Summary
Hier stellen wir Optimierungen an einem Rattenlungentransplantationsmodell vor, die dazu dienen, die Ergebnisse zu verbessern. Wir bieten eine Größentabelle für Manschetten basierend auf dem Körpergewicht, eine Messstrategie zur Bestimmung des 4. Interkostalraums sowie Methoden des Wundverschlusses und der BAL-Flüssigkeit (bronchoalveoläre Lavage) und Gewebeentnahme.
Abstract
Aus unserer Erfahrung mit der Lungentransplantation von Ratten haben wir mehrere Bereiche mit Verbesserungspotenzial gefunden. Die Informationen in der vorhandenen Literatur über Methoden zur Auswahl geeigneter Manschettengrößen für die Pulmonalvene (PV), die Pulmonalarterie (PA) oder den Bronchus (Br) sind vielfältig, so dass die Bestimmung der richtigen Manschettengröße während der Rattenlungentransplantation eine Übung von Versuch und Irrtum ist. Durch die Standardisierung der Cuffing-Technik, um die kleinste effektive Manschette zu verwenden, die für die Größe des Gefäßes oder Bronchus geeignet ist, kann man das Transplantationsverfahren sicherer, schneller und erfolgreicher machen. Da die Durchmesser von PV, PA und Br mit dem Körpergewicht der Ratte zusammenhängen, stellen wir eine Strategie zur Auswahl einer geeigneten Größe unter Verwendung eines gewichtsbasierten Leitfadens vor. Da das Lungenvolumen auch mit dem Körpergewicht zusammenhängt, empfehlen wir, dass dieser Zusammenhang auch bei der Auswahl des richtigen Luftvolumens für das Aufblasen der Spenderlunge während einer warmen Ischämie sowie für das richtige PBS-Volumen, das während der Entnahme von bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BAL) instilliert werden soll, berücksichtigt werden sollte. Wir beschreiben auch Methoden für die 4. Interkostalraumdissektion, den Wundverschluss und die Probenentnahme sowohl aus dem nativen als auch aus dem transplantierten Lappen.
Introduction
Seit über drei Jahrzehnten modifizieren und verbessern Forscher Rattenlungentransplantationsmodelle, damit die generierten Daten konsistenter sind und den tatsächlichen klinischen Zustand besser widerspiegeln. In der Zeit, in der unser Labor dieses Modell durchführte, haben wir vier Bereiche mit Verbesserungspotenzial festgestellt: Cuffing-Techniken für Anastomosen, Identifizierung des 4. Interkostalraums des Empfängers, Aufblasen und Wundverschluss der Lunge während des Eingriffs des Empfängers sowie die Entnahme von Proben für die Analyse.
Modifikationen der Cuffing-Technik für Anastomosen können den gesamten Transplantationsprozess verbessern, indem sie die Handhabungszeit der Spenderlungeverkürzen 1,2,3,4,5,6 und das Anastomosenverfahren für den Mikrochirurgen schneller und technisch einfacher machen. Während es wichtig ist, Manschetten in der richtigen Größe zu verwenden, um die transplantierte Lunge mit dem notwendigen Blut und Luftstrom zu versorgen, gibt es nur begrenzte Richtlinien darüber, wie man die Größe der Manschetten für die Pulmonalvene (PV), die Pulmonalarterie (PA) oder den Bronchus (Br) auswählen sollte5,7,8,9. Da die Durchmesser von PV, PA und Br mit dem Körpergewicht der Spender- und Empfängerratten zusammenhängen, schlagen wir vor, dass die Manschettengröße auf dem Körpergewicht basiert. Dieser Bericht enthält eine Größentabelle für Manschetten basierend auf dem Körpergewicht einer Ratte (180 g bis über 270 g), die dazu dient, die Blut- und Luftversorgung der transplantierten Lunge zu optimieren (Tabelle 1).
Während ein neuerer Mikrochirurg während des Spenderverfahrens erfolgreich und einfach eine Spenderlunge beschaffen kann, ist die Transplantation der Lunge während des Eingriffs des Empfängers komplizierter und hängt von der Erfahrung des Mikrochirurgen ab. Der Versuch, den 4. Interkostalraum zu finden, um Zugang zur linken Lunge des Empfängers zu erhalten, ist einer der schwierigeren Schritte, der eine gewisse Subjektivität aufweist und die Eingriffszeit verlängern kann. Daher stellen wir eine einfache und objektive Methode vor, um die Identifizierung der 4. Interkostalraumlokalisation zu unterstützen, indem wir Brustmessungen und das Herzklopfen verwenden, um den richtigen Bereich der Brustwand zu finden, um 4,5,6,10,11,12 zu präparieren.
Wir schlagen auch eine Verbesserung der Vergrößerung der Spenderlunge vor, die eine potenzielle Ursache für die Schädigung des Organs darstellt. Die Spenderlunge wird entleert, bis die Reperfusion beginnt. Beim Nähen des 4. Zwischenrippenraums wird die Spenderlunge häufig durch Erhöhung des PEEP von 2 cmH2 O auf 6cmH2O aufgebläht. Um die Lungenschädigung durch Überpumpen zu minimieren, schlagen wir eine Technik vor, bei der drei 6-0-Nylonnähte mit einfachen Doppelknoten um die 4. Rippe unterhalb der 5. Rippe gelegt werden. Wenn es Zeit für den Wundverschluss ist, werden die Enden der drei Nähte mit Hämostaten in beiden Händen gehalten, die Wunde wird auf einmal geschlossen, indem auf jeder Seite nach oben gezogen wird, und der PEEP wird sofort auf 2cmH2O reduziert. Auf diese Weise kann sich die Lunge so kurz wie möglich ausdehnen10.
