Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

قياس التطور الزمني للمواد النانوية مع تشتت النيوترونات المتوقف والزاوية الصغيرة

Published: August 6, 2021 doi: 10.3791/62873
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1, 1
1NIST Center for Neutron Research, National Institute of Standards and Technology, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of Windsor, 3Department of Physics, University of Windsor

Summary

يقدم هذا البروتوكول استخدام بيئة عينة التدفق المتوقف لخلط محاليل سائلة متعددة بسرعة في الموقع أثناء قياس تشتت النيوترونات بزاوية صغيرة ودراسة العمليات الحركية على مقاييس طول النانومتر والمقاييس الزمنية الثانية.

Abstract

يقدم هذا البحث استخدام بيئة عينة تشتت النيوترونات صغيرة الزاوية (SANS) ذات التدفق المتوقف لخلط العينات السائلة بسرعة ودراسة العمليات الحركية النانوية على نطاقات زمنية من ثوان إلى دقائق. تستخدم بيئة عينة التدفق المتوقف مضخات الحقن المتاحة تجاريا لخلط الأحجام المطلوبة من العينات السائلة التي يتم حقنها بعد ذلك من خلال خلاط ديناميكي في خلية زجاجية كوارتز في حوالي 1 ثانية. تتم مزامنة الحصول على بيانات SANS التي تم حلها بمرور الوقت مع خلط العينات لمتابعة تطور البنية النانوية في المحلول بعد الخلط.

لتحقيق أقصى استفادة من وقت الحزمة النيوترونية ، نستخدم سلسلة من صمامات محدد التدفق لتحميل الخلية وشطفها وتجفيفها تلقائيا بين القياسات ، مما يسمح بجمع البيانات المتكررة خلال عمليات حقن العينات المتعددة. يتم تكرار حقن العينات حتى يتم جمع إحصاءات كافية عن تشتت النيوترونات. يمكن برمجة إعداد الخلط لتغيير الظروف بشكل منهجي لقياس الحركية بنسب خلط مختلفة وتركيزات العينات وتركيزات المواد المضافة ودرجات الحرارة. الحد الأدنى لحجم العينة المطلوب لكل حقنة هو حوالي 150 ميكرولتر اعتمادا على طول مسار خلية الكوارتز.

يتم تقديم النتائج التمثيلية باستخدام بيئة عينة التدفق المتوقف هذه لحركية التبادل السريع للدهون في وجود مادة مضافة ، سيكلوديكسترين. تتبادل الحويصلات الدهون في الوريقات الخارجية (الخارجية) بترتيب ثوان وتتبادل الدهون الداخلية والخارجية بالكامل في غضون ساعات. يتطلب قياس حركية تبادل الدهون الخلط في الموقع لالتقاط العمليات الأسرع (بالثواني) والأبطأ (بالدقائق) واستخراج ثوابت معدل الحركة. يمكن أيضا استخدام بيئة العينة نفسها لاستكشاف التبادل الجزيئي في أنواع أخرى من العينات السائلة مثل الجسيمات النانوية الدهنية أو البروتينات أو المواد الخافضة للتوتر السطحي أو البوليمرات أو المستحلبات أو الجسيمات النانوية غير العضوية. سيوفر قياس التحولات الهيكلية النانوية وحركية أنظمة التبادل أو التفاعل رؤى جديدة للعمليات التي تتطور على المستوى النانوي.

Introduction

يوفر تشتت النيوترونات بزاوية صغيرة (SANS) طريقة فريدة لقياس أحجام وأشكال وتفاعلات وتنظيم المواد المختلفة على مقاييس الطول من ≈1 نانومتر إلى ≈100 نانومتر1،2،3. الأدوات الحديثة ، بما في ذلك VSANS (تشتت النيوترونات بزاوية صغيرة جدا) مع مرايا التركيز ، تدفع الحدود نحو قياس مقاييس طول أكبر تصل إلى ≈1000 نانومتر 4,5. بشكل عام ، يوفر تباين التشتت الفريد المتأصل في طرق تشتت النيوترونات العديد من المزايا في قياس التطور الزمني للهياكل النانوية ، مثل تجميع المكونات في التركيبات الصيدلانية6 ، تفاعلات التشابك والهلام في أنظمة البوليمر 7,8 ، في التبلور المتوسط للبروتينات الغشائية9,10 ، تدهور البروتينات وكشفها11,12 ، ونمو المواد القائمة على السيليكا13،14،15. يجعل تباين التشتت الفريد SANS (TR-SANS) الذي تم حله بمرور الوقت مكملا مفيدا للقياسات الأخرى القائمة على التدفق المتوقف.

غالبا ما يتم تنفيذ طرق خلط التدفق المتوقف في تشتت الأشعة السينية بزاوية صغيرة (SAXS) 16،17،18،19،20،21 ، مطيافية مضان 22،23،24،25،26 ، وتشتت الضوء27،28،29،30 ، 31,32 تجربة لدراسة العمليات الحركية على المقاييس الزمنية بالمللي ثانية. يتمثل أحد الاختلافات المهمة بين SANS و SAXS في أن تشتت النيوترونات هو تقنية توصيف غير مدمرة ، وعلى هذا النحو ، يمكن استخدام SANS لقياس نفس العينة لساعات أو حتى أيام دون إلحاق ضرر إشعاعي مؤين بالعينة ، والذي يمكن أن يحدث أثناء تجارب تشتت الأشعة السينية عالية التدفق33. نظرا لأن قياسات SANS المتكررة لن تغير التركيب الكيميائي لجزيء المسبار أو العينة ، يمكن دراسة التطور الزمني دون تأثيرات التبييض الضوئي ، على سبيل المثال ، مما قد يعقد قياسات الحركية التي تعتمد على التألق23,24. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام SANS لقياس العينات عالية التركيز وغير الشفافة بصريا والتي غالبا ما يصعب توصيفها باستخدام التقنيات القائمة على الضوء مثل تشتت الضوء الديناميكي.

بالإضافة إلى توفير المعلومات الهيكلية على المقياس النانوي ، يمكن استخدام SANS لاستكشاف التركيب المحلي لهذه الهياكل من خلال الاختلاف في تباين كثافة طول تشتت النيوترونات. تختلف كثافة طول التشتت (SLD) للعناصر المختلفة بشكل عشوائي عبر الجدول الدوري وتختلف باختلاف نظائر العنصر نفسه. ومن الأمثلة الشائعة على ذلك الهيدروجين (1H أو H) والديوتيريوم (2H أو D) ، اللذان لهما أطوال تشتت نيوترونية مختلفة إلى حد كبير. لذلك ، يمكن تمييز المواد الغنية بالهيدروجين ، مثل المواد الخافضة للتوتر السطحي والدهون والبروتينات والحمض النووي الريبي والحمض النووي والبوليمرات الأخرى ، عن المذيبات المخففة باستخدام SANS دون تغيير الخصائص الفيزيائية للنظام بشكل كبير. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن تبادل H / D يمكن أن يؤثر على الكثافة والترابط الهيدروجيني ودرجات حرارة انتقال الطور في العينة. ومع ذلك ، فإن الحساسية الفريدة ل SANS للمواد الغنية بالهيدروجين مفيدة بشكل خاص في أبحاث المادة اللينة حيث يكون للعينات ذات الأهمية تباين وإشارة تشتت أقل في التقنيات القائمة على الأشعة السينية مثل SAXS. كما أن الاستبدال النظيري يجعل SANS أداة قوية لدراسة حركية التبادل الجزيئي في المواد الغنية بالهيدروجين ببساطة عن طريق خلط الجزيئات ذات العلامات H والجزيئات ذات العلامات D. الاستبدال النظيري مفيد بشكل خاص في الأنظمة التي تكون فيها الأصباغ الفلورية الضخمة أكبر من جزيئات الفاعل بالسطح أو الدهون ذات الأهمية ويمكن أن تؤثر على حركية التبادل34,35.

تعد قياسات SANS التي تم حلها بمرور الوقت مفيدة لأن الكثافة المقاسة هي دالة للوقت ومقياس الطول وتباين SLD. على هذا النحو ، يمكن تصميم تجارب TR-SANS لاستكشاف التغييرات المعتمدة على الوقت في التوزيعات المكانية وتركيبات العينات. أدت هذه المزايا الفريدة ل SANS إلى رؤى مهمة في العمليات الحركية في العديد من أنظمة المواد اللينة مثل المواد الخافضة للتوتر السطحي 36،37،38 ، المستحلبات 39،40،41 ، الدهون 34،42،43،44،45،46،47،48،49 ، 50 ، والبوليمرات 51،52،53،54،55،56،57،58،59،60،61،62. ركزت معظم دراسات TR-SANS على المقاييس الزمنية من دقائق إلى ساعات. ومع ذلك ، فإن العديد من العمليات الحركية ذات الأهمية تحدث على مقياس الوقت الثاني وهي ضرورية لفهم الآليات الأساسية. يتطلب التقاط هذه النقاط الزمنية المبكرة خلط الحلول بسرعة وقياسها في الموقع ، حيث تتم مزامنة الخلط مع جمع البيانات أثناء تشتت الضوء المتوقف 27،28،29،30،31،32 ، التألق 22،23،24،25،26 ، والأشعة السينية 16،17،18،19،20،21 تجربة. يصف هذا العمل استخدام بيئة عينة مصممة لخلط عينات سائلة متعددة بسرعة وحقن الخليط في خلية زجاجية كوارتز لقياسات TR-SANS. جهاز الخلط عبارة عن تكيف لجهاز rheoSANS الشعري الذي تم تطويره مؤخرا63 ويستخدم مضخات وصمامات حقن متعددة للتحكم في خلط العينات وأتمتة تنظيف الخلايا. من خلال توصيل مضخات الحقن بسلسلة من صمامات محدد التدفق ، يمكن خلط تيارات المدخل المتعددة وقياسها وشطفها وتجفيفها بشكل متكرر لتسهيل قياسات TR-SANS على مقياس وقت الثواني.

يفترض الإجراء الحالي أن العينات ذات الأهمية قد تم تحديدها وإعدادها. نحن نركز على إعداد الخلط في الموقع وطرق جمع بيانات TR-SANS. تم جمع بيانات تشتت النيوترونات على أداة VSANS في مركز NIST لأبحاث النيوترونات (NCNR) ؛ ومع ذلك ، يجب أن يكون الإجراء قابلا للتطبيق على أدوات SANS الأخرى. يجب على القراء المهتمين بتنفيذ بروتوكولات مماثلة على أدوات SANS الأخرى التشاور مع علماء الأدوات المحليين لتحديد التكوين الأمثل للأداة لزيادة تدفق النيوترونات إلى أقصى حد على مقياس الطول المطلوب والمقياس الزمني الأكثر صلة بالعمليات الحركية ذات الأهمية. تم جمع البيانات المقدمة هنا باستخدام تكوين "الحزمة البيضاء" عالي التدفق على VSANS لزيادة عدد النيوترونات إلى أقصى حد عند فقدان الدقة المكانية5. تم وضع عربات الكاشف لتغطية مجموعة من ناقلات التشتت (q) ، 0.005 Å-1 < q < 0.5 Å-1 ، المقابلة لمقاييس الطول من ≈130 نانومتر إلى ≈13 نانومتر. يتم تعريف متجه التشتت على أنه q = 4π / λ sin (θ / 2) حيث λ هو الطول الموجي النيوتروني ، و θ هي زاوية التشتت.

