Summary
Burada, sonuçları iyileştirmeye hizmet eden bir sıçan akciğer nakli modeline optimizasyonlar sunuyoruz. Vücut ağırlığına göre manşetler için bir boyut kılavuzu, 4. interkostal boşluğu belirlemek için bir ölçüm stratejisi ve yara kapatma ve BAL (bronkoalveoler lavaj) sıvı ve doku toplama yöntemleri sunuyoruz.
Abstract
Sıçan akciğer nakli ile ilgili deneyimlerimizden, iyileştirilmesi gereken birkaç alan bulduk. Pulmoner ven (PV), pulmoner arter (PA) veya bronş (Br) için uygun manşet boyutlarını seçme yöntemlerine ilişkin mevcut literatürdeki bilgiler çeşitlidir, bu nedenle sıçan akciğer transplantasyonu sırasında uygun manşet boyutunun belirlenmesi deneme yanılma egzersizi haline getirilmiştir. Kelepçeleme tekniğini, damarın veya bronşun boyutuna uygun en küçük etkili manşeti kullanacak şekilde standartlaştırarak, transplantasyon prosedürünü daha güvenli, daha hızlı ve daha başarılı hale getirebiliriz. PV, PA ve Br'nin çapları sıçanın vücut ağırlığı ile ilişkili olduğundan, ağırlığa dayalı bir kılavuz kullanarak uygun bir boyut seçmek için bir strateji sunuyoruz. Akciğer hacmi vücut ağırlığı ile de ilişkili olduğundan, sıcak iskemi sırasında donör akciğer enflasyonu için uygun hava hacmini seçerken ve bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvı toplanması sırasında aşılanacak uygun PBS hacmi için bu ilişkinin de göz önünde bulundurulmasını öneririz. Ayrıca 4. interkostal boşluk diseksiyonu, yara kapatma ve hem doğal hem de transplante loblardan örnek toplama yöntemlerini de tanımladık.
Introduction
Otuz yılı aşkın bir süredir, araştırmacılar sıçan akciğer nakli modellerini değiştirmekte ve geliştirmektedir, böylece üretilen veriler daha tutarlı ve gerçek klinik durumu daha yansıtmaktadır. Laboratuvarımızın bu modeli uyguladığı dönemde, dört iyileştirme alanı belirledik: anastomozlar için kelepçeleme teknikleri, alıcının 4. interkostal boşluğunun tanımlanması, alıcının prosedürü sırasında akciğer şişirmesi ve yara kapanması ve analiz için örneklerin toplanması.
Anastomozlar için kelepçeleme tekniği modifikasyonları, donör akciğerin 1,2,3,4,5,6 işlem süresini kısaltarak ve anastomoz prosedürünü mikrocerrah için daha hızlı ve teknik olarak daha kolay hale getirerek tüm transplantasyon prosedürünü iyileştirebilir. Nakledilen akciğere gerekli kan ve hava akışını sağlamak için uygun boyutta manşetlerin kullanılması kritik olmakla birlikte, pulmoner ven (PV), pulmoner arter (PA) veya bronş (Br) için manşetlerin boyutunun nasıl seçilmesi gerektiği konusunda sınırlı rehberlik vardır5,7,8,9. PV, PA ve Br'nin çapları donör ve alıcı sıçanların vücut ağırlığı ile ilişkili olduğundan, manşet boyutunun vücut ağırlığına dayanmasını öneriyoruz. Bu rapor, nakledilen akciğere kan ve hava beslemesini optimize etmeye yarayan bir sıçanın vücut ağırlığına (180 g ila 270 g'ın üzerinde) dayanan manşetler için bir boyut kılavuzu sunmaktadır (Tablo 1).
Yeni bir mikrocerrah, donör prosedürü sırasında bir donör akciğeri başarılı ve kolay bir şekilde temin edebilirken, alıcının prosedürü sırasında akciğerin nakli daha karmaşıktır ve mikrocerrahın deneyimine bağlıdır. Alıcının sol akciğerine erişmek için 4. interkostal boşluğu bulma girişimleri, biraz öznellik taşıyan ve işlem süresini artırabilen daha zor adımlardan biridir. Bu nedenle, göğüs ölçümlerini vekalbin çarpıntılarını kullanarak 4. interkostal boşluk yerinin belirlenmesine yardımcı olacak basit ve objektif bir yöntem sunarak 4,5,6,10,11,12 diseke edilecek doğru alanı göğüs duvarını bulmayı amaçlıyoruz.
Ayrıca, organda potansiyel bir yaralanma kaynağı olan donör akciğer enflasyonunda bir iyileşme öneriyoruz. Donör akciğer, reperfüzyon başlayana kadar söndürülür. 4. interkostal boşluğu dikerken, donör akciğer genellikle PEEP'i 2 cmH 2 O'dan 6 cmH2O'ya yükselterek şişirilir. Aşırı enflasyondan kaynaklanan akciğer hasarını en aza indirmek için, basit çift düğümlü 4. kaburganın 5. kaburganın altına üç adet 6-0 naylon dikişin yerleştirildiği bir teknik öneriyoruz. Yara kapanma zamanı geldiğinde, üç dikişin uçları her iki elde hemostatlarla tutulur, yara her iki taraftan yukarı çekilerek bir kerede kapatılır ve PEEP hemen 2 cmH2O'ya düşürülür. Bu şekilde, akciğerin mümkün olan en kısa sürede genişlemesine izin verilir10.