Am Ende eines Experiments möchte der Forscher oft viele Arten von Proben für viele Arten von Analysen von jedem Transplantat sammeln. Zum Beispiel können eingefrorenes Gewebe, formalinfixiertes Gewebe, Gewebe für das Nass-Trocken-Gewichtsverhältnis zur Bestimmung des Lungenödems und bronchoalvelolare Lavageflüssigkeit (BAL) verwendet werden, um zu beurteilen, wie gut das Transplantat verlaufen ist. Die traditionelle Methode der Entnahme von BAL-Flüssigkeit ermöglicht eine gemischte Probe sowohl aus den nativen Lappen des Empfängers als auch aus dem transplantierten Lappen des Spenders13,14,15. Um dies zu überwinden, stellen wir eine Methode zur Klemmung der Hilarbereiche vor, die einen genaueren Einblick in den Zustand der transplantierten und nativen Lunge geben kann. Darüber hinaus ist es wichtig, das PBS-Volumen zu berücksichtigen, das zum Auffangen von BAL-Flüssigkeit auf jeder Seite der Lunge verwendet wird, da die BAL-Flüssigkeit zahlreiche lösliche Faktoren wie Zytokine und Chemokine enthält, die anhand der Konzentration gemessen werden. Die Normalisierung des Volumens der eingeträuselten Flüssigkeit auf das geschätzte Volumen der Lungenkapazität kann beim Vergleich helfen. Mit vier Lappen auf der rechten Seite und einem Lappen auf der linken Seite hat jeder der fünf Lappen der Ratte ein anderes Volumen und eine andere Oberfläche16. Nach einer früheren Studie zur Volumenmessung von Lungenlappen von Backer et al. beträgt das Volumen des rechten Lappens 63% (4400 mm 3) und des linken Lappens 37% (2500 mm3). Daher empfehlen wir, das PBS-Volumen, das zum Auffangen von BAL-Flüssigkeit verwendet wird, als das Doppelte des Tidalvolumens (7,2 ml/kg) multipliziert mit 63 % für die rechte Lunge und 37 % für die linke Lunge zu berechnen. Mit diesem Ansatz kann man Variablen wie Körpergewicht und Timingbesser kontrollieren 10,16.
Insgesamt werden wir in diesem Bericht einige Modifikationen des experimentellen Standardmodells der Rattenlungentransplantation demonstrieren, die das Verfahren effizienter machen und die Fähigkeit erhöhen können, genauere und reichhaltigere Daten aus jedem Experiment zu generieren.
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Protocol
Männliche Sprague-Dawley-Ratten (180-270 g Körpergewicht) wurden kommerziell gekauft (z. B. Envigo) und unter pathogenfreien Bedingungen in der Ohio State University Animal Facility untergebracht. Alle Verfahren wurden gemäß dem NIH und dem National Research Council's Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals und mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee der Ohio State University (IACUC-Protokoll # 2012A00000135-R2) human durchgeführt.
1. Ersteinrichtung
- Richten Sie chirurgische Geräte ein.
HINWEIS: Dies ist eine Operation, bei der es sich nicht um ein Überleben handelt. Wenn eine Überlebensoperation durchgeführt werden soll, müssten sterile Instrumente und Barrierevorkehrungen getroffen werden.- Schalten Sie das Gerät zur Überwachung der Herzfrequenz/Sauerstoffsättigung und die Wärmetafel auf 42 °C ein.
- Schalten Sie das Beatmungs- und Anästhesiegerät ein, um den Isofluran-Verdampfer vorzuwärmen.
HINWEIS: Verwenden Sie ein Tidalvolumen (Td) von 7,2 ml/kg, einen exspiratorischen Druck (PEEP) von 2cmH2Ound eine Atemfrequenz von 80 Schlägen pro Minute. - Füllen Sie die Anästhesiespritze mit 10 ml flüssigem Isofluran und montieren Sie die Spritze auf dem Beatmungs- und Anästhesiegerät.
- Schalten Sie das Operationsmikroskop ein, wobei die Höhe und der Fokus an die Vorlieben des Mikrochirurgen angepasst sind.
- Schalten Sie das Elektrokautergerät ein.
- Bereiten Sie chirurgische Instrumente vor und legen Sie sie aus (Abbildung 1).
HINWEIS: Alle chirurgischen Instrumente wurden bei 121 °C für 30 min autoklaviert. - Sammeln und erfassen Sie das Körpergewicht von Spender- und Empfängerratten.
- Verwenden Sie Tabelle 1 und das Körpergewicht der Ratte, um das richtige Angiokatheter-Messgerät (20, 18, 16, 14 oder 12 G) für die Herstellung von Manschetten zu bestimmen.
- Bereiten Sie Manschetten für die Pulmonalarterie (PA), den Bronchus (Br) und die Pulmonalvene (PV) unter Verwendung der Größentabelle basierend auf dem Körpergewicht vor (Tabelle 1 und Abbildung 2).
- Legen Sie einen Angiokatheter der Größe 20 G, 18 G, 16 G, 14 G oder 12 G (Abbildung 2A-E) auf eine sterile Oberfläche unter dem Operationsmikroskop.
