Summary
Здесь мы представляем оптимизацию модели трансплантации легких крысы, которая служит для улучшения результатов. Мы предоставляем руководство по размеру манжет на основе массы тела, стратегию измерения для определения4-го межреберья, а также методы закрытия раны и сбора жидкости и тканей BAL (бронхоальвеолярный лаваж).
Abstract
Исходя из нашего опыта трансплантации легких крыс, мы нашли несколько областей для улучшения. Информация в существующей литературе о методах выбора подходящих размеров манжеты для легочной вены (PV), легочной артерии (PA) или бронха (Br) разнообразна, что делает определение правильного размера манжеты во время трансплантации легких крысы методом проб и ошибок. Стандартизировав технику манжеты, чтобы использовать наименьшую эффективную манжету, соответствующую размеру сосуда или бронха, можно сделать процедуру трансплантации более безопасной, быстрой и успешной. Поскольку диаметры PV, PA и Br связаны с массой тела крысы, мы представляем стратегию выбора подходящего размера с использованием руководства на основе веса. Поскольку объем легких также связан с массой тела, мы рекомендуем учитывать эту взаимосвязь при выборе правильного объема воздуха для надувания донорских легких во время теплой ишемии, а также для правильного объема PBS, который будет закапываться во время сбора жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ). Описаны методы рассечения4-го межреберья, закрытия раны и забора образцов как из нативных, так и из трансплантированных долей.
Introduction
На протяжении более трех десятилетий исследователи модифицировали и улучшали модели трансплантации легких крыс, чтобы полученные данные были более последовательными и более отражали фактическое клиническое состояние. За время работы нашей лаборатории с этой моделью мы определили четыре области улучшения: методы манжеты для анастомозов, идентификация4-го межреберья реципиента, раздувание легких и закрытие раны во время процедуры реципиента, а также сбор образцов для анализа.
Модификации техники манжеты для анастомозов могут улучшить всю процедуру трансплантации, сократив время обработки донорского легкого 1,2,3,4,5,6 и сделав процедуру анастомоза более быстрой и технически простой для микрохирурга. Несмотря на то, что крайне важно использовать манжеты правильного размера для подачи необходимой крови и воздушного потока в трансплантированное легкое, существует ограниченное руководство относительно того, как следует выбирать размер манжет для легочной вены (PV), легочной артерии (PA) или бронха (Br)5,7,8,9. Поскольку диаметры PV, PA и Br связаны с массой тела крыс-доноров и реципиентов, мы предлагаем, чтобы размер манжеты основывался на массе тела. В этом отчете представлено руководство по размеру манжет, основанное на массе тела крысы (от 180 г до более 270 г), которое служит для оптимизации кровоснабжения и подачи воздуха в трансплантированное легкое (таблица 1).
В то время как новый микрохирург может успешно и легко получить донорское легкое во время донорской процедуры, трансплантация легкого во время процедуры реципиента является более сложной и зависит от опыта микрохирурга. Попытки найти4-е межреберье для доступа к левому легкому реципиента являются одним из наиболее сложных шагов, который имеет некоторую субъективность и может увеличить время процедуры. Поэтому мы представляем простой и объективный метод, помогающий определить местоположение4-го межреберья с помощью измерений грудной клетки и сердцебиения, чтобы найти правильную область грудной стенки для рассечения 4,5,6,10,11,12.
Мы также предлагаем улучшить инфляцию донорских легких, которая является потенциальным источником повреждения органа. Донорское легкое сдувается до тех пор, пока не начнется реперфузия. При ушивании4-го межреберья донорское легкое обычно раздувают за счет увеличения PEEP с 2 см H 2 O до6 см H2O. Чтобы свести к минимуму повреждение легких из-за чрезмерного надувания, мы предлагаем технику, при которой три нейлоновых шва 6-0 накладываются вокруг4-го ребра, уступающего5-му ребру, с помощью простых двойных узлов. Когда приходит время закрытия раны, концы трех швов удерживаются гемостатами в обеих руках, рана закрывается сразу, подтягиваясь с каждой стороны, и PEEP немедленно уменьшается до 2 см H2O. Таким образом, легкое может расширяться в течение максимально короткого времени10.
