Summary
Hier presenteren we optimalisaties voor een longtransplantatiemodel bij ratten die dienen om de resultaten te verbeteren. We bieden een maattabel voor manchetten op basis van lichaamsgewicht, een meetstrategie om de 4eintercostale ruimte te bepalen en methoden voor wondsluiting en BAL (bronchoalveolaire lavage) vloeistof- en weefselverzameling.
Abstract
Vanuit onze ervaring met longtransplantatie bij ratten hebben we verschillende verbeterpunten gevonden. Informatie in de bestaande literatuur over methoden voor het kiezen van geschikte manchetmaten voor de longader (PV), longslagader (PA) of bronchus (Br) is gevarieerd, waardoor het bepalen van de juiste manchetgrootte tijdens longtransplantatie bij ratten een oefening van vallen en opstaan is. Door de manchettechniek te standaardiseren om de kleinste effectieve manchet te gebruiken die geschikt is voor de grootte van het vat of de bronchus, kan men de transplantatieprocedure veiliger, sneller en succesvoller maken. Omdat diameters van de PV, PA en Br gerelateerd zijn aan het lichaamsgewicht van de rat, presenteren we een strategie voor het kiezen van een geschikte maat met behulp van een op gewicht gebaseerde gids. Aangezien het longvolume ook gerelateerd is aan het lichaamsgewicht, raden we aan dat deze relatie ook moet worden overwogen bij het kiezen van het juiste luchtvolume voor donorlonginflatie tijdens warme ischemie en voor het juiste volume PBS dat moet worden ingebracht tijdens bronchoalveolaire lavage (BAL) vloeistofverzameling. We beschrijven ook methoden voor4e intercostale ruimtedissectie, wondsluiting en monsterverzameling van zowel de inheemse als de getransplanteerde lobben.
Introduction
Al meer dan drie decennia zijn onderzoekers bezig met het aanpassen en verbeteren van longtransplantatiemodellen bij ratten, zodat de gegenereerde gegevens consistenter zijn en meer een afspiegeling zijn van de werkelijke klinische toestand. In de tijd dat ons laboratorium dit model uitvoerde, hebben we vier verbeterpunten bepaald: manchettechnieken voor anastomosen, identificatie van de 4eintercostale ruimte van de ontvanger, longinflatie en wondsluiting tijdens de procedure van de ontvanger en het oogsten van monsters voor analyse.
Manchettechniekaanpassingen voor anastomosen kunnen de hele transplantatieprocedure verbeteren door de behandelingstijd van de donorlong 1,2,3,4,5,6 te verkorten en de anastomoseprocedure sneller en technisch gemakkelijker te maken voor de microchirurg. Hoewel het van cruciaal belang is om de juiste maat manchetten te gebruiken om het nodige bloed en de luchtstroom naar de getransplanteerde long te leveren, is er beperkte begeleiding met betrekking tot hoe men de grootte van manchetten voor de longader (PV), longslagader (PA) of bronchus (Br) 5,7,8,9 moet kiezen. Aangezien de diameters van de PV, PA en Br gerelateerd zijn aan het lichaamsgewicht van de donor- en ontvangerratten, stellen we voor dat de manchetgrootte wordt gebaseerd op het lichaamsgewicht. Dit rapport biedt een maattabel voor manchetten op basis van het lichaamsgewicht van een rat (180 g tot meer dan 270 g) die dient om de bloed- en luchttoevoer naar de getransplanteerde long te optimaliseren (tabel 1).
Terwijl een nieuwere microchirurg met succes en gemakkelijk een donorlong kan verkrijgen tijdens de donorprocedure, is het transplanteren van de long tijdens de procedure van de ontvanger ingewikkelder en afhankelijk van de ervaring van de microchirurg. Pogingen om de 4eintercostale ruimte te vinden om toegang te krijgen tot de linkerlong van de ontvanger is een van de moeilijkere stappen die enige subjectiviteit bevat en de proceduretijd kan verlengen. Daarom introduceren we een eenvoudige en objectieve methode om te helpen bij de identificatie van de4e intercostale ruimtelocatie door gebruik te maken van borstmetingen en de hartkloppingen om het juiste gebied borstwand te vinden om 4,5,6,10,11,12 te ontleden.
We stellen ook een verbetering voor van de donorlonginflatie, die een potentiële bron van letsel aan het orgaan is. De donorlong loopt leeg totdat de reperfusie begint. Tijdens het hechten van de 4eintercostale ruimte wordt de donorlong gewoonlijk opgeblazen door de PEEP te verhogen van 2 cmH 2 O naar 6 cmH2O. Om longletsel door overinflatie te minimaliseren, stellen we een techniek voor waarbij drie 6-0 nylon hechtingen worden geplaatst rond de 4e rib inferieur aan de5e rib met eenvoudige dubbele knopen. Wanneer het tijd is voor wondsluiting, worden de uiteinden van de drie hechtingen vastgehouden met hemostaten in beide handen, wordt de wond in één keer gesloten door aan elke kant omhoog te trekken en wordt PEEP onmiddellijk teruggebracht tot 2 cmH2O. Op deze manier kan de long zo kort mogelijk uitzetten10.
