en signifikant økning i våt-til-tørr-vektforhold sammenlignet med donorens eller mottakerens opprinnelige (p = 0,0050, n = 6 / gruppe; Figur 11).
| Angiokateterstørrelse for mansjetter | |||
| Kroppsvekt hos rotter (g) | PA | Br | PV |
| 180-200 | 20 G | 18 G | 16 G |
| 200-230 | 18 G | 16 G | 14 G |
| 230-250 | 18 G | 14 G | 14 G |
| 250-270 | 18 G | 14 G | 12 - 14 G |
| Over 270 | 16 G | 14 G | 12 G |
Tabell 1. Størrelsesguide for mansjetter. Størrelsen på lungearterien (PA), bronkus (Br) eller lungevenen (PV) er relatert til kroppsvekt. Avhengig av kroppsvekten og hvilken type mansjett du lager, er den anbefalte angiokateterstørrelsen gitt.
Figur 1. Kirurgiske verktøy. (A) Finsaks, (B) tang, (C-E) mikrokirurgisk tang, (F) Dumont #5 fine tang, (G) Vannas-Tubingen fjærsaks og Castroviejo mikrodissekerende saks, (H) Halsted-mygghemostat, (J) retractor, (K) Yasargil klemmer, (L) Dieffenbach bulldog klemme, (M) buede hemostater, og (N) Yasargil klemme applikator. Alle verktøy skal autoklaveres ved 121 °C i 30 minutter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Mansjettforberedelse med forskjellige størrelser angiokateter og rib-back kirurgisk blad #11. Størrelsen på angiokateteret som velges for mansjetten bestemmes av mansjettens størrelsesguide (tabell 1) som tar hensyn til rottens kroppsvekt og om mansjetten er for lungearterien (PA), bronkus (Br) eller lungevenen (PV). Angiokatetrene (A) 20 G, (B) 18 G, (C) 16 G, (D) 14 G eller (E) 12 G kuttes med et (F) ribberygget kirurgisk blad #11 som beskrevet i protokollen, og lagres i saltvann til det trengs. (G) Mansjettlegemets lengde er 2 mm og en 1 mm X 1 mm flik (bredde x høyde) er igjen på toppen av mansjetthuset for håndtering av mansjettlegemet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Varm iskemi. Lungene skylles med konserveringsløsningen gjennom lungearterien, oppblåses med to ganger tidevannsvolumet av luft, og deretter pakkes med en underpute og holdes på operasjonsvarmebrettet for å holde rotta ved normal kroppstemperatur i 1 time. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Cuffing av donor lunge PV, PA og Br. (A) Lungevenen, PV (B) lungearterien, PA, eller (C) bronkus, Br, settes inn gjennom en riktig størrelse mansjett, everted, sikret med 8-0 nylonsutur, og (D) deretter lagret på sterilt gasbind fuktet med iskaldt saltvann på en steril petriskål på is. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Måling og dissekering på 4. (A) Mottakerrotten legges liggende, og brystet måles fra det suprasternale hakket til xiphoidprosessen og en linje trekkes. (B) Midt på denne linjen tegnes en annen linje til venstre side i halve lengden. (C) Langs denne linjen bør mikrokirurgen føle etter et område der hjerteimpulsen er sterkest for å sikre riktig plassering av det 4. interkostalrommet (rød sirkel). (D) Huden og muskelen dissekeres deretter med fin saks. (E) Retractoren brukes deretter til å åpne rommet vidt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6. Anastomose. Donorens cuffed (A) PV (B) Br, eller (C) PA settes inn i mottakerens PV, Br eller PA, og deretter sikret med 7-0 nylonsutur. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7. Reperfusjon. Etter at anastomosene er fullført, kan reperfusjonen startes ved å fjerne klemmen, og mottakerrotten overlever i 3 timer under ventilasjon og anestesi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8. Sår lukking. (A) Tre 6-0 nylon suturer med enkle doble knuter er plassert rundt ribbeina bedre enn 4 ribben og dårligere enn 5ribben. (B) Bruk hemostater i begge hender for å samle de tre suturene sammen og øk PEEP til 6 cmH2O i ventilasjonsinnstillingene. (C) Bind sammen alle tre knutene samtidig ved å trekke opp og bort for å lukke såret, reduser PEEP til 2 cmH2O umiddelbart, og lukk huden med 6-0 nylonsutur. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9. Lungevev samling. (A) For donorens eller mottakerens innfødte lober kan superiorlappen og postkavallappen snapfryses for protein- eller RNA-ekspresjonsanalyser, midtlappen kan bevares for histologi, og den nedre loben kan brukes til våt-til-tørrvektforhold. (B) For den transplanterte loben, samle den øvre regionen for snap frossen, midtre regionen for histologi, eller nedre region for våt-til-tørr vektforhold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10. Påføring av klemmen for selektiv BAL-væskeoppsamling. For å unngå en samlet prøve, kan BAL-væske samles fra enten høyre (innfødt) eller venstre (transplantert) lunge. (A) Det venstre lungehilar området kan klemmes for å samle BAL-væske fra høyre lober. (B) Det høyre lungehilar området kan klemmes for å samle BAL-væske fra venstre lobe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11. Våt-til-tørrvekt-forhold. Våt-til-tørr vektforhold ble beregnet for å måle lungeødem