В конце эксперимента исследователь часто хочет собрать много типов образцов для многих типов анализа из каждой трансплантации. Например, замороженная ткань, фиксированная ткань формалина, ткань для соотношения веса влажного и сухого для определения отека легких и жидкость бронхоальвелололярного лаважа (BAL) могут быть использованы для оценки того, насколько хорошо прошла трансплантация. Традиционный метод сбора жидкости BAL позволяет получить смешанный объединенный образец как из родных долей реципиента, так и из трансплантированной доли донора13,14,15. Чтобы преодолеть это, мы представляем метод зажима прикорневых областей, который может дать более точное представление о состоянии трансплантированных и родных легких. Кроме того, важно учитывать объем PBS, используемый для сбора жидкости BAL с каждой стороны легких, поскольку жидкость BAL содержит множество растворимых факторов, таких как цитокины и хемокины, которые измеряются концентрацией. Нормализация объема закапываемой жидкости до предполагаемого объема емкости легких может помочь в сравнении. С четырьмя лепестками с правой стороны и одной долей с левой стороны, каждая из пяти долей крысы имеет разный объем и площадь поверхности16. Согласно предыдущему исследованию по измерению объема долей легких, проведенному Backer et al., из общего объема всего легкого объем правых долей составляет 63% (4400мм3), а левая доля - 37% (2500 мм3). Поэтому мы рекомендуем, чтобы объем PBS, используемый для сбора жидкости BAL, рассчитывался как удвоенный дыхательный объем (7,2 мл / кг), умноженный на 63% для правого легкого и 37% для левого легкого. Используя этот подход, можно лучше контролировать такие переменные, как масса тела и время10,16.
В целом, в этом отчете мы продемонстрируем несколько модификаций стандартной экспериментальной модели трансплантации легких крысы, которые могут сделать процедуру более эффективной и увеличить возможности получения более точных и обильных данных из каждого эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Самцы крыс Sprague-Dawley (масса тела 180-270 г) были приобретены на коммерческой основе (например, Envigo) и содержались в условиях, свободных от патогенов, в Центре для животных Университета штата Огайо. Все процедуры были гуманно выполнены в соответствии с Руководством NIH и Национального исследовательского совета по гуманному уходу и использованию лабораторных животных и с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию Университета штата Огайо (протокол IACUC # 2012A00000135-R2).
1. Первоначальная настройка
- Настройте хирургические устройства.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это операция, не связанная с выживанием. Если необходимо провести операцию по выживанию, необходимо будет принять стерильные инструменты и барьерные меры предосторожности.- Включите оборудование для контроля частоты сердечных сокращений/насыщения кислородом и доску подогрева до 42 °C.
- Включите аппарат вентиляции и анестезии, чтобы предварительно нагреть испаритель изофлурана.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте дыхательный объем (Td) 7,2 мл / кг, положительное давление выдоха в конце (PEEP) 2 см H2O и частоту дыхания 80 ударов в минуту. - Наполните анестезиологический шприц 10 мл жидкого изофлурана и установите шприц на аппарат вентиляции легких и анестезии.
- Включите хирургический микроскоп с высотой и фокусом, отрегулированными в соответствии с предпочтениями микрохирурга.
- Включите электрокоагулянт.
- Подготовьте и разложите хирургические инструменты (рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты были автоклавированы при 121 ° C в течение 30 минут. - Собирайте и записывайте массу тела крыс-доноров и крыс-реципиентов.
- Используйте таблицу 1 и массу тела крысы, чтобы определить правильный калибр ангиокатетера (20, 18, 16, 14 или 12 G) для изготовления манжет.
- Подготовьте манжеты для легочной артерии (PA), бронха (Br) и легочной вены (PV), используя руководство по размеру в зависимости от массы тела (таблица 1 и рисунок 2).
- Поместите ангиокатетер размером 20 G, 18 G, 16 G, 14 G или 12 G (рис. 2A-E) на стерильную поверхность под хирургическим микроскопом.
- Затем с помощью хирургического лезвия с ребристой спинкой #11 (рис. 2F) разрежьте ангиокатетер под углом 90°, чтобы сформировать корпус манжеты длиной 2 мм с выступом 1 мм X 1 мм (ширина х высота) в верхней части корпуса манжеты (рис. 2G).
- Храните манжеты в стерильном физиологическом растворе до тех пор, пока они не будут готовы к использованию.
- Приготовьте растворы.
- Приготовьте смесь кетамина и ксилазина в стерильном флаконе для инъекций, добавив 1 мл ксилазина (100 мг / мл) к 10 мл кетамина (100 мг / мл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Срок годности этого коктейля определяется с использованием самого раннего срока годности используемых компонентов. - Наберите в шприцы правильную дозировку для крыс (0,1 мл смеси кетамина / ксилазина на 100 г массы тела крысы; например, для крысы 200 г будет доставлено 0,2 мл смеси кетамина / ксилазина).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта доза доставит крысе 91 мг / кг кетамина и 9,1 мг / кг ксилазина и должна держать крысу под седативным действием в течение 60-80 минут. - Приготовьте гепарин, который будет поставляться в дозе 1000 ЕД/кг.
- Храните физиологический раствор, PBS и консервирующий раствор на льду (Таблица материалов).