Bir deneyin sonunda, araştırmacı genellikle her nakilden birçok analiz türü için birçok örnek türü toplamak ister. Örneğin, dondurulmuş doku, formalin sabit dokusu, pulmoner ödemi belirlemek için ıslak-kuru ağırlık oranı için doku ve bronkoalveloler lavaj (BAL) sıvısı, naklin ne kadar iyi gittiğini değerlendirmek için kullanılabilir. BAL sıvısını toplamanın geleneksel yöntemi, hem alıcının doğal loblarından hem de donörün nakledilen lobundan13,14,15 karışık bir havuzlanmış numuneye izin verir. Bunun üstesinden gelmek için, nakledilen ve doğal akciğerlerin durumu hakkında daha kesin bir fikir verebilecek hilar alanları sıkıştırmak için bir yöntem sunuyoruz. Ek olarak, akciğerlerin her iki tarafından BAL sıvısını toplamak için kullanılan PBS'nin hacmi dikkate alınması önemlidir, çünkü BAL sıvısı, konsantrasyonla ölçülen sitokinler ve kemokinler gibi çok sayıda çözünür faktör içerir. Akciğer kapasitesinin tahmini hacmine aşılanan sıvının hacmini normalleştirmek, karşılaştırmaya yardımcı olabilir. Sağ tarafta dört lob ve sol tarafta bir lob ile, sıçanın beş lobunun her biri farklı bir hacme ve yüzey alanına sahiptir16. Backer ve ark. tarafından akciğer loblarının hacim ölçümü üzerine yapılan önceki bir araştırmaya göre, tüm akciğerin toplam hacminin sağ loblarının hacmi% 63 (4400 mm 3) ve sol lob% 37'dir (2500 mm3). Bu nedenle, BAL sıvısını toplamak için kullanılan PBS hacminin, sağ akciğer için% 63 ve sol akciğer için% 37 ile çarpılan tidal hacmin (7.2 mL / kg) iki katı olarak hesaplanmasını öneririz. Bu yaklaşımı kullanarak, vücut ağırlığı ve zamanlama10,16 gibi değişkenleri daha iyi kontrol edebilirsiniz.
Sonuçta, bu raporda, sıçan akciğer transplantasyonunun standart deneysel modelinde, prosedürü daha verimli hale getirebilecek ve her deneyden daha doğru ve bol miktarda veri üretme yeteneğini artırabilecek birkaç değişiklik göstereceğiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Erkek Sprague-Dawley sıçanları (180-270 g vücut ağırlığı) ticari olarak satın alındı (örneğin, Envigo) ve Ohio State Üniversitesi Hayvan Tesisi'nde patojensiz koşullar altında barındırıldı. Tüm prosedürler, NIH ve Ulusal Araştırma Konseyi'nin Laboratuvar Hayvanlarının İnsancıl Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na göre ve Ohio State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin (IACUC Protokolü # 2012A00000135-R2) onayıyla insancıl bir şekilde gerçekleştirilmiştir.
1. İlk kurulum
- Cerrahi cihazları ayarlayın.
NOT: Bu hayatta kalma dışı bir ameliyattır. Sağkalım ameliyatı yapılacaksa, steril aletler ve bariyer önlemlerinin alınması gerekecektir.- Kalp atış hızı/oksijen doygunluğu izleme ekipmanını ve ısıtma kartını 42 ° C'ye açın.
- İzofluran evaporatörünü önceden ısıtmak için havalandırma ve anestezi makinesini açın.
NOT: 7,2 mL/kg tidal hacim (Td), 2 cmH2O pozitif uçlu ekspiratuar basınç (PEEP) ve 80 bpm solunum hızı kullanın. - Anestezi şırıngasını 10 mL sıvı izofluran ile doldurun ve şırıngayı havalandırma ve anestezi makinesine monte edin.
- Cerrahi mikroskobu, mikrocerrahın tercihlerine göre ayarlanmış yükseklik ve odak ile açın.
- Elektrokoter cihazını açın.
- Cerrahi aletleri hazırlayın ve yerleştirin (Şekil 1).
NOT: Tüm cerrahi aletler 121 °C'de 30 dakika süreyle otoklavlandı. - Donör ve alıcı sıçanların vücut ağırlığını toplayın ve kaydedin.
- Manşet yapmak için kullanılacak anjiyo-kateterin (20, 18, 16, 14 veya 12 G) doğru ölçüsünü belirlemek için Tablo 1'i ve sıçanın vücut ağırlığını kullanın.
- Vücut ağırlığına göre boyut kılavuzunu kullanarak pulmoner arter (PA), bronş (Br) ve pulmoner ven (PV) için manşetler hazırlayın (Tablo 1 ve Şekil 2).
- 20 G, 18 G, 16 G, 14 G veya 12 G boyutlarında anjiyo-kateter (Şekil 2A-E) cerrahi mikroskop altında steril bir yüzeye yerleştirin.
- Daha sonra, manşet gövdesinin üstünde 1 mm X 1 mm tırnağı (genişlik x yükseklik) olan 2 mm uzunluğunda bir manşet gövdesi oluşturmak için anjiyo-kateteri 90 ° 'lik bir açıyla kesmek için bir kaburga sırtı cerrahi bıçağı # 11 (Şekil 2F) kullanın (Şekil 2G).
- Manşetleri kullanıma hazır olana kadar steril salin içinde saklayın.
- Çözümler hazırlayın.
- 10 mL ketamine (100 mg / mL) 1 mL ksilazin (100 mg / mL) ekleyerek steril bir enjeksiyon şişesinde ketamin ve ksilazin karışımı hazırlayın.