- Verwenden Sie dann eine chirurgische Klinge #11 mit Rippenrücken, um den Angiokatheter in einem 90°-Winkel zu durchtrennen, um einen 2 mm langen Manschettenkörper mit einer 1 mm x 1 mm großen Lasche (Breite x Höhe) an der Oberseite des Manschettenkörpers zu bilden (Abbildung 2G).
- Bewahren Sie die Manschetten bis zur Verwendung in steriler Kochsalzlösung auf.
- Bereiten Sie Lösungen vor.
- Bereiten Sie eine Mischung aus Ketamin und Xylazin in einer sterilen Injektionsflasche vor, indem Sie 1 ml Xylazin (100 mg/ml) zu 10 ml Ketamin (100 mg/ml) hinzufügen.
HINWEIS: Das Verfallsdatum für diesen Cocktail wird anhand des frühesten Verfallsdatums der verwendeten Komponenten bestimmt. - Ziehen Sie die richtige Dosierung für die Ratten in Spritzen auf (0,1 ml des Ketamin/Xylazin-Gemischs pro 100 g Körpergewicht der Ratte; z. B. würden bei einer 200-g-Ratte 0,2 ml Ketamin/Xylazin-Gemisch abgegeben werden).
HINWEIS: Diese Dosierung liefert der Ratte 91 mg/kg Ketamin und 9,1 mg/kg Xylazin und sollte eine Ratte 60-80 Minuten lang sediert halten. - Bereiten Sie Heparin vor, das in einer Dosis von 1.000 E/kg verabreicht wird.
- Lagern Sie die Kochsalzlösung, PBS und die Konservierungslösung auf Eis (Materialtabelle).
- Bereiten Sie eine Mischung aus Ketamin und Xylazin in einer sterilen Injektionsflasche vor, indem Sie 1 ml Xylazin (100 mg/ml) zu 10 ml Ketamin (100 mg/ml) hinzufügen.
2. Vorbereitung der Spenderratte
- Induzieren Sie eine Anästhesie bei der Spenderratte, indem Sie das Ketamin-Xylazin-Gemisch intraperitoneal injizieren und ~10 Minuten warten, bis sich eine chirurgische Anästhesieebene entwickelt, die durch mangelnde Reaktion auf Zehenzwickungen beurteilt werden kann.
- Rasieren Sie den Einschnitt mit einer elektronischen Haarschneidemaschine.
- Legen Sie die Spenderratte in Rückenlage auf das chirurgische Wärmebrett und wischen Sie den Einschnitt mit einer sterilen, mit Betadine getränkten Gaze ab. Wischen Sie den Bereich dann mit einem 70%igen Isopropylalkohol-Tupfer ab. Wiederholen Sie dies 3 Mal.
- Machen Sie mit einer Schere einen 3 bis 4 cm langen Hautschnitt in der Mitte des Halses und präparieren Sie vorsichtig das Unterhautgewebe und die Muskeln mit einer Pinzette (anstelle einer Schere, um Blutungen zu vermeiden).
- Für die endotracheale Intubation fädeln Sie eine 4-0-Seidennaht um die Luftröhre und führen einen 16-G-Angiokatheter in die Luftröhre ein. Binden Sie die Naht mit einem Doppelknoten fest um die Luftröhre und schließen Sie dann mit einem einzigen Knoten ab, um den Angiokatheter an Ort und Stelle zu halten.
- Schließen Sie den Angiokatheter an das Beatmungsgerät an und halten Sie eine chirurgische Anästhesieebene bei der Ratte mit 1-2% Isofluran aufrecht.
- Führen Sie eine Laparo-Sternotomie als kombinierten Mittellinien- und Querschnitt mit einer Schere durch.
- Injizieren Sie Heparin (1.000 E/kg) mit einer Insulinspritze über die untere Hohlvene (IVC) und lassen Sie 10 Minuten für die systemische Zirkulation einwirken.
HINWEIS: Diese Verabreichung von Heparin verhindert Blutgerinnsel in der Spenderlunge. - Präparieren Sie das Zwerchfell sorgfältig, indem Sie entlang des Brustbogens schneiden, und legen Sie dann die Brusthöhle frei, indem Sie dem Brustbein bis zum Hals folgen.
3. Spender-Lungen-Wärme-Ischämie und -beschaffung
- Euthanasieren Sie die Spenderratte, indem Sie den IVC durchschneiden.
- Während die Lunge noch beatmet wird, schneiden Sie sowohl die rechte als auch die linke Ohrmuschel mit einer Mikropräparier-Federschere und spülen Sie die Lunge mit 20 ml Konservierungslösung in einer Spritze, die bei 28 cmH2O durch Schwerkraft hängt und mit einem Schlauch und einem 18-G-Angiokatheter verbunden ist, der direkt durch die Lungenarterie eingeführt wird.
- Trennen Sie das Beatmungsgerät vom Endotrachealtubus und schließen Sie es an eine 5-ml-Spritze an, die je nach Körpergewicht mit einem geeigneten Luftvolumen gefüllt ist.
HINWEIS: Das Luftvolumen zum Aufblasen der Lunge kann wie folgt berechnet werden, als ob das Doppelte des Tidalvolumens (Td = 7,2 ml/kg) vorhanden wäre, z. B. hätte eine 200-g-Ratte einen Td von 1,44 ml, und multipliziert mit 2 würde dies 2,88 ml Luft ergeben, die zum Aufblasen der Lunge benötigt wird. - Die Lunge des Spenders aufblasen.