og kan brukes til å indikere hvor godt transplantasjonen gikk. Donorens opprinnelige, den transplanterte, eller mottakerens opprinnelige ble samlet som beskrevet i protokollen og veid umiddelbart for våtvekt, tørket ved 60 ° C i 48 timer, og veide deretter igjen for tørrvekten. Et forhold mellom våtvekt og tørrvekt ble tatt. Forholdet mellom den transplanterte var signifikant økt sammenlignet med donorens eller mottakerens innfødte. n=6 rotter/gruppe og barer representerer gjennomsnittlig ± SD. Statistisk analyse ble utført ved bruk av ANOVA med Tukeys post-hoc-analyse. ** s<0.01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne rapporten har vi grepet inn på flere kritiske trinn i en rottelungetransplantasjonsprotokoll for å optimalisere prosedyren. Mens ulike mansjettteknikker for rottelungetransplantasjon har blitt rapportert 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15, kan prosessen fortsatt være subjektiv og vanskelig for mikrokirurger å anvende. Vi har lagt vekt på at riktig størrelse på mansjetter for PV og PA for å gi blod eller Br for å gi luft inn i den transplanterte lungen skal brukes, og vi har gitt en mer objektiv måte å bestemme optimal mansjettstørrelse basert på rottens kroppsvekt. For mer konsekvent å indusere varm iskemi i lungene, har vi gitt anbefalinger om lungeinflasjon, klemming og hvordan du holder rotta varm i løpet av 1 time varm iskemitid. Under mottakerens prosedyre kan det være vanskelig å finne det 4. Vi har anbefalt at man mer nøyaktig kan lokalisere denne posisjonen ved å bruke en metode for måling og følelse for hjerteimpuls. På tidspunktet for reperfusjon, for bedre å lukke såret, viste vi også en teknikk for å håndtere suturer og justere PEEP som raskere kan lukke såret og forhindre overinflasjon og skade på lungen. Til slutt har vi presentert strategier for vevs- og BAL-væskeinnsamling som muliggjør en mer objektiv høsting av prøver som kan sammenlignes på tvers av eksperimenter og forskjellige kroppsvekter.
Den viktigste begrensningen av de beskrevne teknikkene er den ganske bratte læringskurven for transplantasjonsoperasjonen generelt. Læringskurven er en som kan reduseres med konsekvent kirurgisk praksis og fra å gjennomgå feilsøkingsteknikker i litteraturen. En annen begrensning er at denne modellen studerer den akutte fasen av IRI og transplantasjon hvor biokjemiske endringer først oppstår, som er fokus for vårt laboratorium. Fremtidige studier bør teste bronkial og vaskulær patency ved lengre tidslinjer etter transplantasjon.
Samlet sett er en levedyktig modell for smådyrtransplantasjon avgjørende for evaluering av terapeutiske intervensjoner for transplantasjon og iskemi-reperfusjonsskade (IRI). Spesielt rottelungetransplantasjonsmodellen er nyttig som et supplement til å studere små dyr ex vivo lungeperfusjon (EVLP)17. Det er også et mer levedyktig alternativ til murine lungetransplantasjon, fordi den større anatomiske størrelsen gjør det mulig for forskeren å skaffe tilstrekkelig vev for mer dyptgående analyser18. I tillegg er modellen avgjørende for å bestemme levedyktigheten til donorlungeallotransplantater etter terapeutisk inngrep med nye småmolekylære og proteinterapeutiske midler 19,20,21,22 enten til giveren, til donororganet gjennom EVLP 17, eller til mottakeren og gir en kraftig vei for å samle in vivo data. Optimaliseringene som vi beskriver i denne rapporten er viktige for mikrokirurger som tar sikte på å redusere læringskurven og fjerne noe subjektivitet. Ved å benytte en standardisert algoritme for lungemansjettstørrelse, kan den kirurgiske tilnærmingen bli strømlinjeformet og mer objektiv. Ved avslutningen av transplantasjonsreperfusjonsperioden gir den beskrevne strukturerte tilnærmingen til BAL-væske og vevssamling også ansvarlig bruk av dyr og effektiv bruk av mikrokirurgens tid ved å maksimere virkningen av data samlet inn per eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
BAW, YGL og JLK støttes gjennom National Institutes of Health (NIH) tilskudd R01HL143000. BAW støttes gjennom Department of Defense (DOD) grant W81XWH1810787. SMB støttes gjennom NIH-stipend R01DK123475. JM støttes gjennom NIH-tilskudd AR061385, AR070752, DK106394 og AG056919 samt av DOD-tilskudd W81XWH-18-1-0787.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Gauge angio-catheter | BD | 382277 | |
| 14 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251717-02 | |
| 16 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252586-02 | |
| 18 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251679-02 | |
| 20 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252527-02 | |
| 4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| 6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
| 7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