يتكون جهاز خلط التدفق المتوقف المستخدم في قياسات TR-SANS من مضخات متعددة ، ومحاقن شطف ، ومحاقن عينات ، ومحددات تدفق ، بالإضافة إلى خلاط ديناميكي ، وخلية عينة ، وحاوية عينات مختلطة ، كما هو موضح في الشكل 1. توجد جميع مسارات السوائل المختومة داخل حاوية مكيفة الهواء ، والتي تشمل المحاقن والصمامات وأنابيب التوصيل والخلاط الديناميكي وخلايا العينات. يتم استخدام مكيف هواء حراري قابل للبرمجة للتحكم في درجة حرارة العلبة في النطاق من 10 °C إلى 50 °C في غضون ±1 °C. لاحظ أنه تمت إزالة بعض عزل العلبة لإظهار أجزاء العمل في الجهاز. يتم وضع حاوية جهاز الخلط الرئيسية على مرحلة انتقالية على خط شعاع NG3 VSANS في NCNR. يتم ضبط موضع العلبة باستخدام مرحلة الترجمة لوضع خلية العينة في مسار الحزمة النيوترونية (خط أصفر متقطع).

Figure 1
الشكل 1: مثال على الإعداد للجمع بين خلط التدفق المتوقف وقياسات تشتت النيوترونات ذات الزاوية الصغيرة عند خط شعاع VSANS في مركز NIST لأبحاث النيوترونات. يحتوي الإعداد على أربع مضخات حقنة ، وحقنتين لشطف المذيبات وحقنتين لحقن العينة ، وأربعة صمامات اختيار المضخة ، وصمامين لاختيار الخلاط ، وخلاط ديناميكي ، وخلية كوارتز متدفقة ، وحاوية عينات مختلطة. تشتت النيوترونات الساقطة من العينة المختلطة الموجودة داخل خلية العينة. يتم استخدام حاوية معزولة مع نوافذ كوارتز ووحدة مكيفة بالحرارة للتحكم في العينة وجميع المعدات عند درجة حرارة ثابتة. يوضح الخط الأصفر المتقطع مسار حزمة النيوترونات. شريط المقياس = 10 سم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يتكون الجهاز الموضح في الشكل 1 من حقنتي عينة، وحقنتي شطف، وخلية عينة واحدة. يوضح الشكل 2 مخططات التدفق المقابلة للخطوات المختلفة للبروتوكول. يتم حقن الأحجام المطلوبة من العينتين المختلفتين في الخلاط وخلية العينة (الشكل 2 أ). بمجرد ملء خلية العينة ، يتم إغلاق صمام تبديل المدخل (ISV) وصمام تبديل المخرج (OSV) لعزل خلية العينة عن الخلاط الديناميكي ولمنع انتشار العينة مرة أخرى في الخلية أثناء جمع بيانات TR-SANS (الشكل 2B). قبل الخلاط الديناميكي ، يختلف طول أنبوب التوصيل من 10 سم إلى 1 متر ولا يؤثر على وقت تأخير الخلط. ومع ذلك ، ستؤثر وصلات الأنابيب بين الخلاط الديناميكي وخلية العينة على وقت تأخير الخلط وحجم حقن العينة المطلوب. يتم استخدام أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ المقطوعة مسبقا بقطر داخلي 0.04 بوصة (1 مم) وطول 100 مم لتوصيل الخلاط الديناميكي وصمامات محدد الخلاط (MSV1 و MSV2) و ISV و OSV. يتم استخدام الأنابيب المفلورة بقطر داخلي 1 مم وطول 115 مم لتوصيل ISV و OSV (أو مخرج الخلاط الديناميكي) بخلية العينة. يتضمن إجمالي حجم الفراغ الذي يؤثر على وقت تأخير الخلط حجم فراغ الخلاط (0.15 مل) ، والأنبوب بين مخرج الخلاط ومدخل خلية العينة (0.09 مل) ، وحجم خلية العينة (0.16 مل). في هذا المثال، حجم الفراغ الكلي يساوي 0.4 mL. أحجام الفراغ الداخلية للصمامات لا تذكر مقارنة بأحجام فراغ الأنبوب والخلاط وعينة الخلية. على سبيل المثال ، تحتوي صمامات اختيار الضغط المنخفض المستخدمة (قطر التجويف 0.75 مم) على أحجام فراغ تقريبية تبلغ 4 ميكرولتر ، بينما تحتوي صمامات اختيار الضغط العالي وصمامات التبديل (قطر التجويف 0.25 مم) على أحجام فراغ تقريبية تبلغ 0.5 ميكرولتر.

بعد اكتمال قياس TR-SANS ، يتم دفع العينة خارج الخلية بالمذيب ، ويتم ضخ مذيب الشطف بشكل متكرر عبر الخلية لإزالة العينة المتبقية وتنظيف خلية العينة (الشكل 2C). لاحظ أن محاقن الشطف متصلة بخزانات مذيب أكبر (مثل الماء والإيثانول) عبر قيم محدد المضخة لضمان توفر أحجام مذيبات كافية لتنظيف خلية العينة بين عمليات القياس. يتم وضع مصادر المذيبات ومصادر العينات وحاويات العينات المختلطة التي تحتوي على سوائل قابلة للاشتعال في حاوية منفصلة بدون معدات كهربائية للتخلص من جميع مصادر الاشتعال المحتملة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام أغطية زجاجات قفل البخار لتقليل الأبخرة القابلة للاشتعال وتبخر المذيبات. أخيرا ، يتم تجفيف خلية العينة بتيار غاز النيتروجين لإزالة مذيب الشطف المتبقي (الشكل 2 د). يتم تنظيم ضغط غاز النيتروجين الداخل إلى صمام محدد الخلاط إلى حوالي 2 بار (0.2 ميجا باسكال ، ضغط المقياس) باستخدام منظم ضغط يدوي موجود على أسطوانة غاز النيتروجين. بمجرد تنظيف خلية العينة وتجفيفها بشكل كاف ، يتم حقن عينة مختلطة حديثا في خلية العينة لدورة القياس التالية (تكرار الخلط والحقن الموضح في مخطط التدفق في الشكل 2 أ).

Figure 2
الشكل 2: مثال على مخطط التدفق باستخدام خلية عينة واحدة، وعينتين للخلط، ومذيبين شطف للتنظيف. أ: خلط العينة (أ) والعينة (ب) (الحمراء)، ثم تدفق العينة المختلطة (أرجوانية) إلى خلية العينة. (ب) أثناء جمع البيانات، يشير جهاز التدفق المتوقف إلى إغلاق صمامات تبديل بائعي البرامج المستقلين (ISV) وOSV لعزل خلية العينة ومنع الانتشار العكسي للعينة أثناء جمع البيانات. (ج) خطوات التنظيف حيث يتم شطف خلية العينة بمذيب شطف من SS1 (أخضر) بعد جمع البيانات. د: خطوة التجفيف حيث تجفف خلية العينة بغاز النيتروجين (البرتقالي). الاختصارات: ايندهوفن = صمام اختيار المضخة. MSV = صمام محدد الخلاط ؛ OSV = صمام تبديل المخرج ؛ ISV = صمام تبديل المدخل ؛ SS1 = مصدر المذيب 1 ؛ SSA = مصدر العينة A ؛ N2 = مصدر غاز النيتروجين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يوضح الشكل 3 مخططات التدفق لإصدار مختلف قليلا حيث يتم تكوين إعداد الخلط بخليتي عينة منفصلتين متصلتين بنفس صمامات التبديل (الشكل 3A). بينما يتم جمع بيانات TR-SANS في خلية العينة 1 ، يتم شطف خلية العينة 2 (الشكل 3B) وتجفيفها (الشكل 3C). عند اكتمال جمع البيانات لخلية العينة 1 ، يوجه صمام تبديل المدخل عينة مختلطة حديثا إلى خلية العينة 2 لجمع البيانات (الشكل 3D). بينما يتم جمع بيانات TR-SANS في خلية العينة 2 ، يتم شطف خلية العينة 1 وتجفيفها (الشكل 3E). هذه العملية المتناوبة المتوازية بين خليتين من خلايا العينة تقلل من الوقت بين حقن العينات اللاحقة وتزيد من استخدام وقت الحزمة النيوترونية.

Figure 3
الشكل 3: مثال على مخطط السريان باستخدام خليتين من عينتين، وعينتين مختلطتين، ومذيبين شطف للتنظيف. (أ) خلط العينة A (الزرقاء) والعينة B (الحمراء) ثم تدفق العينة المختلطة (الأرجواني) إلى خلية العينة 1. (ب) حالة جهاز التدفق المتوقف أثناء جمع البيانات في خلية العينة 1 بينما تشطف خلية العينة 2 بمذيب من SS1 (أخضر). (ج) حالة جهاز توقف التدفق أثناء جمع البيانات في خلية العينة 1 بينما تجفف خلية العينة 2 بغاز النيتروجين (البرتقالي). (د) بمجرد اكتمال جمع بيانات خلية العينة 1، تخلط على الفور عينة جديدة (أرجوانية) وتتدفق إلى خلية العينة 2. (ه) حالة جهاز التدفق المتوقف أثناء جمع البيانات في خلية العينة 2 بينما تشطف خلية العينة 1 بمذيب من SS1 (أخضر). أثناء قياس خلية عينة واحدة ، يتم تنظيف خلية العينة الأخرى وتجفيفها. تتناوب عملية قياس التدفق المتوقف بين خليتي عينة لتقليل الوقت بين حقن خلط العينات اللاحقة. الاختصارات: ايندهوفن = صمام اختيار المضخة. MSV = صمام محدد الخلاط ؛ OSV = صمام تبديل المخرج ؛ ISV = صمام تبديل المدخل ؛ SS1 = مصدر المذيب 1 ؛ SSA = مصدر العينة A ؛ N2 = مصدر غاز النيتروجين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يتم وصف بروتوكول خطوة بخطوة أدناه لتوصيل المضخات وخطوط الأنابيب ، وتحضير النظام ، وشطف وتجفيف خلية العينة ، وحقن العينة المختلطة. على الرغم من أن تكوين الخلية الواحدة موضح من أجل البساطة (الشكل 2) ، يمكن تعديل الإعداد المعياري المرن والبروتوكول والبرامج النصية بسهولة لتنفيذ المزيد من مضخات الحقن أو الصمامات أو الخلاطات أو تكوينات خلايا العينة ، مثل تكوين الخلية المكونة من عينتين كما هو موضح في الشكل 3. يوضح الشكل 4 بيانات معدل عدد النيوترونات الخام التمثيلية التي تم جمعها خلال دورات حقن الخلط والتنظيف ، بينما يتم عرض حركية تبادل الدهون المقاسة عند 3 درجات حرارة مختلفة وكثافة التشتت الطبيعية المستخرجة المقابلة لجزء الدهون المتبادلة في الشكل 5 والشكل 6 ، على التوالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. قم بإعداد وبدء نظام التدفق المتوقف.