- Setzen Sie eine Yasargil-Klemme auf die Luftröhre, um die Lunge aufgeblasen zu halten, und bedecken Sie die Lunge und das Herz mit steriler Baumwollgaze. Befeuchten Sie die Gaze mit Kochsalzlösung, wickeln Sie die Spenderratte mit einer Unterlage ein und lassen Sie sie 1 Stunde lang auf dem wärmenden Operationsbrett stehen, um eine warme Ischämie in der Lunge zu induzieren (Abbildung 3).
- Nach 1 h warmer Ischämie wird der Herz-Lungen-Block mit einer Mikropräparier-Federschere und einer Pinzette herausgeschnitten und auf sterile, mit eiskaltem PBS angefeuchtete Gaze auf eine sterile Petrischale auf Eis gelegt.
Anmerkungen: Alle folgenden Schritte sollten ausgeführt werden, während sich die Lunge auf der Petrischale auf Eis befindet. - Schneiden Sie die Lungenbänder vorsichtig mit einer Mikropräparier-Federschere ein, um die linke Lunge von der Speiseröhre und dem Postkavallappen zu trennen.
- Schneiden Sie den linken Lungenflügelbereich vorsichtig mit einer Vannas-Tübinger Federschere ab und beschaffen Sie die linke PV, PA und Br.
- Legen Sie die Manschetten auf PV, PA oder Br (Abbildung 4A-C).
- Verwenden Sie einen Moskito-Hämostaten, um die Manschettenlasche zu greifen.
- Verwenden Sie eine feine Pinzette, um das distale Ende des PV, PA oder Br durch den entsprechenden Manschettenkörper zu greifen, das überschüssige Gewebe um die Manschette zu wickeln und mit 8-0 zu sichern Nylon-Naht. Verwenden Sie eine Vannas-Tübingen-Federschere, um überschüssiges Gewebe und die Manschette um den Manschettenkörper herum abzuschneiden.
- Bewahren Sie die Spenderlunge mit mit Kochsalzlösung befeuchteter Gaze auf der Petrischale auf Eis auf, bis sie bereit ist, in die Empfängerratte transplantiert zu werden (Abbildung 4D).
HINWEIS: Die durchschnittliche Zeit der kalten Ischämie beträgt 84 Minuten ± 11 Minuten S.D.
4. Vorbereitung der Empfängerratte
- Induzieren Sie eine Anästhesie bei der Empfängerratte auf die gleiche Weise wie bei der Spenderratte, indem Sie das Ketamin-Xylazin-Gemisch intraperitoneal injizieren (0,1 ml pro 100 g Ratte) und 10 Minuten warten, bis sich eine chirurgische Anästhesieebene entwickelt, die durch mangelndes Ansprechen auf Zehenkneifen beurteilt werden kann.
- Rasieren Sie den Schnittbereich mit einer elektronischen Haarschneidemaschine.
- Legen Sie die Spenderratte in Rückenlage und wischen Sie den Einschnitt mit einer sterilen, mit Betadin getränkten Gaze ab. Wischen Sie den Bereich dann mit einem 70%igen Isopropylalkohol-Tupfer ab. Wiederholen Sie dies 3 Mal.
- Bevor die Ratte an der Beatmungsmaschine befestigt wird, zeichnen Sie Linien auf die Brust der Ratte, um sich darauf vorzubereiten, den 4. Zwischenrippenraum zu finden.
- Messen Sie den Brustkorb von der suprasternalen Kerbe bis zum Processus xiphoideus und zeichnen Sie eine Linie (Abbildung 5A).
- Zeichnen Sie in der Mitte dieser Linie eine Linie entlang der linken Seite des Brustkorbs, die die Hälfte des Maßes von der suprasternalen Kerbe bis zum Processus xiphoideus misst (Abbildung 5A und B).
- Intubieren Sie den Empfänger mit einem 16-G-Angiokatheter durch Visualisierung mit dem Glasfaserkabel, das mit einer LED-Leuchte aus dem endotrachealen Intubationskit verbunden ist.
- Schließen Sie den Angiokatheter an das Beatmungsgerät an und halten Sie eine chirurgische Anästhesieebene mit 1-2% Isofluran aufrecht.
- Um den 4. Zwischenrippenraum zu finden, suchen Sie den Bereich der Brustwand, in dem ein starker tastbarer Herzimpuls zu spüren ist (Abbildung 5C, roter Kreis).
- Schneiden Sie an dieser Stelle die Haut mit einer Schere und den Muskel mit einer Mikropräparierfederschere ein und öffnen Sie mit dem Retraktor den 4. Zwischenrippenraum so weit wie möglich (Abbildung 5D und E).
Anmerkungen: Verwenden Sie eine elektrische Kauterisation, um Blutungen während der Muskeldissektion zu vermeiden oder zu stoppen. - Sobald der Zwischenrippenraum weit geöffnet ist, präparieren Sie vorsichtig die Bänder um die linke Lunge des Empfängers mit einer Vannas-Tübingen-Federschere und ziehen Sie die Lunge mit sterilen Wattestäbchen und Pinzetten aus dem Brustbereich.
- Sterile Gaze um die linke Lunge legen und mit einer Dieffenbach Bulldoggenklemme festhalten.
- Setzen Sie eine Yasargil-Klemme so proximal wie möglich auf den linken Lungenhilabereich auf.
5. Anastomosen
- Lungenvenenanastomose (PV)
- Legen Sie 7-0 Nylonnaht um den PV des Empfängers.
- Schneiden Sie den PV des Empfängers mit der Vannas-Tübingen-Federschere ein, indem Sie die oberen und unteren Segmentvenen so distal wie möglich quer durchtrennen und das Blut mit 0,2 ml heparinisierter Kochsalzlösung (1 U/ml) mit einer Insulinspritze ausspülen.