NOT: Bu kokteylin son kullanma tarihi, kullanılan bileşenlerin en erken son kullanma tarihi kullanılarak belirlenir. - Şırıngalara sıçanlar için uygun dozu çekin (100 g sıçanın vücut ağırlığı başına 0.1 mL ketamin / ksilazin karışımı; örneğin, 200 g'lık bir sıçan için, 0.2 mL ketamin / ksilazin karışımı verilecektir).
NOT: Bu dozaj, sıçana 91 mg / kg ketamin ve 9.1 mg / kg ksilazin verecektir ve bir sıçanı 60-80 dakika boyunca sakinleştirmelidir. - 1.000 U / kg'lık bir dozda verilecek olan heparini hazırlayın.
- Salin, PBS ve koruma solüsyonunu buz üzerinde saklayın (Malzeme Tablosu).
- 10 mL ketamine (100 mg / mL) 1 mL ksilazin (100 mg / mL) ekleyerek steril bir enjeksiyon şişesinde ketamin ve ksilazin karışımı hazırlayın.
2. Donör sıçan hazırlığı
- Ketamin ve ksilazin karışımını intraperitoneal olarak enjekte ederek ve ayak parmağının sıkışmasına yanıt eksikliği ile değerlendirilebilecek cerrahi bir anestezi düzleminin gelişmesi için ~ 10 dakika bekleyerek donör sıçanda anesteziyi indükleyin.
- Kesi bölgesini elektronik makas kullanarak tıraş edin.
- Donör sıçanı cerrahi ısıtma tahtasına sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve insizyon bölgesini betadin ile ıslatılmış steril bir gazlı bezle silin. Ardından alanı% 70 izopropil alkollü çubukla silin. 3 kez tekrarlayın.
- Makas kullanarak boynun ortasından 3 ila 4 cm'lik bir orta hat cilt insizyonu yapın ve forseps kullanarak (kanamayı önlemek için makas yerine) deri altı dokuları ve kasları dikkatlice diseke edin.
- Endotrakeal entübasyon için, trakea etrafına 4-0 ipek sütür iplik takın ve trakeaya 16 G anjiyo-kateter yerleştirin. Sütürü trakea etrafına çift düğümle sıkıca bağlayın ve ardından anjiyo-kateteri yerinde tutmak için tek bir düğümle bitirin.
- Anjiyo-kateteri ventilatöre bağlayın ve sıçanda% 1-2 izofluran içeren cerrahi bir anestezi düzlemi tutun.
- Makas kullanarak kombine orta hat ve enine insizyon olarak laparo-sternotomi yapın.
- Heparini (1.000 U / kg) inferior vena kava (IVC) yoluyla bir insülin şırıngası ile enjekte edin ve sistemik dolaşım için 10 dakika bekleyin.
NOT: Bu heparin uygulaması, donör akciğerdeki kan pıhtılaşmasını önler. - Torasik kemer boyunca keserek diyaframı dikkatlice diseke edin ve ardından sternumu boyuna kadar takip ederek göğüs boşluğunu açığa çıkarın.
3. Donör akciğer sıcak iskemisi ve tedariki
- IVC'yi keserek donör sıçanı ötenazi yapın.
- Akciğerler hala ventilasyon yaparken, hem sağ hem de sol kulak kepçelerini mikro diseksiyon yay makası ile kesin ve yerçekimi, akciğerleri, tüpe bağlı yerçekimi ve doğrudan pulmoner arterden sokulan 18 G anjiyo-kateter ile 28 cmH2O'da asılı bir şırıngada 20 mL koruma çözeltisi ile yıkayın.
- Vantilatörü endotrakeal tüpten ayırın ve vücut ağırlığına bağlı olarak uygun miktarda hava ile doldurulmuş 5 mL'lik bir şırıngaya bağlayın.
NOT: Akciğerleri şişirmek için havanın hacmi, gelgit hacminin iki katı (Td = 7.2 mL / kg) ile hesaplanabilir, örneğin, 200 g'lık bir sıçanın Td'si 1.44 mL'dir ve 2 ile çarpılması, akciğerleri şişirmek için gereken 2.88 mL havaya eşit olacaktır. - Donörün akciğerlerini şişirin.
- Akciğerleri şişirmek için trakeaya bir Yaşargil kelepçesi koyun ve akciğerleri ve kalbi steril pamuklu gazlı bezle örtün. Gazlı bezi tuzlu suyla nemlendirin, donör sıçanı bir alt ped ile sarın ve akciğerlerde sıcak iskemiyi indüklemek için ısınma ameliyat tahtasında 1 saat bekletin (Şekil 3).
- 1 saatlik sıcak iskemiden sonra, kalp-akciğer bloğunu mikro diseksiyon yay makası ve forseps ile eksize edin ve buz üzerinde steril bir Petri kabı üzerinde buz gibi soğuk PBS ile nemlendirilmiş steril gazlı bez üzerine yerleştirin.
NOT: Aşağıdaki adımların tümü, akciğerler buz üzerindeki Petri kabının üzerindeyken gerçekleşmelidir. - Sol akciğeri yemek borusundan ve post-kaval lobdan ayırmak için pulmoner ligamentleri mikro diseksiyon yay makası ile dikkatlice kesin.
- Sol akciğer hilar bölgesini Vannas-Tübingen yay makası ile dikkatlice kesin ve sol PV, PA ve Br'yi temin edin.
- Manşetleri PV, PA veya Br üzerine yerleştirin (Şekil 4A-C).
- Manşet tırnağını kapmak için bir sivrisinek hemostatı kullanın.