Aan het einde van een experiment wil de onderzoeker vaak vele soorten monsters verzamelen voor vele soorten analyses van elke transplantatie. Snap bevroren weefsel, formaline vast weefsel, weefsel voor nat-droog gewichtsverhouding om longoedeem te bepalen en bronchoalvelolar lavage (BAL) vloeistof kunnen bijvoorbeeld allemaal worden gebruikt om te beoordelen hoe goed de transplantatie is verlopen. De traditionele methode voor het verzamelen van BAL-vloeistof maakt een gemengd gepoold monster mogelijk van zowel de inheemse lobben van de ontvanger als de getransplanteerde kwab van de donor13,14,15. Om dit te ondervangen, presenteren we een methode om de hilaire gebieden te klemmen die nauwkeuriger inzicht kan geven in de toestand van de getransplanteerde en inheemse longen. Bovendien is het volume PBS dat wordt gebruikt om BAL-vloeistof van elke kant van de longen te verzamelen belangrijk om te overwegen, omdat BAL-vloeistof tal van oplosbare factoren bevat, zoals cytokines en chemokines die worden gemeten op basis van concentratie. Het normaliseren van het volume van de vloeistof die wordt ingebracht tot het geschatte volume van de longcapaciteit kan helpen bij het vergelijken. Met vier lobben aan de rechterkant en één lob aan de linkerkant, heeft elk van de vijf lobben van de rat een ander volume en oppervlak16. Volgens een eerdere studie over volumemeting van longkwabben door Backer et al., van het totale volume van de hele long is het volume van de rechterkwabben 63% (4400 mm 3) en de linkerkwab 37% (2500 mm3). Daarom raden we aan dat het volume PBS dat wordt gebruikt om BAL-vloeistof te verzamelen, moet worden berekend als tweemaal het getijdenvolume (7,2 ml / kg) vermenigvuldigd met 63% voor de rechterlong en 37% voor de linkerlong. Door deze aanpak te gebruiken, kan men beter controleren op variabelen zoals lichaamsgewicht en timing10,16.
Al met al zullen we in dit rapport enkele wijzigingen in het standaard experimentele model van longtransplantatie bij ratten demonstreren die de procedure efficiënter kunnen maken en het vermogen kunnen vergroten om nauwkeurigere en overvloedigere gegevens van elk experiment te genereren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mannelijke Sprague-Dawley-ratten (180-270 g lichaamsgewicht) werden commercieel gekocht (bijv. Envigo) en werden gehuisvest onder pathogeenvrije omstandigheden in de Ohio State University Animal Facility. Alle procedures werden humaan uitgevoerd volgens de NIH en de National Research Council's Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals en met de goedkeuring van the Ohio State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC Protocol # 2012A00000135-R2).
1. Eerste installatie
- Chirurgische apparaten instellen.
OPMERKING: Dit is een niet-overlevingsoperatie. Als overlevingsoperaties moeten worden uitgevoerd, moeten steriele instrumenten en barrièrevoorzorgsmaatregelen worden genomen.- Schakel de hartslag-/zuurstofsaturatiebewakingsapparatuur en het verwarmingsbord in op 42 °C.
- Schakel het ventilatie- en anesthesieapparaat in om de isofluraanverdamper voor te verwarmen.
OPMERKING: Gebruik een getijdenvolume (Td) van 7,2 ml/kg, een positieve expiratoire druk (PEEP) van 2 cmH2O en een ademhalingsfrequentie van 80 bpm. - Vul de anesthesiespuit met 10 ml vloeibaar isofluraan en monteer de spuit op het beademings- en anesthesieapparaat.
- Schakel de chirurgische microscoop in met de hoogte en focus aangepast aan de voorkeuren van de microchirurg.
- Schakel het elektrocautery-apparaat in.
- Bereid chirurgische hulpmiddelen voor en leg ze klaar (figuur 1).
OPMERKING: Alle chirurgische hulpmiddelen werden gedurende 30 minuten geautoclaveerd bij 121 °C. - Verzamel en registreer het lichaamsgewicht van donor- en ontvangerratten.
- Gebruik tabel 1 en het lichaamsgewicht van de rat om de juiste maat van de angiokatheter (20, 18, 16, 14 of 12 G) te bepalen om manchetten te maken.
- Bereid manchetten voor longslagader (PA), bronchus (Br) en longader (PV) voor met behulp van de maattabel op basis van lichaamsgewicht (tabel 1 en figuur 2).
- Plaats een angiokatheter van 20 G, 18 G, 16 G, 14 G of 12 G (Figuur 2A-E) op een steriel oppervlak onder de chirurgische microscoop.
- Gebruik vervolgens een rib-back chirurgisch mes # 11 (figuur 2F) om de angiokatheter in een hoek van 90 ° te snijden om een 2 mm lang manchetlichaam te vormen met een lipje van 1 mm x 1 mm (breedte x hoogte) aan de bovenkant van het manchetlichaam (figuur 2G).
- Bewaar manchetten in steriele zoutoplossing totdat ze klaar zijn voor gebruik.
- Bereid oplossingen voor.
- Bereid een mengsel van ketamine en xylazine in een steriele injectieflacon door 1 ml xylazine (100 mg / ml) toe te voegen aan 10 ml ketamine (100 mg / ml).
OPMERKING: De vervaldatum voor deze cocktail wordt bepaald aan de hand van de vroegste vervaldatum van de gebruikte componenten. - Zuig in spuiten de juiste dosering voor de ratten (0,1 ml van het ketamine / xylazine-mengsel per 100 g lichaamsgewicht van de rat; bijvoorbeeld voor een rat van 200 g zou 0,2 ml ketamine / xylazine-mengsel worden afgeleverd).
OPMERKING: Deze dosering levert 91 mg / kg ketamine en 9,1 mg / kg xylazine aan de rat en moet een rat 60-80 minuten verdoofd houden. - Bereid heparine dat wordt toegediend in een dosis van 1.000 E/kg.
- Bewaar de zoutoplossing, PBS en conserveringsoplossing op ijs (Materiaaltabel).
- Bereid een mengsel van ketamine en xylazine in een steriele injectieflacon door 1 ml xylazine (100 mg / ml) toe te voegen aan 10 ml ketamine (100 mg / ml).
2. Voorbereiding van donorratten
- Induceer anesthesie bij de donorrat door intraperitoneaal het ketamine- en xylazinemengsel te injecteren en ~ 10 minuten te wachten tot zich een chirurgisch anesthesievlak ontwikkelt dat kan worden beoordeeld door gebrek aan respons op teenknijpen.
- Scheer het incisiegebied met behulp van elektronische tondeuses.
- Plaats de donorrat in rugligging op de chirurgische verwarmingsplaat en veeg het incisiegebied af met een steriel gaasje gedrenkt in betadine. Veeg vervolgens het gebied af met een 70% isopropylalcoholdoekje. Herhaal dit 3 keer.
- Maak een 3 tot 4 cm middellijn huidincisie halverwege de nek met een schaar en ontleed zorgvuldig onderhuidse weefsels en spieren met een tang (in plaats van een schaar om bloedingen te voorkomen).
- Voor endotracheale intubatie, rijg 4-0 zijden hechtdraad rond de luchtpijp en breng een 16 G angio-katheter in de luchtpijp. Bind de hechtdraad rond de luchtpijp stevig vast met een dubbele knoop en eindig vervolgens met een enkele knoop om de angio-katheter op zijn plaats te houden.
- Sluit de angiokatheter aan op de beademingsmachine en onderhoud een chirurgisch anesthesievlak bij de rat met 1-2% isofluraan.
- Voer een laparo-sternotomie uit als een gecombineerde middellijn en transversale incisie met behulp van een schaar.
- Injecteer heparine (1.000 E/kg) met een insulinespuit via de inferieure vena cava (IVC) en laat 10 minuten voor systemische circulatie.
OPMERKING: Deze toediening van heparine voorkomt bloedstolsels in de donorlong. - Ontleed het diafragma voorzichtig door langs de thoracale boog te snijden en leg vervolgens de thoracale holte bloot door het borstbeen naar de nek te volgen.
3. Donorlong-ischemie en verkrijging
- Euthanaseer de donorrat door het IVC door te snijden.
- Terwijl de longen nog steeds ventileren, knipt u zowel de rechter- als de linkeroorschelp met een micro-ontleedveerschaar en gravity flush-longen met 20 ml conserveringsoplossing in een spuit die op 28 cmH2O hangt door de zwaartekracht verbonden met slangen en een 18 G angio-katheter die rechtstreeks door de longslagader wordt ingebracht.
- Koppel de ventilator los van de endotracheale buis en sluit deze aan op een spuit van 5 ml gevuld met een juiste hoeveelheid lucht op basis van het lichaamsgewicht.
OPMERKING: Het volume lucht om de longen op te blazen kan worden berekend als met tweemaal het getijdenvolume (Td = 7,2 ml / kg), bijvoorbeeld, een rat van 200 g zou een Td van 1,44 ml hebben en vermenigvuldigen met 2 zou gelijk zijn aan 2,88 ml lucht die nodig is om de longen op te blazen. - Blaas de longen van de donor op.
- Plaats een Yasargil-klem op de luchtpijp om de longen opgeblazen te houden en bedek de longen en het hart met steriel katoenen gaas. Hydrateer het gaas met zoutoplossing, wikkel de donorrat met een onderkussen en laat het 1 uur op het verwarmende operatiebord liggen om warme ischemie in de longen te veroorzaken (figuur 3).
- Na 1 uur warme ischemie, snijd het hart-longblok met micro-ontleedveerschaar en tang en plaats op steriel gaas bevochtigd met ijskoude PBS op een steriele petrischaal op ijs.
OPMERKING: Alle volgende stappen moeten plaatsvinden terwijl de longen op de petrischaal op ijs liggen. - Snijd longbanden zorgvuldig in met een micro-ontleedbare veerschaar om de linkerlong te scheiden van de slokdarm en de post-cavalkwab.
- Knip het linker long hilar gebied voorzichtig bij met Vannas-Tubingen veerschaar en zorg voor de linker PV, PA en Br.
- Plaats manchetten op PV, PA of Br (figuur 4A-C).
- Gebruik een mug hemostat om het manchetlipje vast te pakken.
- Gebruik een fijne tang om het distale uiteinde van de PV, PA of Br door het juiste manchetlichaam te grijpen, het extra weefsel rond de manchet te gebruiken en vast te zetten met 8-0 Nylon hechtdraad. Gebruik Vannas-Tübingen veerschaar om extra weefsel en de manchet rond het manchetlichaam te trimmen.
- Houd de donorlong bedekt met gaas bevochtigd met zoutoplossing op de petrischaal op ijs totdat deze klaar is om te worden getransplanteerd in de ontvangende rat (figuur 4D).
OPMERKING: De gemiddelde koude ischemietijd is 84 min ± 11 min S.D.
4. Voorbereiding van de ontvangende ratten
- Induceer anesthesie bij de ontvangende rat op dezelfde manier als de donorrat door intraperitoneaal het ketamine- en xylazinemengsel (0,1 ml per 100 g rat) te injecteren en 10 minuten te wachten tot een chirurgisch anesthesievlak zich ontwikkelt dat kan worden beoordeeld door gebrek aan respons op teenknijpen.
- Scheer incisiegebied met behulp van elektronische tondeuses.
- Plaats de donorrat in rugligging en veeg het incisiegebied af met een steriel gaasje gedrenkt in betadine. Veeg vervolgens het gebied af met een 70% isopropylalcoholdoekje. Herhaal dit 3 keer.
- Voordat de rat aan de beademingsmachine wordt bevestigd, tekent u lijnen op de borst van de rat ter voorbereiding op het vinden van de 4e intercostale ruimte.
- Meet de borstkas van de suprasternale inkeping tot de xiphoid-processus en teken een lijn (figuur 5A).
- Teken in het midden van deze lijn een lijn langs de linkerkant van de borst die de helft van de meting meet van de suprasternale inkeping tot het xiphoid-proces (figuur 5A en B).
- Intubeer de ontvanger met behulp van een angiokatheter van 16 G via visualisatie met behulp van de glasvezelkabel die is aangesloten op een LED-lampje van de endotracheale intubatiekit.
- Sluit de angio-katheter aan op de ventilator en onderhoud een chirurgisch anesthesievlak met 1-2% isofluraan.
- Om de 4eintercostale ruimte te vinden, zoekt u het gebied van de borstwand waar een sterke voelbare hartimpuls kan worden gevoeld (figuur 5C, rode cirkel).
- Snijd op deze locatie de huid in met een schaar en de spier met een micro-ontleedveerschaar en gebruik het oprolmechanisme om de 4e intercostale ruimte zo ver mogelijk te openen (figuur 5D en E).
OPMERKING: Gebruik elektrische cauterie om bloedingen tijdens de spierdissectie te voorkomen of te stoppen. - Zodra de intercostale ruimte wijd is geopend, ontleedt u voorzichtig de ligamenten rond de linkerlong van de ontvanger met behulp van een Vannas-Tübingen veerschaar en trekt u de long uit het borstgebied met behulp van steriele wattenstaafjes en een tang.
- Plaats steriel gaas rond de linkerlong en houd het vast met een Dieffenbach bulldogklem.
- Breng een Yasargil-klem zo proximaal mogelijk aan op het hilaire gebied van de linkerlong.
5. Anastomosen
- Pulmonale ader (PV) anastomose
- Plaats 7-0 nylon hechting rond de PV van de ontvanger.
- Snijd het PV van de ontvanger in met de Vannas-Tübingen veerschaar door de bovenste en onderste segmentaderen zo distaal mogelijk door te snijden en spoel bloed uit met 0,2 ml gehepariniseerde zoutoplossing (1 U / ml) met behulp van een insulinespuit.
- Plaats de donorlong nog omwikkeld met ijskoud nat steriel gaas in de borstholte.
- Steek het PV met manchetten van de donor in het PV van de ontvanger en zet het vervolgens vast met de voorgeplaatste 7-0 nylon hechting (figuur 6).
- Bronchiale (Br) anastomose
- Plaats 7-0 nylon hechting rond de Br van de ontvanger.
- Snijd de Br van de ontvanger in door de bovenste en onderste segmentale luchtwegen zo distaal mogelijk dwars af te snijden met een veerschaar van Vannas-Tübingen.
- Steek de geboeide Br van de donor in de Br van de ontvanger en zet vast met de voorgezette 7-0 nylon hechting (figuur 6).
- Longslagader (PA) anastomose:
- Plaats 7-0 nylon hechting rond de PA van de ontvanger.
- Snijd de PA van de ontvanger uit de adventitiële schede, snijd de helft van de omtrek van het vat in met een Vannas-Tübingen veerschaar en spoel vervolgens bloed in de PA met 0,2 ml gehepariniseerde zoutoplossing (1 U / ml) met behulp van een insulinespuit.
- Steek de geboeide PA van de donor in de PA van de ontvanger en zet deze vast met de voorgezette 7-0 nylon hechting (figuur 6).
6. Reperfusie
- Verwijder de Yasargil-klem op de hilum om reperfusie en beademing van de getransplanteerde donorlong mogelijk te maken (figuur 7).
- Ontleed de inheemse linkerlong van de ontvanger met behulp van een micro-ontleedveerschaar en -tang.
- Herpositioneer de getransplanteerde linkerlong zorgvuldig in de thorax van de ontvanger.
- Sluit de thoracotomie-incisie met behulp van 6-0 nylon hechtdraad.
- Plaats drie 6-0 nylon hechtingen met eenvoudige dubbele knopen rond de ribben superieur aan de 4e rib en inferieur aan de 5erib (figuur 8A).
- Gebruik hemostaten om de drie hechtingen samen te brengen (figuur 8B).
- Verhoog de PEEP tot 6 cmH2O in de ventilatiestanden.
- Bind alle drie de knopen tegelijkertijd samen door weg te trekken om de wond te sluiten (figuur 8C).
- Verlaag de PEEP onmiddellijk tot 2 cmH2O.
- Sluit de huid met 6-0 nylon hechting.
OPMERKING: Ons laboratorium bestudeert de acute fase na transplantatie, zodat de ontvangende rat in dit model 3 uur na de transplantatie wordt overleefd onder beademing en anesthesie en vervolgens worden monsters verzameld.
7. Verzameling van experimentele monsters (plasma, longweefsel)
- Voor controlemonsters verzamelt u de rechterkwabben van de donor nadat de reperfusieperiode van 3 uur is gestart.
- Vries de superieure kwab en post-cavalkwab in voor eiwit- of RNA-expressieanalyses, behoud de middelste kwab voor histologie en gebruik de inferieure kwab voor de verhouding tussen nat en droog gewicht (figuur 9A).
- Bereid u 10 minuten voor het einde van de reperfusietijd van 3 uur voor op het oogsten van de ontvangermonsters door heparine (1.000 E/kg) met een insulinespuit in de halsader te injecteren.
OPMERKING: Deze toediening van heparine voorkomt bloedstolsels in de longen en zorgt voor een grondiger blozen op het moment van verkrijging. - Plasma collectie
- Aan het einde van de reperfusieperiode van 3 uur verzamelt u 1 ml bloed met een spuit via de IVC.
- Bewaren op ijs en vervolgens centrifugeren op 2.000 x g gedurende 10 minuten om plasma te oogsten.
- Euthanaseer de ontvangende rat door de IVC door te snijden om exsanguinatie mogelijk te maken.
- Ontleed het diafragma langs de thoracale boog en leg de thoracale holte bloot door de ribbenkast te ontleden.
- Verzamel BAL-vloeistof uit de inheemse of getransplanteerde longen indien gewenst (optioneel).
OPMERKING: Als de verhouding tussen nat en droog gewicht of histologie op de long wordt uitgevoerd, mag balvloeistofverzameling niet worden uitgevoerd omdat dit de resultaten kan beïnvloeden.- Rijg 4-0 zijden hechtdraad rond de luchtpijp en bind een strakke dubbele knoop rond de luchtpijp en intubatiebuis om vloeistoflekkage te voorkomen.
- Bereken de hoeveelheid ijskoude PBS voor BAL-vloeistofverzameling van de rechterlobben en linkerkwab.
OPMERKING: De volumeverhouding voor de rechterlong is 63%, terwijl de volumeverhouding voor de linkerlong 37% is16. Om de hoeveelheid PBS te bepalen die in elke zijde moet worden ingebracht, moet het volume daarom worden berekend als tweemaal het getijdenvolume (Td = 7,2 ml / kg) vermenigvuldigd met 63% voor de rechterlong en 37% voor de linkerlong. - Plaats een Yasargil-klem op het linker longgebied (figuur 10A) en spuit, met een spuit aangesloten op de angio-katheter, injecteer de berekende hoeveelheid ijskoude PBS in de rechterlong (de oorspronkelijke lobben van de ontvanger) en vang de BAL-vloeistof op door zachtjes op de zuiger van de spuit te trekken. Voer twee keer uit.
OPMERKING: Men zou 70-80% herstel van ingesmelde vloeistof moeten verwachten. - Verwijder de Yasargil-klem op de linkerlong en plaats de klem op het rechterlonggebied (figuur 10B).
- Verzamel BAL-vloeistof uit de getransplanteerde linkerkwab op dezelfde manier als het werd verzameld voor de rechterkwabben en verwijder vervolgens de klem op het hilaire gebied van de rechterlong.
- Knip de rechter en linker oorschelp met een micro-ontleedveerschaar en spoel de longen door de zwaartekracht door de PA met behulp van een 18 G angio-katheter bevestigd aan de slang en een spuit met 20 ml voorgekoelde conserveringsoplossing hangend bij 28 cmH2O.
- Verzamel monsters uit de long van de ontvanger.
- Snap-freeze de superieure kwab en post-caval kwab voor eiwit- of RNA-expressieanalyses, behoud de middelste kwab voor histologie en gebruik de inferieure kwab voor de verhouding tussen nat en droog gewicht) (figuur 9A).
- Verdeel de linker getransplanteerde linkerkwab in drie delen: het bovenste gebied verzameld voor snap-frozen, het middelste gebied voor histologie en het onderste gebied voor nat-droog gewichtsverhouding (figuur 9B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om longoedeem te meten, werd de verhouding nat-drooggewicht berekend. De inheemse kwab van de donor, de getransplanteerde kwab en de inheemse kwab van de ontvanger werden verzameld zoals beschreven in het protocol en onmiddellijk gewogen voor nat gewicht, gedroogd bij 60 ° C gedurende 48 uur en vervolgens opnieuw gewogen voor het droge gewicht. Een verhoogde verhouding tussen nat en droog gewicht zou wijzen op longoedeem. Onze resultaten geven aan dat de getransplanteerde kwab een significante toename van de verhouding tussen nat en droog gewicht had in vergelijking met de inheemse kwab van de donor of ontvanger (p = 0,0050, n = 6 / groep; Figuur 11).
| Angio-kathetermaat voor manchetten | |||
| Lichaamsgewicht van de rat (g) | PA | Br | PV |
| 180-200 | 20 gr | 18 gr | 16 gr |
| 200-230 | 18 gr | 16 gr | 14 gr |
| 230-250 | 18 gr | 14 gr | 14 gr |
| 250-270 | 18 gr | 14 gr | 12 tot 14 gr |
| Meer dan 270 | 16 gr | 14 gr | 12 gr |
Tabel 1. Maattabel voor manchetten. De grootte van de longslagader (PA), bronchus (Br) of longader (PV) is gerelateerd aan het lichaamsgewicht. Afhankelijk van het lichaamsgewicht en welk type manchet u maakt, wordt de aanbevolen angiokathetergrootte gegeven.
Figuur 1. Chirurgische hulpmiddelen. (A) Fijne schaar, (B) tang, (C-E) microchirurgische tang, (F) Dumont #5 fijne tang, (G) Vannas-Tübingen veerschaar en Castroviejo micro-ontleedschaar, (H) Halsted-mug hemostat, (J) retractor, (K) Yasargil klemmen, (L) Dieffenbach bulldogklem, (M) gebogen hemostaten en (N) Yasargil klemapplicator. Alle gereedschappen moeten gedurende 30 minuten worden geautoclaveerd bij 121 °C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Manchetvoorbereiding met verschillende maten angio-katheter en rib-back chirurgisch mes #11. De grootte van de angiokatheter die voor de manchet is gekozen, wordt bepaald door de manchetmaatgids (tabel 1) die rekening houdt met het lichaamsgewicht van de rat en of de manchet voor de longslagader (PA), bronchus (Br) of longader (PV) is. De angiokatheters (A) 20 G, (B) 18 G, (C) 16 G, (D) 14 G of (E) 12 G worden gesneden met een (F) rib-back chirurgisch mes #11 zoals beschreven in het protocol, en opgeslagen in zoutoplossing totdat ze nodig zijn. (G) De lichaamslengte van de manchet is 2 mm en aan de bovenkant van het manchetlichaam wordt een lipje van 1 mm X 1 mm (breedte x hoogte) overgelaten voor het hanteren van het manchetlichaam. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Warme ischemie. Longen worden gespoeld met de conserveringsoplossing door de longslagader, opgeblazen met tweemaal het getijdenvolume van lucht, en vervolgens omwikkeld met een onderkussen en op de verwarmingsplaat van de operatie gehouden om de rat gedurende 1 uur op normale lichaamstemperatuur te houden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Manchetten van donorlong-PV, PA en Br. (A) Pulmonale ader, PV (B) longslagader, PA, of (C) bronchus, Br, wordt ingebracht door een manchet van de juiste grootte, everted, beveiligd met 8-0 nylon hechtdraad, en (D) vervolgens opgeslagen op steriel gaas bevochtigd met ijskoude zoutoplossing op een steriele petrischaal op ijs. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Meten en ontleden op de 4e intercostale ruimte. (A) De ontvangende rat wordt liggend gelegd en de borstkas wordt gemeten van de suprasternale inkeping tot het xiphoid-proces en er wordt een lijn getrokken. (B) In het midden van deze lijn wordt een andere lijn naar links getrokken op de helft van de lengte. (C) Langs deze lijn moet de microchirurg voelen voor een gebied waar de hartimpuls het sterkst is om de juiste locatie van de 4e intercostale ruimte (rode cirkel) te garanderen. (D) De huid en spieren worden vervolgens ontleed met een fijne schaar. (E) Het oprolmechanisme wordt vervolgens gebruikt om de ruimte wijd te openen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Anastomosis. De geboeide (A) PV (B) Br of (C) PA van de donor wordt ingebracht in de PV, Br of PA van de ontvanger en vervolgens beveiligd met 7-0 nylon hechtdraad. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. Reperfusie. Nadat de anastomosen zijn voltooid, kan de reperfusie worden gestart door de klem te verwijderen en wordt de ontvangende rat gedurende 3 uur overleefd onder beademing en anesthesie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8. Wondsluiting. (A) Drie 6-0 nylon hechtingen met eenvoudige dubbele knopen worden rond de ribben geplaatst die superieur zijn aan de 4e rib en inferieur aan de5e rib. (B) Gebruik hemostaten in beide handen om de drie hechtingen samen te brengen en de PEEP te verhogen tot 6 cmH2O in de ventilatie-instellingen. (C) Bind alle drie de knopen tegelijkertijd samen door op en neer te trekken om de wond te sluiten, verlaag PEEP onmiddellijk tot 2 cmH2O en sluit de huid met 6-0 nylon hechting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9. Longweefsel verzameling. (A) Voor de inheemse kwabben van de donor of ontvanger kunnen de superieure kwab en de post-cavalkwab worden ingevroren voor eiwit- of RNA-expressieanalyses, de middelste kwab kan worden bewaard voor histologie en de inferieure kwab kan worden gebruikt voor de verhouding tussen nat en droog gewicht. (B) Verzamel voor de getransplanteerde kwab het bovenste gebied voor snap bevroren, het middelste gebied voor histologie of het onderste gebied voor de verhouding tussen nat en droog gewicht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10. Toepassing van de klem voor selectieve BAL-vloeistofverzameling. Om een gepoold monster te voorkomen, kan BAL-vloeistof worden verzameld uit de rechter (native) of linker (getransplanteerde) long. (A) Het hilaire gebied van de linkerlong kan worden geklemd om BAL-vloeistof uit de rechterkwabben te verzamelen. (B) Het hilaire gebied van de rechterlong kan worden geklemd om BAL-vloeistof uit de linkerkwab te verzamelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11. Verhouding tussen nat en droog gewicht. De verhouding tussen nat en droog gewicht is berekend om longoedeem te meten en kan worden gebruikt om aan te geven hoe goed de transplantatie is verlopen. De inheemse kwab van de donor, de getransplanteerde kwab of de inheemse kwab van de ontvanger werd verzameld zoals beschreven in het protocol en onmiddellijk gewogen voor nat gewicht, gedroogd bij 60 ° C gedurende 48 uur en vervolgens opnieuw gewogen voor het droge gewicht. Er werd een verhouding genomen tussen nat gewicht en drooggewicht. De verhouding voor de getransplanteerde kwab was significant verhoogd in vergelijking met de inheemse kwabben van de donor of ontvanger. n=6 ratten/groep en staven vertegenwoordigen gemiddelde ± SD. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van ANOVA met de post-hoc analyse van Tukey. ** p<0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit rapport hebben we ingegrepen bij verschillende kritieke stappen in een longtransplantatieprotocol bij ratten om de procedure te optimaliseren. Hoewel verschillende manchettechnieken voor longtransplantatie bij ratten zijn gemeld 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15, kan het proces nog steeds subjectief en moeilijk zijn voor microchirurgen om toe te passen. We hebben benadrukt dat de juiste maat manchetten voor PV en PA om bloed of Br te leveren om lucht in de getransplanteerde long te leveren, moet worden gebruikt, en we hebben een meer objectieve manier geboden om de optimale manchetgrootte te bepalen op basis van het lichaamsgewicht van de rat. Om consistenter warme ischemie van de longen te induceren, hebben we aanbevelingen gegeven voor longinflatie, klemmen en hoe de rat warm te houden tijdens de 1 uur warme ischemietijd. Tijdens de procedure van de ontvanger kan het moeilijk zijn om de 4eintercostale ruimte te lokaliseren. We hebben aanbevolen dat men deze positie nauwkeuriger kan lokaliseren door gebruik te maken van een meetmethode en gevoel voor cardiale impuls. Op het moment van reperfusie, om de wond beter te sluiten, toonden we ook een techniek van het hanteren van hechtingen en het aanpassen van PEEP die de wond sneller kan sluiten en overinflatie en letsel van de long kan voorkomen. Ten slotte hebben we strategieën gepresenteerd voor weefsel- en BAL-vloeistofverzameling die een objectievere oogst van monsters mogelijk maken die kunnen worden vergeleken tussen experimenten en verschillende lichaamsgewichten.
De belangrijkste beperking van de beschreven technieken is de vrij steile leercurve van de transplantatieoperatie in het algemeen. De leercurve is er een die kan worden verminderd met consistente chirurgische praktijk en door het beoordelen van probleemoplossingstechnieken in de literatuur. Een andere beperking is dat dit model de acute fase van IRI en transplantatie bestudeert waar biochemische veranderingen het eerst optreden, wat de focus is van ons laboratorium. Toekomstige studies moeten bronchiale en vasculaire doorgankelijkheid testen op langere tijdlijnen na transplantatie.
Over het algemeen is een levensvatbaar transplantatiemodel voor kleine dieren van cruciaal belang voor het evalueren van therapeutische interventies voor transplantatie en ischemie-reperfusieletsel (IRI). Met name het longtransplantatiemodel bij ratten is nuttig als aanvulling op het bestuderen van ex vivo longperfusie (EVLP) van kleine dieren17. Het is ook een meer levensvatbaar alternatief voor muriene longtransplantatie, omdat de grotere anatomische grootte de onderzoeker in staat stelt voldoende weefsel te verkrijgen voor meer diepgaande analyses18. Bovendien is het model essentieel voor het bepalen van de levensvatbaarheid van donorlongtransplantaten na therapeutische interventie met nieuwe kleine molecuul- en eiwittherapieën 19,20,21,22 aan de donor, aan het donororgaan via EVLP17 of aan de ontvanger en biedt het een krachtige manier om in vivo gegevens te verzamelen. De optimalisaties die we in dit rapport beschrijven, zijn belangrijk voor microchirurgen die hun leercurve willen verminderen en enige subjectiviteit willen verwijderen. Door gebruik te maken van een gestandaardiseerd algoritme voor longmanchetten, kan de chirurgische aanpak worden gestroomlijnd en objectiever worden. Aan het einde van de transplantatiereperfusieperiode biedt de beschreven gestructureerde benadering van BAL-vloeistof- en weefselverzameling ook een verantwoord gebruik van dieren en een efficiënt gebruik van de tijd van de microchirurg door de impact van de per experiment verzamelde gegevens te maximaliseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
BAW, YGL en JLK worden ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidie R01HL143000. BAW wordt ondersteund door de subsidie van het Ministerie van Defensie (DOD) W81XWH1810787. SMB wordt ondersteund door NIH-subsidie R01DK123475. JM wordt ondersteund door NIH-subsidies AR061385, AR070752, DK106394 en AG056919, evenals door DOD-subsidie W81XWH-18-1-0787.
Acknowledgments
Geen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Gauge angio-catheter | BD | 382277 | |
| 14 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251717-02 | |
| 16 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252586-02 | |
| 18 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251679-02 | |
| 20 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252527-02 | |
| 4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| 6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
| 7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
| 8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
| Betadine Spray | Avrio Health L.P | UPC 367618160039 | |
| Clippers | VWR | MSPP-023326 | |
| Castroviejo micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5668 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Electrocautery | Macan | MV-7A | |
| Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Halsted-mosquito hemostat | Roboz Surgical Instrument Co | RS-7112 | |
| Heparin | Fresnius Medical Care | C504701 | |
| Insulin syringe | Life Technologies | B328446 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropyl Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| Ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
| Dieffenbach Bulldog Clamp | World Precision Instruments | WPI14117 | |
| Needle holder/Forceps, Curved | Micrins | MI1542 | |
| Needle holder/Forceps, Straight | Micrins | MI1540 | |
| Perfadex Plus (Organ Preservation Solution) | XVIVO Perfusion AB | REF# 19950 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | Used to check SpO2 and heartbeat |
| Retractor | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6560 | |
| Saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Syringe 5mL | BD | 309646 | |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT351T | Used to clamp bronchus |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT261T | Used to clamp hilum |
| Yasargil Clamp Applicator | Aesculap, Inc | FT484T |
References
- Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 97 (4), 578-581 (1989).
- Zhai, W., et al. Simplified rat lung transplantation by using a modified cuff technique. Journal of Investigative Surgery. 21 (1), 33-37 (2008).
- Goto, T., et al. Simplified rat lung transplantation using a new cuff technique. Annals of Thoracic Surgery. 93 (6), 2078-2080 (2012).
- Guo, H., et al. Improvements of surgical techniques in a rat model of an orthotopic single lung transplant. European Journal of Medical Research. 18, 1 (2013).
- Tian, D., Shiiya, H., Sato, M., Nakajima, J. Rat lung transplantation model: modifications of the cuff technique. Annals of Translational Medicine. 8 (6), 407 (2020).
- Rajab, T. K. Anastomotic techniques for rat lung transplantation. World Journal of Transplantation. 8 (2), 38-43 (2018).
- Reis, A., Giaid, A., Serrick, C., Shennib, H. Improved outcome of rat lung transplantation with modification of the nonsuture external cuff technique. Journal of Heart and Lung Transplantation. 14 (2), 274-279 (1995).
- Sugimoto, R., et al. Experimental orthotopic lung transplantation model in rats with cold storage. Surgery Today. 39 (7), 641-645 (2009).
- Santana Rodriguez, N., et al. Technical modifications of the orthotopic lung transplantation model in rats with brain-dead donors. Archivos de Bronconeumología. 47 (10), 488-494 (2011).
- Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade. Journal of Surgical Research. 194 (2), 659-666 (2015).
- Rajab, T. K. Techniques for lung transplantation in the rat. Experimental Lung Research. 45 (9-10), 267-274 (2019).
- Iskender, I., et al. Effects of Warm Versus Cold Ischemic Donor Lung Preservation on the Underlying Mechanisms of Injuries During Ischemia and Reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
- Lin, X., et al. Five-year update on the mouse model of orthotopic lung transplantation: Scientific uses, tricks of the trade, and tips for success. Journal of Thoracic Disease. 4 (3), 247-258 (2012).
- Song, J. A., et al. Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats. Toxicological Research. 26 (3), 203-208 (2010).
- Chang, J. E., Kim, H. J., Yi, E., Jheon, S., Kim, K. Reduction of ischemia-reperfusion injury in a rat lung transplantation model by low-concentration GV1001. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (5), 972-979 (2016).
- De Backer, J. W., et al. Study of the variability in upper and lower airway morphology in Sprague-Dawley rats using modern micro-CT scan-based segmentation techniques. Anatomical Record. 292 (5), Hoboken. 720-727 (2009).
- Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), e52309 (2015).
- Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. Journal of Visualized Experiments. (65), e3947 (2012).
- Jia, Y., et al. Treatment of acute lung injury by targeting MG53-mediated cell membrane repair. Nature Communications. 5, 4387 (2014).
- Kim, J. L., et al. Pegylated-Catalase Is Protective in Lung Ischemic Injury and Oxidative Stress. Annals of Thoracic Surgery. , (2020).
- Beal, E. W., et al. D-Ala(2), D-Leu(5)] Enkephalin Improves Liver Preservation During Normothermic Ex Vivo Perfusion. Journal of Surgical Research. 241 (2), 323-335 (2019).
- Akateh, C., et al. Intrahepatic Delivery of Pegylated Catalase Is Protective in a Rat Ischemia/Reperfusion Injury Model. Journal of Surgical Research. 238, 152-163 (2019).