- Legen Sie die Spenderlunge, die noch mit eiskalter, nasser, steriler Gaze umwickelt ist, in die Brusthöhle.
- Führen Sie den PV mit Manschetten des Spenders in den PV des Empfängers ein und befestigen Sie ihn dann mit dem vorpositionierten 7-0-Nylonnaht (Abbildung 6).
- Bronchiale (Br) Anastomose
- Legen Sie 7-0 Nylonnaht um die Br.
- Schneiden Sie das Br des Empfängers ein, indem Sie die oberen und unteren segmentalen Atemwege mit einer Vannas-Tübingen-Federschere so distal wie möglich quer durchtrennen.
- Führen Sie das Br mit Manschetten des Spenders in das Br des Empfängers ein und sichern Sie es mit dem vorpositionierten 7-0-Nylonnaht (Abbildung 6).
- Anastomose der Pulmonalarterie (PA):
- Legen Sie 7-0 Nylonnaht um die PA des Empfängers.
- Schneiden Sie die PA des Empfängers aus der Adventitialhülle, schneiden Sie die Hälfte des Gefäßumfangs mit einer Vannas-Tübingen-Federschere ein und spülen Sie dann das Blut in der PA mit 0,2 ml heparinisierter Kochsalzlösung (1 U/ml) mit einer Insulinspritze aus.
- Führen Sie die PA mit Manschetten des Spenders in die PA des Empfängers ein und sichern Sie sie mit der vorpositionierten 7-0-Nylonnaht (Abbildung 6).
6. Reperfusion
- Entfernen Sie die Yasargil-Klemme am Hilum, um eine Reperfusion und Belüftung der transplantierten Spenderlunge zu ermöglichen (Abbildung 7).
- Präparieren Sie die native linke Lunge des Empfängers mit einer Mikropräparierfederschere und einer Pinzette.
- Positionieren Sie die transplantierte linke Lunge vorsichtig wieder in den Brustkorb des Empfängers.
- Schließen Sie den Thorakotomie-Schnitt mit einer 6-0-Nylonnaht.
- Legen Sie drei 6-0-Nylonnähte mit einfachen Doppelknoten um die Rippen oberhalb der 4. Rippe und unterhalb der 5. Rippe (Abbildung 8A).
- Verwenden Sie Hämostate, um die drei Nähte zusammenzufassen (Abbildung 8B).
- Erhöhen Sie den PEEP in den Lüftungseinstellungen auf 6cmH2O.
- Binden Sie alle drei Knoten gleichzeitig zusammen, indem Sie sie wegziehen, um die Wunde zu schließen (Abbildung 8C).
- PEEP sofort auf 2cmH2O verringern.
- Schließen Sie die Haut mit einer 6-0 Nylonnaht.
HINWEIS: Unser Labor untersucht die akute Phase nach der Transplantation, so dass die Empfängerratte in diesem Modell 3 Stunden nach der Transplantation unter Beatmung und Anästhesie überlebt wird und dann Proben entnommen werden.
7. Sammlung von Versuchspräparaten (Plasma, Lungengewebe)
- Bei Kontrollproben werden die rechten Lappen des Spenders nach Beginn der 3-stündigen Reperfusionszeit entnommen.
- Schnappen Sie den oberen Lappen und den Postkavallappen für Protein- oder RNA-Expressionsanalysen, bewahren Sie den Mittellappen für die Histologie auf und verwenden Sie den unteren Lappen für das Nass-Trocken-Gewichtsverhältnis (Abbildung 9A).
- Bereiten Sie 10 Minuten vor Ablauf der 3-stündigen Reperfusionszeit die Entnahme der Empfängerproben vor, indem Sie Heparin (1.000 E/kg) mit einer Insulinspritze in die Halsvene injizieren.
HINWEIS: Diese Verabreichung von Heparin verhindert Blutgerinnsel in der Lunge und ermöglicht eine gründlichere Spülung zum Zeitpunkt der Beschaffung. - Plasma-Sammlung
- Am Ende der 3-stündigen Reperfusionszeit werden 1 ml Blut mit einer Spritze über den IVC entnommen.
- Auf Eis lagern und dann 10 Minuten lang bei 2.000 x g zentrifugieren, um Plasma zu gewinnen.
- Schläfern Sie die Empfängerratte ein, indem Sie den IVC durchschneiden, um eine Ausblutung zu ermöglichen.
- Präparieren Sie das Zwerchfell entlang des Brustbogens und legen Sie die Brusthöhle frei, indem Sie den Brustkorb herauspräparieren.
- Sammeln Sie BAL-Flüssigkeit aus der nativen oder transplantierten Lunge, falls gewünscht (optional).
HINWEIS: Wenn ein Nass-Trocken-Gewichtsverhältnis oder eine Histologie an der Lunge durchgeführt wird, sollte keine BAL-Flüssigkeitsentnahme durchgeführt werden, da dies die Ergebnisse beeinflussen kann.- Fädeln Sie 4-0 Seidennaht um die Luftröhre und binden Sie einen festen Doppelknoten um die Luftröhre und den Intubationsschlauch, um ein Austreten von Flüssigkeit zu verhindern.
- Berechnen Sie die Menge an eiskaltem PBS für die Sammlung von BAL-Flüssigkeit aus dem rechten Lappen und dem linken Lappen.