| 8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
| Betadine Spray | Avrio Health L.P | UPC 367618160039 | |
| Clippers | VWR | MSPP-023326 | |
| Castroviejo micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5668 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Electrocautery | Macan | MV-7A | |
| Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Halsted-mosquito hemostat | Roboz Surgical Instrument Co | RS-7112 | |
| Heparin | Fresnius Medical Care | C504701 | |
| Insulin syringe | Life Technologies | B328446 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropyl Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| Ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
| Dieffenbach Bulldog Clamp | World Precision Instruments | WPI14117 | |
| Needle holder/Forceps, Curved | Micrins | MI1542 | |
| Needle holder/Forceps, Straight | Micrins | MI1540 | |
| Perfadex Plus (Organ Preservation Solution) | XVIVO Perfusion AB | REF# 19950 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | Used to check SpO2 and heartbeat |
| Retractor | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6560 | |
| Saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Syringe 5mL | BD | 309646 | |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT351T | Used to clamp bronchus |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT261T | Used to clamp hilum |
| Yasargil Clamp Applicator | Aesculap, Inc | FT484T |
References
- Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 97 (4), 578-581 (1989).
- Zhai, W., et al. Simplified rat lung transplantation by using a modified cuff technique. Journal of Investigative Surgery. 21 (1), 33-37 (2008).
- Goto, T., et al. Simplified rat lung transplantation using a new cuff technique. Annals of Thoracic Surgery. 93 (6), 2078-2080 (2012).
- Guo, H., et al. Improvements of surgical techniques in a rat model of an orthotopic single lung transplant. European Journal of Medical Research. 18, 1 (2013).
- Tian, D., Shiiya, H., Sato, M., Nakajima, J. Rat lung transplantation model: modifications of the cuff technique. Annals of Translational Medicine. 8 (6), 407 (2020).
- Rajab, T. K. Anastomotic techniques for rat lung transplantation. World Journal of Transplantation. 8 (2), 38-43 (2018).
- Reis, A., Giaid, A., Serrick, C., Shennib, H. Improved outcome of rat lung transplantation with modification of the nonsuture external cuff technique. Journal of Heart and Lung Transplantation. 14 (2), 274-279 (1995).
- Sugimoto, R., et al. Experimental orthotopic lung transplantation model in rats with cold storage. Surgery Today. 39 (7), 641-645 (2009).
- Santana Rodriguez, N., et al. Technical modifications of the orthotopic lung transplantation model in rats with brain-dead donors. Archivos de Bronconeumología. 47 (10), 488-494 (2011).
- Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade. Journal of Surgical Research. 194 (2), 659-666 (2015).
- Rajab, T. K. Techniques for lung transplantation in the rat. Experimental Lung Research. 45 (9-10), 267-274 (2019).
- Iskender, I., et al. Effects of Warm Versus Cold Ischemic Donor Lung Preservation on the Underlying Mechanisms of Injuries During Ischemia and Reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
- Lin, X., et al. Five-year update on the mouse model of orthotopic lung transplantation: Scientific uses, tricks of the trade, and tips for success. Journal of Thoracic Disease. 4 (3), 247-258 (2012).
- Song, J. A., et al. Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats. Toxicological Research. 26 (3), 203-208 (2010).
- Chang, J. E., Kim, H. J., Yi, E., Jheon, S., Kim, K. Reduction of ischemia-reperfusion injury in a rat lung transplantation model by low-concentration GV1001. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (5), 972-979 (2016).
- De Backer, J. W., et al. Study of the variability in upper and lower airway morphology in Sprague-Dawley rats using modern micro-CT scan-based segmentation techniques. Anatomical Record. 292 (5), Hoboken. 720-727 (2009).
- Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), e52309 (2015).
- Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. Journal of Visualized Experiments. (65), e3947 (2012).
- Jia, Y., et al. Treatment of acute lung injury by targeting MG53-mediated cell membrane repair. Nature Communications. 5, 4387 (2014).
- Kim, J. L., et al. Pegylated-Catalase Is Protective in Lung Ischemic Injury and Oxidative Stress. Annals of Thoracic Surgery. , (2020).
- Beal, E. W., et al. D-Ala(2), D-Leu(5)] Enkephalin Improves Liver Preservation During Normothermic Ex Vivo Perfusion. Journal of Surgical Research. 241 (2), 323-335 (2019).
- Akateh, C., et al. Intrahepatic Delivery of Pegylated Catalase Is Protective in a Rat Ischemia/Reperfusion Injury Model. Journal of Surgical Research. 238, 152-163 (2019).