  1. قم بتشغيل جميع مصادر طاقة المضخة والخلاطات الديناميكية باستخدام مفتاح الطاقة.
  2. ابدأ تشغيل جميع المضخات والصمامات في واجهة المستخدم الرسومية (GUI) للتحكم في نظام التدفق المتوقف عن طريق إدخال مسار تكوين الجهاز واستخدام الأوامر bus=qmixbus. Bus(), bus.open(), bus.start(), pump=qmixpump. Pump() وpump.enable() والصمام = ViciMultiposSelector() (انظر مثال رمز البدء المتاح في مستودع مفتوح المصدرعبر الإنترنت 64).
  3. قم بمعايرة المضخات قبل توصيل المحاقن باستخدام الأمر pump.calibrate().
  4. تأكد من بدء تشغيل الصمامات والانتقال إلى منفذ المحدد الصحيح عند الأمر باستخدام الأمر valve.setPort() و valve.getPort() .
  5. قم بتعيين نوع المحقنة المراد استخدامها لكل مضخة باستخدام الأمر pump.set_syringe_param (A ، B) ، حيث A هو القطر الداخلي لبرميل المحقنة (مم) ، و B هو أقصى مسافة شوط مكبس للحقنة (مم).
  6. قم بتوصيل محاقن العينة بمضخات الحقن.
    1. بعد التأكد من معايرة المضخات ، قم بربط براميل حقنة نظيفة بالوصلة الموجودة أعلى المضخة (رأس تثبيت المحقنة).
    2. عند استخدام المحاقن الزجاجية ، تأكد من فك رأس حامل المحقنة قبل توزيع حجم التعبئة ، بحيث لا تنكسر المحقنة الزجاجية بسبب القوة المفرطة من مكبس المحقنة.
    3. المسمار في مكبس حقنة إلى اتصال في الجزء السفلي من المضخة (حقنة جبل الذيل).
    4. بعد توصيل برميل المحقنة ومكبس المحقنة بالمضخة ، قم بتوزيع حجم التعبئة لنوع المحقنة باستخدام الأمر pump.empty() ، الذي يحرك مكبس المحقنة إلى أعلى برميل المحقنة.
    5. عند استخدام المحاقن الزجاجية ، شد رأس حامل المحقنة بعد توقف حركة المكبس.
  7. قم بتوصيل الأنبوب بمصادر العينة والمذيبات والمحاقن والصمامات والخلاطات وخلايا العينات وحاوية العينات المختلطة.
    1. قم بتوصيل أنبوب مضخة المحقنة بصمامات محدد المضخة.
    2. قم بتوصيل أنبوب صمام محدد المضخة بمصادر العينة.
    3. قم بتوصيل أنبوب صمام محدد المضخة بمصادر مذيب الشطف.
    4. قم بتوصيل أنبوب صمام محدد المضخة بأنبوب صمام محدد الخلاط.
    5. قم بتوصيل أنبوب صمام محدد الخلاط بمصدر غاز النيتروجين.
    6. قم بتوصيل أنبوب صمام محدد الخلاط بمداخل الخلاط.
    7. قم بتوصيل مخرج الخلاط بصمام مفتاح المدخل.
    8. قم بتوصيل صمام مفتاح المدخل بمدخل خلية العينة.
    9. قم بتوصيل مخرج خلية العينة بصمام مفتاح المخرج.
    10. قم بتوصيل صمام مفتاح المخرج بحاوية العينات المختلطة.
  8. حدد جميع توصيلات الأنابيب والصمامات التي تم إجراؤها (الخطوة 1.7) في واجهة المستخدم الرسومية للتحكم في نظام التدفق المتوقف عن طريق كتابة توصيلات رقم المنفذ المقابلة التي تم إجراؤها لكل صمام (انظر مثال رمز التحكم في مستودع مفتوح المصدرعبر الإنترنت 64).
  9. احسب حجم الفراغ للأنبوب بين مدخل الخلاط ومخرج خلية العينة ، والذي يحدد الحد الأدنى لكمية العينة اللازمة لملء خلية العينة لكل قياس.

2. تحميل العينة.

  1. اضبط حجم تعبئة العينة المطلوب وحجم تعبئة المذيبات في واجهة المستخدم الرسومية للتحكم في نظام التدفق المتوقف عن طريق كتابة الأرقام المطلوبة (انظر مثال رمز التحكم في مستودع مفتوح المصدرعبر الإنترنت 64).
  2. استخدم الأمر pump.aspirate () لسحب (نضح) العينة المطلوبة وأحجام المذيبات من مصادرها إلى محاقن العينة من خلال صمامات اختيار المضخة.
    ملاحظة: عند تحميل حقنة فارغة لأول مرة ، سيكون الهواء موجودا في الجزء العلوي من المحقنة التي يجب تطهيرها لتجهيز النظام بالعينة والمذيب في الخطوة 3.

3. رئيس النظام.

  1. استخدم الأمر pump.dispense( ) لدفع (توزيع) كل الهواء من المحاقن وخطوط الأنابيب والصمامات. تأكد من توزيع كمية كافية من السائل من كل حقنة لإزالة كل الهواء تماما من المحاقن والأنابيب والصمامات. إذا كانت فقاعات الهواء مرئية داخل أي أنبوب ، فاستمر في توزيع المذيب أو العينة حتى تتم إزالة الفقاعات.
  2. بمجرد تطهير الهواء من النظام ، قم بإجراء حقن عينة واحدة على الأقل وشطفها (بدون جمع بيانات تشتت النيوترونات).
    1. انقر لتحديد الخلية المسماة بدء تجربة الخلط في واجهة المستخدم الرسومية لعنصر التحكم.
    2. مع تحديد هذه الخلية بنشاط ، انقر فوق الزر "تشغيل" (مثلث قائم الأيمن) الموجود أعلى واجهة المستخدم الرسومية للتحكم ، أو اضغط على مفتاحي Shift و Enter معا على لوحة المفاتيح.
    3. افحص خلية العينة بصريا للتأكد من عدم وجود فقاعات هواء.
      1. في حالة وجود فقاعات هواء ، كرر خطوتي البروتوكول 3.1 و 3.2 لمزيد من تطهير أي هواء من خطوط الأنابيب.
      2. إذا لم تكن فقاعات الهواء موجودة في خلية العينة، فانتقل إلى الخطوة 4 لتحديد خطوات بروتوكول التجربة المتبقية.

4. حدد بروتوكول خلط التدفق المتوقف في البرنامج النصي للبرنامج (انظر مثال الكود في مستودع مفتوح المصدر عبر الإنترنت64).

  1. أدخل نقطة ضبط درجة الحرارة لوحدة مكيف الهواء القابلة للبرمجة (AC) التي تتحكم في درجة حرارة العلبة المعزولة المحيطة بجهاز التدفق المتوقف.
    1. أثناء الضغط على زر النجمة في وحدة التحكم في التيار المتردد ، اضغط على السهمين لأعلى ولأسفل لتغيير درجة حرارة نقطة الضبط. بدلا من ذلك ، اكتب نقطة ضبط درجة الحرارة المطلوبة في واجهة المستخدم الرسومية للتحكم وانقر فوق تشغيل.
    2. انتظر لمدة 15-30 دقيقة للسماح للحاوية الداخلية بالتوازن عند درجة الحرارة المطلوبة قبل بدء التجارب الحركية.
      ملاحظة: يتراوح نطاق درجة الحرارة الذي يمكن الوصول إليه حاليا بين 10 درجات مئوية و 50 درجة مئوية ، واستقرار درجة الحرارة ± 1 درجة مئوية.
  2. أدخل جميع خطوات تسلسل الشطف عن طريق كتابة وحدات التخزين المناسبة ومعدلات التدفق والأوقات وعدد مرات التكرار في واجهة المستخدم الرسومية لعنصر التحكم.
    1. حدد حجم كل عينة سيتم حقنها ، والتي تحدد معدل التدفق الكلي (Q).
    2. حدد حجم كل مذيب يتم حقنه أثناء إجراء الشطف.
    3. حدد وقت التجفيف بين كل خطوة فرعية للشطف (ر جافة).
    4. حدد عدد خطوات الشطف الفرعية.
    5. حدد المذيبات المختلفة لخطوات الشطف اللاحقة.
    6. حدد عدد مرات تكرار الشطف التي يجب إجراؤها بعد كل قياس (nشطف).
    7. حدد الوقت اللازم لتجفيف خلية العينة والخلاط بالكامل ، مع توفير خلية عينة نظيفة لحقن العينة اللاحقة (tdry_final).
  3. حدد جميع خطوات تسلسل حقن العينة عن طريق كتابة الأحجام المناسبة ومعدلات التدفق والأوقات في واجهة المستخدم الرسومية للتحكم في نظام التدفق المتوقف.
    1. تحديد حجم كل عينة المراد حقنها ومعدل التدفق.
    2. احسب وقت التأخير(تأخير t) من حجم الفراغ (V void) ومعدل التدفق الإجمالي (tdelay = Vvoid / Q).
      ملاحظة: وقت التأخير هو الوقت اللازم لملء خلية العينة بالعينة المختلطة.
    3. حدد وقت الاستحواذ المطلوب لبيانات TR-SANS بحيث تحدث العملية الحركية ذات الاهتمام بالكامل (tscatt).
    4. اضبط وقت الانتظار بين نهاية تجربة التشتت وبداية دورات الشطف (twait).
      ملاحظة: يجب أن يكون وقت الانتظار هذا 100 ثانية على الأقل إذا كان سيتم قياس انتقال النيوترون للعينة قبل شطفها من الخلية. هناك حاجة إلى نقل العينة أثناء معالجة البيانات لتقليل البيانات إلى الكثافة المطلقة.
    5. حدد عدد دورات الحقن التي يجب إجراؤها مع تسلسلات الشطف التي يتم تشغيلها بين كل حقنة محددة في الخطوة 4.2 (دورة n).
  4. احسب الوقت الإجمالي لدورة جمع بيانات التدفق المتوقف (t cycle) باستخدام المعادلة (1).
    دورة t= n شطف × (تأخير t + tجاف) + t تأخير dry_final+ t تأخير + t scatt (1)
    حيث nشطف = عدد مرات الشطف (الخطوة 4.2.6) ؛ tdelay = وقت تأخير جهاز التدفق المتوقف (الخطوة 4.3.2) ؛ tdry = وقت التجفيف بين كل خطوة فرعية للشطف (الخطوة 4.2.3) ؛ tdry_final = الوقت اللازم لتجفيف خلية العينة والخلاط بالكامل (الخطوة 4.2.7) ؛ tscatt = وقت الحصول على بيانات TR-SANS المطلوب (الخطوة 4.3.3)

5. تحديد معلمات تشتت النيوترونات ذات الزاوية الصغيرة في واجهة المستخدم الرسومية للتحكم في أداة SANS.