HINWEIS: Das Volumenverhältnis für die rechte Lunge beträgt 63 %, während das Volumenverhältnis für die linke Lunge 37 % beträgt16. Um die Menge an PBS zu bestimmen, die in jede Seite eingeträufelt werden soll, sollte das Volumen daher als das Doppelte des Tidalvolumens (Td = 7,2 ml/kg) multipliziert mit 63 % für die rechte Lunge und 37 % für die linke Lunge berechnet werden. - Setzen Sie eine Yasargil-Klemme auf den linken Lungenbereich (Abbildung 10A) und träufeln Sie mit einer Spritze, die an den Angiokatheter angeschlossen ist, die berechnete Menge eiskaltes PBS in die rechte Lunge (die nativen Lappen des Empfängers) und sammeln Sie die BAL-Flüssigkeit, indem Sie vorsichtig am Spritzenkolben nach oben ziehen. Zweimal ausführen.
HINWEIS: Man sollte mit einer Rückgewinnung von 70-80% der eingeträufelten Flüssigkeit rechnen. - Entfernen Sie die Yasargil-Klemme an der linken Lunge und platzieren Sie die Klemme im rechten Lungenhilabereich (Abbildung 10B).
- Sammeln Sie BAL-Flüssigkeit aus dem transplantierten linken Lappen auf die gleiche Weise, wie sie für den rechten Lappen gesammelt wurde, und entfernen Sie dann die Klemme im Bereich des rechten Lungenhilars.
- Schneiden Sie die rechte und linke Ohrmuschel mit einer Mikropräparier-Federschere und spülen Sie die Lunge durch Schwerkraft durch die PA mit einem 18-G-Angiokatheter, der an einem Schlauch befestigt ist, und einer Spritze mit 20 ml vorgekühlter Konservierungslösung, die bei 28cmH2O hängt.
- Entnahme von Proben aus der Lunge des Empfängers.
- Frieren Sie den oberen Lappen und den Postkavallappen für Protein- oder RNA-Expressionsanalysen ein, bewahren Sie den Mittellappen für die Histologie auf und verwenden Sie den unteren Lappen für das Verhältnis von Nass- zu Trockengewicht) (Abbildung 9A).
- Teilen Sie den linken transplantierten linken Lappen in drei Teile: den oberen Bereich, der für das Schockfrosten gesammelt wurde, den mittleren Bereich für die Histologie und den unteren Bereich für das Nass-Trocken-Gewichtsverhältnis (Abbildung 9B).
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Representative Results
Um das Lungenödem zu messen, wurde das Nass-Trocken-Gewichtsverhältnis berechnet. Der native Lappen des Spenders, der transplantierte Lappen und der native Lappen des Empfängers wurden wie im Protokoll beschrieben entnommen und sofort auf das Nassgewicht gewogen, 48 h lang bei 60 °C getrocknet und dann erneut für das Trockengewicht gewogen. Ein erhöhtes Nass-Trocken-Gewichtsverhältnis würde auf ein Lungenödem hindeuten. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass der transplantierte Lappen eine signifikante Zunahme des Nass-Trocken-Gewichtsverhältnisses im Vergleich zum nativen Lappen des Spenders oder Empfängers aufwies (p=0,0050, n=6/Gruppe; Abbildung 11).
| Angio-Katheter-Größe für Manschetten | |||
| Körpergewicht der Ratte (g) | PAPA | Br | PV |
| 180-200 | 20 G | 18 g | 16 G |
| 200-230 | 18 g | 16 G | 14 G |
| 230-250 | 18 g | 14 G | 14 G |
| 250-270 | 18 g | 14 G | 12 - 14 g |
| Über 270 | 16 G | 14 G | 12 G |
Tabelle 1. Größentabelle für Manschetten. Die Größe der Pulmonalarterie (PA), des Bronchus (Br) oder der Pulmonalvene (PV) hängt vom Körpergewicht ab. Abhängig vom Körpergewicht und der Art der Manschette, die Sie anfertigen, wird die empfohlene Angiokathetergröße angegeben.
Abbildung 1. Chirurgische Instrumente. (A) Feine Schere, (B) Pinzette, (C-E) mikrochirurgische Pinzette, (F) Dumont #5 feine Pinzette, (G) Vannas-Tübingen-Federschere und Castroviejo-Mikropräparierschere, (H) Halsted-Mücken-Hämostat, (J) Retraktor, (K) Yasargil-Klemmen, (L) Dieffenbach-Bulldoggenklemme, (M) gebogene Hämostate und (N) Yasargil-Klemmapplikator. Alle Werkzeuge sollten bei 121 °C für 30 min autoklaviert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. Manschettenpräparation mit verschiedenen Größen des Angiokatheters und der chirurgischen Klinge #11 mit Rippenrücken. Die Größe des Angiokatheters, der für die Manschette gewählt wird, wird durch die Manschettengrößentabelle (Tabelle 1) bestimmt, die das Körpergewicht der Ratte berücksichtigt und unabhängig davon, ob die Manschette für die Pulmonalarterie (PA), den Bronchus (Br) oder die Pulmonalvene (PV) bestimmt wird. Die Angiokatheter (A) 20 G, (B) 18 G, (C) 16 G, (D) 14 G oder (E) 12 G werden wie im Protokoll beschrieben mit einer (F) chirurgischen Klinge #11 mit Rippenrücken durchtrennt und bis zur Verwendung in Kochsalzlösung gelagert. (G) Die Länge des Manschettenkörpers beträgt 2 mm und eine Lasche von 1 mm x 1 mm (Breite x Höhe) befindet sich an der Oberseite des Manschettenkörpers für die Handhabung des Manschettenkörpers. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3. Warme Ischämie. Die Lunge wird mit der Konservierungslösung durch die Lungenarterie gespült, mit dem doppelten Atemzugvolumen aufgeblasen und dann mit einem Unterpolster umwickelt und auf dem Operationswärmerbrett gehalten, um die Ratte 1 Stunde lang auf normaler Körpertemperatur zu halten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4. Cuffing der Spenderlunge PV, PA und Br. (A) Pulmonalvene, PV (B) Pulmonalarterie, PA, oder (C) Bronchus, Br, wird durch eine richtig große Manschette eingeführt, umgebogen und mit 8-0 gesichert Nylonnaht und (D) dann auf steriler, mit eiskalter Kochsalzlösung befeuchteter Gaze auf einer sterilen Petrischale auf Eis gelagert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5. Messen und Sezieren am 4. Interkostalraum. (A) Die Empfängerratte wird in Rückenlage gelegt, und der Brustkorb wird von der suprasternalen Kerbe bis zum Processus xiphoideus gemessen und eine Linie gezogen. (B) In der Mitte dieser Linie wird eine weitere Linie auf der linken Seite mit halber Länge gezeichnet. (C) Entlang dieser Linie sollte der Mikrochirurg einen Bereich abtasten, in dem der Herzimpuls am stärksten ist, um die richtige Position des 4. Interkostalraums (roter Kreis) sicherzustellen. (D) Die Haut und der Muskel werden dann mit einer feinen Schere präpariert. (E) Der Retraktor wird dann verwendet, um den Raum weit zu öffnen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6. Anastomose. Die (A) PV (B) Br oder (C) PA des Spenders mit Manschetten wird in die PV, Br oder PA des Empfängers eingeführt und dann mit einer 7-0-Nylonnaht gesichert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7. Reperfusion. Nachdem die Anastomosen abgeschlossen sind, kann die Reperfusion durch Entfernen der Klemme gestartet werden, und die Empfängerratte wird 3 Stunden lang unter Beatmung und Narkose überlebt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8. Wundverschluss. (A) Drei 6-0-Nylonnähte mit einfachen Doppelknoten werden um die Rippen oberhalb der 4. Rippe und unterhalb der 5. Rippe gelegt. (B) Verwenden Sie Hämostate in beiden Händen, um die drei Nähte zusammenzufassen und den PEEP in den Beatmungseinstellungen auf 6cmH2Ozu erhöhen. (C) Binden Sie alle drei Knoten gleichzeitig zusammen, indem Sie sie nach oben und weg ziehen, um die Wunde zu schließen, verringern Sie den PEEP sofort auf 2cmH2O und schließen Sie die Haut mit einer 6-0-Nylonnaht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 9. Entnahme von Lungengewebe. (A) Für die nativen Lappen des Spenders oder Empfängers können der obere Lappen und der Postkavallappen für Protein- oder RNA-Expressionsanalysen eingefroren werden, der Mittellappen kann für die Histologie konserviert werden und der untere Lappen kann für das Verhältnis von Nass- zu Trockengewicht verwendet werden. (B) Sammeln Sie für den transplantierten Lappen den oberen Bereich für Snap Frozen, den mittleren Bereich für die Histologie oder den unteren Bereich für das Nass-Trocken-Gewichtsverhältnis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 10. Anwendung der Klemme zur selektiven Sammlung von BAL-Flüssigkeiten. Um eine Ansammlung von Proben zu vermeiden, kann BAL-Flüssigkeit entweder aus der rechten (nativen) oder linken (transplantierten) Lunge entnommen werden. (A) Der linke Hilarbereich der Lunge kann geklemmt werden, um BAL-Flüssigkeit aus dem rechten Lappen zu sammeln. (B) Der rechte Hilusbereich der Lunge kann geklemmt werden, um BAL-Flüssigkeit aus dem linken Lappen zu sammeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 11. Gewichtsverhältnis von Nass zu Trocken. Das Verhältnis von Nass- zu Trockengewicht wurde berechnet, um das Lungenödem zu messen, und kann verwendet werden, um anzuzeigen, wie gut die Transplantation verlaufen ist. Der native Lappen des Spenders, der transplantierte Lappen oder der native Lappen des Empfängers wurde wie im Protokoll beschrieben entnommen und sofort auf Nassgewicht gewogen, 48 h lang bei 60 °C getrocknet und dann erneut für das Trockengewicht gewogen. Es wurde ein Verhältnis von Nassgewicht zu Trockengewicht genommen. Das Verhältnis für den transplantierten Lappen war im Vergleich zu den nativen Lappen des Spenders oder Empfängers signifikant erhöht. n = 6 Ratten/Gruppe und die Balken stellen den Mittelwert ± SD dar. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung der ANOVA mit der Post-hoc-Analyse von Tukey durchgeführt. ** S<0.01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
In diesem Bericht haben wir an mehreren kritischen Schritten eines Rattenlungentransplantationsprotokolls interveniert, um das Verfahren zu optimieren. Obwohl über verschiedene Cuffing-Techniken für die Lungentransplantation von Ratten berichtet wurde 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15, kann der Prozess immer noch subjektiv und für Mikrochirurgen schwer anzuwenden sein. Wir haben betont, dass die richtige Größe der Manschetten für PV und PA verwendet werden sollte, um Blut oder Br zu liefern, um Luft in die transplantierte Lunge zu bringen, und wir haben eine objektivere Methode zur Bestimmung der optimalen Manschettengröße basierend auf dem Körpergewicht der Ratte bereitgestellt. Um eine gleichmäßigere Wärmeischämie der Lunge zu induzieren, haben wir Empfehlungen zum Aufblasen der Lunge, zum Abklemmen und zum Warmhalten der Ratte während der 1-stündigen warmen Ischämiezeit gegeben. Während des Eingriffs des Empfängers kann es schwierig sein, den 4. Interkostalraum zu lokalisieren. Wir haben empfohlen, dass man diese Position genauer lokalisieren kann, indem man eine Methode zur Messung und zum Abtasten des Herzimpulses anwendet. Zum Zeitpunkt der Reperfusion zeigten wir, um die Wunde besser zu schließen, auch eine Technik zur Handhabung von Nähten und zur Anpassung des PEEP, die die Wunde schneller schließen und ein Überpumpen und eine Verletzung der Lunge verhindern kann. Schließlich haben wir Strategien für die Gewebe- und BAL-Flüssigkeitsentnahme vorgestellt, die eine objektivere Entnahme von Proben ermöglichen, die über Experimente und unterschiedliche Körpergewichte hinweg verglichen werden können.
