Summary

En råttlungtransplantationsmodell av varm ischemi / reperfusionsskada: optimeringar för att förbättra resultaten

Published: October 28, 2021
doi:

Summary

Här presenterar vi optimeringar till en lungtransplantationsmodell för råttor som tjänar till att förbättra resultaten. Vi tillhandahåller en storleksguide för manschetter baserat på kroppsvikt, en mätstrategi för att fastställa det 4: e interkostala utrymmet och metoder för sårförslutning och BAL (bronkoalveolär sköljning) vätska och vävnadsuppsamling.

Abstract

Från vår erfarenhet av lungtransplantation på råtta har vi hittat flera förbättringsområden. Informationen i den befintliga litteraturen om metoder för att välja lämpliga manschettstorlekar för lungvenen (PV), lungartären (PA) eller bronken (Br) varierar, vilket gör bestämningen av korrekt manschettstorlek under lungtransplantation på råtta till en övning av försök och fel. Genom att standardisera manschetttekniken för att använda den minsta effektiva manschetten som är lämplig för kärlets eller bronkens storlek kan man göra transplantationsproceduren säkrare, snabbare och mer framgångsrik. Eftersom diametrar på PV, PA och Br är relaterade till råttans kroppsvikt presenterar vi en strategi för att välja en lämplig storlek med hjälp av en viktbaserad guide. Eftersom lungvolymen också är relaterad till kroppsvikt rekommenderar vi att detta förhållande också bör beaktas vid val av rätt luftvolym för donatorlunginflation under varm ischemi samt för att rätt volym PBS ska införas under bronkoalveolär sköljning (BAL) vätskeuppsamling. Vi beskriver också metoder för 4: e interkostal rymddissektion, sårförslutning och provinsamling från både de inhemska och transplanterade loberna.

Introduction

I över tre decennier har forskare modifierat och förbättrat råttlungtransplantationsmodeller så att de genererade uppgifterna är mer konsekventa och mer reflekterande av det faktiska kliniska tillståndet. Under vårt laboratoriums tid att utföra denna modell har vi bestämt fyra förbättringsområden: manschetttekniker för anastomoser, identifiering av mottagarens 4: e interkostala utrymme, lunginflation och sårförslutning under mottagarens procedur och skörd av prover för analys.

Manschettteknikmodifieringar för anastomoser kan förbättra hela transplantationsproceduren genom att förkorta hanteringstiden för donatorlungan 1,2,3,4,5,6 och göra anastomosproceduren snabbare och tekniskt enklare för mikrokirurgen. Även om det är viktigt att använda manschetter av rätt storlek för att leverera det nödvändiga blod- och luftflödet till den transplanterade lungan, finns det begränsad vägledning om hur man ska välja storleken på manschetter för lungvenen (PV), lungartären (PA) eller bronkus (Br) 5,7,8,9. Eftersom diametrarna för PV, PA och Br är relaterade till kroppsvikten hos donator- och mottagarråttorna, föreslår vi att manschettstorleken baseras på kroppsvikt. Denna rapport ger en storleksguide för manschetter baserat på en råttas kroppsvikt (180 g till över 270 g) som tjänar till att optimera blod- och lufttillförseln till den transplanterade lungan (tabell 1).

Medan en nyare mikrokirurg framgångsrikt och enkelt kan skaffa en donatorlunga under givarproceduren, är transplantation av lungan under mottagarens procedur mer komplicerad och beror på mikrokirurgens erfarenhet. Försök att hitta det 4: e interkostala utrymmet för att komma åt mottagarens vänstra lunga är ett av de svårare stegen som har viss subjektivitet och kan öka procedurtiden. Därför introducerar vi en enkel och objektiv metod för att hjälpa till att identifiera den 4: e interkostala rymdplatsen genom att använda bröstmätningar och hjärtklappning för att hitta rätt område bröstvägg för att dissekera 4,5,6,10,11,12.

Vi föreslår också en förbättring av donatorlunginflationen, som är en potentiell källa till skada på organet. Donatorlungan töms tills reperfusion startar. Vid suturering av det 4: e interkostala utrymmet blåses donatorlungan vanligen upp genom att öka PEEP från 2 cmH 2 O till6 cmH2O. För att minimera lungskador från överinflation föreslår vi en teknik där tre 6-0 nylonsuturer placeras runt den 4: e ribben sämre än den 5: e ribben med enkla dubbelknutar. När det är dags för sårstängning hålls ändarna på de tre suturerna med hemostater i båda händerna, såret stängs på en gång genom att dra upp på varje sida och PEEP reduceras omedelbart till 2cmH2O. På detta sätt får lungan expandera under kortast möjliga tid10.