- PV, PA veya Br'nin distal ucunu uygun manşet gövdesinden tutmak, manşetin etrafındaki ekstra dokuyu atmak ve 8-0 kullanarak güvence altına almak için ince forseps kullanın naylon dikiş. Ekstra dokuyu ve manşet gövdesinin etrafındaki manşeti kesmek için Vannas-Tübingen yay makası kullanın.
- Donör akciğeri, alıcı sıçana nakledilmeye hazır olana kadar buz üzerindeki Petri kabında tuzlu su ile nemlendirilmiş gazlı bezle kaplı tutun (Şekil 4D).
NOT: Ortalama soğuk iskemi süresi 84 dakika ± 11 dakika S.D.'dir.
4. Alıcı sıçan hazırlığı
- Ketamin ve ksilazin karışımını (100 g sıçan başına 0.1 mL) intraperitoneal olarak enjekte ederek ve ayak parmağının sıkışmasına yanıt verilmemesi ile değerlendirilebilecek cerrahi bir anestezi düzleminin gelişmesi için 10 dakika bekleyerek alıcı sıçanda donör sıçanla aynı şekilde anestezi indükleyin.
- Elektronik makas kullanarak kesi alanını tıraş edin.
- Donör sıçanı sırtüstü pozisyona yerleştirin ve insizyon bölgesini betadine ile ıslatılmış steril bir gazlı bezle silin. Ardından alanı% 70 izopropil alkollü çubukla silin. 3 kez tekrarlayın.
- Sıçan havalandırma makinesine sabitlenmeden önce, 4. interkostal boşluğu bulmaya hazırlanırken sıçanın göğsüne çizgiler çizin.
- Göğsü suprasternal çentikten ksifoid sürece kadar ölçün ve bir çizgi çizin (Şekil 5A).
- Bu çizginin ortasında, göğsün sol tarafı boyunca, ölçümün yarısını suprasternal çentikten ksifoid sürece kadar ölçen bir çizgi çizin (Şekil 5A ve B).
- Endotrakeal entübasyon kitinden bir LED ışığına bağlı fiber optik kabloyu kullanarak görselleştirme yoluyla 16 G anjiyo-kateter kullanarak alıcıyı entübe edin.
- Anjiyo-kateteri ventilatöre bağlayın ve% 1-2 izofluran ile cerrahi anestezi düzlemini koruyun.
- 4. interkostal boşluğu bulmak için, göğüs duvarının güçlü bir palpe edilebilir kardiyak impulsun hissedilebileceği alanını bulun (Şekil 5C, kırmızı daire).
- Bu konumda, cildi makasla ve kası mikro diseksiyon yaylı makasla kesin ve 4. interkostal boşluğu mümkün olduğunca geniş açmak için retraktörü kullanın (Şekil 5D ve E).
NOT: Kas diseksiyonu sırasında kanamayı önlemek veya durdurmak için elektriksel koter kullanın. - İnterkostal boşluk geniş bir şekilde açıldıktan sonra, Vannas-Tübingen yay makası kullanarak alıcının sol akciğerinin etrafındaki bağları dikkatlice inceleyin ve steril pamuklu çubuklar ve forsepsler kullanarak akciğeri göğüs bölgesinden dışarı çekin.
- Sol akciğerin etrafına steril gazlı bez yerleştirin ve bir Dieffenbach bulldog kelepçesi ile tutun.
- Sol akciğer hilar bölgesine mümkün olduğunca yakından bir Yaşargil kelepçesi uygulayın.
5. Anastomozlar
- Pulmoner ven (PV) anastomozu
- Alıcının PV'sinin etrafına 7-0 naylon sütür yerleştirin.
- Üst ve alt segmental damarları mümkün olduğunca distal olarak enine keserek Vannas-Tübingen yay makası kullanarak alıcının PV'sini kesin ve bir insülin şırıngası kullanarak kanı 0.2 mL heparinize salin (1 U / mL) ile temizleyin.
- Donör akciğeri hala buz gibi soğuk ıslak steril gazlı bezle sarılmış olarak göğüs boşluğuna yerleştirin.
- Donörün kelepçeli PV'sini alıcının PV'sine yerleştirin ve ardından önceden konumlandırılmış 7-0 naylon sütür ile sabitleyin (Şekil 6).
- Bronşiyal (Br) anastomoz
- Alıcının Br'sinin etrafına 7-0 naylon sütür yerleştirin.
- Üst ve alt segmental hava yollarını Vannas-Tübingen yay makası ile mümkün olduğunca distal olarak enine keserek alıcının Br'sini kesin.
- Donörün kelepçeli Br'sini alıcının Br'sine yerleştirin ve önceden konumlandırılmış 7-0 naylon sütür ile sabitleyin (Şekil 6).
- Pulmoner arter (PA) anastomozu:
- Alıcının PA'sının etrafına 7-0 naylon sütür yerleştirin.
- Alıcının PA'sını adventitial kılıfından kesin, damarın çevresinin yarısını Vannas-Tubingen yay makası ile kesin ve daha sonra bir insülin şırıngası kullanarak PA'daki kanı 0.2 mL heparinize salin (1 U / mL) ile temizleyin.
- Donörün kelepçeli PA'sını alıcının PA'sına yerleştirin ve önceden konumlandırılmış 7-0 naylon sütür ile sabitleyin (Şekil 6).
6. Reperfüzyon
- Nakledilen donör akciğerin reperfüzyonuna ve ventilasyonuna izin vermek için hilum üzerindeki Yaşargil kelepçesini çıkarın (Şekil 7).
- Mikro diseksiyon yay makası ve forseps kullanarak alıcının doğal sol akciğerini diseke edin.