Die bedeutendste Einschränkung der beschriebenen Techniken ist die recht steile Lernkurve der Transplantation im Allgemeinen. Die Lernkurve kann durch konsequente chirurgische Praxis und durch die Überprüfung von Fehlerbehebungstechniken in der Literatur verkürzt werden. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass dieses Modell die akute Phase von IRI und Transplantation untersucht, in der zuerst biochemische Veränderungen auftreten, was der Schwerpunkt unseres Labors ist. Zukünftige Studien sollten die Bronchial- und Gefäßdurchgängigkeit über längere Zeiträume nach der Transplantation testen.
Insgesamt ist ein praktikables Kleintiertransplantationsmodell entscheidend für die Bewertung therapeutischer Interventionen bei Transplantation und Ischämie-Reperfusionsschäden (IRI). Insbesondere das Modell der Ratten-Lungentransplantation eignet sich als Ergänzung zur Untersuchung der Ex-vivo-Lungenperfusion (EVLP) bei Kleintieren17. Es ist auch eine praktikablere Alternative zur murinen Lungentransplantation, da die größere anatomische Größe es dem Forscher ermöglicht, genügend Gewebe für eingehendere Analysen zu erhalten18. Darüber hinaus ist das Modell essentiell für die Bestimmung der Lebensfähigkeit von Spender-Lungenallotransplantaten nach therapeutischer Intervention mit neuartigen niedermolekularen und Proteintherapeutika 19,20,21,22 entweder für den Spender, für das Spenderorgan durch EVLP17 oder für den Empfänger und bietet einen leistungsstarken Weg zur Erfassung von In-vivo-Daten. Die Optimierungen, die wir in diesem Bericht beschreiben, sind wichtig für Mikrochirurgen, die darauf abzielen, ihre Lernkurve zu verkürzen und einen Teil der Subjektivität zu beseitigen. Durch die Verwendung eines standardisierten Algorithmus für die Größe der Lungenmanschette kann der chirurgische Ansatz rationalisiert und objektiver gestaltet werden. Am Ende der Reperfusionsphase des Transplantats bietet der beschriebene strukturierte Ansatz zur Entnahme von BAL-Flüssigkeit und -Gewebe auch einen verantwortungsvollen Umgang mit Tieren und eine effiziente Nutzung der Zeit des Mikrochirurgen, indem die Wirkung der pro Experiment gesammelten Daten maximiert wird.
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Disclosures
BAW, YGL und JLK werden durch den Zuschuss R01HL143000 der National Institutes of Health (NIH) unterstützt. BAW wird durch den Zuschuss des US-Verteidigungsministeriums (Department of Defense, DOD) W81XWH1810787 unterstützt. SMB wird durch den NIH-Zuschuss R01DK123475 unterstützt. JM wird durch die NIH-Zuschüsse AR061385, AR070752, DK106394 und AG056919 sowie durch den DOD-Zuschuss W81XWH-18-1-0787 unterstützt.
Acknowledgments
Nichts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Gauge angio-catheter | BD | 382277 | |
| 14 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251717-02 | |
| 16 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252586-02 | |
| 18 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251679-02 | |
| 20 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252527-02 | |
| 4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| 6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
| 7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
| 8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
| Betadine Spray | Avrio Health L.P | UPC 367618160039 | |
| Clippers | VWR | MSPP-023326 | |
| Castroviejo micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5668 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Electrocautery | Macan | MV-7A | |
| Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Halsted-mosquito hemostat | Roboz Surgical Instrument Co | RS-7112 | |
| Heparin | Fresnius Medical Care | C504701 | |
| Insulin syringe | Life Technologies | B328446 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropyl Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| Ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
| Dieffenbach Bulldog Clamp | World Precision Instruments | WPI14117 | |
| Needle holder/Forceps, Curved | Micrins | MI1542 | |
| Needle holder/Forceps, Straight | Micrins | MI1540 | |
| Perfadex Plus (Organ Preservation Solution) | XVIVO Perfusion AB | REF# 19950 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | Used to check SpO2 and heartbeat |
| Retractor | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6560 | |
| Saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Syringe 5mL | BD | 309646 | |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT351T | Used to clamp bronchus |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT261T | Used to clamp hilum |
| Yasargil Clamp Applicator | Aesculap, Inc | FT484T |
References
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