Summary
Ici, nous présentons des optimisations à un modèle de transplantation pulmonaire de rat qui servent à améliorer les résultats. Nous fournissons un guide des tailles pour les brassards basé sur le poids corporel, une stratégie de mesure pour déterminer le 4èmeespace intercostal , et des méthodes de fermeture de la plaie et de collecte de liquide et de tissu BAL (lavage broncho-alvéolaire).
Abstract
D’après notre expérience avec la transplantation pulmonaire de rat, nous avons trouvé plusieurs domaines d’amélioration. Les informations contenues dans la littérature existante concernant les méthodes de choix des tailles de brassard appropriées pour la veine pulmonaire (PV), l’artère pulmonaire (PA) ou les bronches (Br) sont variées, ce qui fait de la détermination de la taille appropriée de la coiffe pendant la transplantation pulmonaire de rat un exercice d’essais et d’erreurs. En standardisant la technique de brassard pour utiliser le plus petit brassard efficace approprié à la taille du vaisseau ou de la bronche, on peut rendre la procédure de transplantation plus sûre, plus rapide et plus réussie. Étant donné que les diamètres du PV, du PA et du Br sont liés au poids corporel du rat, nous présentons une stratégie pour choisir une taille appropriée à l’aide d’un guide basé sur le poids. Étant donné que le volume pulmonaire est également lié au poids corporel, nous recommandons que cette relation soit également prise en compte lors du choix du volume d’air approprié pour l’inflation pulmonaire du donneur pendant l’ischémie chaude ainsi que pour le volume approprié de PBS à instiller pendant le lavage broncho-alvéolaire (BAL) collecte de liquide. Nous décrivons également des méthodes pour la 4e dissectionspatiale intercostale, la fermeture de la plaie et le prélèvement d’échantillons dans les lobes natifs et transplantés.
Introduction
Depuis plus de trois décennies, les chercheurs modifient et améliorent les modèles de transplantation pulmonaire de rats afin que les données générées soient plus cohérentes et reflètent mieux l’état clinique réel. Au cours de la réalisation de ce modèle par notre laboratoire, nous avons déterminé quatre domaines d’amélioration: les techniques de brassard pour les anastomoses, l’identification du 4eespace intercostal du receveur, le gonflage pulmonaire et la fermeture de la plaie pendant la procédure du receveur, et le prélèvement d’échantillons pour analyse.
Les modifications de la technique de brassard pour les anastomoses peuvent améliorer l’ensemble de la procédure de transplantation en raccourcissant le temps de manipulation du poumon donneur 1,2,3,4,5,6 et en rendant la procédure d’anastomose plus rapide et techniquement plus facile pour le microchirurgien. Bien qu’il soit essentiel d’utiliser les brassards de la bonne taille pour fournir le sang et le flux d’air nécessaires au poumon transplanté, il existe peu de directives sur la façon de choisir la taille des brassards pour la veine pulmonaire (PV), l’artère pulmonaire (PA) ou les bronches (Br)5,7,8,9. Étant donné que les diamètres du PV, du PA et du Br sont liés au poids corporel des rats donneurs et receveurs, nous proposons que la taille du brassard soit basée sur le poids corporel. Ce rapport fournit un guide des tailles pour les brassards basé sur le poids corporel du rat (180 g à plus de 270 g) qui sert à optimiser l’apport de sang et d’air au poumon transplanté (tableau 1).
Alors qu’un microchirurgien plus récent peut obtenir avec succès et facilement un poumon de donneur pendant la procédure de donneur, la transplantation du poumon pendant la procédure du receveur est plus compliquée et dépend de l’expérience du microchirurgien. Les tentatives de trouver le 4èmeespace intercostal pour accéder au poumon gauche du receveur est l’une des étapes les plus difficiles qui contient une certaine subjectivité et peut augmenter le temps de procédure. Par conséquent, nous introduisons une méthode simple et objective pour aider à l’identification de la 4ème localisationspatiale intercostale en utilisant les mesures thoraciques et les palpitations du cœur pour trouver la bonne zone de paroi thoracique à disséquer4,5,6,10,11,12.
Nous proposons également une amélioration de l’inflation pulmonaire du donneur, qui est une source potentielle de lésions de l’organe. Le poumon du donneur est dégonflé jusqu’à ce que la reperfusion commence. Lors de la suture du 4èmeespace intercostal, le poumon donneur est généralement gonflé en augmentant la PEP de 2cmH2Oà 6cmH2O. Afin de minimiser les lésions pulmonaires dues au surgonflage, nous proposons une technique où trois sutures en nylon 6-0 sont placées autour de la 4ème côte inférieure à la 5èmecôte avec des doubles nœuds simples. Au moment de la fermeture de la plaie, les extrémités des trois sutures sont maintenues avec des hémostatiques dans les deux mains, la plaie est fermée d’un seul coup en tirant de chaque côté et la PEP est immédiatement réduite à 2 cmH2O. De cette façon, le poumon est autorisé à se dilater le moins longtemps possible10.
À la fin d’une expérience, le chercheur souhaite souvent prélever de nombreux types d’échantillons pour de nombreux types d’analyse de chaque greffe. Par exemple, le tissu congelé à pression, le tissu fixe au formol, le tissu pour le rapport de poids humide à sec pour déterminer l’œdème pulmonaire et le liquide de lavage broncho-alvéolaire (BAL) peuvent tous être utilisés pour évaluer le déroulement de la greffe. La méthode traditionnelle de prélèvement du liquide BAL permet d’obtenir un échantillon mélangé à partir des lobes natifs du receveur et du lobe transplanté du donneur13,14,15. Pour surmonter cela, nous présentons une méthode de serrage des zones hilaires qui peut donner un aperçu plus précis de l’état des poumons transplantés et natifs. De plus, le volume de PBS utilisé pour recueillir le liquide BAL de chaque côté des poumons est important à considérer, car le liquide BAL contient de nombreux facteurs solubles tels que les cytokines et les chimiokines qui sont mesurés par concentration. La normalisation du volume de liquide instillé au volume estimé de la capacité pulmonaire peut aider à la comparaison. Avec quatre lobes du côté droit et un lobe du côté gauche, chacun des cinq lobes du rat a un volume et une surface différents16. Selon une étude antérieure sur la mesure du volume des lobes pulmonaires par Backer et al., du volume total du poumon entier, le volume des lobes droits est de 63% (4400 mm 3) et le lobe gauche est de 37% (2500 mm3). Par conséquent, nous recommandons que le volume de PBS utilisé pour recueillir le liquide BAL soit calculé comme le double du volume courant (7,2 mL/kg) multiplié par 63 % pour le poumon droit et 37 % pour le poumon gauche. En utilisant cette approche, on peut mieux contrôler des variables telles que le poids corporel et le moment10,16.
Dans l’ensemble, dans ce rapport, nous démontrerons quelques modifications au modèle expérimental standard de transplantation pulmonaire de rat qui peuvent rendre la procédure plus efficace et augmenter la capacité de générer des données plus précises et abondantes à partir de chaque expérience.
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Protocol
Les rats Sprague-Dawley mâles (180 à 270 g de poids corporel) ont été achetés dans le commerce (p. ex. Envigo) et ont été hébergés dans des conditions exemptes d’agents pathogènes à l’installation animalière de l’Ohio State University. Toutes les procédures ont été effectuées sans cruauté conformément au Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals des NIH et du Conseil national de recherches du Canada et avec l’approbation du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Ohio State University (Protocole IACUC # 2012A00000135-R2).
1. Configuration initiale
- Installez des dispositifs chirurgicaux.
REMARQUE: Il s’agit d’une chirurgie de non-survie. Si une chirurgie de survie doit être effectuée, des instruments stériles et des précautions de barrière devraient être pris.- Allumez l’équipement de surveillance de la fréquence cardiaque et de la saturation en oxygène et la planche chauffante à 42 °C.
- Allumez l’appareil de ventilation et d’anesthésie pour préchauffer l’évaporateur d’isoflurane.
REMARQUE : Utiliser un volume courant (Td) de 7,2 mL/kg, une pression expiratoire positive (PEP) de 2cmH2O et une fréquence respiratoire de 80 bpm. - Remplissez la seringue d’anesthésie avec 10 mL d’isoflurane liquide et montez la seringue sur l’appareil de ventilation et d’anesthésie.
- Allumez le microscope chirurgical avec la hauteur et la mise au point ajustées aux préférences du microchirurgien.
- Allumez l’appareil d’électrocautérisation.
- Préparez et disposez les outils chirurgicaux (figure 1).
NOTE: Tous les outils chirurgicaux ont été autoclavés à 121 ° C pendant 30 minutes. - Recueillir et consigner le poids corporel des rats donneurs et receveurs.
- Utilisez le tableau 1 et le poids corporel du rat pour déterminer le calibre correct de l’angiocathéter (20, 18, 16, 14 ou 12 G) à utiliser pour fabriquer les menottes.
- Préparez les brassards pour l’artère pulmonaire (AP), les bronches (Br) et les veines pulmonaires (PV) à l’aide du guide des tailles basé sur le poids corporel (tableau 1 et figure 2).
- Placer un angiocathéter de 20 G, 18 G, 16 G, 14 G ou 12 G (Figure 2A-E) sur une surface stérile au microscope chirurgical.
- Utilisez ensuite une lame chirurgicale de dos côtelé #11 (figure 2F) pour couper l’angiocathéter à un angle de 90° afin de former un corps de brassard de 2 mm de longueur avec une languette de 1 mm X 1 mm (largeur x hauteur) au sommet du corps du brassard (Figure 2G).
- Conservez les brassards dans une solution saline stérile jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être utilisés.
- Préparez des solutions.
- Préparer un mélange de kétamine et de xylazine dans un flacon d’injection stérile en ajoutant 1 mL de xylazine (100 mg/mL) à 10 mL de kétamine (100 mg/mL).
NOTE: La date de péremption de ce cocktail est déterminée en utilisant la date de péremption la plus ancienne des composants utilisés. - Aspirer dans les seringues la dose appropriée pour les rats (0,1 mL du mélange kétamine/xylazine par 100 g de poids corporel du rat; p. ex., pour un rat de 200 g, 0,2 mL de mélange kétamine/xylazine serait administré).
REMARQUE: Ce dosage fournira 91 mg / kg de kétamine et 9,1 mg / kg de xylazine au rat et devrait garder un rat sous sédation pendant 60-80 min. - Préparer l’héparine qui sera délivrée à une dose de 1 000 U/kg.
- Entreposer la solution saline, le PBS et la solution de préservation sur de la glace (Tableau des matériaux).
- Préparer un mélange de kétamine et de xylazine dans un flacon d’injection stérile en ajoutant 1 mL de xylazine (100 mg/mL) à 10 mL de kétamine (100 mg/mL).
2. Préparation du rat donneur
- Induire l’anesthésie chez le rat donneur en injectant par voie intrapéritonéale le mélange de kétamine et de xylazine et en attendant ~10 min qu’un plan chirurgical d’anesthésie se développe qui peut être évalué par l’absence de réponse au pincement des orteils.
- Rasez la zone d’incision à l’aide de tondeuses électroniques.
- Placez le rat donneur en décubitus dorsal sur la planche chauffante chirurgicale et essuyez la zone d’incision avec une gaze stérile imbibée de bétadine. Ensuite, essuyez la zone avec un tampon d’alcool isopropylique à 70%. Répétez 3 fois.
- Faites une incision cutanée médiane de 3 à 4 cm à mi-cou à l’aide de ciseaux et disséquez soigneusement les tissus sous-cutanés et les muscles à l’aide de forceps (au lieu de ciseaux pour éviter les saignements).
- Pour l’intubation endotrachéale, enfiler une suture de soie 4-0 autour de la trachée et insérer un angio-cathéter de 16 G dans la trachée. Attachez fermement la suture autour de la trachée avec un double nœud, puis terminez avec un seul nœud pour maintenir l’angio-cathéter en place.
- Connectez l’angio-cathéter au ventilateur et maintenez un plan chirurgical d’anesthésie chez le rat avec 1-2% d’isoflurane.
- Effectuer une laparo-sternotomie sous forme d’incision médiane et transversale combinée à l’aide de ciseaux.
- Injecter de l’héparine (1 000 U/kg) avec une seringue à insuline via la veine cave inférieure (IVC) et laisser agir 10 min pour la circulation systémique.
REMARQUE: Cette administration d’héparine empêche la formation de caillots sanguins dans le poumon du donneur. - Disséquez soigneusement le diaphragme en coupant le long de l’arc thoracique, puis exposez la cavité thoracique en suivant le sternum jusqu’au cou.
3. Ischémie chaude pulmonaire du donneur et approvisionnement
- Euthanasier le rat donneur en coupant l’IVC.
- Pendant que les poumons sont encore ventilés, coupez les oreillettes droite et gauche avec des ciseaux à ressort à microdissection et rincer les poumons par gravité avec 20 ml de solution de conservation dans une seringue suspendue à 28 cmH2O par gravité reliée à un tube et un angiocathéter de 18 G introduit directement par l’artère pulmonaire.
- Débranchez le ventilateur du tube endotrachéal et reliez-le à une seringue de 5 mL remplie d’un volume d’air approprié en fonction du poids corporel.
REMARQUE : Le volume d’air nécessaire pour gonfler les poumons peut être calculé comme avec deux fois le volume courant (Td = 7,2 mL/kg), p. ex., un rat de 200 g aurait une Td de 1,44 mL et la multiplier par 2 équivaudrait à 2,88 mL d’air nécessaire pour gonfler les poumons. - Gonfler les poumons du donneur.
- Mettez une pince Yasargil sur la trachée pour garder les poumons gonflés et couvrez les poumons et le cœur avec de la gaze de coton stérile. Hydratez la gaze avec une solution saline, enveloppez le rat donneur avec un sous-tampon et laissez-la reposer sur la planche de chirurgie chauffante pendant 1 h pour provoquer une ischémie chaude dans les poumons (Figure 3).
- Après 1 h d’ischémie chaude, exciser le bloc cœur-poumon avec des ciseaux à ressort et des pinces à microdissection et placer sur de la gaze stérile imbibée de PBS glacé sur une boîte de Petri stérile sur glace.
REMARQUE: Toutes les étapes suivantes devraient avoir lieu lorsque les poumons sont sur la boîte de Petri sur la glace. - Inciser soigneusement les ligaments pulmonaires avec des ciseaux à ressort à microdissection pour séparer le poumon gauche de l’œsophage et du lobe post-caval.
- Coupez soigneusement la zone hilaire du poumon gauche avec un ciseau à ressort Vannas-Tubingen et procurez-vous le PV, PA et Br. gauche.
- Placez les brassards sur PV, PA ou Br (Figure 4A-C).
- Utilisez un hémostatique de moustique pour saisir la languette du brassard.
- Utilisez des pinces fines pour saisir l’extrémité distale du PV, PA ou Br à travers le corps de brassard approprié, inversez le tissu supplémentaire autour du brassard et fixez à l’aide de 8-0 Suture en nylon. Utilisez des ciseaux à ressort Vannas-Tubingen pour couper le tissu supplémentaire et le brassard autour du corps du brassard.
- Gardez le poumon du donneur recouvert de gaze imbibée de solution saline sur la boîte de Petri sur glace jusqu’à ce qu’elle soit prête à être transplantée chez le rat receveur (figure 4D).
NOTE: Le temps moyen d’ischémie froide est de 84 min ± 11 min S.D.
4. Préparation du rat receveur
- Induire l’anesthésie chez le rat receveur de la même manière que chez le rat donneur en injectant par voie intrapéritonéale le mélange de kétamine et de xylazine (0,1 mL pour 100 g de rat) et en attendant 10 minutes qu’un plan chirurgical d’anesthésie se développe qui peut être évalué par l’absence de réponse au pincement des orteils.
- Raser la zone d’incision à l’aide de tondeuses électroniques.
- Placez le rat donneur en décubitus dorsal et essuyez la zone d’incision avec une gaze stérile imbibée de bétadine. Ensuite, essuyez la zone avec un tampon d’alcool isopropylique à 70%. Répétez 3 fois.
- Avant que le rat ne soit fixé à la machine de ventilation, tracez des lignes sur la poitrine du rat en vue de trouver le 4èmeespace intercostal .
- Mesurer la poitrine de l’encoche suprasternale au processus xiphoïde et tracer une ligne (Figure 5A).
- Au milieu de cette ligne, tracez une ligne le long du côté gauche de la poitrine qui mesure la moitié de la mesure de l’encoche suprasternale au processus xiphoïde (Figure 5A et B).
- Intuber le receveur à l’aide d’un angiocathéter de 16 G par visualisation à l’aide du câble à fibre optique connecté à une lumière LED du kit d’intubation endotrachéale.
- Connectez l’angio-cathéter au ventilateur et maintenez un plan chirurgical d’anesthésie avec 1-2% d’isoflurane.
- Pour trouver le 4èmeespace intercostal , trouvez la zone de la paroi thoracique où l’on peut sentir une forte impulsion cardiaque palpable (Figure 5C, cercle rouge).
- A cet endroit, inciser la peau avec des ciseaux et le muscle avec des ciseaux à ressort à microdissection, et utiliser l’écarteur pour ouvrir le 4èmeespace intercostal le plus largement possible (Figure 5D et E).
REMARQUE: Utilisez la cautérisation électrique pour éviter ou arrêter les saignements pendant la dissection musculaire. - Une fois l’espace intercostal largement ouvert, disséquez soigneusement les ligaments autour du poumon gauche du receveur à l’aide de ciseaux à ressort Vannas-Tubingen et retirez le poumon de la région de la poitrine à l’aide de coton-tiges et de pinces stériles.
- Placez de la gaze stérile autour du poumon gauche et tenez-la avec une pince de bouledogue Dieffenbach.
- Appliquez une pince Yasargil sur la zone hilaire du poumon gauche aussi proximale que possible.
5. Anastomoses
- Anastomose veineuse pulmonaire (PV)
- Placez une suture en nylon 7-0 autour du PV du destinataire.
- Inciser la PV du receveur à l’aide des ciseaux à ressort Vannas-Tubingen en coupant transversalement les veines segmentaires supérieure et inférieure aussi distalement que possible et en rinçant le sang avec 0,2 mL de solution saline héparinée (1 U/mL) à l’aide d’une seringue à insuline.
- Placez le poumon du donneur encore enveloppé de gaze stérile humide glacée dans la cavité thoracique.
- Insérez le PV à manchettes du donneur dans le PV du receveur, puis fixez-le avec la suture en nylon 7-0 prépositionnée (Figure 6).
- Anastomose bronchique (Br)
- Placez une suture en nylon 7-0 autour du Br.
- Inciser le Br du receveur en coupant transversalement les voies respiratoires des segments supérieur et inférieur de la manière la plus distale possible avec des ciseaux à ressort Vannas-Tubingen.
- Insérez le Br menotté du donneur dans le Br du receveur et fixez-le avec la suture en nylon prépositionnée 7-0 (Figure 6).
- Anastomose de l’artère pulmonaire (AP) :
- Placez une suture en nylon 7-0 autour de la sonorisation du destinataire.
- Inciser l’AP du receveur de sa gaine adventive, inciser la moitié de la circonférence du vaisseau avec des ciseaux de ressort Vannas-Tubingen, puis rincer le sang dans l’AP avec 0,2 mL de solution saline héparinée (1 U/mL) à l’aide d’une seringue à insuline.
- Insérez l’AP menottée du donneur dans l’AP du receveur et fixez-la à l’aide de la suture en nylon 7-0 prépositionnée (Figure 6).
6. Reperfusion
- Retirez la pince Yasargil sur le hile pour permettre la reperfusion et la ventilation du poumon du donneur transplanté (Figure 7).
- Disséquez le poumon gauche natif du receveur à l’aide de ciseaux à ressort et de pinces à microdissection.
- Repositionnez soigneusement le poumon gauche transplanté dans le thorax du receveur.
- Fermez l’incision de thoracotomie en utilisant une suture en nylon 6-0.
- Placer trois sutures en nylon 6-0 avec des doubles nœuds simples autour des côtes supérieures à la 4e côte et inférieures à la 5ecôte (figure 8A).
- Utilisez des hémostatiques pour rassembler les trois sutures (figure 8B).
- Augmenter la PEP à 6cmH2Odans les réglages de ventilation.
- Attacher ensemble les trois nœuds en même temps en tirant pour fermer la plaie (figure 8C).
- Réduire immédiatement la PEP à 2 cmH2O.
- Fermer la peau avec une suture en nylon 6-0.
REMARQUE: Notre laboratoire étudie la phase aiguë post-transplantation, de sorte que le rat receveur dans ce modèle est survécu pendant 3 heures après la transplantation sous ventilation et anesthésie, puis des échantillons sont prélevés.
7. Prélèvement d’échantillons expérimentaux (plasma, tissu pulmonaire)
- Pour les échantillons témoins, prélever les lobes droits du donneur après le début de la période de reperfusion de 3 heures.
- Congeler le lobe supérieur et le lobe post-caval pour les analyses d’expression des protéines ou de l’ARN, préserver le lobe intermédiaire pour l’histologie et utiliser le lobe inférieur pour le rapport poids-humidité (figure 9A).
- A 10 min avant la fin du temps de reperfusion de 3h, préparez-vous à prélever les échantillons receveurs en injectant de l’héparine (1 000 U/kg) avec une seringue à insuline dans la veine jugulaire.
REMARQUE: Cette administration d’héparine prévient les caillots sanguins dans les poumons et permet un rinçage plus complet au moment de l’approvisionnement. - Collecte de plasma
- À la fin de la période de reperfusion de 3 heures, prélever 1 mL de sang avec une seringue via l’IVC.
- Conserver sur de la glace, puis centrifuger à 2 000 x g pendant 10 minutes pour récolter le plasma.
- Euthanasier le rat receveur en coupant l’IVC pour permettre l’exsanguination.
- Disséquez le diaphragme le long de l’arc thoracique et exposez la cavité thoracique en disséquant la cage thoracique.
- Recueillir le liquide BAL des poumons natifs ou transplantés si désiré (facultatif).
REMARQUE: Si le rapport de poids humide à sec ou l’histologie est effectuée sur le poumon, le prélèvement de liquide BAL ne doit pas être effectué car il peut affecter les résultats.- Enfiler la suture de soie 4-0 autour de la trachée et nouer un double nœud serré autour de la trachée et du tube d’intubation pour éviter les fuites de liquide.
- Calculer la quantité de PBS glacé pour la collecte de liquide BAL des lobes droit et du lobe gauche.
REMARQUE : Le rapport volumique pour le poumon droit est de 63 % tandis que le rapport volumique pour le poumon gauche est de 37 %16. Par conséquent, pour déterminer la quantité de PBS à instiller de chaque côté, le volume doit être calculé comme le double du volume courant (Td = 7,2 mL/kg) multiplié par 63 % pour le poumon droit et 37 % pour le poumon gauche. - Placer une pince Yasargil sur la zone hilaire du poumon gauche (Figure 10A) et, à l’aide d’une seringue reliée à l’angiocathéter, instiller la quantité calculée de PBS glacé dans le poumon droit (lobes natifs du receveur) et recueillir le liquide BAL en tirant doucement vers le haut sur le piston de la seringue. Effectuez deux fois.
REMARQUE: Il faut s’attendre à une récupération de 70 à 80% du liquide instillé. - Retirez la pince Yasargil sur le poumon gauche et placez la pince sur la région hilaire du poumon droit (Figure 10B).
- Recueillir le liquide BAL du lobe gauche transplanté de la même manière qu’il a été recueilli pour les lobes droits, puis retirer la pince sur la région hilaire du poumon droit.
- Couper les oreillettes droite et gauche avec des ciseaux à ressort à microdissection et rincer les poumons par gravité à travers le PA à l’aide d’un angiocathéter de 18 G fixé à un tube et d’une seringue contenant 20 ml de solution de conservation préréfrigérée suspendue à 28 cmH2O.
- Prélever des échantillons dans les poumons du receveur.
- Congeler le lobe supérieur et le lobe post-caval pour les analyses d’expression de protéines ou d’ARN, préserver le lobe intermédiaire pour l’histologie et utiliser le lobe inférieur pour le rapport poids humide/sec) (Figure 9A).
- Divisez le lobe gauche transplanté gauche en trois parties : la région supérieure recueillie pour la surgélation, la région médiane pour l’histologie et la région inférieure pour le rapport poids humide-sec (figure 9B).
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Representative Results
Afin de mesurer l’œdème pulmonaire, le rapport de poids humide-sec a été calculé. Le lobe natif du donneur, le lobe transplanté et le lobe natif du receveur ont été prélevés comme décrit dans le protocole et pesés immédiatement pour le poids humide, séchés à 60 °C pendant 48 h, puis pesés à nouveau pour le poids sec. Une augmentation du rapport de poids humide à sec indiquerait un œdème pulmonaire. Nos résultats indiquent que le lobe transplanté a eu une augmentation significative du rapport de poids humide à sec par rapport au lobe natif du donneur ou du receveur (p = 0,0050, n = 6 / groupe; Graphique 11).
| Taille de l’angio-cathéter pour les brassards | |||
| Poids corporel du rat (g) | PAPA | Br | PV |
| 180-200 | 20 g | 18 g | 16 g |
| 200-230 | 18 g | 16 g | 14 g |
| 230-250 | 18 g | 14 g | 14 g |
| 250-270 | 18 g | 14 g | 12 à 14 g |
| Plus de 270 | 16 g | 14 g | 12 g |
Tableau 1. Guide des tailles pour les poignets. La taille de l’artère pulmonaire (PA), de la bronche (Br) ou de la veine pulmonaire (PV) est liée au poids corporel. Selon le poids corporel et le type de brassard que vous fabriquez, la taille d’angio-cathéter recommandée est indiquée.
Graphique 1. Outils chirurgicaux. (A) Ciseaux fins, (B) pinces, (C-E) pinces microchirurgicales, (F) pinces fines Dumont #5, (G) ciseaux à ressort Vannas-Tubingen et ciseaux à microdissection Castroviejo, (H) hémostat Halsted-moustique, (J) rétracteur, (K) pinces Yasargil, (L) pince bulldog Dieffenbach, (M) hémostatiques courbes et (N) applicateur de pince Yasargil. Tous les outils doivent être autoclavés à 121 °C pendant 30 min. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Préparation du brassard avec différentes tailles d’angio-cathéter et lame chirurgicale côtelée #11. La taille de l’angiocathéter choisi pour le brassard est déterminée par le guide de taille du brassard (tableau 1) qui tient compte du poids corporel du rat et si le brassard est destiné à l’artère pulmonaire (PA), à la bronche (Br) ou à la veine pulmonaire (PV). Les angio-cathéters (A) 20 G, (B) 18 G, (C) 16 G, (D) 14 G ou (E) 12 G sont coupés avec une lame chirurgicale (F) côtelée #11 comme décrit dans le protocole, et stockés dans une solution saline jusqu’à ce que nécessaire. (G) La longueur du corps du brassard est de 2 mm et une languette de 1 mm X 1 mm (largeur x hauteur) est laissée au sommet du corps du brassard pour la manipulation du corps du brassard. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 3. Ischémie chaude. Les poumons sont rincés avec la solution de préservation à travers l’artère pulmonaire, gonflés avec deux fois le volume courant d’air, puis enveloppés avec un coussin inférieur et conservés sur la planche chauffante chirurgicale pour maintenir le rat à la température normale du corps pendant 1 h. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 4. Brassard du poumon du donneur PV, PA et Br. (A) Veine pulmonaire, PV (B) artère pulmonaire, PA, ou (C) bronche, Br, est inséré à travers un brassard de taille appropriée, éversé, fixé avec 8-0 suture en nylon, et (D) ensuite stockée sur de la gaze stérile humidifiée avec une solution saline glacée sur une boîte de Petri stérile sur de la glace. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 5. Mesure et dissection au 4ème espace intercostal. (A) Le rat receveur est couché sur le dos, et la poitrine est mesurée de l’encoche suprasternale au processus xiphoïde et une ligne est tracée. (B) Au milieu de cette ligne, une autre ligne vers la gauche est tracée à la moitié de la longueur. (C) Dans cette optique, le microchirurgien doit palper une zone où l’impulsion cardiaque est la plus forte pour assurer le bon emplacement du 4èmeespace intercostal (cercle rouge). (D) La peau et les muscles sont ensuite disséqués avec de fins ciseaux. (E) L’enrouleur est ensuite utilisé pour ouvrir largement l’espace. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 6. Anastomose. Le PA (A) PV (B) Br ou (C) du donneur est inséré dans le PV, Br ou PA du receveur, puis fixé avec une suture en nylon 7-0. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 7. Reperfusion. Une fois les anastomoses terminées, la reperfusion peut être commencée en retirant la pince, et le rat receveur survit pendant 3 heures sous ventilation et anesthésie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 8. Fermeture de la plaie. (A) Trois sutures en nylon 6-0 avec des doubles nœuds simples sont placées autour des côtes supérieures à la 4ème côte et inférieures à la 5èmecôte. (B) Utiliser des hémostatiques dans les deux mains pour rassembler les trois sutures et augmenter la PEP à 6 cmH2O dans les réglages de ventilation. (C) Attacher ensemble les trois nœuds en même temps en tirant vers le haut et loin pour fermer la plaie, diminuer immédiatement la PEP à 2 cmH2O et fermer la peau avec une suture en nylon 6-0. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 9. Collecte de tissu pulmonaire. (A) Pour les lobes natifs du donneur ou du receveur, le lobe supérieur et le lobe post-caval peuvent être congelés pour des analyses d’expression de protéines ou d’ARN, le lobe intermédiaire peut être préservé pour l’histologie et le lobe inférieur peut être utilisé pour le rapport poids humide / sec. (B) Pour le lobe transplanté, prélever la région supérieure pour le surgel, la région médiane pour l’histologie ou la région inférieure pour le rapport poids humide/sec. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 10. Application de la pince pour la collecte sélective du fluide BAL. Pour éviter un échantillon regroupé, le liquide BAL peut être prélevé dans le poumon droit (natif) ou gauche (transplanté). (A) La zone hilaire du poumon gauche peut être serrée pour recueillir le liquide BAL des lobes droits. (B) La zone hilaire du poumon droit peut être serrée pour recueillir le liquide BAL du lobe gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 11. Rapport poids humide/sec. Le rapport de poids humide à sec a été calculé pour mesurer l’œdème pulmonaire et peut être utilisé pour indiquer comment la greffe s’est déroulée. Le lobe natif du donneur, le lobe transplanté ou le lobe natif du receveur a été prélevé comme décrit dans le protocole et pesé immédiatement pour le poids humide, séché à 60 °C pendant 48 h, puis pesé à nouveau pour le poids sec. Un rapport entre le poids humide et le poids sec a été pris. Le rapport pour le lobe transplanté a été significativement augmenté par rapport aux lobes natifs du donneur ou du receveur. n = 6 rats/groupe et les barres représentent la moyenne ± écart-type. L’analyse statistique a été effectuée en utilisant l’ANOVA avec l’analyse post-hoc de Tukey. ** p<0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans ce rapport, nous sommes intervenus à plusieurs étapes critiques d’un protocole de transplantation pulmonaire de rat afin d’optimiser la procédure. Bien que diverses techniques de brassard pour la transplantation de poumon de rat aient été signalées 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15, le processus peut encore être subjectif et difficile à appliquer pour les microchirurgiens. Nous avons souligné que la taille appropriée des brassards pour PV et PA pour fournir du sang ou Br pour fournir de l’air dans le poumon transplanté devrait être utilisée, et nous avons fourni un moyen plus objectif de déterminer la taille optimale du brassard en fonction du poids corporel du rat. Pour induire plus régulièrement une ischémie chaude des poumons, nous avons donné des recommandations sur l’inflation pulmonaire, le clampage et la façon de garder le rat au chaud pendant le temps d’ischémie chaude de 1 h. Pendant la procédure du destinataire, il peut être difficile de localiser le 4èmeespace intercostal. Nous avons recommandé que l’on puisse localiser plus précisément cette position en utilisant une méthode de mesure et de sensation d’impulsion cardiaque. Au moment de la reperfusion, pour mieux refermer la plaie, nous avons également montré une technique de manipulation des sutures et d’ajustement de la PEP qui permet de refermer plus rapidement la plaie et de prévenir le surgonflage et les blessures au poumon. Enfin, nous avons présenté des stratégies pour la collecte de tissus et de liquide BAL qui permettent une récolte plus objective d’échantillons qui peuvent être comparés entre des expériences et différents poids corporels.
La limite la plus importante des techniques décrites est la courbe d’apprentissage assez raide de l’opération de transplantation en général. La courbe d’apprentissage peut être réduite avec une pratique chirurgicale cohérente et en examinant les techniques de dépannage dans la littérature. Une autre limite est que ce modèle étudie la phase aiguë de l’IRI et de la transplantation où les changements biochimiques se produisent pour la première fois, ce qui est l’objectif de notre laboratoire. Les études futures devraient tester la perméabilité bronchique et vasculaire à des délais plus longs après la transplantation.
Dans l’ensemble, un modèle viable de transplantation de petits animaux est essentiel pour évaluer les interventions thérapeutiques pour la transplantation et les lésions d’ischémie-reperfusion (IRI). Le modèle de transplantation pulmonaire chez le rat, en particulier, est utile en complément de l’étude de la perfusion pulmonaire ex vivo chez les petits animaux (EVLP)17. C’est aussi une alternative plus viable à la transplantation pulmonaire murine, car la plus grande taille anatomique permet au chercheur d’obtenir suffisamment de tissu pour des analyses plus approfondies18. De plus, le modèle est essentiel pour déterminer la viabilité des allogreffes pulmonaires de donneurs après une intervention thérapeutique avec de nouvelles petites molécules et protéines thérapeutiques 19,20,21,22 soit pour le donneur, soit pour l’organe du donneur par EVLP 17, soit pour le receveur, et fournit un moyen puissant de recueillir des données in vivo. Les optimisations que nous décrivons dans ce rapport sont importantes pour les microchirurgiens qui visent à réduire leur courbe d’apprentissage et à éliminer une certaine subjectivité. En utilisant un algorithme normalisé de taille de la coiffe pulmonaire, l’approche chirurgicale peut être rationalisée et plus objective. À la fin de la période de reperfusion de greffe, l’approche structurée décrite pour la collecte de liquide et de tissus BAL permet également une utilisation responsable des animaux et une utilisation efficace du temps du microchirurgien en maximisant l’impact des données recueillies par expérience.
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Disclosures
BAW, YGL et JLK sont soutenus par la subvention R01HL143000 des National Institutes of Health (NIH). BAW est soutenu par la subvention W81XWH1810787 du ministère de la Défense (DOD). SMB est soutenu par la subvention NIH R01DK123475. JM est soutenu par les subventions NIH AR061385, AR070752, DK106394 et AG056919 ainsi que par la subvention DOD W81XWH-18-1-0787.
Acknowledgments
Aucun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Gauge angio-catheter | BD | 382277 | |
| 14 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251717-02 | |
| 16 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252586-02 | |
| 18 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251679-02 | |
| 20 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252527-02 | |
| 4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| 6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
| 7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
| 8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
| Betadine Spray | Avrio Health L.P | UPC 367618160039 | |
| Clippers | VWR | MSPP-023326 | |
| Castroviejo micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5668 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Electrocautery | Macan | MV-7A | |
| Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Halsted-mosquito hemostat | Roboz Surgical Instrument Co | RS-7112 | |
| Heparin | Fresnius Medical Care | C504701 | |
| Insulin syringe | Life Technologies | B328446 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropyl Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| Ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
| Dieffenbach Bulldog Clamp | World Precision Instruments | WPI14117 | |
| Needle holder/Forceps, Curved | Micrins | MI1542 | |
| Needle holder/Forceps, Straight | Micrins | MI1540 | |
| Perfadex Plus (Organ Preservation Solution) | XVIVO Perfusion AB | REF# 19950 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | Used to check SpO2 and heartbeat |
| Retractor | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6560 | |
| Saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Syringe 5mL | BD | 309646 | |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT351T | Used to clamp bronchus |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT261T | Used to clamp hilum |
| Yasargil Clamp Applicator | Aesculap, Inc | FT484T |
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