- Приготовьте смесь кетамина и ксилазина в стерильном флаконе для инъекций, добавив 1 мл ксилазина (100 мг / мл) к 10 мл кетамина (100 мг / мл).
2. Подготовка крыс-доноров
- Индуцировать анестезию у крысы-донора путем внутрибрюшинной инъекции смеси кетамина и ксилазина и ожидания ~ 10 мин, пока не разовьется хирургическая плоскость анестезии, которую можно оценить по отсутствию реакции на защемление пальца ноги.
- Побрейте область разреза с помощью электронных машинок для стрижки.
- Поместите крысу-донора в положение лежа на спине на хирургической согревающей доске и протрите область разреза стерильной марлей, пропитанной бетадином. Затем протрите участок тампоном с 70% изопропиловым спиртом. Повторить 3 раза.
- Сделайте разрез средней линии кожи 3–4 см на средней линии шеи с помощью ножниц и тщательно рассеките подкожные ткани и мышцы щипцами (вместо ножниц, чтобы избежать кровотечения).
- Для эндотрахеальной интубации наденьте шелковый шов 4-0 вокруг трахеи и вставьте ангиокатетер 16 G в трахею. Плотно завяжите шов вокруг трахеи двойным узлом, а затем закончите одинарным узлом, чтобы удерживать ангиокатетер на месте.
- Подключите ангиокатетер к аппарату искусственной вентиляции легких и поддерживайте операционную плоскость анестезии у крысы 1-2% изофлурана.
- Выполняют лапаро-стернотомию в виде комбинированного срединного и поперечного разреза с помощью ножниц.
- Введите гепарин (1,000 ЕД / кг) инсулиновым шприцем через нижнюю полую вену (IVC) и подождите 10 минут для системного кровообращения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это введение гепарина предотвращает образование тромбов в донорских легких. - Осторожно рассеките диафрагму, разрезав вдоль грудной дуги, а затем обнажите грудную полость, следуя по грудине к шее.
3. Донорская теплая ишемия легких и заготовка
- Усыпьте крысу-донора, разрезав IVC.
- Пока легкие все еще вентиляционны, разрежьте правую и левую ушные раковины микрорассекающими пружинными ножницами и промыте легкие гравитационным раствором 20 мл консервирующего раствора в шприце, подвешенном под действием силы тяжести 28смH2O под действием силы тяжести, соединенного с трубкой, и ангиокатетером 18G, который вводится непосредственно через легочную артерию.
- Отсоедините аппарат искусственной вентиляции легких от эндотрахеальной трубки и подключите его к шприцу объемом 5 мл, наполненному соответствующим объемом воздуха в зависимости от массы тела.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем воздуха для надувания легких может быть рассчитан как удвоенный дыхательный объем (Td = 7,2 мл / кг), например, крыса весом 200 г будет иметь Td 1,44 мл, а умножение его на 2 будет равняться 2,88 мл воздуха, необходимого для надувания легких. - Надуть легкие донора.
- Наденьте зажим Яшаргила на трахею, чтобы легкие были надуты, и накройте легкие и сердце стерильной ватной марлей. Смочите марлю физиологическим раствором, оберните крысу-донора прокладкой под прокладкой и оставьте на согревающей операционной доске на 1 час, чтобы вызвать теплую ишемию в легких (рис. 3).
- После 1 ч теплой ишемии иссечь блокаду сердца и легких микрорассекающими пружинными ножницами и щипцами и поместить на стерильную марлю, смоченную ледяным PBS, на стерильную чашку Петри на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие шаги должны выполняться, пока легкие находятся на чашке Петри на льду. - Аккуратно надрежьте легочные связки микрорассекающими пружинными ножницами, чтобы отделить левое легкое от пищевода и посткавальной доли.
- Аккуратно обрежьте левую прикорневую область легкого пружинными ножницами Vannas-Tubingen и приобретите левый PV, PA и Br.
- Наденьте манжеты на PV, PA или Br (рис. 4A-C).
- Используйте противомоскитный гемостат, чтобы захватить язычок манжеты.
- Используйте тонкие щипцы, чтобы захватить дистальный конец PV, PA или Br через соответствующий корпус манжеты, вывернуть лишнюю ткань вокруг манжеты и закрепить с помощью 8-0 нейлоновый шов. Используйте пружинные ножницы Vannas-Tubingen, чтобы обрезать лишнюю ткань и манжету вокруг корпуса манжеты.
- Держите донорское легкое покрытым марлей, смоченной физиологическим раствором, на чашке Петри на льду до тех пор, пока оно не будет готово к пересадке крысе-реципиенту (рис. 4D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Среднее время холодовой ишемии составляет 84 мин ± 11 мин С.Д.
