Summary
Här presenterar vi optimeringar till en lungtransplantationsmodell för råttor som tjänar till att förbättra resultaten. Vi tillhandahåller en storleksguide för manschetter baserat på kroppsvikt, en mätstrategi för att fastställa det 4: e interkostala utrymmet och metoder för sårförslutning och BAL (bronkoalveolär sköljning) vätska och vävnadsuppsamling.
Abstract
Från vår erfarenhet av lungtransplantation på råtta har vi hittat flera förbättringsområden. Informationen i den befintliga litteraturen om metoder för att välja lämpliga manschettstorlekar för lungvenen (PV), lungartären (PA) eller bronken (Br) varierar, vilket gör bestämningen av korrekt manschettstorlek under lungtransplantation på råtta till en övning av försök och fel. Genom att standardisera manschetttekniken för att använda den minsta effektiva manschetten som är lämplig för kärlets eller bronkens storlek kan man göra transplantationsproceduren säkrare, snabbare och mer framgångsrik. Eftersom diametrar på PV, PA och Br är relaterade till råttans kroppsvikt presenterar vi en strategi för att välja en lämplig storlek med hjälp av en viktbaserad guide. Eftersom lungvolymen också är relaterad till kroppsvikt rekommenderar vi att detta förhållande också bör beaktas vid val av rätt luftvolym för donatorlunginflation under varm ischemi samt för att rätt volym PBS ska införas under bronkoalveolär sköljning (BAL) vätskeuppsamling. Vi beskriver också metoder för 4: e interkostal rymddissektion, sårförslutning och provinsamling från både de inhemska och transplanterade loberna.
Introduction
I över tre decennier har forskare modifierat och förbättrat råttlungtransplantationsmodeller så att de genererade uppgifterna är mer konsekventa och mer reflekterande av det faktiska kliniska tillståndet. Under vårt laboratoriums tid att utföra denna modell har vi bestämt fyra förbättringsområden: manschetttekniker för anastomoser, identifiering av mottagarens 4: e interkostala utrymme, lunginflation och sårförslutning under mottagarens procedur och skörd av prover för analys.
Manschettteknikmodifieringar för anastomoser kan förbättra hela transplantationsproceduren genom att förkorta hanteringstiden för donatorlungan 1,2,3,4,5,6 och göra anastomosproceduren snabbare och tekniskt enklare för mikrokirurgen. Även om det är viktigt att använda manschetter av rätt storlek för att leverera det nödvändiga blod- och luftflödet till den transplanterade lungan, finns det begränsad vägledning om hur man ska välja storleken på manschetter för lungvenen (PV), lungartären (PA) eller bronkus (Br) 5,7,8,9. Eftersom diametrarna för PV, PA och Br är relaterade till kroppsvikten hos donator- och mottagarråttorna, föreslår vi att manschettstorleken baseras på kroppsvikt. Denna rapport ger en storleksguide för manschetter baserat på en råttas kroppsvikt (180 g till över 270 g) som tjänar till att optimera blod- och lufttillförseln till den transplanterade lungan (tabell 1).
Medan en nyare mikrokirurg framgångsrikt och enkelt kan skaffa en donatorlunga under givarproceduren, är transplantation av lungan under mottagarens procedur mer komplicerad och beror på mikrokirurgens erfarenhet. Försök att hitta det 4: e interkostala utrymmet för att komma åt mottagarens vänstra lunga är ett av de svårare stegen som har viss subjektivitet och kan öka procedurtiden. Därför introducerar vi en enkel och objektiv metod för att hjälpa till att identifiera den 4: e interkostala rymdplatsen genom att använda bröstmätningar och hjärtklappning för att hitta rätt område bröstvägg för att dissekera 4,5,6,10,11,12.
Vi föreslår också en förbättring av donatorlunginflationen, som är en potentiell källa till skada på organet. Donatorlungan töms tills reperfusion startar. Vid suturering av det 4: e interkostala utrymmet blåses donatorlungan vanligen upp genom att öka PEEP från 2 cmH 2 O till6 cmH2O. För att minimera lungskador från överinflation föreslår vi en teknik där tre 6-0 nylonsuturer placeras runt den 4: e ribben sämre än den 5: e ribben med enkla dubbelknutar. När det är dags för sårstängning hålls ändarna på de tre suturerna med hemostater i båda händerna, såret stängs på en gång genom att dra upp på varje sida och PEEP reduceras omedelbart till 2cmH2O. På detta sätt får lungan expandera under kortast möjliga tid10.
I slutet av ett experiment vill forskaren ofta samla in många typer av prover för många typer av analyser från varje transplantation. Till exempel kan snapfryst vävnad, formalinfixerad vävnad, vävnad för våt-till-torrviktförhållande för att bestämma lungödem och bronkoalvelolär lavage (BAL) vätska alla användas för att bedöma hur bra transplantationen gick. Den traditionella metoden för att samla BAL-vätska möjliggör ett blandat poolat prov från både mottagarens inhemska lober och donatorns transplanterade lob13,14,15. För att övervinna detta presenterar vi en metod för att klämma fast hilarområdena som kan ge mer exakt inblick i de transplanterade och inhemska lungornas tillstånd. Dessutom är volymen av PBS som används för att samla BAL-vätska från varje sida av lungorna viktigt att överväga eftersom BAL-vätska innehåller många lösliga faktorer såsom cytokiner och kemokiner som mäts genom koncentration. Normalisering av volymen av vätskan som instilleras till den uppskattade volymen lungkapacitet kan hjälpa till med jämförelse. Med fyra lober på höger sida och en lob på vänster sida har var och en av råttans fem lober en annan volym och yta16. Enligt en tidigare studie om volymmätning av lunglober av Backer et al. är volymen av hela lungan 63% (4400 mm 3) och vänster lob 37% (2500 mm3). Därför rekommenderar vi att volymen PBS som används för att samla BAL-vätska ska beräknas som två gånger tidalvolymen (7,2 ml / kg) multiplicerat med 63% för höger lunga och 37% för vänster lunga. Genom att använda detta tillvägagångssätt kan man bättre kontrollera för variabler som kroppsvikt och timing10,16.
Sammantaget kommer vi i denna rapport att visa några modifieringar av den vanliga experimentella modellen för råttlungtransplantation som kan göra proceduren effektivare och öka förmågan att generera mer exakta och rikliga data från varje experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Manliga Sprague-Dawley-råttor (180-270 g kroppsvikt) köptes kommersiellt (t.ex. Envigo) och hölls under patogenfria förhållanden vid Ohio State University Animal Facility. Alla procedurer utfördes humant enligt NIH och National Research Council's Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals och med godkännande av Ohio State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC Protocol # 2012A00000135-R2).
1. Första installationen
- Ställ in kirurgiska enheter.
OBS: Detta är en icke-överlevnadsoperation. Om överlevnadskirurgi ska utföras måste sterila instrument och barriärförsiktighetsåtgärder vidtas.- Slå på puls-/syremättnadsövervakningsutrustningen och värmekortet till 42 °C.
- Slå på ventilations- och anestesimaskinen för att förvärma isofluranförångaren.
OBS: Använd en tidalvolym (Td) på 7,2 ml / kg, ett expiratoriskt tryck med positiv ände (PEEP) på 2 cmH2O och en andningsfrekvens på 80 slag per minut. - Fyll anestesisprutan med 10 ml flytande isofluran och montera sprutan på ventilations- och anestesimaskinen.
- Slå på det kirurgiska mikroskopet med höjd och fokus anpassat till mikrokirurgens preferenser.
- Slå på elektrocautery-enheten.
- Förbered och lägg ut kirurgiska verktyg (figur 1).
OBS: Alla kirurgiska verktyg autoklaverades vid 121 °C i 30 minuter. - Samla in och registrera kroppsvikt hos donator- och mottagarråttor.
- Använd tabell 1 och råttans kroppsvikt för att bestämma rätt mätare av angiokateter (20, 18, 16, 14 eller 12 G) som ska användas för att göra manschetter.
- Förbered manschetter för lungartär (PA), bronkus (Br) och lungven (PV) med hjälp av storleksguiden baserat på kroppsvikt (tabell 1 och figur 2).
- Placera angiokateter i storlek 20 G, 18 G, 16 G, 14 G eller 12 G (figur 2A-E) på en steril yta under det kirurgiska mikroskopet.
- Använd sedan ett kirurgiskt blad #11 (figur 2F) för att skära angiokatetern i 90 ° vinkel för att bilda en 2 mm lång manschettkropp med en flik på 1 mm X 1 mm (bredd x höjd) högst upp på manschettkroppen (figur 2G).
- Förvara manschetter i steril saltlösning tills de är klara att användas.
- Förbered lösningar.
- Bered en blandning av ketamin och xylazin i en steril injektionsflaska genom att tillsätta 1 ml xylazin (100 mg/ml) till 10 ml ketamin (100 mg/ml).
OBS: Utgångsdatumet för denna cocktail bestäms med hjälp av det tidigaste utgångsdatumet för de använda komponenterna. - Dra upp rätt dosering för råttorna i sprutor (0,1 ml ketamin/xylazinblandning per 100 g råttas kroppsvikt; t.ex. för en 200 g råtta skulle 0,2 ml ketamin/xylazinblandning levereras).
OBS: Denna dosering kommer att leverera 91 mg / kg ketamin och 9,1 mg / kg xylazin till råtta och bör hålla en råtta sederad i 60-80 min. - Bered heparin som kommer att levereras i en dos av 1,000 E/kg.
- Förvara saltlösning, PBS och konserveringslösning på is (materialtabell).
- Bered en blandning av ketamin och xylazin i en steril injektionsflaska genom att tillsätta 1 ml xylazin (100 mg/ml) till 10 ml ketamin (100 mg/ml).
2. Förberedelse av givarråtta
- Inducera anestesi hos donatorråttan genom att intraperitonealt injicera ketamin- och xylazinblandningen och vänta ~ 10 minuter på att ett kirurgiskt anestesiplan utvecklas som kan bedömas genom brist på svar på tå-nypa.
- Raka snittområdet med elektroniska klippare.
- Placera donatorråttan i ryggläge på det kirurgiska uppvärmningskortet och torka snittområdet med en steril gasväv blöt med betadin. Torka sedan av området med en 70% isopropylalkoholpinne. Upprepa 3 gånger.
- Gör ett 3 till 4 cm mittlinjesnitt i mitten av halsen med sax och dissekera försiktigt subkutana vävnader och muskler med pincett (istället för sax för att undvika blödning).
- För endotrakeal intubation, trä 4-0 silkesutur runt luftstrupen och sätt in en 16 G angiokateter i luftstrupen. Bind suturen runt luftstrupen tätt med en dubbelknut och avsluta sedan med en enda knut för att hålla angiokatetern på plats.
- Anslut angiokatetern till ventilatorn och behåll ett kirurgiskt anestesiplan hos råtta med 1-2% isofluran.
- Utför en laparo-sternotomi som ett kombinerat mittlinje och tvärgående snitt med sax.
- Injicera heparin (1 000 E/kg) med en insulinspruta via inferior vena cava (IVC) och tillåt 10 min för systemisk cirkulation.
OBS: Denna administrering av heparin förhindrar blodproppar i givarlungan. - Dissekera membranet försiktigt genom att skära längs bröstkorgsbågen och exponera sedan brösthålan genom att följa bröstbenet till nacken.
3. Donatorlungvarm ischemi och tillvaratagande
- Avliva donatorråttan genom att skära IVC.
- Medan lungorna fortfarande ventilerar, skär både höger och vänster auriklar med mikrodissekerande fjädersax och gravitationsspola lungorna med 20 ml konserveringslösning i en spruta som hänger vid 28cmH2Ogenom tyngdkraften ansluten till slangen och en 18 G angiokateter som införs direkt genom lungartären.
- Koppla bort ventilatorn från endotrakealtuben och anslut den till en 5 ml spruta fylld med rätt luftvolym baserat på kroppsvikt.
OBS: Volymen luft för att blåsa upp lungorna kan beräknas som med två gånger tidalvolymen (Td = 7,2 ml / kg), t.ex. en 200 g råtta skulle ha en Td på 1,44 ml och multiplicera den med 2 skulle motsvara 2,88 ml luft som behövs för att blåsa upp lungorna. - Blås upp givarens lungor.
- Sätt en Yasargil-klämma på luftstrupen för att hålla lungorna uppblåsta och täck lungorna och hjärtat med steril bomullsgas. Fuktar gasbindningen med saltlösning, linda donatorråttan med en underkudde och lämna på uppvärmningsoperationskortet i 1 timme för att inducera varm ischemi i lungorna (figur 3).
- Efter 1 h varm ischemi, skära hjärt-lungblocket med mikrodissekerande fjädersax och pincett och placera på steril gasväv fuktad med iskall PBS på en steril petriskål på is.
OBS: Alla följande steg bör inträffa medan lungorna är på petriskålen på is. - Skär försiktigt lungligament med mikrodissekerande vårsax för att separera vänster lunga från matstrupen och post-caval loben.
- Trimma försiktigt det vänstra lungområdet med Vannas-Tübingen fjädersax och skaffa vänster PV, PA och Br.
- Placera manschetter på PV, PA eller Br (figur 4A-C).
- Använd en mygghemostat för att ta tag i manschettfliken.
- Använd fina pincett för att ta tag i den distala änden av PV, PA eller Br genom lämplig manschettkropp, evert den extra vävnaden runt manschetten och säkra med 8-0 nylon sutur. Använd Vannäs-Tübingen fjädersax för att trimma extra vävnad och manschetten runt manschettkroppen.
- Håll donatorlungan täckt med gasväv fuktad med saltlösning på petriskålen på is tills den är redo att transplanteras i mottagarråttan (figur 4D).
OBS: Genomsnittlig kall ischemi tid är 84 min ± 11 min S.D.
4. Förberedelse av mottagarråtta
- Inducera anestesi hos mottagarråtta på samma sätt som donatorråttan genom att intraperitonealt injicera ketamin- och xylazinblandningen (0,1 ml per 100 g råtta) och vänta 10 minuter på att ett kirurgiskt anestesiplan ska utvecklas som kan bedömas genom brist på svar på tå-nypa.
- Raka snittområdet med elektroniska klippare.
- Placera donatorråttan i ryggläge och torka snittområdet med en steril gasväv blöt med betadin. Torka sedan av området med en 70% isopropylalkoholpinne. Upprepa 3 gånger.
- Innan råttan är fäst vid ventilationsmaskinen, rita linjer på råttans bröstkorg som förberedelse för att hitta det 4: e interkostala utrymmet.
- Mät bröstet från det suprasternala hacket till xiphoidprocessen och rita en linje (figur 5A).
- I mitten av denna linje ritar du en linje längs vänster sida av bröstet som mäter hälften av mätningen från suprasternalhacket till xiphoidprocessen (figur 5A och B).
- Intubera mottagaren med en 16 G angiokateter via visualisering med hjälp av den fiberoptiska kabeln ansluten till ett LED-ljus från endotrakeal intubationssatsen.
- Anslut angiokatetern till ventilatorn och behåll ett kirurgiskt anestesiplan med 1-2% isofluran.
- För att hitta det 4: e interkostala utrymmet, hitta området på bröstväggen där en stark palpabel hjärtimpuls kan kännas (Figur 5C, röd cirkel).
- På denna plats, skära huden med sax och muskeln med mikrodissekerande fjädersax och använd retraktorn för att öppna det 4: e interkostala utrymmet så brett som möjligt (figur 5D och E).
OBS: Använd elektrisk cautery för att undvika eller stoppa blödning under muskeldissektionen. - När det interkostala utrymmet har öppnats brett, dissekera försiktigt ligamenten runt mottagarens vänstra lunga med Vannas-Tübingen fjädersax och dra lungan ur bröstområdet med sterila bomullspinnar och pincett.
- Placera steril gasväv runt vänster lunga och håll den med en Dieffenbach bulldoggklämma.
- Applicera en Yasargil-klämma på vänster lunghilarområde så nära som möjligt.
5. Anastomoser
- Lungven (PV) anastomos
- Placera 7-0 nylonsutur runt mottagarens PV.
- Snitta mottagarens PV med Vannas-Tübingen fjädersax genom att tvärgående klippa de övre och nedre segmentvenerna så distalt som möjligt och spola ut blod med 0,2 ml hepariniserad saltlösning (1 U / ml) med en insulinspruta.
- Placera donatorlungan fortfarande insvept med iskall våt steril gasbindning i brösthålan.
- Sätt in givarens manschetterade PV i mottagarens PV och säkra sedan med den förplacerade 7-0 nylonsuturen (figur 6).
- Bronkial (Br) anastomos
- Placera 7-0 nylonsutur runt mottagarens Br.
- Snitta mottagarens Br genom att klippa de övre och nedre segmentluftvägarna tvärs så distalt som möjligt med Vannäs-Tübingen fjädersax.
- Sätt in givarens manschett Br i mottagarens Br och säkra med den förplacerade 7-0 nylonsuturen (figur 6).
- Lungartär (PA) anastomos:
- Placera 7-0 nylonsutur runt mottagarens PA.
- Skär mottagarens PA från dess adventitialhölje, skär hälften av kärlets omkrets med Vannas-Tübingen fjädersax och spola sedan ut blod i PA med 0,2 ml hepariniserad saltlösning (1 U / ml) med en insulinspruta.
- Sätt in donatorns manschett PA i mottagarens PA och säkra med den förplacerade 7-0 nylonsuturen (figur 6).
6. Reperfusion
- Ta bort Yasargil-klämman på hilum för att möjliggöra reperfusion och ventilation av den transplanterade donatorlungan (figur 7).
- Dissekera mottagarens ursprungliga vänstra lunga med hjälp av mikrodissekerande fjädersax och pincett.
- Flytta försiktigt den transplanterade vänstra lungan i mottagarens bröstkorg.
- Stäng thorakotomi snittet genom att använda 6-0 nylonsutur.
- Placera tre 6-0 nylonsuturer med enkla dubbla knutar runt revbenen som är högre än den 4: e revbenet och sämre än den 5: e revbenet (figur 8A).
- Använd hemostater för att samla de tre suturerna tillsammans (figur 8B).
- Öka PEEP till 6 cmH2O i ventilationsinställningarna.
- Knyt ihop alla tre knutarna samtidigt genom att dra bort för att stänga såret (figur 8C).
- Sänk PEEP till 2cmH2Oomedelbart.
- Stäng huden med 6-0 nylonsutur.
OBS: Vårt laboratorium studerar den akuta fasen efter transplantation, så mottagarråttan i denna modell överlevs i 3 timmar efter transplantation under ventilation och anestesi och sedan samlas prover in.
7. Insamling av experimentella prover (plasma, lungvävnad)
- För kontrollprover, samla donatorns högra lober efter att 3 timmars reperfusionsperiod har inletts.
- Snap-freeze den överlägsna loben och post-caval loben för protein- eller RNA-uttrycksanalyser, bevara mittloben för histologi och använd den nedre loben för våt-till-torr viktförhållande (figur 9A).
- Vid 10 min före slutet av 3h reperfusionstiden, förbered dig på att skörda mottagarproverna genom att injicera heparin (1,000 E/kg) med en insulinspruta i halsvenen.
OBS: Denna administrering av heparin förhindrar blodproppar i lungorna och möjliggör en mer grundlig spolning vid tidpunkten för upphandlingen. - Plasma samling
- Vid slutet av 3 h reperfusionsperioden, samla 1 ml blod med en spruta via IVC.
- Förvara på is och centrifugera sedan vid 2 000 x g i 10 minuter för att skörda plasma.
- Avliva mottagarråttan genom att skära IVC för att möjliggöra exsanguination.
- Dissekera membranet längs bröstkorgsbågen och exponera brösthålan genom att dissekera bröstkorgen.
- Samla BAL-vätska från de inhemska eller transplanterade lungorna om så önskas (valfritt).
OBS: Om våt-till-torr viktförhållande eller histologi utförs på lungan, bör BAL-vätskeuppsamling inte utföras eftersom det kan påverka resultaten.- Trä 4-0 silkesutur runt luftstrupen och knyt en tät dubbelknut runt luftstrupen och intubationsröret för att förhindra vätskeläckage.
- Beräkna mängden iskall PBS för BAL-vätskeuppsamling från höger lober och vänster lob.
OBS: Volymförhållandet för höger lunga är 63% medan volymförhållandet för vänster lunga är 37%16. För att bestämma mängden PBS som ska införas i varje sida bör volymen därför beräknas som två gånger tidalvolymen (Td = 7,2 ml / kg) multiplicerat med 63% för höger lunga och 37% för vänster lunga. - Placera en Yasargil-klämma på vänster lunghilarområde (figur 10A) och, med en spruta ansluten till angiokatetern, sätt in den beräknade mängden iskall PBS i höger lunga (mottagarens inhemska lober) och samla BAL-vätskan genom att dra försiktigt upp sprutkolven. Utför två gånger.
OBS: Man bör förvänta sig 70-80% återvinning av instillerad vätska. - Ta bort Yasargil-klämman på vänster lunga och placera klämman på höger lungområde (figur 10B).
- Samla BAL-vätska från transplanterad vänster lob på samma sätt som den samlades in för de högra loberna och ta sedan bort klämman på höger lunghilarområde.
- Skär höger och vänster auriklar med mikrodissekerande fjädersax och spola lungorna genom tyngdkraften genom PA med en 18 G angiokateter fäst vid slangen och en spruta med 20 ml förkyld konserveringslösning hängande vid 28 cmH2O.
- Samla prover från mottagarens lunga.
- Snap-freeze den överlägsna loben och post-caval loben för protein- eller RNA-uttrycksanalyser, bevara mittloben för histologi och använd den nedre loben för våt-till-torr viktförhållande) (figur 9A).
- Dela den vänstra transplanterade vänstra loben i tre delar: den övre regionen som samlats in för snap-fryst, den mellersta regionen för histologi och den nedre regionen för våt-till-torrvikt-förhållande (figur 9B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att mäta lungödem beräknades förhållandet mellan våt och torr vikt. Donatorns inhemska lob, den transplanterade loben och mottagarens inhemska lob samlades in enligt beskrivningen i protokollet och vägdes omedelbart för våtvikt, torkades vid 60 °C i 48 timmar och vägdes sedan igen för torrvikten. Ett ökat förhållande mellan våt och torr vikt skulle vara en indikation på lungödem. Våra resultat indikerar att den transplanterade loben hade en signifikant ökning av förhållandet mellan våt och torr vikt jämfört med donatorns eller mottagarens ursprungliga lob (p = 0,0050, n = 6 / grupp; Figur 11).
| Angiokateterstorlek för manschetter | |||
| Råtta kroppsvikt (g) | PA | Br | PV |
| 180-200 | 20 g | 18 g | 16 g |
| 200-230 | 18 g | 16 g | 14 g |
| 230-250 | 18 g | 14 g | 14 g |
| 250-270 | 18 g | 14 g | 12 - 14 g |
| Över 270 | 16 g | 14 g | 12 g |
Tabell 1. Storleksguide för manschetter. Storleken på lungartären (PA), bronkus (Br) eller lungvenen (PV) är relaterad till kroppsvikt. Beroende på kroppsvikt och vilken typ av manschett du gör, anges den rekommenderade angiokateterstorleken.
Figur 1. Kirurgiska verktyg. (A) Fina saxar, (B) pincett, (C-E) mikrokirurgiska pincett, (F) Dumont #5 fina pincett, (G) Vannas-Tübingen fjädersax och Castroviejo mikrodissekeringssax, (H) Halsted-mygghemostat, (J) upprullare, (K) Yasargil-klämmor, (L) Dieffenbach bulldoggklämma, (M) böjda hemostater och (N) Yasargil klämapplikator. Alla verktyg ska autoklaveras vid 121 °C i 30 minuter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Manschettberedning med olika storlekar av angiokateter och ribbrygg kirurgiskt blad #11. Storleken på angiokatetern som valts för manschetten bestäms av manschettens storleksguide (tabell 1) som tar hänsyn till råttans kroppsvikt och om manschetten är för lungartären (PA), bronkus (Br) eller lungvenen (PV). Angiokatetrarna (A) 20 G, (B) 18 G, (C) 16 G, (D) 14 G eller (E) 12 G skärs med ett (F) kirurgiskt ryggblad #11 enligt beskrivningen i protokollet och förvaras i saltlösning tills de behövs. (G) Manschettens kroppslängd är 2 mm och en flik på 1 mm X 1 mm (bredd x höjd) lämnas överst på manschettkroppen för hantering av manschettkroppen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. Varm ischemi. Lungorna spolas med konserveringslösningen genom lungartären, blåses upp med dubbelt så stor tidalvolym luft och lindas sedan med en underdyna och hålls på operationsuppvärmningskortet för att hålla råttan vid normal kroppstemperatur i 1 h. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. Manschett av donatorlung PV, PA och Br. (A) Lungvenen, PV (B) lungartär, PA, eller (C) bronkus, Br, sätts in genom en korrekt storlek manschett, everted, säkrad med 8-0 nylonsutur, och (D) lagras sedan på steril gasväv fuktad med iskall saltlösning på en steril petriskål på is. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5. Mätning och dissekering vid 4: e interkostala rymden. (A) Mottagarråttan läggs liggande och bröstet mäts från suprasternalhacket till xiphoidprocessen och en linje dras. (B) Vid mittpunkten av denna linje dras en annan linje till vänster sida vid halva längden. (C) Längs denna linje bör mikrokirurgen känna efter ett område där hjärtimpulsen är starkast för att säkerställa rätt placering av det 4: e interkostala utrymmet (röd cirkel). (D) Huden och muskeln dissekeras sedan med fin sax. (E) Upprullningsdonet används sedan för att öppna utrymmet på vid gavel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6. Anastomos. Donatorns manschett (A) PV (B) Br eller (C) PA sätts in i mottagarens PV, Br eller PA och säkras sedan med 7-0 nylonsutur. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7. Reperfusion. Efter att anastomoserna är färdiga kan reperfusion startas genom att ta bort klämman, och mottagarråttan överlever i 3 timmar under ventilation och anestesi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8. Sårförslutning. (A) Tre 6-0 nylonsuturer med enkla dubbla knutar placeras runt revbenen som är högre än den 4: e revbenet och sämre än den 5: e revbenet. (B) Använd hemostater i båda händerna för att samla ihop de tre suturerna och öka PEEP till 6cmH2Oi ventilationsinställningarna. (C) Knyt ihop alla tre knutarna samtidigt genom att dra upp och bort för att stänga såret, minska PEEP till 2 cmH2O omedelbart och stäng huden med 6-0 nylonsutur. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9. Lungvävnad samling. (A) För donatorns eller mottagarens inhemska lober kan den övre loben och post-caval loben snäppfrysas för protein- eller RNA-uttrycksanalyser, mellanloben kan bevaras för histologi och den nedre loben kan användas för våt-till-torr viktförhållande. (B) För den transplanterade loben, samla in det övre området för snäppfryst, mellersta regionen för histologi eller nedre regionen för våt-till-torrt viktförhållande. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 10. Applicering av klämman för selektiv BAL-vätskeuppsamling. För att undvika ett poolat prov kan BAL-vätska samlas in från antingen höger (infödd) eller vänster (transplanterad) lunga. (A) Det vänstra lungområdet kan klämmas fast för att samla BAL-vätska från de högra loberna. (B) Det högra lungområdet kan klämmas fast för att samla BAL-vätska från vänster lob. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 11. Våt-till-torrt viktförhållande. Våt-till-torrvikt-förhållandet beräknades för att mäta lungödem och kan användas för att indikera hur bra transplantationen gick. Donatorns inhemska lob, den transplanterade loben eller mottagarens inhemska lob samlades in enligt beskrivningen i protokollet och vägdes omedelbart för våtvikt, torkades vid 60 °C i 48 timmar och vägdes sedan igen för torrvikten. Ett förhållande mellan våtvikt och torrvikt togs. Förhållandet för den transplanterade loben ökade signifikant jämfört med donatorns eller mottagarens inhemska lober. n = 6 råttor / grupp och staplar representerar medelvärde ± SD. Statistisk analys utfördes med hjälp av ANOVA med Tukeys post-hoc-analys. ** s<0.01. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna rapport har vi ingripit i flera kritiska steg i ett lungtransplantationsprotokoll för råttor för att optimera proceduren. Medan olika manschetttekniker för lungtransplantation av råttor har rapporterats 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15, kan processen fortfarande vara subjektiv och svår för mikrokirurger att tillämpa. Vi har betonat att rätt storlek på manschetter för PV och PA för att ge blod eller Br för att ge luft till den transplanterade lungan bör användas, och vi har tillhandahållit ett mer objektivt sätt att bestämma optimal manschettstorlek baserat på råttans kroppsvikt. För att mer konsekvent framkalla varm ischemi i lungorna har vi gett rekommendationer om lunginflation, avspänning och hur man håller råttan varm under 1 h varm ischemitid. Under mottagarens procedur kan det vara svårt att hitta det 4: e interkostala utrymmet. Vi har rekommenderat att man mer exakt kan lokalisera denna position genom att använda en metod för mätning och känsla för hjärtimpuls. Vid tidpunkten för reperfusion, för att bättre stänga såret, visade vi också en teknik för att hantera suturer och justera PEEP som snabbare kan stänga såret och förhindra överinflation och skada på lungan. Slutligen har vi presenterat strategier för vävnads- och BAL-vätskeinsamling som möjliggör en mer objektiv skörd av prover som kan jämföras mellan experiment och olika kroppsvikter.
Den mest signifikanta begränsningen av de beskrivna teknikerna är den ganska branta inlärningskurvan för transplantationsoperationen i allmänhet. Inlärningskurvan är en som kan minskas med konsekvent kirurgisk praxis och från att granska felsökningstekniker i litteraturen. En annan begränsning är att denna modell studerar den akuta fasen av IRI och transplantation där biokemiska förändringar först sker, vilket är fokus för vårt laboratorium. Framtida studier bör testa bronkial och vaskulär patency vid längre tidslinjer efter transplantation.
Sammantaget är en livskraftig smådjurstransplantationsmodell avgörande för att utvärdera terapeutiska ingrepp för transplantation och ischemi-reperfusionsskada (IRI). I synnerhet lungtransplantationsmodellen på råtta är användbar som ett komplement till studier av lungperfusion (EVLP) hos små djur ex vivo (EVLP)17. Det är också ett mer livskraftigt alternativ till murin lungtransplantation, eftersom den större anatomiska storleken gör det möjligt för forskaren att få tillräcklig vävnad för mer djupgående analyser18. Dessutom är modellen avgörande för att bestämma livskraften hos donatorlungtransplantat efter terapeutisk intervention med nya småmolekyl- och proteinterapier 19,20,21,22 antingen till donatorn, till donatororganet genom EVLP 17 eller till mottagaren och ger en kraftfull väg att samla in in vivo-data. Optimeringarna som vi beskriver i denna rapport är viktiga för mikrokirurger som syftar till att minska sin inlärningskurva och ta bort viss subjektivitet. Genom att använda en standardiserad algoritm för lungmanschettstorlek kan det kirurgiska tillvägagångssättet effektiviseras och vara mer objektivt. Vid slutet av transplantationsreperfusionsperioden ger det beskrivna strukturerade tillvägagångssättet för BAL-vätska och vävnadsinsamling också ansvarsfull användning av djur och effektiv användning av mikrokirurgens tid genom att maximera effekten av data som samlats in per experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
BAW, YGL och JLK stöds genom National Institutes of Health (NIH) bidrag R01HL143000. BAW stöds genom Department of Defense (DOD) grant W81XWH1810787. SMB stöds via NIH-bidrag R01DK123475. JM stöds genom NIH-anslagen AR061385, AR070752, DK106394 och AG056919 samt genom DOD-anslaget W81XWH-18-1-0787.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Gauge angio-catheter | BD | 382277 | |
| 14 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251717-02 | |
| 16 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252586-02 | |
| 18 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251679-02 | |
| 20 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252527-02 | |
| 4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| 6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
| 7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
| 8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
| Betadine Spray | Avrio Health L.P | UPC 367618160039 | |
| Clippers | VWR | MSPP-023326 | |
| Castroviejo micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5668 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Electrocautery | Macan | MV-7A | |
| Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Halsted-mosquito hemostat | Roboz Surgical Instrument Co | RS-7112 | |
| Heparin | Fresnius Medical Care | C504701 | |
| Insulin syringe | Life Technologies | B328446 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropyl Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| Ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
| Dieffenbach Bulldog Clamp | World Precision Instruments | WPI14117 | |
| Needle holder/Forceps, Curved | Micrins | MI1542 | |
| Needle holder/Forceps, Straight | Micrins | MI1540 | |
| Perfadex Plus (Organ Preservation Solution) | XVIVO Perfusion AB | REF# 19950 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | Used to check SpO2 and heartbeat |
| Retractor | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6560 | |
| Saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Syringe 5mL | BD | 309646 | |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT351T | Used to clamp bronchus |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT261T | Used to clamp hilum |
| Yasargil Clamp Applicator | Aesculap, Inc | FT484T |
References
- Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 97 (4), 578-581 (1989).
- Zhai, W., et al. Simplified rat lung transplantation by using a modified cuff technique. Journal of Investigative Surgery. 21 (1), 33-37 (2008).
- Goto, T., et al. Simplified rat lung transplantation using a new cuff technique. Annals of Thoracic Surgery. 93 (6), 2078-2080 (2012).
- Guo, H., et al. Improvements of surgical techniques in a rat model of an orthotopic single lung transplant. European Journal of Medical Research. 18, 1 (2013).
- Tian, D., Shiiya, H., Sato, M., Nakajima, J. Rat lung transplantation model: modifications of the cuff technique. Annals of Translational Medicine. 8 (6), 407 (2020).
- Rajab, T. K. Anastomotic techniques for rat lung transplantation. World Journal of Transplantation. 8 (2), 38-43 (2018).
- Reis, A., Giaid, A., Serrick, C., Shennib, H. Improved outcome of rat lung transplantation with modification of the nonsuture external cuff technique. Journal of Heart and Lung Transplantation. 14 (2), 274-279 (1995).
- Sugimoto, R., et al. Experimental orthotopic lung transplantation model in rats with cold storage. Surgery Today. 39 (7), 641-645 (2009).
- Santana Rodriguez, N., et al. Technical modifications of the orthotopic lung transplantation model in rats with brain-dead donors. Archivos de Bronconeumología. 47 (10), 488-494 (2011).
- Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade. Journal of Surgical Research. 194 (2), 659-666 (2015).
- Rajab, T. K. Techniques for lung transplantation in the rat. Experimental Lung Research. 45 (9-10), 267-274 (2019).
- Iskender, I., et al. Effects of Warm Versus Cold Ischemic Donor Lung Preservation on the Underlying Mechanisms of Injuries During Ischemia and Reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
- Lin, X., et al. Five-year update on the mouse model of orthotopic lung transplantation: Scientific uses, tricks of the trade, and tips for success. Journal of Thoracic Disease. 4 (3), 247-258 (2012).
- Song, J. A., et al. Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats. Toxicological Research. 26 (3), 203-208 (2010).
- Chang, J. E., Kim, H. J., Yi, E., Jheon, S., Kim, K. Reduction of ischemia-reperfusion injury in a rat lung transplantation model by low-concentration GV1001. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (5), 972-979 (2016).
- De Backer, J. W., et al. Study of the variability in upper and lower airway morphology in Sprague-Dawley rats using modern micro-CT scan-based segmentation techniques. Anatomical Record. 292 (5), Hoboken. 720-727 (2009).
- Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), e52309 (2015).
- Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. Journal of Visualized Experiments. (65), e3947 (2012).
- Jia, Y., et al. Treatment of acute lung injury by targeting MG53-mediated cell membrane repair. Nature Communications. 5, 4387 (2014).
- Kim, J. L., et al. Pegylated-Catalase Is Protective in Lung Ischemic Injury and Oxidative Stress. Annals of Thoracic Surgery. , (2020).
- Beal, E. W., et al. D-Ala(2), D-Leu(5)] Enkephalin Improves Liver Preservation During Normothermic Ex Vivo Perfusion. Journal of Surgical Research. 241 (2), 323-335 (2019).
- Akateh, C., et al. Intrahepatic Delivery of Pegylated Catalase Is Protective in a Rat Ischemia/Reperfusion Injury Model. Journal of Surgical Research. 238, 152-163 (2019).