I slutet av ett experiment vill forskaren ofta samla in många typer av prover för många typer av analyser från varje transplantation. Till exempel kan snapfryst vävnad, formalinfixerad vävnad, vävnad för våt-till-torrviktförhållande för att bestämma lungödem och bronkoalvelolär lavage (BAL) vätska alla användas för att bedöma hur bra transplantationen gick. Den traditionella metoden för att samla BAL-vätska möjliggör ett blandat poolat prov från både mottagarens inhemska lober och donatorns transplanterade lob13,14,15. För att övervinna detta presenterar vi en metod för att klämma fast hilarområdena som kan ge mer exakt inblick i de transplanterade och inhemska lungornas tillstånd. Dessutom är volymen av PBS som används för att samla BAL-vätska från varje sida av lungorna viktigt att överväga eftersom BAL-vätska innehåller många lösliga faktorer såsom cytokiner och kemokiner som mäts genom koncentration. Normalisering av volymen av vätskan som instilleras till den uppskattade volymen lungkapacitet kan hjälpa till med jämförelse. Med fyra lober på höger sida och en lob på vänster sida har var och en av råttans fem lober en annan volym och yta16. Enligt en tidigare studie om volymmätning av lunglober av Backer et al. är volymen av hela lungan 63% (4400 mm 3) och vänster lob 37% (2500 mm3). Därför rekommenderar vi att volymen PBS som används för att samla BAL-vätska ska beräknas som två gånger tidalvolymen (7,2 ml / kg) multiplicerat med 63% för höger lunga och 37% för vänster lunga. Genom att använda detta tillvägagångssätt kan man bättre kontrollera för variabler som kroppsvikt och timing10,16.

Sammantaget kommer vi i denna rapport att visa några modifieringar av den vanliga experimentella modellen för råttlungtransplantation som kan göra proceduren effektivare och öka förmågan att generera mer exakta och rikliga data från varje experiment.

Protocol

Manliga Sprague-Dawley-råttor (180-270 g kroppsvikt) köptes kommersiellt (t.ex. Envigo) och hölls under patogenfria förhållanden vid Ohio State University Animal Facility. Alla procedurer utfördes humant enligt NIH och National Research Council’s Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals och med godkännande av Ohio State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC Protocol # 2012A00000135-R2). 1. Första installationen Ställ in kirurgiska enhet…

Representative Results

För att mäta lungödem beräknades förhållandet mellan våt och torr vikt. Donatorns inhemska lob, den transplanterade loben och mottagarens inhemska lob samlades in enligt beskrivningen i protokollet och vägdes omedelbart för våtvikt, torkades vid 60 °C i 48 timmar och vägdes sedan igen för torrvikten. Ett ökat förhållande mellan våt och torr vikt skulle vara en indikation på lungödem. Våra resultat indikerar att den transplanterade loben hade en signifikant ökning av förh…

Discussion

I denna rapport har vi ingripit i flera kritiska steg i ett lungtransplantationsprotokoll för råttor för att optimera proceduren. Medan olika manschetttekniker för lungtransplantation av råttor har rapporterats 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ingen.

Materials

12 Gauge angio-catheter BD 382277
14 Gauge angio-catheter B. Braun 4251717-02
16 Gauge angio-catheter B. Braun 4252586-02
18 Gauge angio-catheter B. Braun 4251679-02
20 Gauge angio-catheter B. Braun 4252527-02
4-0 silk suture Surgical Specialties Corp. SP116
6-0 nylon suture AD Surgical S-N618R13
7-0 nylon suture AD Surgical S-N718SP13
8-0 nylon suture AD Surgical XXS-N807T6
Betadine Spray Avrio Health L.P UPC 367618160039
Clippers VWR MSPP-023326
Castroviejo micro dissecting spring scissors Roboz Surgical Instrument Co RS-5668
Dumont #5 – Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Electrocautery Macan MV-7A
Endotracheal intubation kit Kent Scientific ETI-MSE
Forceps Fine Science Tools 11027-12
Halsted-mosquito hemostat Roboz Surgical Instrument Co RS-7112
Heparin Fresnius Medical Care C504701
Insulin syringe Life Technologies B328446
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 66794-017-25
Isopropyl Alcohol Swabs BD 326895
Ketamine Hikma Pharmaceuticals PLC NDC 0413-9505-10
Dieffenbach Bulldog Clamp World Precision Instruments WPI14117
Needle holder/Forceps, Curved Micrins MI1542
Needle holder/Forceps, Straight Micrins MI1540
Perfadex Plus (Organ Preservation Solution) XVIVO Perfusion AB REF# 19950
PhysioSuite Kent Scientific PS-MSTAT-RT Used to check SpO2 and heartbeat
Retractor Roboz Surgical Instrument Co RS-6560
Saline PP Pharmaceuticals LLC NDC 63323-186-10
Scissors Fine Science Tools 14090-11
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System Kent Scientific SS-MVG-Module
Sterile  Cotton Gauze Pad Fisherbrand 22-415-469
Surgical Microscope Leica M500-N w/ OHS
Syringe 5mL BD 309646
Vannas-Tubingen Spring Scissors Fine Science Tools 15008-08
Xylazine Korn Pharmaceuticals Corp NDC 59399-110-20
Yasargil Clamp Aesculap, Inc FT351T Used to clamp bronchus
Yasargil Clamp Aesculap, Inc FT261T Used to clamp hilum
Yasargil Clamp Applicator Aesculap, Inc FT484T