4. Подготовка крысы-реципиента
- Индуцировать анестезию у крысы-реципиента так же, как и у крысы-донора, путем внутрибрюшинного введения смеси кетамина и ксилазина (0,1 мл на 100 г крысы) и ожидания 10 минут, пока не разовьется хирургическая плоскость анестезии, которую можно оценить по отсутствию реакции на защемление пальца ноги.
- Место разреза для бритья с помощью электронных машинок для стрижки.
- Поместите крысу-донора в положение лежа на спине и протрите область разреза стерильной марлей, пропитанной бетадином. Затем протрите участок тампоном с 70% изопропиловым спиртом. Повторить 3 раза.
- Перед тем, как крыса будет прикреплена к аппарату искусственной вентиляции легких, нарисуйте линии на груди крысы, готовясь к нахождению4-го межреберья.
- Измерьте грудную клетку от надгрудинной выемки до мечевидного отростка и проведите линию (рис. 5А).
- В середине этой линии проведите линию вдоль левой стороны грудной клетки, которая измеряет половину измерения от надгрудинной выемки до мечевидного отростка (рис. 5A и B).
- Интубируйте реципиента с помощью ангиокатетера 16 G с помощью визуализации с помощью оптоволоконного кабеля, подключенного к светодиодной лампе из набора для эндотрахеальной интубации.
- Подключите ангиокатетер к аппарату искусственной вентиляции легких и поддерживайте операционную плоскость анестезии 1-2% изофлураном.
- Чтобы найти4-е межреберье, найдите область грудной стенки, где может ощущаться сильный пальпируемый сердечный импульс (рисунок 5В, красный кружок).
- В этом месте надрежьте кожу ножницами и мышцу микрорассекающими пружинными ножницами и с помощью ретрактора максимально широко раскройте4-е межреберье (рис. 5D и E).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте электрическое прижигание, чтобы избежать или остановить кровотечение во время рассечения мышц. - Как только межреберье широко открыто, осторожно рассеките связки вокруг левого легкого реципиента с помощью пружинных ножниц Vannas-Tubingen и вытащите легкое из области груди с помощью стерильных ватных палочек и щипцов.
- Поместите стерильную марлю вокруг левого легкого и удерживайте ее бульдожьим зажимом Диффенбаха.
- Наложите зажим Ясаргила на прикорневую область левого легкого как можно проксимальнее.
5. Анастомозы
- Анастомоз легочной вены (ПВ)
- Наложите нейлоновый шов 7-0 вокруг PV реципиента.
- Надрежьте PV реципиента с помощью пружинных ножниц Vannas-Tubingen, поперечно разрезав верхнюю и нижнюю сегментарные вены как можно дистальнее, и промойте кровь 0,2 мл гепаринизированного физиологического раствора (1 Ед / мл) с помощью инсулинового шприца.
- Поместите донорское легкое, все еще обернутое ледяной влажной стерильной марлей, в грудную полость.
- Вставьте PV с манжетой донора в PV реципиента, а затем закрепите предварительно установленным нейлоновым швом 7-0 (рис. 6).
- Бронхиальный (Br) анастомоз
- Наложите нейлоновый шов 7-0 на Br реципиента.
- Надрежьте Br реципиента, разрезав верхнюю и нижнюю сегментарные дыхательные пути поперечно как можно дальше с помощью пружинных ножниц Vannas-Tubingen.
- Вставьте донорский Br с манжетой в Br реципиента и закрепите его предварительно позиционированным нейлоновым швом 7-0 (рис. 6).
- Анастомоз легочной артерии (ПА):
- Наложите нейлоновый шов 7-0 вокруг ПА реципиента.
- Отрежьте ПА реципиента от его адвентициальной оболочки, надрежьте половину окружности сосуда пружинными ножницами Vannas-Tubingen, а затем промойте кровь в ПА 0,2 мл гепаринизированного физиологического раствора (1 Ед / мл) с помощью инсулинового шприца.
- Вставьте донорский ПА с манжетой в ПА реципиента и закрепите его предварительно позиционированным нейлоновым швом 7-0 (рис. 6).
6. Реперфузия
- Снимите зажим Ясаргила на бугорке, чтобы обеспечить реперфузию и вентиляцию трансплантированного донорского легкого (рис. 7).
- Рассеките родное левое легкое реципиента с помощью микрорассекающих пружинных ножниц и щипцов.
- Аккуратно переместите пересаженное левое легкое в грудную клетку реципиента.
- Закройте торакотомический разрез нейлоновым швом 6-0.
- Наложите три нейлоновых шва 6-0 с простыми двойными узлами вокруг ребер, которые выше4-го ребра и ниже5-го ребра (рис. 8А).
- Используйте гемостаты, чтобы собрать три шва вместе (рис. 8B).
- Увеличьте PEEP до 6 смH2O в настройках вентиляции.
- Завяжите все три узла одновременно, оттянув, чтобы закрыть рану (рис. 8C).
- Немедленно уменьшите PEEP до 2 см H2O.
- Закройте кожу нейлоновым швом 6-0.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наша лаборатория изучает острую фазу после трансплантации, поэтому крыса-реципиент в этой модели выживает в течение 3 ч после трансплантации под искусственной вентиляцией легких и анестезией, а затем собирается образец.
7. Сбор экспериментальных образцов (плазма, легочная ткань)
- Для контрольных образцов собирают правые доли донора после начала 3-часового периода реперфузии.
- Мгновенно заморозьте верхнюю долю и посткавальную долю для анализа экспрессии белка или РНК, сохраните среднюю долю для гистологии и используйте нижнюю долю для соотношения массы от влажной к сухой (рис. 9A).
- За 10 минут до окончания 3-часового времени реперфузии подготовьтесь к сбору образцов реципиента, введя гепарин (1000 ЕД / кг) инсулиновым шприцем в яремную вену.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это введение гепарина предотвращает образование тромбов в легких и позволяет проводить более тщательную промывку во время получения. - Сбор плазмы
- В конце 3-часового периода реперфузии соберите 1 мл крови с помощью шприца через НПВ.
- Хранить на льду, а затем центрифугировать при 2000 x g в течение 10 мин для сбора плазмы.
- Усыпьте крысу-реципиента, разрезав IVC, чтобы обеспечить обескровливание.
- Рассекают диафрагму вдоль грудной дуги и обнажают грудную полость, рассекая грудную клетку.
- При желании соберите жидкость BAL из нативных или пересаженных легких (по желанию).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если на легких проводится соотношение веса влажного и сухого или гистология, сбор жидкости BAL не следует проводить, так как это может повлиять на результаты.- Натяните шелковый шов 4-0 вокруг трахеи и завяжите тугой двойной узел вокруг трахеи и интубационной трубки, чтобы предотвратить утечку жидкости.
- Рассчитайте количество ледяного PBS для сбора жидкости BAL из правых и левых долей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объемное соотношение для правого легкого составляет 63%, а объемное соотношение для левого легкого составляет 37%16. Следовательно, чтобы определить количество PBS для закапывания в каждую сторону, объем следует рассчитать как удвоенный дыхательный объем (Td = 7,2 мл / кг), умноженный на 63% для правого легкого и 37% для левого легкого. - Поместите зажим Yasargil на прикорневую область левого легкого (рис. 10A) и с помощью шприца, подключенного к ангиокатетеру, закапайте рассчитанное количество ледяного PBS в правое легкое (родные доли реципиента) и соберите жидкость BAL, осторожно потянув за поршень шприца. Выполните дважды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует ожидать 70-80% восстановления закапываемой жидкости. - Снимите зажим Ясаргила на левом легком и поместите зажим на прикорневую область правого легкого (рис. 10B).
- Соберите жидкость BAL из пересаженной левой доли так же, как она была собрана для правых долей, а затем снимите зажим на прикорневой области правого легкого.
- Разрежьте правую и левую ушные раковины с помощью микрорассекающих пружинных ножниц и промойте легкие под действием силы тяжести через ПА с помощью ангиокатетера 18 G, прикрепленного к трубке, и шприца с 20 мл предварительно охлажденного консервационного раствора, подвешенного на 28 см H2O.
- Соберите образцы из легкого реципиента.
- Заморозьте верхнюю долю и посткавальную долю для анализа экспрессии белка или РНК, сохраните среднюю долю для гистологии и используйте нижнюю долю для соотношения веса от влажной к сухой) (рис. 9A).
- Разделите левую пересаженную левую долю на три части: верхнюю область, собранную для мгновенной заморозки, среднюю область для гистологии и нижнюю область для соотношения веса от влажного к сухому (рис. 9B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для измерения отека легких было рассчитано отношение массы влажных и сухих веществ. Родную долю донора, трансплантированную долю и родную долю реципиента собирали, как описано в протоколе, и немедленно взвешивали для влажного веса, сушили при 60 ° C в течение 48 часов, а затем снова взвешивали для сухого веса. Повышенное соотношение влажного и сухого веса будет свидетельствовать об отеке легких. Наши результаты показывают, что трансплантированная доля действительно имела значительное увеличение соотношения влажного и сухого веса по сравнению с родной долей донора или реципиента (p = 0,0050, n = 6 / группа; Рисунок 11).
| Размер ангиокатетера для манжет | |||
| Масса тела крысы (г) | ПАПА | Бр | ПВ |
| 180-200 | 20 Г | 18 Г | 16 г |
| 200-230 | 18 Г | 16 г | 14 Г |
| 230-250 | 18 Г | 14 Г | 14 Г |
| 250-270 | 18 Г | 14 Г | 12 - 14 г |
| Более 270 | 16 г | 14 Г | 12 г |
Таблица 1. Руководство по размерам манжет. Размер легочной артерии (PA), бронха (Br) или легочной вены (PV) связан с массой тела. В зависимости от массы тела и того, какой тип манжеты вы делаете, указывается рекомендуемый размер ангиокатетера.