  1. حدد مقاييس الطول ونطاق q محل الاهتمام لكل عينة.
  2. حدد تكوين الجهاز لتغطية نطاق الاهتمام q المطلوب ، مع زيادة تدفق النيوترونات في العينة.
  3. اضبط إجمالي وقت الحصول على بيانات VSANS في واجهة المستخدم الرسومية للتحكم في أداة SANS على وقت الدورة المحسوب في الخطوة 4.4 (وقت الحصول على بيانات تشتت النيوترونات =دورة t).
  4. اضبط وقت قياس إرسال العينة على 100 ثانية في واجهة المستخدم الرسومية للتحكم في أداة SANS.
  5. باستخدام واجهة المستخدم الرسومية للتحكم في أداة SANS ، قم بتشغيل جمع بيانات وضع الحدث عن طريق كتابة GenerateEventModeData true في سطر الأوامر.

6. اجمع قياسات التشتت القياسية لتقليل البيانات قبل بدء تجربة التدفق المتوقف لمعالجة بيانات TR-SANS.

  1. قياس تشتت الخلفية.
    1. تأكد من إغلاق غالق الجهاز المحلي.
    2. قم بتوصيل عينة الحزمة المحظورة بالجزء الخلفي من فتحة العينة، وقم بتأمين بيئة الجهاز المحلية، وافتح غالق الجهاز المحلي.
    3. حدد وقت الحصول على بيانات تشتت الحزمة المحظورة في البرنامج ، واجمع بيانات تشتت الحزمة المحظورة ، مع احتساب نفس المدة مثل أطول وقت للحصول على بيانات التشتت (tscatt).
    4. بمجرد اكتمال جمع البيانات ، أغلق مصراع الجهاز ، وقم بإزالة عينة الحزمة المسدودة من فتحة العينة.
  2. قياس تشتت الخلية الفارغة.
    1. تأكد من شطف خلية العينة وتجفيفها جيدا.
    2. افتح غالق الأداة المحلية.
    3. اجمع قياس انتقال الخلية الفارغة لمدة 100 ثانية.
    4. اجمع قياس تشتت الخلية الفارغة ، مع احتساب أطول وقت اكتساب على الأقل (tscatt).

7. ابدأ تجربة التدفق المتوقف.

  1. بدء جمع بيانات تشتت VSANS في وضع الحدث .
    1. تأكد من أن منطقة الجهاز المحلية آمنة ثم افتح غالق شعاع الجهاز المحلي.
    2. ابدأ في جمع بيانات SANS باستخدام برنامج التحكم في أداة SANS على كمبيوتر الجهاز عن طريق سحب وإسقاط عمليات التشغيل المطلوبة في قائمة انتظار الجهاز.
      ملاحظة: لضمان قياس النقاط الزمنية الأولى، ابدأ في جمع البيانات قبل بدء تجربة خلط التدفق المتوقف. ستتم معالجة البيانات لاحقا في خطوة لاحقة لحساب وقت التأخير (tdelay).
  2. ابدأ تجربة خلط التدفق المتوقف في واجهة المستخدم الرسومية للتحكم .
    1. حدد خلية دفتر الملاحظات المسماة بدء تجربة الخلط في واجهة المستخدم الرسومية للتحكم في نظام التدفق المتوقف.
    2. مع تحديد هذه الخلية بنشاط ، انقر فوق الزر "تشغيل" (مثلث قائم الأيمن) الموجود أعلى برنامج التحكم في جهاز التدفق المتوقف ، أو اضغط على مفتاحي Shift و Enter معا على لوحة المفاتيح.
    3. تأكد من بدء تشغيل بروتوكول خلط التدفق المتوقف المحدد في القسم 4.
    4. أضف قياس الإرسال 100 ثانية إلى قائمة انتظار أجهزة VSANS بعد تشغيل التشتت باستخدام واجهة المستخدم الرسومية للتحكم في أداة SANS.
    5. أضف تشغيل قياس تشتت واحد وتشغيل قياس إرسال واحد إلى قائمة انتظار الجهاز لكل دورة خلط متبقية بالتدفق المتوقف (دورة n - 1، الخطوة 4.3.5) في واجهة المستخدم الرسومية للتحكم في جهاز SANS.

8. معالجة البيانات وتقليلها لإزالة جميع الخلفيات ، وتصحيح حساسية الكاشف ، وتصحيح نقل العينات.

  1. قم بتنزيل ملفات البيانات المبعثرة وملفات الأحداث المقترنة من الخادم.
    ملاحظة: سيتم إنشاء ملفات أحداث كاشف منفصلة بعد كل قياس VSANS ، ملف حدث واحد لكل حامل كاشف نشط (على سبيل المثال ، كاشف أمامي و / أو متوسط و / أو خلفي).
  2. قم بتجميع البيانات المبعثرة إلى حاويات الوقت المطلوبة باستخدام الأمر events=Rebin(filename) متبوعا بالأمر e vents.do_rebinning(timebins) ، حيث يتوافق اسم ملف الإدخال مع اسم ملف بيانات SANS المطلوب ، وtimebins هي قائمة بحدود حاوية الوقت المطلوبة بالثواني.
    ملاحظة: إذا تم إدخال مفاتيح توقيت الإدخال كرقم واحد بدلا من قائمة، تجميع البيانات في عدد N من الحاويات ذات العروض الزمنية المتساوية، حيث N هي حاويات توقيت الإدخال (انظر البرامج النصية التي يوفرها خط الإرسال والمستودع مفتوح المصدر المتاح عبر الإنترنت64).
  3. تقليل بيانات التشتت المعبأة باستخدام البرنامج المقدم من خط الشعاع65.

9. تحليل بيانات TR-SANS.

  1. احسب وقت عملية الاهتمام (عملية t) من أوقات القياس باستخدام المعادلة (2).
    عملية t = ti - tstop +t تأخير (2)
    حيث ti هي صناديق وقت القياس التي تبدأ بعد توقف التدفق ، و tstop هو وقت القياس فور توقف التدفق ، و tdelay هو وقت التأخير.
  2. ارسم الشدة المعتمدة على q I (q) كدالة لوقت العملية باستخدام حاويات الوقت المحددة في الخطوة 8.2وعملية t المحسوبة في الخطوة 9.1.
    ملاحظة: يتم تقييد أقرب وقت معالجة يمكن الوصول إليه بسببتأخير t. لقياس النقاط الزمنية السابقة للعملية ، قم بزيادة معدل التدفق الإجمالي (Q) أو تقليل إجمالي حجم الفراغ (V void).
  3. استخراج المعلمات الحركية ذات الأهمية من التغيير في I(q) كدالة لوقت العملية.

10. إنهاء التجربة.

  1. قم بإيقاف تشغيل الحزمة النيوترونية عن طريق إغلاق مصراع الجهاز المحلي.
  2. قم بإجراء فحص الإشعاع باستخدام جهاز مراقبة الإشعاع الذي يوفره خط الشعاع قبل فصل أي أجزاء أو أنابيب أو تفريغ أي عينات أو حاويات عينات مختلطة.
  3. نقل المحاقن والأنابيب وحاوية العينات المختلطة إلى قسم الفيزياء الصحية.
  4. املأ نماذج الفيزياء الصحية وانتظر التقييم من قبل موظفي الفيزياء الصحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تقيس بيانات النيوترونات التمثيلية الموضحة هنا حركية تبادل الدهون في وجود ميثيل β سيكلودكسترين (mβCD) ، وهي مادة مضافة تحفز تبادل الدهون بين الحويصلات بسعر الصرف (ke) 66,67. أظهرت الدراسات الفلورية السابقة أن ke يعتمد على تركيز mβCD ، وأن عمر النصف لعملية التبادل في حدود68 دقيقة. تستخدم التجارب الحالية TR-SANS ذات التدفق المتوقف لقياس التبادل الدهني المحفز mβCD بين الحويصلات على مقياس الثواني. تم إعداد مجموعتين من الحويصلات الدهنية المتميزة نظائريا. تم تحضير مجموعة حويصلة واحدة مع دهون ثنائي ميريستويل فوسفاتيديل كولين المهدرجة الذيل (DMPC) (حويصلات الدهون H في الشكل 5) ، وتم تحضير مجموعة الحويصلات الأخرى باستخدام دهون DMPC (DMPC-d54) (حويصلات دهنية D في الشكل 5). تمت إضافة جزء مول من 0.05 (5 مول٪) من دهون ثنائي ميريسوتيل فوسفاتيديل جليركول (DMPG) المشحونة إلى كل من مساحيق الدهون الجافة DMPC و DMPC-d54 لتعزيز تكوين الحويصلة أحادية الصفيحة69.

تم تحضير محاليل حويصلة H وحويصلة D منفصلة عن طريق ترطيب الأغشية الدهنية المعنية في مذيب يحتوي على 45٪ من حجم الماء الثقيل (D 2 O) و 55٪ من الماء الحجمي (H2O). تم حساب تركيبة مذيب D 2 O/ H2O بحيث تتطابق كثافة طول تشتت النيوترونات (ρ) للمذيب مع خليط عشوائي من H-lipids و D-lipids (Δρ = ρlipid- ρsolvent = 0). وبعبارة أخرى، فإن حويصلة H/D المختلطة عشوائيا ستكون "غير مرئية" للنيوترونات وتولد تشتتا نيوترونيا متماسكا صفريا. تم تحضير محاليل الحويصلة أحادية الصفيحة عن طريق تجميد وإذابة المحاليل خمس مرات ثم بثق المحاليل الفردية من خلال مرشح بولي كربونات مع مسام قطرها 100 نانومتر. تم بثق محاليل الحويصلة ذهابا وإيابا بين حقنتين والمرشح لما مجموعه 31 مرة عند 30 درجة مئوية. بعد ذلك ، تمت إضافة كمية صغيرة من محلول مخزون mβCD المركز المحضر في نفس خليط المذيبات D 2 O /H2O إلى محاليل الحويصلة. كان تركيز الدهون النهائي 14 مليمول / لتر (mM) وكان تركيز mβCD 30 mM. تمت موازنة محاليل الحويصلات الفردية لمدة 30 دقيقة على الأقل مع mβCD المضافة قبل تحميل المحاليل في محاقن العينة في جهاز خلط التدفق المتوقف.