- Nakledilen sol akciğeri alıcının toraksına dikkatlice yeniden konumlandırın.
- Torakotomi insizyonunu 6-0 naylon sütür kullanarak kapatın.
- Kaburgaların etrafına basit çift düğümlü üç adet 6-0 naylon sütür yerleştirin: 4. kaburgadan üstün ve 5. kaburgadan daha düşük (Şekil 8A).
- Üç sütürü bir araya getirmek için hemostatları kullanın (Şekil 8B).
- Havalandırma ayarlarında PEEP'i 6 cmH2O'ya yükseltin.
- Yarayı kapatmak için üç düğümü de çekerek aynı anda birbirine bağlayın (Şekil 8C).
- PEEP'i hemen 2 cmH2O'ya düşürün.
- 6-0 naylon dikiş ile cildi kapatın.
NOT: Laboratuvarımız transplantasyon sonrası akut fazı incelediğinden, bu modeldeki alıcı sıçan ventilasyon ve anestezi altında nakil sonrası 3 saat hayatta kalır ve daha sonra örnekler toplanır.
7. Deneysel örneklerin toplanması (plazma, akciğer dokusu)
- Kontrol örnekleri için, 3 saatlik reperfüzyon periyodu başlatıldıktan sonra donörün sağ loblarını toplayın.
- Protein veya RNA ekspresyon analizleri için superior lob ve post-kaval lobu snap-freeze yapın, histoloji için orta lobu koruyun ve ıslak-kuru ağırlık oranı için inferior lobu kullanın (Şekil 9A).
- 3 saatlik reperfüzyon süresinin bitiminden 10 dakika önce, juguler ven içine bir insülin şırıngası ile heparin (1.000 U / kg) enjekte ederek alıcı örnekleri toplamaya hazırlanın.
NOT: Bu heparin uygulaması, akciğerlerdeki kan pıhtılaşmasını önler ve tedarik sırasında daha kapsamlı bir kızarmaya izin verir. - Plazma toplama
- 3 saatlik reperfüzyon süresinin sonunda, IVC yoluyla bir şırınga ile 1 mL kan toplayın.
- Buz üzerinde saklayın ve daha sonra plazmayı hasat etmek için 10 dakika boyunca 2.000 x g'de santrifüj yapın.
- Ekssanguinasyona izin vermek için IVC'yi keserek alıcı sıçanı ötenazi yapın.
- Torasik kemer boyunca diyaframı diseke edin ve göğüs kafesini diseke ederek göğüs boşluğunu ortaya çıkarın.
- İstenirse doğal veya nakledilen akciğerlerden BAL sıvısı toplayın (isteğe bağlı).
NOT: Akciğerde ıslak-kuru ağırlık oranı veya histoloji yapılıyorsa, sonuçları etkileyebileceğinden BAL sıvı toplanması yapılmamalıdır.- Trakea etrafına 4-0 ipek sütür iplik takın ve sıvı sızıntısını önlemek için trakea ve entübasyon tüpünün etrafına sıkı bir çift düğüm bağlayın.
- Sağ loblardan ve sol lobdan BAL sıvı alımı için buz gibi soğuk PBS miktarını hesaplayın.
NOT: Sağ akciğer için hacim oranı %63, sol akciğer için hacim oranı %37'dir16. Bu nedenle, her iki tarafa da aşılanacak PBS miktarını belirlemek için, hacim tidal hacmin iki katı (Td = 7.2 mL / kg) sağ akciğer için% 63 ve sol akciğer için% 37 ile çarpılarak hesaplanmalıdır. - Sol akciğer hilar bölgesine bir Yasargil kelepçesi yerleştirin (Şekil 10A) ve anjiyo-katetere bağlı bir şırınga ile, hesaplanan miktarda buz gibi soğuk PBS'yi sağ akciğere (alıcının doğal lobları) aşılayın ve şırınga pistonunu yavaşça yukarı çekerek BAL sıvısını toplayın. İki kez gerçekleştirin.
NOT: Aşılanan sıvının% 70-80 oranında geri kazanılması beklenmelidir. - Sol akciğerdeki Yaşargil kelepçesini çıkarın ve kelepçeyi sağ akciğer hiler bölgesine yerleştirin (Şekil 10B).
- Nakledilen sol lobdan BAL sıvısını sağ loblar için toplandığı gibi toplayın ve ardından sağ akciğer hiler bölgesindeki kelepçeyi çıkarın.
- Sağ ve sol kulak kepçelerini mikro diseksiyon yay makası ile kesin ve akciğerleri, boruya bağlı 18 G anjiyo-kateter ve 28 cmH2O'da asılı 20 mL önceden soğutulmuş koruma çözeltisi içeren bir şırınga kullanarak PA boyunca yerçekimi ile yıkayın.
- Alıcının akciğerinden örnekler toplayın.
- Protein veya RNA ekspresyon analizleri için superior lob ve post-kaval lobu snap-freeze edin, histoloji için orta lobu koruyun ve ıslak-kuru ağırlık oranı için inferior lob kullanın) (Şekil 9A).