Рисунок 1. Хирургические инструменты. (A) Тонкие ножницы, (B) щипцы, (C-E) микрохирургические щипцы, (F) тонкие щипцы Dumont #5, (G) пружинные ножницы Vannas-Tubingen и микрорассекающие ножницы Castroviejo, (H) гемостат комара Холстеда, (J) ретрактор, (K) зажимы Yasargil, (L) зажим бульдога Диффенбаха, (M) изогнутые гемостаты и (N) аппликатор зажима Yasargil. Все инструменты следует автоклавировать при температуре 121 °C в течение 30 мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Подготовка манжеты с ангиокатетером различных размеров и хирургическим лезвием реберной спинки #11. Размер ангиокатетера, выбранного для манжеты, определяется направляющей размера манжеты (таблица 1), которая учитывает массу тела крысы и то, предназначена ли манжета для легочной артерии (PA), бронха (Br) или легочной вены (PV). Ангиокатетеры (A) 20 G, (B) 18 G, (C) 16 G, (D) 14 G или (E) 12 G разрезают хирургическим лезвием (F) с реберной спинкой #11, как описано в протоколе, и хранят в физиологическом растворе до тех пор, пока они не понадобятся. (G) Длина корпуса манжеты составляет 2 мм, а в верхней части корпуса манжеты оставлен выступ размером 1 мм х 1 мм (ширина х высота) для перемещения корпуса манжеты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Теплая ишемия. Легкие промывают консервирующим раствором через легочную артерию, надувают вдвое большим дыхательным объемом воздуха, а затем оборачивают подкладкой и держат на согревающей доске для операции, чтобы поддерживать нормальную температуру тела крысы в течение 1 часа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Манжета донорского легкого PV, PA и Br. (A) Легочная вена, PV (B) легочная артерия, PA, или (C) бронх, Br, вводится через манжету правильного размера, выворачивается, закрепляется 8-0 нейлоновый шов, а затем (D) хранят на стерильной марле, смоченной ледяным физиологическим раствором, на стерильной чашке Петри на льду. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5. Измерение и рассечение в 4-м межреберье. (А) Крысу-реципиента укладывают лежа на спине, измеряют грудную клетку от надгрудинной выемки до мечевидного отростка и проводят линию. (B) В середине этой линии проводится еще одна линия слева на половину длины. (C) По этой линии микрохирург должен нащупать область, где сердечный импульс наиболее силен, чтобы обеспечить правильное расположение4-го межреберья (красный круг). (D) Затем кожа и мышцы рассекаются тонкими ножницами. (E) Затем втягивающее устройство используется для широкого открытия пространства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6. Анастомоз. Донорская манжета (A) PV (B) Br или (C) PA вставляется в PV, Br или PA реципиента, а затем фиксируется нейлоновым швом 7-0. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7. Реперфузия. После того, как анастомозы завершены, реперфузию можно начать, сняв зажим, и крыса-реципиент выживает в течение 3 часов под искусственной вентиляцией легких и анестезией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8. Закрытие раны. (А) Три нейлоновых шва 6-0 с простыми двойными узлами накладываются вокруг ребер, выше 4-го ребра и ниже5-го ребра. (B) Используйте гемостаты в обеих руках, чтобы собрать три шва вместе и увеличить PEEP до 6 см H2O в условиях вентиляции. (C) Завяжите все три узла одновременно, потянув вверх и в сторону, чтобы закрыть рану, немедленно уменьшите PEEP до 2 смH 2O и закройте кожу нейлоновым швом 6-0. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9. Забор легочной ткани. (A) Для нативных долей донора или реципиента верхняя доля и посткавальная доля могут быть заморожены для анализа экспрессии белка или РНК, средняя доля может быть сохранена для гистологии, а нижняя доля может быть использована для соотношения веса от влажной к сухой. (B) Для трансплантированной доли соберите верхнюю область для мгновенной заморозки, среднюю область для гистологии или нижнюю область для соотношения веса влажного и сухого веса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 10. Применение зажима для селективного сбора жидкости БАЛ. Чтобы избежать объединенного образца, жидкость BAL может быть собрана как из правого (родного), так и из левого (трансплантированного) легкого. (A) Прикорневая область левого легкого может быть зажата для сбора жидкости BAL из правых долей. (B) Прикорневая область правого легкого может быть зажата для сбора жидкости BAL из левой доли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 11. Соотношение веса влажного и сухого веса. Соотношение влажного и сухого веса было рассчитано для измерения отека легких и может быть использовано для определения того, насколько хорошо прошла трансплантация. Родную долю донора, трансплантированную долю или родную долю реципиента собирали, как описано в протоколе, и сразу взвешивали для влажного веса, сушили при 60 ° C в течение 48 часов, а затем снова взвешивали для сухого веса. Было взято соотношение сырого веса к сухому весу. Соотношение для трансплантированной доли было значительно увеличено по сравнению с родными долями донора или реципиента. n = 6 крыс на группу, а столбцы представляют собой среднее значение ± SD. Статистический анализ был выполнен с использованием ANOVA с последующим анализом Тьюки. ** стр<0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом отчете мы вмешались на нескольких важных этапах протокола трансплантации легких крысы, чтобы оптимизировать процедуру. Несмотря на то, что сообщалось о различных методах манжеты для трансплантации легких крысы 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15, этот процесс все еще может быть субъективным и трудным для микрохирургов. Мы подчеркнули, что следует использовать надлежащий размер манжет для PV и PA для обеспечения кровью или Br для подачи воздуха в трансплантированное легкое, и мы предоставили более объективный способ определения оптимального размера манжеты на основе массы тела крысы. Чтобы более последовательно индуцировать теплую ишемию легких, мы дали рекомендации по надуванию легких, зажиму и тому, как держать крысу в тепле в течение 1 часа теплой ишемии. Во время процедуры реципиента может быть трудно найти4-е межреберье. Мы рекомендовали, чтобы можно было более точно определить это положение, используя метод измерения и ощущения сердечного импульса. Во время реперфузии, чтобы лучше закрыть рану, мы также показали технику обработки швов и регулировки PEEP, которая может быстрее закрыть рану и предотвратить чрезмерное надувание и повреждение легкого. Наконец, мы представили стратегии сбора тканей и жидкости БАЛ, которые позволяют более объективно собирать образцы, которые можно сравнивать в экспериментах и с разной массой тела.
Наиболее существенным ограничением описанных методик является довольно крутая кривая обучения операции трансплантации в целом. Кривая обучения может быть сокращена с помощью последовательной хирургической практики и обзора методов устранения неполадок в литературе. Еще одним ограничением является то, что эта модель изучает острую фазу IRI и трансплантации, когда впервые происходят биохимические изменения, что находится в центре внимания нашей лаборатории. Будущие исследования должны проверить бронхиальную и сосудистую проходимость в более длительные сроки после трансплантации.
В целом, жизнеспособная модель трансплантации мелких животных имеет решающее значение для оценки терапевтических вмешательств при трансплантации и ишемии-реперфузионном повреждении (IRI). Модель трансплантации легких крысы, в частности, полезна в качестве дополнения к изучению перфузии легких мелких животных ex vivo (EVLP)17. Это также более жизнеспособная альтернатива трансплантации легких мышей, поскольку больший анатомический размер позволяет исследователю получить достаточное количество ткани для более глубокого анализа18. Кроме того, модель имеет важное значение для определения жизнеспособности донорских аллотрансплантатов легких после терапевтического вмешательства с использованием новых низкомолекулярных и белковых терапевтических средств 19,20,21,22 либо для донора, либо для донорского органа через EVLP 17, либо для реципиента и обеспечивает мощный способ сбора данных in vivo. Оптимизации, которые мы описываем в этом отчете, важны для микрохирургов, которые стремятся уменьшить свою кривую обучения и устранить некоторую субъективность. Используя стандартизированный алгоритм размера манжеты легких, хирургический подход может быть упрощенным и более объективным. По завершении периода реперфузии трансплантата описанный структурированный подход к сбору жидкости и тканей BAL также обеспечивает ответственное использование животных и эффективное использование времени микрохирурга за счет максимизации воздействия данных, собранных в ходе эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
BAW, YGL и JLK поддерживаются грантом Национального института здравоохранения (NIH) R01HL143000. BAW поддерживается за счет гранта Министерства обороны (DOD) W81XWH1810787. Малый и средний бизнес поддерживается за счет гранта NIH R01DK123475. JM поддерживается грантами NIH AR061385, AR070752, DK106394 и AG056919, а также грантом Министерства обороны W81XWH-18-1-0787.
Acknowledgments
Никакой.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Gauge angio-catheter | BD | 382277 | |
| 14 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251717-02 | |
| 16 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252586-02 | |
| 18 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251679-02 | |
| 20 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252527-02 | |
| 4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| 6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
| 7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
| 8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
| Betadine Spray | Avrio Health L.P | UPC 367618160039 | |
| Clippers | VWR | MSPP-023326 | |
| Castroviejo micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5668 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Electrocautery | Macan | MV-7A | |
| Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Halsted-mosquito hemostat | Roboz Surgical Instrument Co | RS-7112 | |
| Heparin | Fresnius Medical Care | C504701 | |
| Insulin syringe | Life Technologies | B328446 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropyl Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| Ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
| Dieffenbach Bulldog Clamp | World Precision Instruments | WPI14117 | |
| Needle holder/Forceps, Curved | Micrins | MI1542 | |
| Needle holder/Forceps, Straight | Micrins | MI1540 | |
| Perfadex Plus (Organ Preservation Solution) | XVIVO Perfusion AB | REF# 19950 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | Used to check SpO2 and heartbeat |
| Retractor | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6560 | |
| Saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Syringe 5mL | BD | 309646 | |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT351T | Used to clamp bronchus |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT261T | Used to clamp hilum |
| Yasargil Clamp Applicator | Aesculap, Inc | FT484T |
References
- Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 97 (4), 578-581 (1989).
- Zhai, W., et al. Simplified rat lung transplantation by using a modified cuff technique. Journal of Investigative Surgery. 21 (1), 33-37 (2008).
- Goto, T., et al. Simplified rat lung transplantation using a new cuff technique. Annals of Thoracic Surgery. 93 (6), 2078-2080 (2012).
- Guo, H., et al. Improvements of surgical techniques in a rat model of an orthotopic single lung transplant. European Journal of Medical Research. 18, 1 (2013).
- Tian, D., Shiiya, H., Sato, M., Nakajima, J. Rat lung transplantation model: modifications of the cuff technique. Annals of Translational Medicine. 8 (6), 407 (2020).
- Rajab, T. K. Anastomotic techniques for rat lung transplantation. World Journal of Transplantation. 8 (2), 38-43 (2018).
- Reis, A., Giaid, A., Serrick, C., Shennib, H. Improved outcome of rat lung transplantation with modification of the nonsuture external cuff technique. Journal of Heart and Lung Transplantation. 14 (2), 274-279 (1995).
- Sugimoto, R., et al. Experimental orthotopic lung transplantation model in rats with cold storage. Surgery Today. 39 (7), 641-645 (2009).
- Santana Rodriguez, N., et al. Technical modifications of the orthotopic lung transplantation model in rats with brain-dead donors. Archivos de Bronconeumología. 47 (10), 488-494 (2011).
- Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade. Journal of Surgical Research. 194 (2), 659-666 (2015).
- Rajab, T. K. Techniques for lung transplantation in the rat. Experimental Lung Research. 45 (9-10), 267-274 (2019).
- Iskender, I., et al. Effects of Warm Versus Cold Ischemic Donor Lung Preservation on the Underlying Mechanisms of Injuries During Ischemia and Reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
- Lin, X., et al. Five-year update on the mouse model of orthotopic lung transplantation: Scientific uses, tricks of the trade, and tips for success. Journal of Thoracic Disease. 4 (3), 247-258 (2012).
- Song, J. A., et al. Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats. Toxicological Research. 26 (3), 203-208 (2010).
- Chang, J. E., Kim, H. J., Yi, E., Jheon, S., Kim, K. Reduction of ischemia-reperfusion injury in a rat lung transplantation model by low-concentration GV1001. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (5), 972-979 (2016).
- De Backer, J. W., et al. Study of the variability in upper and lower airway morphology in Sprague-Dawley rats using modern micro-CT scan-based segmentation techniques. Anatomical Record. 292 (5), Hoboken. 720-727 (2009).
- Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), e52309 (2015).
- Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. Journal of Visualized Experiments. (65), e3947 (2012).
- Jia, Y., et al. Treatment of acute lung injury by targeting MG53-mediated cell membrane repair. Nature Communications. 5, 4387 (2014).
- Kim, J. L., et al. Pegylated-Catalase Is Protective in Lung Ischemic Injury and Oxidative Stress. Annals of Thoracic Surgery. , (2020).
- Beal, E. W., et al. D-Ala(2), D-Leu(5)] Enkephalin Improves Liver Preservation During Normothermic Ex Vivo Perfusion. Journal of Surgical Research. 241 (2), 323-335 (2019).
- Akateh, C., et al. Intrahepatic Delivery of Pegylated Catalase Is Protective in a Rat Ischemia/Reperfusion Injury Model. Journal of Surgical Research. 238, 152-163 (2019).