يوضح الشكل 4 أ مثالا على معدلات عدد النيوترونات المقاسة خلال دورات الحقن المتعددة. تتكون كل دورة من 9 خطوات شطف وخطوة تجفيف واحدة وخطوة حقن عينة واحدة. يتم تقديم معدلات العد المقاسة فقط على حامل الكاشف الأوسط في أداة VSANS من أجل الوضوح. تم العثور على اتجاهات مماثلة على عربة الكاشف الأمامية ، والتي تتوافق مع البيانات التي تم جمعها بزوايا تشتت أكبر أو قيم q أعلى. ارتفع معدل العد مع كل حقن مذيب شطف (المذيب S1 والمذيب S2) وعاد إلى تعداد خط الأساس للخلية الفارغة عندما تم دفع المذيب خارج الخلية بغاز النيتروجين وتجفيفه. كان شطف الخلية النهائي باستخدام S2 ، وهو الإيثانول في هذا المثال ، وتم تجفيف الخلية مرة أخيرة بغاز النيتروجين لمدة 3 دقائق قبل حقن العينة. بعد فترة وجيزة من حقن العينة في الخلية ، ارتفع معدل عدد النيوترونات ، وتم جمع البيانات بشكل مستمر لمدة 5 دقائق. كانت العينة التمثيلية التي تم حقنها في بيانات المثال في الشكل 4 أ عبارة عن خلفية عازلة للملح. تعكس التقلبات في الكثافة المقاسة بمرور الوقت الاختلافات في معدل عدد النيوترونات الخلفية ولا تعكس تغيرا في متوسط تكوين العينة. تكررت الدورة الكاملة لعينة الشطف والتجفيف والخلط والحقن وقتا إضافيا في المثال الوارد في الشكل 4 أ ، حيث استمرت كل دورة لمدة 15 دقيقة.

تم خلط محاليل الحويصلات الدهنية الفردية ذات العلامات H و D في وقتالخلط t وتدفقت على الفور إلى خلية العينة. ارتفع معدل عدد النيوترونات المقاس ثم وصل إلى أقصى قيمة عندما تم ملء خلية العينة عندملء t ، كما هو موضح في الشكل 4B. يسمى الوقت المنقضي المطلوب لملء خلية العينة وقت التأخير t تأخير ويعطى بواسطة tdelay = t fill-t mix. إذا كان حجم الفراغ (الفراغ V) بين الخلاط وخلية العينة معروفا وكان معدل التدفق الإجمالي (Q) معروفا ، فيمكن أيضا حسابتأخير t على أنه tdelay = Vvoid / Q (انظر خطوة البروتوكول 4.3.2) ، وهو أيضا متوسط وقت الإقامة لعينة السائل لدخول الخلاط ومغادرة خلية العينة. بعد الوصول إلىملء t ، استمر التدفق بمعدل تدفق ثابت للتأكد من أن الخلية قد امتلأت ووصلت إلى حالة مستقرة. ثم توقف التدفق على الفور عندنقطة توقف. ظل متوسط معدل عدد النيوترونات ثابتا كدالة لوقت القياس بين tfill و tstop لأن معدل التدفق عبر خلية العينة كان ثابتا ، وبالتالي ، كانت العينة داخل مسار الحزمة النيوترونية في حالة مستقرة. بمعنى آخر ، تتوافق البيانات المقاسة عند tstop مع العينة التي تم خلطها وتطويرها بواسطة tdelay = tfill-t mix = Vvoid / Q. أوقات القياسالمثبتة التي تم جمعها مباشرة بعدt stop هي البيانات الحركية الرئيسية ذات الأهمية.

في الشكل 4C ، يتم رسم عدد النيوترونات من عينة الحويصلات الدهنية المختلطة عند ثلاث درجات حرارة مختلفة كدالة لمقياس وقت العملية المصححة (عملية t) ، وهو وقت العملية الذي تم تصحيحه لفترة تدفق الحالة المستقرة ووقت التأخير. تم حساب مقياس وقت العملية بواسطة t process = t i- t stop +t delay ، أو ما يعادلها ، tprocess = ti- t stop + t fill- tmix. تم جمع بيانات SANS بشكل مستمر في الشكل 4 في ما يسمى وضع الحدث. أثناء جمع بيانات نمط الحدث ، يتم تسجيل كل حدث نيوتروني مكتشف بطابع زمني فريد وموقعه x و y على كاشف النيوترونات ثنائي الأبعاد. ثم تتم معالجة بيانات وضع الحدث لاحقا في صناديق الوقت المطلوبة (ti) في الشكل 4B.

تمت إعادة بناء بيانات وضع الحدث ضمن النافذة الزمنية للعملية التي يمكن الوصول إليها (أي تشتت النيوترونات التي تم جمعها عند كل ti بعدتوقف t في الشكل 4B) في صورة كاشف ثنائية الأبعاد (2D) لتلك الحاوية الزمنية باستخدام البروتوكولات والبرامج النصية المتاحة في مستودع مفتوح المصدر عبر الإنترنت64. ثم تمت معالجة كل صورة كاشف 2D باستخدام إجراءات تقليل البيانات لطرح المصادر المختلفة للخلفية ، وتصحيح نقل العينة وكفاءة الكاشف ، ودمج بيانات الكاشف 2D في مخططات الكثافة (I) مقابل متجه التشتت (q)65. تم تجميع البيانات الواردة في الشكل 5 في صناديق زمنية متساوية (3 ثوان) وهي تمثل المعلومات المعتمدة على مقياس الوقت والطول التي يمكن الحصول عليها من قياس TR-SANS. على غرار إجمالي معدل العد الخام الموضح في الشكل 4B ، تقل الكثافة المعتمدة على q I (q) بمرور الوقت حيث تتبادل الليبيدات في الوريقات الخارجية وتختلط عشوائيا بين الحويصلات المختلفة.

يتم عرض البيانات في الشكل 5 لحركية تبادل الدهون المقاسة عند 3 درجات حرارة مختلفة. تعرض كل قطعة بيانات تم جمعها لأول 110 دقيقة بعد الخلط. تنخفض الشدة المقاسة بترتيب من حيث الحجم عند أدنى قيم q عند 36 درجة مئوية و 30 درجة مئوية ، والتي تتوافق مع مرحلة السائل الدهني. وفي الوقت نفسه ، تتغير بيانات الكثافة المتناثرة بشكل أبطأ بكثير مع مرور الوقت عند 20 درجة مئوية ، مما يشير إلى أن حركية تبادل الوريقات الخارجية أبطأ بكثير في مرحلة هلام الدهون.

ترتبط شدة التشتت المقاسة ، I (q) ، بتباين SLD ك Equation 1، حيث Δρ هو فرق SLD بين الحويصلة والمذيب المحيط. يرتبط متوسط تباين SLD هذا ارتباطا مباشرا بالأعداد النسبية للدهون H والدهون D في الحويصلة في أي وقت. على هذا النحو ، يمكن تطبيع شدة التشتت المقاسة في وقت معين لتحديد جزء من مجموعة الدهون التي تم تبادلها. يتم تحقيق هذا التطبيع من خلال جمع قياسين إضافيين ، بما في ذلك: (1) الشدة المقاسة I (0) في الوقت t = 0 ، عندما لا يكون هناك تبادل دهني بين الحويصلات ، و (2) الشدة المقاسة I (∞) في الوقت t = ∞ ، عندما يتم تبادل جميع الدهون وتوازن السكان. يتم رسم معدل العد الطبيعي ، 42 ، Equation 2 كدالة لوقت العملية لدرجات الحرارة المختلفة في الشكل 6. في هذا المثال ، I (t) هي الشدة المتكاملة q في وقت المعالجة t (الكثافة المطروحة في الخلفية المدمجة كدالة ل q) ، I (∞) هي الكثافة المتكاملة q في وقت لا نهائي بعد تبادل جميع الدهون (والتي يجب أن تكون مشابهة لتشتت خلفية المذيب) ، و I (0) هي q المتكاملة شدة في الوقت t = 0 (مع عدم وجود تبادل الدهون). تم قياس I (0) لعينة مختلطة تحت درجة حرارة انتقال الطور عند 20 درجة مئوية حيث كان التبادل بطيئا ، وتم قياس I (∞) في عينة منفصلة تمت موازنتها لأكثر من 36 ساعة عند 40 درجة مئوية وتم تبادلها بالكامل H-lipids و D-lipids.

يجب أن يضمحل معدل العد الطبيعي من R (t) = 1 في وقت المعالجة t = 0 ، إلى R (t) = 0 عند t = ∞ ، ويرتبط ارتباطا مباشرا بتباين SLD في العينة وبالتالي مدى تبادل الدهون27،28،29،30،31،32،33،34،35 . لاحظ أن أقدم بيانات R (t) المقاسة لا تبدأ عند R (t) = 1 عند 30 درجة مئوية و 36 درجة مئوية ، مما يشير إلى حدوث كمية كبيرة من تبادل الدهون خلال أول 3 ثوان بعد الخلط ، والتي لم يكن الوصول إليها تجريبيا بسبب وقت التأخير(تأخير t = 2.4 ثانية) لبروتوكول خلط التدفق المتوقف المستخدم. وفي الوقت نفسه ، ظل قياس R (t) عند 20 درجة مئوية ثابتا تقريبا خلال الدقائق الأولى (2-3). بالنسبة لحركية تبادل الدهون المقاسة عند 30 درجة مئوية و 36 درجة مئوية ، اضمحلت R (t) بسرعة إلى ≈0.5 في غضون 100 ثانية ، مما يشير إلى أن دهون الوريقات الخارجية قد تبادلت تماما واتنمت في غضون دقائق. وفقا لذلك ، أصبح التقاط تبادل الدهون المحفز mβCD ممكنا باستخدام SANS المتوقف وسيكون من الصعب التقاطه باستخدام خلط الماصة اليدوي. سيتطلب التقاط نقاط زمنية مبكرة للعملية (t < 3 s) نوعا مختلفا من الخلاط مع حجم فراغ أصغر ، وأحجام فراغ أصغر للأنابيب ، ومعدلات تدفق إجمالية أعلى لتقليل وقت التأخير.