References

  1. Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 97 (4), 578-581 (1989).
  2. Zhai, W., et al. Simplified rat lung transplantation by using a modified cuff technique. Journal of Investigative Surgery. 21 (1), 33-37 (2008).
  3. Goto, T., et al. Simplified rat lung transplantation using a new cuff technique. Annals of Thoracic Surgery. 93 (6), 2078-2080 (2012).
  4. Guo, H., et al. Improvements of surgical techniques in a rat model of an orthotopic single lung transplant. European Journal of Medical Research. 18, 1 (2013).
  5. Tian, D., Shiiya, H., Sato, M., Nakajima, J. Rat lung transplantation model: modifications of the cuff technique. Annals of Translational Medicine. 8 (6), 407 (2020).
  6. Rajab, T. K. Anastomotic techniques for rat lung transplantation. World Journal of Transplantation. 8 (2), 38-43 (2018).
  7. Reis, A., Giaid, A., Serrick, C., Shennib, H. Improved outcome of rat lung transplantation with modification of the nonsuture external cuff technique. Journal of Heart and Lung Transplantation. 14 (2), 274-279 (1995).
  8. Sugimoto, R., et al. Experimental orthotopic lung transplantation model in rats with cold storage. Surgery Today. 39 (7), 641-645 (2009).
  9. Santana Rodriguez, N., et al. Technical modifications of the orthotopic lung transplantation model in rats with brain-dead donors. Archivos de Bronconeumología. 47 (10), 488-494 (2011).
  10. Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade. Journal of Surgical Research. 194 (2), 659-666 (2015).
  11. Rajab, T. K. Techniques for lung transplantation in the rat. Experimental Lung Research. 45 (9-10), 267-274 (2019).
  12. Iskender, I., et al. Effects of Warm Versus Cold Ischemic Donor Lung Preservation on the Underlying Mechanisms of Injuries During Ischemia and Reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
  13. Lin, X., et al. Five-year update on the mouse model of orthotopic lung transplantation: Scientific uses, tricks of the trade, and tips for success. Journal of Thoracic Disease. 4 (3), 247-258 (2012).
  14. Song, J. A., et al. Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats. Toxicological Research. 26 (3), 203-208 (2010).
  15. Chang, J. E., Kim, H. J., Yi, E., Jheon, S., Kim, K. Reduction of ischemia-reperfusion injury in a rat lung transplantation model by low-concentration GV1001. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (5), 972-979 (2016).
  16. De Backer, J. W., et al. Study of the variability in upper and lower airway morphology in Sprague-Dawley rats using modern micro-CT scan-based segmentation techniques. Anatomical Record. 292 (5), 720-727 (2009).
  17. Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), e52309 (2015).
  18. Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. Journal of Visualized Experiments. (65), e3947 (2012).
  19. Jia, Y., et al. Treatment of acute lung injury by targeting MG53-mediated cell membrane repair. Nature Communications. 5, 4387 (2014).
  20. Kim, J. L., et al. Pegylated-Catalase Is Protective in Lung Ischemic Injury and Oxidative Stress. Annals of Thoracic Surgery. , (2020).
  21. Beal, E. W., et al. D-Ala(2), D-Leu(5)] Enkephalin Improves Liver Preservation During Normothermic Ex Vivo Perfusion. Journal of Surgical Research. 241 (2), 323-335 (2019).
  22. Akateh, C., et al. Intrahepatic Delivery of Pegylated Catalase Is Protective in a Rat Ischemia/Reperfusion Injury Model. Journal of Surgical Research. 238, 152-163 (2019).

Play Video

Cite This Article
Lee, Y. G., Kim, J., Palmer, A. F., Reader, B. F., Ma, J., Black, S. M., Whitson, B. A. A Rat Lung Transplantation Model of Warm Ischemia/Reperfusion Injury: Optimizations to Improve Outcomes. J. Vis. Exp. (176), e62445, doi:10.3791/62445 (2021).

View Video