- Sol nakledilen sol lobu üç bölüme ayırın: dondurulmuş için toplanan üst bölge, histoloji için orta bölge ve ıslak-kuru ağırlık oranı için alt bölge (Şekil 9B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pulmoner ödemi ölçmek için ıslak-kuru ağırlık oranı hesaplandı. Donörün doğal lobu, nakledilen lob ve alıcının doğal lobu protokolde açıklandığı gibi toplandı ve ıslak ağırlık için hemen tartıldı, 48 saat boyunca 60 ° C'de kurutuldu ve daha sonra kuru ağırlık için tekrar tartıldı. Islak-kuru ağırlık oranının artması, pulmoner ödemin göstergesi olacaktır. Sonuçlarımız, nakledilen lobun ıslak-kuru ağırlık oranında donörün veya alıcının doğal lobuna kıyasla anlamlı bir artış olduğunu göstermektedir (p=0.0050, n=6/grup; Şekil 11).
| Manşetler için anjiyo-kateter boyutu | |||
| Sıçan Vücut Ağırlığı (g) | PA | Br | PV |
| 180-200 | 20 gr | 18 gr | 16 gr |
| 200-230 | 18 gr | 16 gr | 14 gr |
| 230-250 | 18 gr | 14 gr | 14 gr |
| 250-270 | 18 gr | 14 gr | 12 - 14 G |
| 270'in üzerinde | 16 gr | 14 gr | 12 gr |
Tablo 1. Manşetler için boyut kılavuzu. Pulmoner arterin (PA), bronşun (Br) veya pulmoner venin (PV) büyüklüğü vücut ağırlığı ile ilgilidir. Vücut ağırlığına ve hangi tip manşet yaptığınıza bağlı olarak, önerilen anjiyo-kateter boyutu verilir.
Şekil 1. Cerrahi aletler. (A) İnce makas, (B) forseps, (C-E) mikrocerrahi forseps, (F) Dumont #5 ince forseps, (G) Vannas-Tubingen yay makası ve Castroviejo mikro diseksiyon makasları, (H) Halsted-sivrisinek hemostatı, (J) retraktör, (K) Yasargil kelepçeleri, (L) Dieffenbach bulldog kelepçesi, (M) kavisli hemostatlar ve (N) Yaşargil kelepçe aplikatörü. Tüm aletler 121 ° C'de 30 dakika boyunca otoklavlanmalıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Çeşitli boyutlarda anjiyo-kateter ve kaburga sırtı cerrahi bıçağı #11 ile manşet hazırlığı. Manşet için seçilen anjiyo-kateterin boyutu, sıçanın vücut ağırlığını ve manşetin pulmoner arter (PA), bronş (Br) veya pulmoner ven (PV) için olup olmadığını dikkate alan manşet boyut kılavuzu (Tablo 1) ile belirlenir. Anjiyo-kateterler (A) 20 G, (B) 18 G, (C) 16 G, (D) 14 G veya (E) 12 G, protokolde açıklandığı gibi bir (F) kaburga sırtı cerrahi bıçağı #11 ile kesilir ve ihtiyaç duyulana kadar tuzlu suda saklanır. (G) Manşet gövdesi uzunluğu 2 mm'dir ve manşet gövdesinin taşınması için manşet gövdesinin üst kısmında 1 mm X 1 mm'lik bir sekme (genişlik x yükseklik) bırakılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Sıcak iskemi. Akciğerler, pulmoner arter boyunca koruma çözeltisi ile yıkanır, gelgit hacminin iki katı hava ile şişirilir ve daha sonra bir alt ped ile sarılır ve sıçanı 1 saat boyunca normal vücut sıcaklığında tutmak için ameliyat ısıtma tahtasında tutulur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Donör akciğer PV, PA ve Br'nin kelepçelenmesi. (A) Pulmoner ven, PV (B) pulmoner arter, PA veya (C) bronş, Br, 8-0 ile sabitlenmiş, uygun büyüklükte bir manşetten sokulur naylon sütür ve (D) daha sonra buz üzerinde steril bir Petri kabı üzerinde buz gibi soğuk salin ile nemlendirilmiş steril gazlı bez üzerinde saklanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5. 4. interkostal alanda ölçme ve diseksiyon. (A) Alıcı sıçan sırtüstü yatırılır ve göğüs suprasternal çentikten ksifoid sürece kadar ölçülür ve bir çizgi çizilir. (B) Bu çizginin orta noktasında, sol tarafa doğru yarı uzunlukta başka bir çizgi çizilir. (C) Bu çizgi boyunca, mikrocerrah, 4. interkostal boşluğun (kırmızı daire) uygun yerini sağlamak için kardiyak impulsun en güçlü olduğu bir alanı hissetmelidir. (D) Deri ve kas daha sonra ince makasla diseke edilir. (E) Retraktör daha sonra alanı geniş bir şekilde açmak için kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6. Anastomoz. Donörün kelepçeli (A) PV (B) Br veya (C) PA'sı alıcının PV, Br veya PA'sına yerleştirilir ve daha sonra 7-0 naylon sütür ile sabitlenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7. Reperfüzyon. Anastomozlar tamamlandıktan sonra kelepçe çıkarılarak reperfüzyona başlanabilir ve alıcı sıçan ventilasyon ve anestezi altında 3 saat hayatta kalır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8. Yara kapanması. (A) Basit çift düğümlü üç adet 6-0 naylon sütür, kaburgaların etrafına 4. kaburgadan üstün ve 5. kaburgadan daha düşük olarak yerleştirilir. (B) Üç sütürü bir araya getirmek için her iki elinizde hemostat kullanın ve ventilasyon ayarlarında PEEP'i 6 cmH2O'ya yükseltin. (C) Yarayı kapatmak için yukarı ve uzağa çekerek üç düğümü aynı anda birbirine bağlayın, PEEP'i hemen 2 cmH2O'ya düşürün ve cildi 6-0 naylon dikişle kapatın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9. Akciğer dokusu toplanması. (A) Donörün veya alıcının doğal lobları için, superior lob ve post-kaval lob, protein veya RNA ekspresyon analizleri için dondurulabilir, orta lob histoloji için korunabilir ve inferior lob ıslak-kuru ağırlık oranı için kullanılabilir. (B) Nakledilen lob için, dondurulmuş için üst bölgeyi, histoloji için orta bölgeyi veya ıslak-kuru ağırlık oranı için alt bölgeyi toplayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10. Seçici BAL sıvı toplama için kelepçenin uygulanması. Havuzlanmış bir numuneden kaçınmak için, BAL sıvısı sağ (yerli) veya sol (nakledilen) akciğerden toplanabilir. (A) Sol akciğer hiler bölgesi, sağ loblardan BAL sıvısı toplamak için kelepçelenebilir. (B) Sol lobdan BAL sıvısı toplamak için sağ akciğer hiler bölgesi kelepçelenebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 11. Islak-kuru ağırlık oranı. Islak-kuru ağırlık oranı, pulmoner ödemi ölçmek için hesaplanmıştır ve naklin ne kadar iyi gittiğini göstermek için kullanılabilir. Donörün doğal lobu, nakledilen lob veya alıcının doğal lobu protokolde açıklandığı gibi toplandı ve ıslak ağırlık için hemen tartıldı, 48 saat boyunca 60 ° C'de kurutuldu ve daha sonra kuru ağırlık için tekrar tartıldı. Islak ağırlığın kuru ağırlığa oranı alındı. Nakledilen lobun oranı, donör veya alıcının doğal loblarına kıyasla önemli ölçüde artmıştır. n=6 sıçan/grup ve barlar SD'± ortalamasını temsil etmektedir. İstatistiksel analiz ANOVA kullanılarak ve Tukey'in post-hoc analizi ile yapıldı. ** s<0.01. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, prosedürü optimize etmek için bir sıçan akciğer nakli protokolünde birkaç kritik adımda müdahale ettik. Sıçan akciğer transplantasyonu için çeşitli kelepçeleme teknikleri bildirilmiş olsa da 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15, mikrocerrahlar için işlem hala öznel ve zor olabilir. PV ve PA'nın kan sağlaması için uygun manşet boyutunun veya nakledilen akciğere hava sağlamak için Br'nin kullanılması gerektiğini vurguladık ve sıçanın vücut ağırlığına göre optimal manşet boyutunu belirlemek için daha objektif bir yol sağladık. Akciğerlerin sıcak iskemisini daha tutarlı bir şekilde indüklemek için, akciğer enflasyonu, kelepçeleme ve 1 saatlik sıcak iskemi süresi boyunca sıçanın nasıl sıcak tutulacağı konusunda önerilerde bulunduk. Alıcının prosedürü sırasında, 4. interkostal boşluğu bulmak zor olabilir. Kardiyak impuls için bir ölçüm ve his yöntemi kullanarak bu pozisyonun daha doğru bir şekilde bulunabileceğini önerdik. Reperfüzyon sırasında, yarayı daha iyi kapatmak için, dikişleri ele alma ve yarayı daha hızlı kapatabilen ve akciğerin aşırı şişmesini ve yaralanmasını önleyebilen PEEP'i ayarlama tekniğini de gösterdik. Son olarak, deneyler ve farklı vücut ağırlıkları arasında karşılaştırılabilecek örneklerin daha objektif bir şekilde toplanmasına izin veren doku ve BAL sıvı toplama stratejileri sunduk.
Tarif edilen tekniklerin en önemli sınırlaması, genel olarak nakil operasyonunun oldukça dik öğrenme eğrisidir. Öğrenme eğrisi, tutarlı cerrahi uygulamalarla ve literatürdeki sorun giderme tekniklerinin gözden geçirilmesiyle azaltılabilen bir eğridir. Diğer bir sınırlama, bu modelin IRI ve transplantasyonun akut fazını ve biyokimyasal değişikliklerin ilk meydana geldiği transplantasyonu incelemesidir, bu da laboratuvarımızın odak noktasıdır. Gelecekteki çalışmalar, transplantasyon sonrası daha uzun zaman çizelgelerinde bronşiyal ve vasküler açıklığı test etmelidir.
Genel olarak, uygulanabilir bir küçük hayvan nakli modeli, transplantasyon ve iskemi-reperfüzyon hasarı (IRI) için terapötik müdahaleleri değerlendirmek için kritik öneme sahiptir. Özellikle sıçan akciğer nakli modeli, küçük hayvan ex vivo akciğer perfüzyonunun (EVLP) incelenmesine ek olarak yararlıdır17. Aynı zamanda murin akciğer transplantasyonuna daha uygun bir alternatiftir, çünkü daha büyük anatomik boyut, araştırmacının daha derinlemesine analizler için yeterli doku elde etmesini sağlar18. Ek olarak, model, yeni küçük molekül ve protein terapötikleri 19,20,21,22 ile terapötik müdahaleden sonra donör akciğer allogreftlerinin donöre, EVLP 17 aracılığıyla donör organa veya alıcıya uygulanabilirliğini belirlemek için gereklidir ve in vivo veri toplamak için güçlü bir yol sağlar. Bu raporda anlattığımız optimizasyonlar, öğrenme eğrilerini azaltmayı ve bazı öznellikleri ortadan kaldırmayı amaçlayan mikrocerrahlar için önemlidir. Standartlaştırılmış bir akciğer kelepçeleme boyutu algoritması kullanılarak, cerrahi yaklaşım kolaylaştırılabilir ve daha objektif hale getirilebilir. Transplant reperfüzyon periyodunun sonunda, BAL sıvısı ve doku toplanmasına yönelik tarif edilen yapılandırılmış yaklaşım, deney başına toplanan verilerin etkisini en üst düzeye çıkararak hayvanların sorumlu kullanımını ve mikrocerrahın zamanının verimli kullanımını da sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
BAW, YGL ve JLK, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibesi R01HL143000 ile desteklenmektedir. BAW, Savunma Bakanlığı (DOD) hibesi W81XWH1810787 ile desteklenmektedir. SMB, NIH hibesi R01DK123475 aracılığıyla desteklenir. JM, NIH hibeleri AR061385, AR070752, DK106394 ve AG056919'un yanı sıra DOD hibesi W81XWH-18-1-0787 tarafından desteklenmektedir.
Acknowledgments
Hiç kimse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Gauge angio-catheter | BD | 382277 | |
| 14 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251717-02 | |
| 16 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252586-02 | |
| 18 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251679-02 | |
| 20 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252527-02 | |
| 4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| 6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
| 7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
| 8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
| Betadine Spray | Avrio Health L.P | UPC 367618160039 | |
| Clippers | VWR | MSPP-023326 | |
| Castroviejo micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5668 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Electrocautery | Macan | MV-7A | |
| Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Halsted-mosquito hemostat | Roboz Surgical Instrument Co | RS-7112 | |
| Heparin | Fresnius Medical Care | C504701 | |
| Insulin syringe | Life Technologies | B328446 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropyl Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| Ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
| Dieffenbach Bulldog Clamp | World Precision Instruments | WPI14117 | |
| Needle holder/Forceps, Curved | Micrins | MI1542 | |
| Needle holder/Forceps, Straight | Micrins | MI1540 | |
| Perfadex Plus (Organ Preservation Solution) | XVIVO Perfusion AB | REF# 19950 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | Used to check SpO2 and heartbeat |
| Retractor | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6560 | |
| Saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Syringe 5mL | BD | 309646 | |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT351T | Used to clamp bronchus |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT261T | Used to clamp hilum |
| Yasargil Clamp Applicator | Aesculap, Inc | FT484T |
References
- Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 97 (4), 578-581 (1989).
- Zhai, W., et al. Simplified rat lung transplantation by using a modified cuff technique. Journal of Investigative Surgery. 21 (1), 33-37 (2008).
- Goto, T., et al. Simplified rat lung transplantation using a new cuff technique. Annals of Thoracic Surgery. 93 (6), 2078-2080 (2012).
- Guo, H., et al. Improvements of surgical techniques in a rat model of an orthotopic single lung transplant. European Journal of Medical Research. 18, 1 (2013).
- Tian, D., Shiiya, H., Sato, M., Nakajima, J. Rat lung transplantation model: modifications of the cuff technique. Annals of Translational Medicine. 8 (6), 407 (2020).
- Rajab, T. K. Anastomotic techniques for rat lung transplantation. World Journal of Transplantation. 8 (2), 38-43 (2018).
- Reis, A., Giaid, A., Serrick, C., Shennib, H. Improved outcome of rat lung transplantation with modification of the nonsuture external cuff technique. Journal of Heart and Lung Transplantation. 14 (2), 274-279 (1995).
- Sugimoto, R., et al. Experimental orthotopic lung transplantation model in rats with cold storage. Surgery Today. 39 (7), 641-645 (2009).
- Santana Rodriguez, N., et al. Technical modifications of the orthotopic lung transplantation model in rats with brain-dead donors. Archivos de Bronconeumología. 47 (10), 488-494 (2011).
- Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade. Journal of Surgical Research. 194 (2), 659-666 (2015).
- Rajab, T. K. Techniques for lung transplantation in the rat. Experimental Lung Research. 45 (9-10), 267-274 (2019).
- Iskender, I., et al. Effects of Warm Versus Cold Ischemic Donor Lung Preservation on the Underlying Mechanisms of Injuries During Ischemia and Reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
- Lin, X., et al. Five-year update on the mouse model of orthotopic lung transplantation: Scientific uses, tricks of the trade, and tips for success. Journal of Thoracic Disease. 4 (3), 247-258 (2012).
- Song, J. A., et al. Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats. Toxicological Research. 26 (3), 203-208 (2010).
- Chang, J. E., Kim, H. J., Yi, E., Jheon, S., Kim, K. Reduction of ischemia-reperfusion injury in a rat lung transplantation model by low-concentration GV1001. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (5), 972-979 (2016).
- De Backer, J. W., et al. Study of the variability in upper and lower airway morphology in Sprague-Dawley rats using modern micro-CT scan-based segmentation techniques. Anatomical Record. 292 (5), Hoboken. 720-727 (2009).
- Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), e52309 (2015).
- Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. Journal of Visualized Experiments. (65), e3947 (2012).
- Jia, Y., et al. Treatment of acute lung injury by targeting MG53-mediated cell membrane repair. Nature Communications. 5, 4387 (2014).
- Kim, J. L., et al. Pegylated-Catalase Is Protective in Lung Ischemic Injury and Oxidative Stress. Annals of Thoracic Surgery. , (2020).
- Beal, E. W., et al. D-Ala(2), D-Leu(5)] Enkephalin Improves Liver Preservation During Normothermic Ex Vivo Perfusion. Journal of Surgical Research. 241 (2), 323-335 (2019).
- Akateh, C., et al. Intrahepatic Delivery of Pegylated Catalase Is Protective in a Rat Ischemia/Reperfusion Injury Model. Journal of Surgical Research. 238, 152-163 (2019).