استمر R (t) في الاضمحلال في أوقات أطول حيث تقلب الدهون بين الوريقات الداخلية والخارجية. يمكن جمع بيانات TR-SANS لعملية التقليب الأبطأ (t > 5 دقائق) بعينات منفصلة ممزوجة يدويا وتحميلها في خلايا عينة SANS القياسية ، حيث تستغرق طريقة خلط الماصة اليدوية حوالي 5 دقائق. وبالمثل ، كان تبادل الدهون عند 20 درجة مئوية في مرحلة هلام الدهون بطيئا بما يكفي ليتم خلطه وقياسه بشكل منفصل ، ولم يكن هذا القياس بحاجة بالضرورة إلى دراسته باستخدام طريقة خلط التدفق المتوقف. تكون قياسات العمليات الحركية على المقاييس الزمنية من عدة دقائق إلى ساعات أكثر كفاءة عندما يتم خلط العينات عن طريق خلط الماصة يدويا. ومع ذلك ، فإن العمليات الحركية على نطاقات زمنية أقل من دقائق ستتطلب هذا الخلط المتوقف وإجراءات قياس TR-SANS.

Figure 4
الشكل 4: بيانات معدل عدد النيوترونات الخام التمثيلية التي تم جمعها خلال دورات حقن الخلط والتنظيف. (أ) مثال على معدل عد النيوترونات (الكاشف الأوسط) كدالة للزمن أثناء تتابعات الشطف المتكررة، وتتابع التجفيف، وتتابع حقن العينات المختلطة على مدار دورات متعددة. كانت العينة في (أ) عبارة عن خلفية عازلة ملحية ، وتعكس التغيرات في شدتها بمرور الوقت الاختلافات في معدل عد الخلفية ، وليس تغييرا في العينة. (ب) معدل عدد النيوترونات الطبيعي بالشاشة كدالة لوقت التجربة بعد حقن الحويصلات المختلطة من H-lipid و D-lipid عند 30 درجة مئوية. تشير الخطوط المتقطعة الرأسية إلى وقت بدء الخلط (tmix) ووقت التعبئة (tfill) ووقت توقف التدفق (tstop) ومنطقة تجميع الوقت (ti). يرجع الاضمحلال في معدل العد بعدt stop إلى فقدان التباين في العينة حيث يتم تبادل الدهون بين الحويصلات. (ج) مراقبة معدلات عد النيوترونات الطبيعية كدالة لوقت عملية التبادل لأول 100 ثانية من التجربة عند (أزرق) 20 درجة مئوية و (أخضر) 30 درجة مئوية و (أحمر) 36 درجة مئوية. تتم معالجة بيانات وضع الحدث في صناديق 1 s. الاختصارات: S1 = مذيب 1 ؛ S2 = مذيب 2 ؛ tmix = وقت التجربة الذي يتم فيه خلط محاليل العينة ؛ tfill = وقت التجربة الذي يتم فيه ملء خلية العينة ؛ tstop = وقت التجربة الذي يتوقف عنده التدفق ؛ عملية t = وقت العملية الحركية المحسوب للفائدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: رسم توضيحي للتبادل المحفز للطبقة الخارجية للحويصلات الدهنية والتغيرات المقابلة في شدة التشتت (I) كدالة لمتجه التشتت (q) عند درجات حرارة مختلفة. رسم تخطيطي يوضح تبادل الدهون بين حويصلات الدهون H و D-lipid بعد (A) الخلط الأولي عند t = 0 و (B) تبادل الطبقة الخارجية المحفزة بواسطة ميثيل β سيكلودكسترين (mβCD). انخفاض شدة تشتت النيوترونات كدالة لمتجه موجة التشتت q. تكررت تجارب خلط التدفق المتوقف وقياسات VSANS عند (C) 36 درجة مئوية و (D) 30 درجة مئوية و (E) 20 درجة مئوية. تم تجميع البيانات المقدمة في فترات 3 ثوان خلال أول 10 دقائق بعد الخلط عند كل درجة حرارة محددة. أشرطة الخطأ هي عدم اليقين المنتشر من إحصائيات العد وتمثل انحرافا معياريا واحدا. الاختصارات: ke = معدل ثابت لتبادل الدهون بين الحويصلات ؛ mβCD = ميثيل β سيكلودكسترين ؛ kf = معدل ثابت لتبادل الدهون بين الوريقات ، ويشار إليه أيضا باسم التقليب الدهني ؛ l (q) = شدة SANS المقاسة بوحدات cm-1 ؛ q = متجه التشتت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: شدة متفرقة طبيعية تقابل جزء الليبيدات المتبادلة، والتي يمكن نمذجتها لاستخراج ثوابت المعدل لعمليات الحركة محل الاهتمام . (أ) تبادل الدهون بين الوريقة الخارجية للحويصلات التي تحدث في نطاقات زمنية تتراوح بين 3 ثوان و600 ثانية مقاسة عند (أزرق) 20 درجة مئوية، (أسود) 30 درجة مئوية، (أحمر) 36 درجة مئوية. يتم تكبير الجزء الداخلي في الشكل على أول 60 ثانية من العملية الحركية. أشرطة الخطأ هي عدم اليقين المنتشر من التكامل العددي لشدة التشتت وتمثل انحرافا معياريا واحدا. الاختصارات: R (t) = شدة مبعثرة طبيعية ؛ عملية t = وقت العملية المصححة للفائدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف الإجراء الحالي جهاز الخلط وخطوات إجراء قياسات TR-SANS ذات التدفق المتوقف. تم تحسين الجهاز والبروتوكول لعينات السوائل منخفضة اللزوجة حيث تتراوح المقاييس الزمنية ذات الأهمية من ≈1 ثانية إلى 5 دقائق. بالنسبة للمقاييس الزمنية التي تزيد عن 5 دقائق ، قد يكون خلط العينات يدويا وتحميلها في خلايا التشتت القياسية أسهل ومرغوبا فيه ، خاصة بالنسبة للعينات عالية اللزوجة أو المواد الهلامية أو المعاجين. يتطلب الوصول إلى جداول زمنية أقل من 1 ثانية جهاز خلط مختلفا ، وأحجام فراغ إجمالية أقل ، ومعدلات تدفق إجمالية أعلى لتقليل وقت التأخير. من المهم أيضا ملاحظة أن دراسة العمليات الحركية على هذه المقاييس الزمنية القصيرة ستتطلب على الأرجح حقن عينات متكررة لتجميع إحصائيات عد التشتت الكافية على مقياس زمني بالمللي ثانية باستخدام TR-SANS. إذا كانت أحجام العينات الإجمالية محدودة ، فقد يكون من المستحسن استخدام تقنية تدفق أعلى ، مثل تشتت الضوء أو تشتت الأشعة السينية ، الأمر الذي يتطلب عددا أقل من حقن العينات أو حجم عينة أقل لكل حقنة ، على افتراض وجود تباين تشتت كاف مع تشتت الضوء أو الأشعة السينية.

يخلق نهج SANS المعياري للتدفق المتوقف العديد من المزايا والعيوب الرئيسية مقارنة بأدوات التدفق المتوقف المتاحة تجاريا والتي تم تحسينها لتجارب تشتت النيوترونات. تشمل المزايا الرئيسية (1) قياسات TR-SANS بالتناوب بين خلايا العينة المختلفة أثناء فترات الشطف لزيادة استخدام وقت الحزمة النيوترونية إلى أقصى حد ، (2) تكييف عدد المحاقن وأحجام المحاقن وأنواع الخلاطات لخلط العينات الثلاثية أو غيرها من متطلبات خلط العينات الأكثر تعقيدا ، و (3) السماح بفترات قياس أطول عن طريق عزل خلية العينة والقضاء على الانتشار الخلفي في نطاقات زمنية أطول (>10 دقائق). على الرغم من عدم تنفيذها هنا ، فإن نمطية تصميم خلية الخلط ستسمح أيضا بجمع البيانات في وقت واحد باستخدام طرق قياس متعددة ، مثل تمشيط قياسات SANS و UV-Vis والتألق70. هناك عيبان رئيسيان لهذا الإعداد المعياري يتضمنان (1) أوقات تأخير خلط أطول نسبيا (1 ثانية إلى 3 ثوان) مقارنة بالأنظمة الأخرى التي يمكن أن توفر أوقات تأخير من 1 مللي ثانية إلى 100 مللي ثانية ، و (2) نطاق درجة حرارة تشغيل أصغر (10 درجة مئوية إلى 50 درجة مئوية) مقارنة بالأنظمة الأخرى المتاحة التي يمكنها الوصول إلى درجات حرارة التشغيل من -20 درجة مئوية إلى أكثر من 80 درجة مئوية.

يعد جمع بيانات SANS الأولية على العينات ذات الأهمية قبل إجراء تجارب الخلط في الموقع أمرا مهما لجمع أفضل بيانات TR-SANS ، لا سيما في التجارب المصممة لمراقبة حركية التبادل الجزيئي ، مثل المثال المقدم هنا. يعد تحديد القيم الدقيقة ل I (0) و I (∞) أمرا بالغ الأهمية لحساب القيم الدقيقة للشدة الطبيعية ، R (t) ، التي تم تصميمها لاستخراج المعلمات الحركية المطلوبة. يمكن حساب قيمة I (0) مباشرة من شدة التشتت المقاسة لمخزون الحويصلة H والحويصلة D المنفصلين ، ويمكن تحديد I (∞) عن طريق تحضير عينة حويصلة منفصلة محضرة من خليط 50/50 من H-lipids / D-lipids. يمكن أيضا استخدام بيانات التشتت من عينات التحكم هذه لتحديد التكوين الأمثل لنطاق q وجهاز SANS لقياس TR-SANS لزيادة الإشارة إلى أقصى حد والتحقق من تقدم حركية التبادل أثناء تجارب TR-SANS. إذا كانت الكثافة المقاسة في النقطة الزمنية الأولى بعد الخلط لا تساوي I (0) المحسوبة ، فقد تكون هناك حاجة إلى أوقات خلط أسرع لالتقاط جميع العمليات ذات الاهتمام. بمجرد وصول الكثافة المقاسة إلى I (∞) ، تكتمل عملية التبادل ، ويمكن إفراغ الخلية وتنظيفها استعدادا للحقن التالي.

لخلط عينة السائل بنجاح ل TR-SANS ، من الأهمية بمكان التأكد من أن جميع المحاقن والصمامات وخطوط الأنابيب مهيأة وخالية من الهواء ، وأن جميع وصلات الأنابيب آمنة لمنع التسرب. قد يؤدي الفشل في تنفيذ هذه الخطوات الحاسمة بشكل صحيح إلى أحجام خلط غير دقيقة أو شدة تشتت مطلقة غير دقيقة. على سبيل المثال ، ستقلل فقاعات الهواء المحبوسة داخل خلية العينة من شدة SANS المقاسة بسبب انخفاض حجم العينة في مسار الحزمة النيوترونية. بدلا من ذلك ، يمكن أن تنتج فقاعات الهواء "خطوطا" أو "مشاعل" عالية الكثافة على الكاشف بسبب انكسار الحزمة في واجهة الهواء والسائل. قد تشير التغييرات غير المتوقعة في شدة التشتت المقاسة بمرور الوقت إلى سوء خلط العينات أو تسرب الصمام أو فقاعات الهواء في خلية العينة أو الانتشار الخلفي للعينة.

يعد جمع قياس الإرسال لكل عينة أثناء تجربة TR-SANS أمرا بالغ الأهمية لتقليل البيانات التي تم جمعها إلى كثافة مطلقة. من الممكن جمع بيانات التشتت والإرسال في وقت واحد على بعض أجهزة SANS ، مما يبسط برمجة الحصول على بيانات TR-SANS الشاملة ؛ ومع ذلك ، هذا غير ممكن على جميع الأدوات ، بما في ذلك أداة VSANS المستخدمة في هذا البروتوكول. نظرا لأن قياسات إرسال العينة وتشتت العينة تتطلب تكوينات مختلفة للأجهزة ، فقد تم جمع قياسات الإرسال في نهاية قياسات التشتت (خطوة البروتوكول 7.2.4) لضمان قياس بيانات التشتت في أقرب وقت بعد حقن العينة في الخلية. يعتمد الإرسال فقط على التركيب الكلي للعنصر وطول مسار العينة وطول موجة النيوترونات. لذلك ، يجب ألا يتغير الإرسال إذا ظل التركيب الكلي للعناصر ثابتا طوال التجربة التي تم حلها بالوقت. تشير الاختلافات الكبيرة في قيم الإرسال بين عمليات التشغيل المتكررة لنفس العينة إلى وجود مشكلة إما من أحجام عينة الخلط غير المتسقة ، أو الملء غير الكامل لخلية العينة ، أو فقاعات الهواء ، أو تسرب الصمام وتدفق العينة أثناء التجربة.

الميزة الفريدة ل TR-SANS هي أن الشدة المقاسة تعتمد على متجه التشتت (q) ويمكن استخدامها لاستكشاف التغيرات المكانية على المقياس النانوي. عند دمجها مع جهاز خلط التدفق المتوقف ، يمكن ل TR-SANS التحقيق في هذه التغييرات النانوية على المقاييس الزمنية من الثانية إلى الدقيقة ، مما يوفر نظرة ثاقبة حول التجميع الذاتي وتبادل المواد الخافضة للتوتر السطحي والدهون ، وتجميع البوليمر والبروتين عند إضافة السواغات ، ونمو الجسيمات النانوية واضمحلالها ، أو تبادل المنتجات المغلفة في المستحلبات. يمكن تكوين جهاز التدفق المتوقف بمضخات حقنة ومحاقن متعددة العينات لتسهيل خلط عينتين سائلتين أو أكثر. تتيح هذه المرونة التحقيق المنهجي للمواد المضافة على حركية الاهتمام. على سبيل المثال ، يمكن خلط أحجام مختلفة من محلول الببتيد المضاد للميكروبات المركز مع محاليل H-vesicle و D-vesicle لدراسة آثار تركيز الببتيد على حركية تبادل الدهون45,46. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن جميع مسارات السوائل المختومة مغلفة في حاوية يتم التحكم في درجة حرارتها ، والتي تشمل محاقن العينات والصمامات والخلاطات والأنابيب ، يمكن تغيير درجة حرارة النظام لاستخراج المعلمات الديناميكية الحرارية المتعلقة بالعمليات الحركية ذات الأهمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgments

تم توفير الوصول إلى NG3 VSANS من قبل مركز تشتت النيوترونات عالي الدقة ، وهي شراكة بين المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا والمؤسسة الوطنية للعلوم بموجب الاتفاقية رقم DMR-2010792. تقر M.H.L.N بالتمويل المقدم من Mitacs Globalink (كندا). إن تحديد أي منتجات تجارية أو أسماء تجارية هو لتعزيز التفاهم ولا يعني موافقة أو توصية من قبل المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynamic mixer Analytical Scientific Instruments 462-0150A Magnetically coupled rotor, binary dynamic mixer assembly (ternary type available), 0.15 mL dead volume (larger dead volume available)
Fluoropolymer tubing IDEX Health & Science 1507L PFA Tubing Natural 1/16 inch OD x 0.040 inch ID x 50 ft
Fluoropolymer 1/4-28 flangeless fittings IDEX Health & Science XP-245 PFA flangeless fitting with ferrules, 1/4-28 threading, 1/16 inch OD tubing
Glass syringes Hamilton Company 81660 Hamilton 1000 series syringes, 10 mL (81660), model 1010 C syr, 1/4"-28 thread termination, other volumes available
High-pressure flow selector valves Vici Valco C85X-1570EUTB Vici 10 position selector valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure switch valves Vici Valco C82X-1574EUHB Vici 4 port switch valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure syringes Cetoni A2019000358 3 mL stainless steel syringe, 510 bar max, 21 mL/min flow rate max
Low-pressure flow selector valves Vici Valco C25-3180EUHB Vici 10 position selector valves, max 250 psi liquid, 0.75 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 1/4-28 threaded ports, USB universal actuator
neMESYS high-pressure syringe pumps Cetoni A3921000103 Max force 2600 N
neMESYS mid-pressure syringe pumps Cetoni A3921000131 Max force 1000 N
Power supply Cetoni A3921000127 Base 600, supplies power for up to 4 high pressure pumps
Quartz flow-through sample cell Starna Scientific 3-2.30-Q-1/TC Quartz micro flow cells, 2 mm path length (1 mm available), 2 mm by 2 mm by 30 mm internal dimension
Quartz windows Technical Glass Products NA GE 124 Clear fused quartz ground and polished plates, 11.75 inch by 23.75 inch by 0.375 inch thick
Stainless steel 10-32 coned compression fittings IDEX Health & Science U-321X, U-320X 316 stainless steel ferrule (U-321X) and nut (U-320X) -Valco type, 10-32 coned, for 1/16 inch OD stainless steel tubing
Stainless steel tubing IDEX Health & Science U-102 Stainless Steel Tubing 1/16 inch OD x 0.020 inch ID, 10 cm, various precut lengths available
Syringe pump control software Cetoni T6000000004 QmixElements software for nemesys pumps, QmixSDK software development kit
Thermoelectric air conditioner EIC Solutions AAC-140C-4XT-HC Thermoelectric air conditioner mounted on insulated enclosure to control the pump, valve, mixer, and sample temperature
T-slot railing McMaster-Carr 47065T103 Aluminum t-slotted railing (1.5 inch by 1.5 inch) cut to various lengths
Vapor locking bottle caps  Cole-Parmer EW-12018-02 Four 304 SS port inserts, 1/4"-28 threads, GL45 bottle cap size, PTFE body, SS threads, PP collar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Melnichenko, Y. B., Wignall, G. D. Small-angle neutron scattering in materials science: Recent practical applications. Journal of Applied Physics. 102 (2), 021101 (2007).
  2. Grillo, I. Small-angle neutron scattering and applications in soft condensed matter. Soft Matter Characterization. Borsali, R., Pecora, R. , Springer. Dordrecht. (2008).
  3. Hollamby, M. J. Practical applications of small-angle neutron scattering. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (26), 10566-10579 (2013).
  4. Pipich, V., Fu, Z. KWS-3: Very small angle diffractor with focusing mirror. Journal of large-scale research. 1, 31 (2015).
  5. Kline, S. 2019 NCNR Annual Report, Special Publication (NIST SP). , National Institute of Standards and Technology. Gaithersburg, MD. (2019).
  6. Gilbert, P. H., et al. Preservative induced polysorbate 80 micelle aggregation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 10 (6), 2395-2404 (2021).
  7. Terashima, T., et al. In situ and time-resolved small-angle neutron scattering observation of star polymer formation via arm-linking reaction in ruthenium-catalyzed living radical polymerization. Macromolecules. 43 (19), 8218-8232 (2010).
  8. Hashimoto, K., Fujii, K., Nishi, K., Shibayama, M. Ion gel network formation in an ionic liquid studied by time-resolved small-angle neutron scattering. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (40), 9419-9424 (2018).
  9. Conn, C. E., et al. Membrane protein structures in lipid bilayers; small-Angle neutron scattering with contrast-matched bicontinuous cubic phases. Frontiers in Chemistry. 8, 619470 (2021).
  10. van't Hag, L., et al. Protein-eye view of the in meso crystallization mechanism. Langmuir. 35 (25), 8344-8356 (2019).
  11. Mahieu, E., et al. Observing protein degradation by the PAN-20S proteasome by time-resolved neutron scattering. Biophysical Journal. 119 (2), 375-388 (2020).
  12. Ibrahim, Z., et al. Time-resolved neutron scattering provides new insight into protein substrate processing by a AAA+ unfoldase. Scientific Reports. 7 (1), 40948 (2017).
  13. Hollamby, M. J., et al. Growth of mesoporous silica nanoparticles monitored by time-resolved small-angle neutron scattering. Langmuir. 28 (9), 4425-4433 (2012).
  14. Blin, J. L., Impéror-Clerc, M. Mechanism of self-assembly in the synthesis of silica mesoporous materials: in situ studies by X-ray and neutron scattering. Chemical Society Reviews. 42 (9), 4071-4082 (2013).
  15. Impéror-Clerc, M., Grillo, I., Khodakov, A. Y., Durand, D., Zholobenko, V. L. New insights into the initial steps of the formation of SBA-15 materials: an in situ small angle neutron scattering investigation. Chemical Communications. 8, 834-836 (2007).
  16. Narayanan, T., Rüter, A., Olsson, U. SAXS/WAXS investigation of amyloid-β(16-22) peptide nanotubes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 654349 (2021).
  17. Angelov, B., et al. DNA/Fusogenic lipid nanocarrier assembly: millisecond structural dynamics. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (11), 1959-1964 (2013).
  18. Amann, M., et al. Kinetic pathways for polyelectrolyte coacervate micelle formation revealed by time-resolved synchrotron SAXS. Macromolecules. 52 (21), 8227 (2019).
  19. Varga, Z., Wacha, A., Bóta, A. Osmotic shrinkage of sterically stabilized liposomes as revealed by time-resolved small-angle X-ray scattering. Journal of Applied Crystallography. 47 (1), 35-40 (2014).
  20. Panine, P., Finet, S., Weiss, T. M., Narayanan, T. Probing fast kinetics in complex fluids by combined rapid mixing and small-angle X-ray scattering. Advances in Colloid and Interface Science. 127 (1), 9-18 (2006).
  21. Grillo, I. Applications of stopped-flow in SAXS and SANS. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 14 (6), 402-408 (2009).
  22. Gomez-Hens, A., Perez-Bendito, D. The stopped-flow technique in analytical chemistry. Analytica Chimica Acta. 242, 147-177 (1991).
  23. Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. Use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the ATP turnover cycle of kinesins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52142 (2014).
  24. Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of stopped-flow kinetics methods to investigate the mechanism of action of a DNA repair protein. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1874 (2010).
  25. Raney, K. D., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. A fluorescence-based assay for monitoring helicase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6644-6648 (1994).
  26. Roder, H., Maki, K., Cheng, H. Early events in protein folding explored by rapid mixing methods. Chemical reviews. 106 (5), 1836-1861 (2006).
  27. Milon, A., et al. Osmotic swelling of unilamellar vesicles by the stopped-flow light scattering method. Influence of vesicle size, solute, temperature, cholesterol and three α,ω-dihydroxycarotenoids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 859 (1), 1-9 (1986).
  28. Gast, K., Nöppert, A., Müller-Frohne, M., Zirwer, D., Damaschun, G. Stopped-flow dynamic light scattering as a method to monitor compaction during protein folding. European Biophysics Journal. 25 (3), 211-219 (1997).
  29. Antoun, A., Pavlov, M. Y., Tenson, T., Ehrenberg, M. M. Ribosome formation from subunits studied by stopped-flow and Rayleigh light scattering. Biological Procedures Online. 6, 35-54 (2004).
  30. Zhu, Z., Armes, S. P., Liu, S. pH-Induced micellization kinetics of ABC triblock copolymers measured by stopped-flow light scattering. Macromolecules. 38 (23), 9803-9812 (2005).
  31. Ye, J., et al. Comparative study of temperature-induced association of cyclic and linear poly(N-isopropylacrylamide) chains in dilute solutions by laser light scattering and stopped-flow temperature jump. Macromolecules. 41 (12), 4416-4422 (2008).
  32. Liu, X., et al. Early stage kinetics of polyelectrolyte complex coacervation monitored through stopped-flow light scattering. Soft Matter. 12 (44), 9030-9038 (2016).
  33. Garman, E. F., Weik, M. X-ray radiation damage to biological samples: recent progress. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (4), 907-911 (2019).
  34. Garg, S., Porcar, L., Woodka, A. C., Butler, P. D., Perez-Salas, U. Noninvasive neutron scattering measurements reveal slower cholesterol transport in model lipid membranes. Biophysical Journal. 101 (2), 370-377 (2011).
  35. Marquardt, D., et al. 1H NMR shows slow phospholipid flip-flop in gel and fluid bilayers. Langmuir. 33 (15), 3731-3741 (2017).
  36. Egelhaaf, S. U., Olsson, U., Schurtenberger, P. Time-resolved SANS for surfactant phase transitions. Physica B: Condensed Matter. 276-278, 326-329 (2000).
  37. Tabor, R. F., Eastoe, J., Grillo, I. Time-resolved small-angle neutron scattering as a lamellar phase evolves into a microemulsion. Soft Matter. 5 (10), 2125-2129 (2009).
  38. Gradzielski, M., Bergmeier, M., Hoffmann, H., Müller, M., Grillo, I. Vesicle gel formed by a self-organization process. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (49), 11594-11597 (2000).
  39. Lee, Y. -T., Li, D. S., Pozzo, L. D. Kinetic analysis of ultrasound-induced oil exchange in oil-in-water emulsions through contrast variation time-resolved small-sngle neutron scattering. Langmuir. 35 (47), 15204-15213 (2019).
  40. Lee, Y. -T., Pozzo, L. D. Contrast-variation time-resolved small-angle neutron scattering analysis of oil-exchange kinetics between oil-in-water emulsions stabilized by anionic surfactants. Langmuir. 35 (47), 15192-15203 (2019).
  41. Roger, K., Olsson, U., Schweins, R., Cabane, B. Emulsion ripening through molecular exchange at droplet contacts. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1452-1455 (2015).
  42. Nakano, M., Fukuda, M., Kudo, T., Endo, H., Handa, T. Determination of Interbilayer and Transbilayer Lipid Transfers by Time-Resolved Small-Angle Neutron Scattering. Physical Review Letters. 98 (23), 238101 (2007).
  43. Nakano, M., et al. Flip-flop of phospholipids in vesicles: kinetic analysis with time-resolved small-angle neutron scattering. The Journal of Physical Chemistry B. 113 (19), 6745-6748 (2009).
  44. Nguyen, M. H. L., et al. Methanol accelerates DMPC flip-flop and transfer: A SANS study on lipid dynamics. Biophysical Journal. 116 (5), 755-759 (2019).
  45. Nguyen, M. H. L., et al. Peptide-induced Lipid flip-flop in asymmetric liposomes measured by small angle neutron scattering. Langmuir. 35 (36), 11735-11744 (2019).
  46. Nguyen, M. H. L., et al. Time-resolved SANS reveals pore-forming peptides cause rapid lipid reorganization. New Journal of Chemistry. 45 (1), 447-456 (2021).
  47. Xia, Y., et al. Effects of nanoparticle morphology and acyl chain length on spontaneous lipid transfer rates. Langmuir. 31 (47), 12920-12928 (2015).
  48. Xia, Y., et al. Morphology-induced defects enhance lipid transfer rates. Langmuir. 32 (38), 9757-9764 (2016).
  49. Maric, S., et al. Time-resolved small-angle neutron scattering as a probe for the dynamics of lipid exchange between human lipoproteins and naturally derived membranes. Scientific Reports. 9 (1), 7591 (2019).
  50. Nielsen, J. E., Bjørnestad, V. A., Pipich, V., Jenssen, H., Lund, R. Beyond structural models for the mode of action: How natural antimicrobial peptides affect lipid transport. Journal of Colloid and Interface Science. 582, 793-802 (2021).
  51. Willner, L., Poppe, A., Allgaier, J., Mokenbusch, M., Richter, D. TIme-resolved SANS for the determintioan of unimer exchange kinetics in block copolymer micelles. Europhysics Letters. 55 (5), 667 (2001).
  52. Lund, R., Willner, L., Stellbrink, J., Lindner, P., Richter, D. Logarithmic chain-exchange kinetics of diblock copolymer micelles. Physical Review Letters. 96 (6), 068302 (2006).
  53. Lund, R., Willner, L., Richter, D., Dormidontova, E. E. Equilibrium chain exchange kinetics of diblock copolymer micelles: Tuning and logarithmic relaxation. Macromolecules. 39 (13), 4566-4575 (2006).
  54. Lund, R., Willner, L., Richter, D. Kinetics of block copolymer micelles studied by small-angle scattering methods. in Controlled Polymerization and Polymeric Structures. Advances in Polymer Science. Abe, A., Lee, K. S., Leibler, L., Kobayashi, S. , Springer. Cham. 51 (2013).
  55. Choi, S. -H., Lodge, T. P., Bates, F. S. Mechanism of molecular exchange in diblock copolymer micelles: hypersensitivity to core chain length. Physical Review Letters. 104 (4), 047802 (2010).
  56. Choi, S. -H., Bates, F. S., Lodge, T. P. Molecular exchange in ordered diblock copolymer micelles. Macromolecules. 44 (9), 3594-3604 (2011).
  57. Lu, J., Bates, F. S., Lodge, T. P. Chain exchange in binary copolymer micelles at equilibrium: confirmation of the independent chain hypothesis. ACS Macro Letters. 2 (5), 451-455 (2013).
  58. Lu, J., Bates, F. S., Lodge, T. P. Remarkable effect of molecular architecture on chain exchange in triblock copolymer micelles. Macromolecules. 48 (8), 2667-2676 (2015).
  59. Kelley, E. G., et al. Size evolution of highly amphiphilic macromolecular solution assemblies via a distinct bimodal pathway. Nature Communications. 5 (1), 3599 (2014).
  60. Murphy, R. P., Kelley, E. G., Rogers, S. A., Sullivan, M. O., Epps, T. H. Unlocking chain exchange in highly amphiphilic block polymer micellar systems: influence of agitation. ACS Macro Letters. 3 (11), 1106-1111 (2014).
  61. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50 (6), 2484-2494 (2017).
  62. Lantz, K. A., et al. Cavitation enables switchable and rapid block polymer exchange under high-χN conditions. Macromolecules. 51 (17), 6967-6975 (2018).
  63. Murphy, R. P., et al. Capillary RheoSANS: measuring the rheology and nanostructure of complex fluids at high shear rates. Soft Matter. 16 (27), 6285-6293 (2020).
  64. Stopped Flow Sans. usnistgov. , Available from: https://github.com/usnistgov/stopped-flow-sans (2021).
  65. Kline, S. Reduction and analysis of SANS and USANS data using IGOR Pro. Journal of Applied Crystallography. 39 (6), 895-900 (2006).
  66. Doktorova, M., et al. Preparation of asymmetric phospholipid vesicles for use as cell membrane models. Nature Protocols. 13 (9), 2086-2101 (2018).
  67. Huang, Z., London, E. Effect of cyclodextrin and membrane lipid structure upon cyclodextrin-lipid interaction. Langmuir. 29 (47), 14631-14638 (2013).
  68. Sugiura, T., Ikeda, K., Nakano, M. Kinetic analysis of the methyl-β-cyclodextrin-mediated intervesicular transfer of pyrene-labeled phospholipids. Langmuir. 32 (51), 13697-13705 (2016).
  69. Scott, H. L., et al. On the mechanism of bilayer separation by extrusion, or why your LUVs are not really unilamellar. Biophysical Journal. 117 (8), 1381-1386 (2019).
  70. Dicko, C., et al. NUrF-Optimization of in situ UV-vis and fluorescence and autonomous characterization techniques with small-angle neutron scattering instrumentation. Review of Scientific Instruments. 91 (7), 075111 (2020).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 174 ، تشتت النيوترونات بزاوية صغيرة (SANS) ، التشتت الذي تم حله بمرور الوقت ، خلط التدفق المتوقف ، حركية التبادل الجزيئي ، الجسيمات النانوية الدهنية ، الأغشية الدهنية ، الحويصلات ، التطور الهيكلي
قياس التطور الزمني للمواد النانوية مع تشتت النيوترونات المتوقف والزاوية الصغيرة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelley, E. G., Nguyen, M. H. L.,… More

Kelley, E. G., Nguyen, M. H. L., Marquardt, D., Maranville, B. B., Murphy, R. P. Measuring the Time-Evolution of Nanoscale Materials with Stopped-Flow and Small-Angle Neutron Scattering. J. Vis. Exp. (174), e62873, doi:10.3791/62873 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter