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Engineering

Mesure de l’évolution temporelle des matériaux à l’échelle nanométrique avec flux arrêté et diffusion neutronique aux petits angles

Published: August 6, 2021 doi: 10.3791/62873
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1, 1
1NIST Center for Neutron Research, National Institute of Standards and Technology, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of Windsor, 3Department of Physics, University of Windsor

Summary

Ce protocole présente l’utilisation d’un environnement d’échantillon à écoulement arrêté pour mélanger rapidement plusieurs solutions liquides in situ lors d’une mesure de diffusion de neutrons aux petits angles et pour étudier les processus cinétiques sur des échelles de longueur nanométrique et des échelles de temps secondes.

Abstract

Cet article présente l’utilisation d’un environnement d’échantillons SANS (Small Angle Neutron-Scattering) à écoulement arrêté pour mélanger rapidement des échantillons liquides et étudier les processus cinétiques à l’échelle nanométrique sur des échelles de temps de quelques secondes à quelques minutes. L’environnement d’échantillonnage à débit arrêté utilise des pompes à seringue disponibles dans le commerce pour mélanger les volumes souhaités d’échantillons liquides qui sont ensuite injectés à travers un mélangeur dynamique dans une cellule en verre de quartz en 1 s environ. L’acquisition de données SANS résolue dans le temps est synchronisée avec le mélange de l’échantillon pour suivre l’évolution de la nanostructure en solution après le mélange.

Pour utiliser le plus efficacement possible le temps de faisceau de neutrons, nous utilisons une série de vannes sélecteur de débit pour charger, rincer et sécher automatiquement la cellule entre les mesures, ce qui permet une collecte répétée de données lors d’injections d’échantillons multiples. Les injections d’échantillons sont répétées jusqu’à ce que des statistiques suffisantes sur la diffusion des neutrons soient recueillies. La configuration de mélange peut être programmée pour faire varier systématiquement les conditions afin de mesurer la cinétique à différents rapports de mélange, concentrations d’échantillons, concentrations d’additifs et températures. Le volume minimal d’échantillon requis par injection est d’environ 150 μL selon la longueur du trajet de la cellule de quartz.

Des résultats représentatifs utilisant cet environnement d’échantillon à écoulement arrêté sont présentés pour la cinétique d’échange lipidique rapide en présence d’un additif, la cyclodextrine. Les vésicules échangent les lipides externes (extérieurs) de l’ordre de quelques secondes et échangent complètement les lipides intérieurs et extérieurs en quelques heures. La mesure de la cinétique d’échange lipidique nécessite un mélange in situ pour capturer les processus les plus rapides (secondes) et les plus lents (minutes) et extraire les constantes de vitesse cinétique. Le même environnement d’échantillon peut également être utilisé pour sonder l’échange moléculaire dans d’autres types d’échantillons liquides tels que les nanoparticules lipidiques, les protéines, les tensioactifs, les polymères, les émulsions ou les nanoparticules inorganiques. La mesure des transformations structurelles à l’échelle nanométrique et de la cinétique des systèmes d’échange ou de réaction fournira de nouvelles informations sur les processus qui évoluent à l’échelle nanométrique.

Introduction

La diffusion neutronique aux petits angles (SANS) offre un moyen unique de mesurer les tailles, les formes, les interactions et l’organisation de divers matériaux sur des échelles de longueur allant de ≈1 nm à ≈100 nm 1,2,3. Les instruments récents, y compris les instruments VSANS (Very small-angle neutron scattering) avec miroirs de focalisation, repoussent les limites pour mesurer des échelles de longueur encore plus grandes jusqu’à ≈1000 nm 4,5. En général, le contraste de diffusion unique inhérent aux méthodes de diffusion neutronique offre plusieurs avantages dans la mesure de l’évolution temporelle des structures à l’échelle nanométrique, tels que l’agrégation des composants dans les formulations pharmaceutiques6, les réactions de réticulation et de gélification dans les systèmes polymères7,8, la cristallisation méso des protéines membranaires9,10, la dégradation et le déploiement des protéines11,12 et la croissance des matériaux à base de silice13,14,15. Le contraste de diffusion unique fait du SAN à résolution temporelle (TR-SANS) un complément utile aux autres mesures basées sur le flux arrêté.

Les méthodes de mélange à écoulement arrêté sont souvent mises en œuvre dans la diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS)16,17,18,19,20,21, la spectroscopie de fluorescence 22,23,24,25,26 et la diffusion de la lumière27,28,29,30, 31,32 expériences pour étudier les processus cinétiques sur des échelles de temps de la milliseconde. Une différence importante entre SANS et SAXS est que la diffusion neutronique est une technique de caractérisation non destructive et, en tant que telle, SANS peut être utilisée pour mesurer le même échantillon pendant des heures, voire des jours, sans endommager l’échantillon par les rayonnements ionisants, ce qui peut se produire lors d’expériences de diffusion de rayons X à flux plus élevé33. Comme les mesures SANS répétées ne modifieront pas la structure chimique de la molécule ou de l’échantillon de la sonde, l’évolution temporelle peut être étudiée sans effets du photoblanchiment, par exemple, ce qui peut compliquer les mesures cinétiques qui reposent sur la fluorescence23,24. De plus, SANS peut être utilisé pour mesurer des échantillons très concentrés et optiquement opaques qui sont souvent difficiles à caractériser avec des techniques basées sur la lumière telles que la diffusion dynamique de la lumière.

En plus de fournir des informations structurelles à l’échelle nanométrique, SANS peut être utilisé pour sonder la composition locale de ces structures grâce à la variation du contraste de densité de longueur de diffusion des neutrons. La densité de longueur de diffusion (DLS) des différents éléments varie de façon aléatoire dans le tableau périodique et varie avec différents isotopes du même élément. Un exemple couramment exploité est l’hydrogène (1H ou H) et le deutérium (2H ou D), qui ont des longueurs de diffusion des neutrons très différentes. Par conséquent, les matériaux riches en hydrogène, tels que les tensioactifs, les lipides, les protéines, l’ARN, l’ADN et d’autres polymères, peuvent être distingués des solvants deutérés à l’aide de SANS sans modifier de manière significative les propriétés physiques du système. Cependant, il est important de noter que l’échange H/D peut affecter la densité, la liaison hydrogène et les températures de transition de phase dans l’échantillon. Néanmoins, la sensibilité unique du SANS aux matériaux riches en hydrogène est particulièrement utile dans la recherche sur la matière molle où les échantillons d’intérêt ont un contraste de diffusion et un signal plus faibles dans les techniques basées sur les rayons X telles que SAXS. La substitution isotopique fait également du SANS un outil puissant pour étudier la cinétique d’échange moléculaire dans les matériaux riches en hydrogène en mélangeant simplement des molécules marquées H et marquées D. La substitution isotopique est particulièrement utile dans les systèmes où les colorants fluorescents encombrants sont plus gros que les molécules de tensioactif ou de lipides d’intérêt et peuvent influencer la cinétique d’échange34,35.

Les mesures SANS résolues dans le temps sont avantageuses car l’intensité mesurée est fonction du temps, de l’échelle de longueur et du contraste SLD. En tant que telles, les expériences TR-SANS peuvent être conçues pour sonder les changements dépendants du temps dans les distributions spatiales et les compositions des échantillons. Ces avantages uniques de SANS ont conduit à des informations importantes sur les processus cinétiques dans de nombreux systèmes de matériaux mous tels que les tensioactifs 36,37,38, les émulsions 39,40,41, les lipides 34,42,43,44,45,46,47,48,49 ,50, et polymères 51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62. La plupart des études TR-SANS se sont concentrées sur des échelles de temps allant de quelques minutes à quelques heures. Cependant, de nombreux processus cinétiques d’intérêt se produisent sur la deuxième échelle de temps et sont essentiels pour comprendre les mécanismes sous-jacents. La capture de ces premiers points temporels nécessite que les solutions soient rapidement mélangées et mesurées in situ, dans lesquelles le mélange est synchronisé avec la collecte de données pendant la diffusion de la lumière à écoulement arrêté 27,28,29,30,31,32, la fluorescence 22,23,24,25,26 et les rayons X 16,17,18,19,20,21 expériences. Ce travail décrit l’utilisation d’un environnement d’échantillonnage conçu pour mélanger rapidement plusieurs échantillons liquides et injecter le mélange dans une cellule en verre de quartz pour les mesures TR-SANS. Le dispositif de mélange est une adaptation du dispositif rheoSANS capillairerécemment développé 63 et utilise plusieurs pompes à seringue et vannes pour contrôler le mélange des échantillons et automatiser le nettoyage des cellules. En connectant les pompes à seringue à une série de vannes sélecteur de débit, plusieurs flux d’entrée peuvent être mélangés, mesurés, rincés et séchés à plusieurs reprises pour faciliter les mesures TR-SANS sur l’échelle de temps des secondes.

La procédure actuelle suppose que les échantillons d’intérêt ont été identifiés et préparés. Nous nous concentrons sur la configuration du mélange in situ et les méthodes de collecte des données TR-SANS. Les données de diffusion neutronique ont été recueillies sur l’instrument VSANS au NIST Center for Neutron Research (NCNR); toutefois, la procédure devrait être applicable à d’autres instruments SANS. Les lecteurs intéressés à mettre en œuvre des protocoles similaires sur d’autres instruments SANS devraient consulter les scientifiques locaux afin de déterminer la configuration optimale de l’instrument pour maximiser le flux de neutrons à l’échelle de longueur et à l’échelle de temps souhaitées les plus pertinentes pour les processus cinétiques d’intérêt. Les données présentées ici ont été recueillies à l’aide de la configuration à « faisceau blanc » à haut flux sur VSANS afin de maximiser le nombre de neutrons à la perte de résolution spatiale5. Les chariots du détecteur ont été positionnés de manière à couvrir une gamme de vecteurs de diffusion (q), 0,005 Å-1 < q < 0,5 Å-1, correspondant à des échelles de longueur de ≈130 nm à ≈13 nm. Le vecteur de diffusion est défini comme q = 4π/λ sin (θ/2) dans lequel λ est la longueur d’onde des neutrons et θ est l’angle de diffusion.

Le dispositif de mélange à écoulement arrêté utilisé pour les mesures TR-SANS se compose de plusieurs pompes, de seringues de rinçage, de seringues d’échantillon, de sélecteurs de débit, ainsi que d’un mélangeur adynamique, d’une cellule d’échantillonnage et d’un récipient d’échantillon mixte, comme illustré à la figure 1. Tous les chemins de fluide scellés sont situés à l’intérieur d’une enceinte climatisée, qui comprend les seringues, les valves, les tubes de connexion, le mélangeur dynamique et les cellules d’échantillonnage. Un climatiseur thermoélectrique programmable est utilisé pour contrôler la température de l’enceinte dans la plage de 10 °C à 50 °C dans les ±1 °C. Notez qu’une partie de l’isolant du boîtier a été retirée pour montrer les parties fonctionnelles de l’appareil. L’enceinte principale du dispositif de mélange est positionnée sur une platine translationnelle sur la ligne de faisceau NG3 VSANS au NCNR. La position de l’enceinte est ajustée à l’aide de l’étage de translation pour positionner la cellule d’échantillon sur le trajet du faisceau de neutrons (ligne pointillée jaune).

Figure 1
Figure 1 : Exemple de configuration pour combiner le mélange à flux arrêté et les mesures de diffusion de neutrons aux petits angles à la ligne de faisceau VSANS du Centre de recherche sur les neutrons du NIST. L’installation contient quatre pompes à seringues, deux seringues pour le rinçage des solvants et deux seringues pour l’injection d’échantillons, quatre vannes sélecteur de pompe, deux vannes sélecteur de mélangeur, un mélangeur dynamique, une cellule de quartz à écoulement continu et un récipient d’échantillon mixte. Les neutrons incidents dispersent l’échantillon mélangé situé à l’intérieur de la cellule d’échantillon. Une enceinte isolée avec des fenêtres en quartz et une unité thermoélectrique climatisée est utilisée pour contrôler l’échantillon et tous les équipements à température constante. La ligne pointillée jaune montre le trajet du faisceau de neutrons. Barre d’échelle = 10 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Le dispositif illustré à la figure 1 est configuré avec deux seringues d’échantillon, deux seringues de rinçage et une cellule d’échantillonnage. Les organigrammes correspondants pour les différentes étapes du protocole sont illustrés à la figure 2. Les volumes souhaités des deux échantillons différents sont injectés dans le mélangeur et la cellule d’échantillonnage (Figure 2A). Une fois la cellule d’échantillon remplie, la vanne d’admission (ISV) et la vanne de commutation de sortie (OSV) sont fermées pour isoler la cellule d’échantillon du mélangeur dynamique et empêcher la rediffusion de l’échantillon dans la cellule pendant la collecte de données TR-SANS (Figure 2B). Avant le mélangeur dynamique, la longueur du tube de raccordement varie de 10 cm à 1 m et n’affecte pas le temps de temps de mélange. Cependant, les connexions de tubes entre le mélangeur dynamique et la cellule d’échantillon affecteront le temps de retard de mélange et le volume d’injection d’échantillon requis. Des tubes en acier inoxydable prédécoupés de 0,04 pouce (1 mm) de diamètre intérieur et de 100 mm de longueur sont utilisés pour connecter le mélangeur dynamique, les vannes sélecteur de mélangeur (MSV1 et MSV2), ainsi que les ISV et OSV. Un tube fluoré de 1 mm de diamètre intérieur et de 115 mm de longueur est utilisé pour connecter l’ISV et l’OSV (ou la sortie du mélangeur dynamique) à la cellule d’échantillonnage. Le volume total de vide qui influence le temps de délai de mélange comprend le volume de vide du mélangeur (0,15 mL), le tube entre la sortie du mélangeur et l’entrée de la cellule d’échantillon (0,09 mL) et le volume de la cellule échantillon (0,16 mL). Dans cet exemple, le volume total du vide est de 0,4 mL. Les volumes de vide interne des vannes sont négligeables par rapport aux volumes de vide des tubes, du mélangeur et de la cellule d’échantillonnage. Par exemple, les vannes sélecteur basse pression utilisées (diamètre d’alésage de 0,75 mm) contiennent des volumes de vide approximatifs de 4 μL, tandis que les vannes sélecteur haute pression et les vannes de commutation (diamètre d’alésage de 0,25 mm) contiennent des volumes de vide approximatifs de 0,5 μL.

Une fois la mesure TR-SANS terminée, l’échantillon est expulsé de la cellule avec un solvant, et le solvant de rinçage est pompé à plusieurs reprises à travers la cellule pour éliminer l’échantillon résiduel et nettoyer la cellule d’échantillon (Figure 2C). Notez que les seringues de rinçage sont connectées à des réservoirs de solvant plus grands (p. ex. eau et éthanol) au moyen de valeurs de sélecteur de pompe pour s’assurer que des volumes de solvant adéquats sont disponibles pour nettoyer la cellule d’échantillon entre les cycles de mesure. Les sources de solvants, les sources d’échantillons et les contenants d’échantillons mélangés contenant des liquides inflammables sont placés dans une enceinte séparée sans équipement électrique pour éliminer toutes les sources d’inflammation possibles. De plus, des bouchons de bouteilles à verrouillage de la vapeur sont utilisés pour minimiser les vapeurs inflammables et l’évaporation des solvants. Enfin, la cellule d’échantillon est séchée avec un flux d’azote gazeux pour éliminer le solvant de rinçage résiduel (figure 2D). La pression d’azote gazeux à l’entrée de la vanne sélecteur du mélangeur est réglée à environ 2 bar (0,2 MPa, pression manométrique) à l’aide d’un régulateur de pression manuel situé sur la bouteille d’azote gazeux. Une fois que la cellule d’échantillon est suffisamment nettoyée et séchée, un échantillon nouvellement mélangé est injecté dans la cellule d’échantillon pour le cycle de mesure suivant (en répétant le mélange et l’injection illustrés dans le diagramme de flux de la figure 2A).

Figure 2
Figure 2 : Exemple d’organigramme utilisant une cellule d’échantillonnage, deux échantillons mélangés et deux solvants de rinçage pour le nettoyage. (A) Mélange de l’échantillon A (bleu) et de l’échantillon B (rouge), puis écoulement de l’échantillon mélangé (violet) dans la cellule d’échantillon. (B) Pendant la collecte des données, l’état du dispositif d’écoulement arrêté où les vannes de commutation ISV et OSV sont fermées pour isoler la cellule d’échantillonnage et empêcher la rétrodiffusion de l’échantillon pendant la collecte des données. (C) Les étapes de nettoyage où la cellule d’échantillon est rincée avec le solvant de rinçage de SS1 (vert) après la collecte des données. D) Étape de séchage au cours de laquelle la cellule d’échantillonnage est séchée à l’azote gazeux (orange). Abréviations : PSV = robinet sélecteur de pompe; MSV = vanne sélecteur de mélangeur; OSV = vanne de commutation de sortie; ISV = vanne d’interrupteur d’admission; SS1 = source de solvant 1; ASS = source d’échantillon A; N2 = source d’azote gazeux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La figure 3 montre des organigrammes pour une version légèrement différente dans laquelle la configuration de mélange est configurée avec deux cellules d’échantillonnage distinctes connectées aux mêmes vannes de commutation (figure 3A). Alors que les données TR-SANS sont recueillies dans la cellule d’échantillon 1, la cellule d’échantillon 2 est rincée (figure 3B) et séchée (figure 3C). Lorsque la collecte de données est terminée pour la cellule d’échantillon 1, la vanne d’interrupteur d’admission dirige un échantillon nouvellement mélangé dans la cellule d’échantillon 2 pour la collecte de données (figure 3D). Alors que les données TR-SANS sont recueillies dans la cellule d’échantillon 2, la cellule d’échantillon 1 est rincée et séchée (figure 3E). Ce processus parallèle alterné entre deux cellules d’échantillon minimise le temps entre les injections ultérieures d’échantillons et maximise l’utilisation du temps de faisceau de neutrons.

Figure 3
Figure 3 : Exemple d’organigramme utilisant deux cellules d’échantillonnage, deux échantillons mélangés et deux solvants de rinçage pour le nettoyage. (A) Mélanger l’échantillon A (bleu) et l’échantillon B (rouge), puis faire couler l’échantillon mélangé (violet) dans la cellule d’échantillon 1. (B) L’état du dispositif d’écoulement arrêté pendant la collecte des données sur la cellule d’échantillon 1 pendant que la cellule d’échantillon 2 est rincée avec le solvant de SS1 (vert). (C) L’état du dispositif d’écoulement arrêté pendant la collecte des données sur la cellule d’échantillonnage 1 pendant que la cellule d’échantillon 2 est séchée avec de l’azote gazeux (orange). (D) Une fois la collecte des données de la cellule d’échantillon 1 terminée, un nouvel échantillon (violet) est immédiatement mélangé et acheminé dans la cellule d’échantillon 2. E) L’état du dispositif d’écoulement arrêté pendant la collecte des données sur la cellule d’échantillonnage 2 pendant que la cellule d’échantillon 1 est rincée avec le solvant de SS1 (vert). Pendant qu’une cellule d’échantillon est mesurée, l’autre cellule d’échantillon est nettoyée et séchée. Le processus de mesure du débit arrêté alterne entre deux cellules d’échantillonnage afin de minimiser le temps entre les injections ultérieures de mélange d’échantillons. Abréviations : PSV = robinet sélecteur de pompe; MSV = vanne sélecteur de mélangeur; OSV = vanne de commutation de sortie; ISV = vanne d’interrupteur d’admission; SS1 = source de solvant 1; ASS = source d’échantillon A; N2 = source d’azote gazeux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Un protocole étape par étape est décrit ci-dessous pour connecter les pompes et les conduites de tuyauterie, amorcer le système, rincer et sécher la cellule d’échantillon et injecter l’échantillon mélangé. Bien que la simplicité de la configuration à cellule unique soit démontrée (Figure 2), la configuration modulaire flexible, le protocole et les scripts peuvent être facilement modifiés pour implémenter davantage de pompes à seringues, de vannes, de mélangeurs ou de configurations de cellules d’échantillonnage, telles que la configuration à deux cellules à échantillon illustrée à la Figure 3. Les données représentatives du taux brut de numération des neutrons recueillies tout au long des cycles d’injection de mélange et de nettoyage sont présentées à la figure 4, tandis que la cinétique d’échange lipidique mesurée à 3 températures différentes et l’intensité diffusée normalisée extraite correspondant à la fraction de lipides échangés sont montrées à la figure 5 et à la figure 6, respectivement.

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Protocol

1. Configurez et lancez le système d’écoulement arrêté.

  1. Allumez tous les blocs d’alimentation de la pompe et les mélangeurs dynamiques à l’aide de l’interrupteur d’alimentation.
  2. Lancez toutes les pompes et vannes dans l’interface utilisateur graphique (GUI) de contrôle du système à débit arrêté en entrant le chemin de configuration du périphérique et en utilisant les commandes bus=qmixbus. Bus(), bus.open(), bus.start(), pump=qmixpump. Pump(), pump.enable() et valve=ViciMultiposSelector() (voir exemple de code d’initiation disponible dans un référentiel open source en ligne64).
  3. Calibrez les pompes avant de fixer les seringues à l’aide de la commande pump.calibrate().
  4. Vérifiez que les vannes sont lancées et déplacez-vous vers le port de sélection approprié sur commande à l’aide des commandes valve.setPort() et valve.getPort().
  5. Attribuez le type de seringue à utiliser pour chaque pompe à l’aide de la commande pump.set_syringe_param(A, B), dans laquelle A est le diamètre intérieur du canon de la seringue (mm) et B est la distance maximale de course du piston de la seringue (mm).
  6. Connectez les seringues d’échantillon aux pompes à seringues.
    1. Après vous être assuré que les pompes ont été étalonnées, vissez les barilles de seringue propres au raccord situé en haut de la pompe (tête de montage de la seringue).
    2. Lorsque vous utilisez des seringues en verre, assurez-vous que la tête de montage de la seringue est desserrée avant de distribuer le volume de remplissage, afin que la seringue en verre ne se brise pas en raison d’une force excessive du piston de la seringue.
    3. Vissez le piston de la seringue à la connexion au bas de la pompe (queue de montage de seringue).
    4. Une fois le barillet de la seringue et le piston de la seringue connectés à la pompe, distribuez le volume de remplissage du type de seringue à l’aide de la commande pump.empty(), qui déplace le piston de la seringue vers le haut du corps de la seringue.
    5. Lorsque vous utilisez des seringues en verre, serrez la tête de montage de la seringue après l’arrêt du mouvement du piston.
  7. Connectez le tube aux sources d’échantillon et de solvant, aux seringues, aux valves, aux mélangeurs, aux cellules d’échantillon et au récipient d’échantillon mixte.
    1. Connectez le tube de la pompe à seringue aux vannes sélecteur de pompe.
    2. Raccordez le tube de la vanne sélecteur de pompe aux sources d’échantillonnage.
    3. Raccordez le tube de la vanne sélecteur de pompe aux sources de solvant de rinçage.
    4. Connectez le tube de la vanne sélecteur de pompe au tube de la vanne sélecteur du mélangeur.
    5. Connectez le tube de la vanne sélecteur du mélangeur à la source d’azote gazeux.
    6. Connectez le tube de la vanne sélecteur du mélangeur aux entrées du mélangeur.
    7. Raccordez la sortie du mélangeur à la vanne d’interrupteur d’admission.
    8. Connectez la vanne d’interrupteur d’admission à l’entrée de la cellule d’échantillonnage.
    9. Connectez la sortie de la cellule d’échantillon à la vanne de commutation de sortie.
    10. Raccordez la vanne de commutation de sortie au récipient d’échantillon mixte.
  8. Définissez toutes les connexions de tubes et de vannes effectuées (étape 1.7) dans l’interface graphique de contrôle du système à débit arrêté en saisissant les connexions de numéro de port correspondantes effectuées sur chaque vanne (voir l’exemple de code de contrôle dans le référentiel open source en ligne64).
  9. Calculer le volume de vide du tube entre l’entrée du mélangeur et la sortie de la cellule d’échantillon, ce qui définit la quantité minimale d’échantillon nécessaire pour remplir la cellule d’échantillon pour chaque mesure.

2. Chargez l’échantillon.

  1. Définissez le volume de remplissage de l’échantillon et le volume de remplissage de solvant souhaités dans l’interface graphique de contrôle du système à écoulement arrêté en tapant les nombres souhaités (voir l’exemple de code de contrôle dans le référentiel open sourceen ligne 64).
  2. Utilisez la commande pump.aspirate( ) pour aspirer (aspirer) les volumes d’échantillon et de solvant souhaités de leurs sources dans les seringues d’échantillon à travers les vannes sélecteur de pompe.
    REMARQUE: Lors du premier chargement d’une seringue vide, de l’air sera présent au sommet de la seringue qui doit être purgé pour amorcer le système avec l’échantillon et le solvant à l’étape 3.

3. Amorcer le système.

  1. Utilisez la commande pump.dispense () pour expulser (distribuer) tout l’air des seringues, des conduites de tubes et des valves. Assurez-vous qu’un volume de liquide suffisant est distribué par chaque seringue pour éliminer complètement tout l’air des seringues, des tubes et des valves. Si des bulles d’air sont visibles à l’intérieur d’un tube, continuez à distribuer du solvant ou de l’échantillon jusqu’à ce que les bulles soient éliminées.
  2. Une fois que l’air a été purgé du système, effectuer au moins une procédure d’injection et de rinçage de l’échantillon (sans données de diffusion neutronique recueillies).
    1. Sélectionnez la cellule intitulée Démarrer l’expérience de mixage dans l’interface graphique du contrôle.
    2. Une fois cette cellule activement sélectionnée, cliquez sur le bouton Exécuter (triangle droit) situé en haut de l’interface graphique de contrôle, ou appuyez simultanément sur les touches Maj et Entrée du clavier.
    3. Inspectez visuellement la cellule d’échantillonnage pour confirmer qu’il n’y a pas de bulles d’air.
      1. Si des bulles d’air sont présentes, répétez les étapes 3.1 et 3.2 du protocole pour purger davantage l’air des conduites de tuyauterie.
      2. Si aucune bulle d’air n’est présente dans la cellule d’échantillonnage, passez à l’étape 4 pour définir les étapes restantes du protocole d’expérience.

4. Définissez le protocole de mélange à flux arrêté dans le script du programme (voir l’exemple de code dans le référentiel open source en ligne64).

  1. Entrez le point de consigne de température du climatiseur programmable (CA) qui contrôle la température de l’enceinte isolée entourant le dispositif à débit arrêté.
    1. Tout en maintenant enfoncé le bouton étoile de l’unité de commande CA, appuyez sur les flèches haut et bas pour modifier la température de consigne. Vous pouvez également saisir le point de consigne de température souhaité dans l’interface graphique de contrôle et cliquer sur Exécuter.
    2. Attendez 15-30 minutes pour permettre à l’intérieur de l’enceinte de s’équilibrer à la température souhaitée avant de commencer les expériences cinétiques.
      NOTE: La plage de température accessible est actuellement comprise entre 10 ° C et 50 ° C, et la stabilité de la température est de ± 1 ° C.
  2. Entrez toutes les étapes de la séquence de rinçage en tapant les volumes, débits, durées et nombre de répétitions appropriés dans l’interface graphique de contrôle.
    1. Définissez le volume de chaque échantillon à injecter, ce qui définit le débit total (Q).
    2. Définir le volume de chaque solvant à injecter pendant la procédure de rinçage.
    3. Définir le temps de séchage entre chaque sous-étape de rinçage (tséchage).
    4. Définissez le nombre de sous-étapes de rinçage.
    5. Définir les différents solvants pour les étapes de rinçage suivantes.
    6. Définir le nombre de répétitions de rinçage à effectuer après chaque mesure (nrinçage).
    7. Définir le temps nécessaire pour sécher complètement la cellule d’échantillon et le mélangeur, en fournissant une cellule d’échantillon propre pour l’injection d’échantillon suivante (tdry_final).
  3. Définissez toutes les étapes de séquence d’injection d’échantillon en tapant les volumes, débits et temps appropriés dans l’interface graphique de contrôle du système de débit arrêté.
    1. Définissez le volume de chaque échantillon à injecter et le débit.
    2. Calculez le temps de retard (t retard) à partir du volume de vide (V vide) et du débit total (tretard = Vvide/Q).
      REMARQUE : Le délai est le temps nécessaire pour remplir la cellule d’échantillon avec l’échantillon mélangé.
    3. Définir le temps d’acquisition souhaité pour les données TR-SANS de telle sorte que l’ensemble du processus cinétique d’intérêt se soit produit (tscatt).
    4. Réglez le temps d’attente entre la fin de l’expérience de diffusion et le début des cycles de rinçage (tattendre).
      REMARQUE : Ce temps d’attente devrait être d’au moins 100 s si la transmission des neutrons de l’échantillon doit être mesurée avant qu’elle ne soit rincée de la cellule. La transmission de l’échantillon est nécessaire pendant le traitement des données pour réduire les données à une intensité absolue.
    5. Définissez le nombre de cycles d’injection à effectuer avec les séquences de rinçage exécutées entre chaque injection qui sont définies à l’étape 4.2 (ncycle).
  4. Calculer la durée totale d’un cycle unique de collecte de données à flux arrêté (cycle t) à l’aide de l’équation (1).
    tcycle = n× de rinçage (t retard + tsec) + tdry_final + tretard + tscatt (1)
    dans lequel nrinçage = nombre de répétitions de rinçage (étape 4.2.6); t retard = temps deretard du dispositif d’écoulement arrêté (étape 4.3.2); tsec = temps de séchage entre chaque sous-étape de rinçage (étape 4.2.3); tdry_final = temps nécessaire pour sécher complètement la cellule d’échantillonnage et le mélangeur (étape 4.2.7); tscatt = temps d’acquisition des données TR-SANS souhaité (étape 4.3.3)

5. Définissez les paramètres de diffusion des neutrons aux petits angles dans l’interface graphique de contrôle de l’instrument SANS.

  1. Déterminer les échelles de longueur et la plage q d’intérêt pour chaque échantillon.
  2. Définissez la configuration de l’instrument pour couvrir la plage q d’intérêt souhaitée, tout en maximisant le flux de neutrons à l’échantillon.
  3. Définissez le temps total d’acquisition de données VSANS dans l’interface graphique de contrôle de l’instrument SANS sur le temps de cycle calculé à l’étape 4.4 (temps d’acquisition des données de diffusion de neutrons =cycle t).
  4. Réglez le temps de mesure de la transmission de l’échantillon sur 100 s dans l’interface graphique de contrôle de l’instrument SANS.
  5. À l’aide de l’interface graphique du contrôle d’instrument SANS, activez la collecte de données en mode événement en tapant GenerateEventModeData true dans la ligne de commande.

6. Recueillir des mesures de diffusion standard pour la réduction des données avant de commencer l’expérience d’écoulement arrêté pour traiter les données TR-SANS.

  1. Mesurez la diffusion de fond.
    1. Assurez-vous que l’obturateur local des instruments est fermé.
    2. Fixez l’échantillon de faisceau bloqué à l’arrière de l’ouverture de l’échantillon, fixez l’environnement local de l’instrument et ouvrez l’obturateur local de l’instrument.
    3. Définissez le temps d’acquisition des données de diffusion de faisceau bloqué dans le logiciel et collectez les données de diffusion de faisceau bloqué, en comptant pour la même durée que le temps d’acquisition de données de diffusion le plus long (tscatt).
    4. Une fois la collecte de données terminée, fermez l’obturateur de l’instrument et retirez l’échantillon de faisceau bloqué de l’ouverture de l’échantillon.
  2. Mesurez la diffusion des cellules vides.
    1. Assurez-vous que la cellule d’échantillon a été soigneusement rincée et séchée.
    2. Ouvrez l’obturateur local des instruments.
    3. Collectez la mesure de transmission de cellule vide pendant 100 s.
    4. Collectez la mesure de diffusion de cellules vides, en comptant au moins pour le temps d’acquisition le plus long (tscatt).

7. Commencez l’expérience du flux arrêté.

  1. Démarrez la collecte de données de diffusion VSANS en mode événement .
    1. Assurez-vous que la zone locale des instruments est sécurisée, puis ouvrez l’obturateur local du faisceau d’instruments.
    2. Commencez la collecte de données SANS à l’aide du logiciel de contrôle d’instrument SANS sur l’ordinateur de l’instrument en faisant glisser et en déposant les exécutions souhaitées dans la file d’attente des instruments.
      REMARQUE : Pour vous assurer que les premiers points temporels sont mesurés, commencez la collecte de données avant de commencer l’expérience de mélange à flux arrêté. Les données seront post-traitées ultérieurement pour tenir compte du délai (tdélai).
  2. Démarrez l’expérience de mélange à flux arrêté dans l’interface graphique de contrôle.
    1. Sélectionnez la cellule de l’ordinateur portable intitulée Démarrer l’expérience de mixage dans l’interface graphique de contrôle du système à flux arrêté.
    2. Une fois cette cellule activement sélectionnée, cliquez sur le bouton Exécuter (triangle droit) situé en haut du programme de contrôle du périphérique à flux arrêté, ou appuyez simultanément sur les touches Maj et Entrée du clavier.
    3. Confirmer que le protocole de mélange à flux arrêté défini à la section 4 a commencé à fonctionner.
    4. Ajoutez la mesure de transmission de 100 s à la file d’attente d’instruments VSANS après l’exécution de diffusion à l’aide de l’interface graphique de contrôle d’instrument SANS.
    5. Ajoutez un cycle de mesure de diffusion et un cycle de mesure de transmission à la file d’attente de l’instrument pour chaque cycle de mélange à flux arrêté restant (ncycle - 1, étape 4.3.5) dans l’interface graphique de contrôle de l’instrument SANS.

8. Traiter et réduire les données pour supprimer tous les arrière-plans, corriger la sensibilité du détecteur et corriger la transmission de l’échantillon.

  1. Téléchargez les fichiers de données de dispersion et les fichiers d’événements associés à partir du serveur.
    REMARQUE : Des fichiers d’événements distincts seront générés après chaque mesure VSANS, un fichier d’événement pour chaque chariot de détecteur actif (par exemple, détecteur avant, milieu et/ou arrière).
  2. Bin les données de diffusion vers les cases de temps souhaitées en utilisant la commande events=Rebin(filename ) suivie de la commande events.do_rebinning(timebins), dans laquelle le nom du fichier d’entrée correspond au nom du fichier de données SANS souhaité, et timebins est une liste des limites de la plage horaire souhaitée en secondes.
    REMARQUE: Si les bacs d’entrée sont entrés comme un seul nombre au lieu d’une liste, les données seront regroupées dans N nombre de bacs avec des largeurs de temps égales, où N est la boîte de temps d’entrée (voir les scripts logiciels fournis par la ligne de faisceau et le référentiel open source disponible en ligne64).
  3. Réduire les données de diffusion groupées à l’aide du logiciel fourni par la ligne de faisceau65.

9. Analysez les données TR-SANS.

  1. Calculer le temps de traitement d’intérêt (processus t) à partir des temps de mesure à l’aide de l’équation (2).
    tprocess = ti - tstop + tdelay (2)
    Où ti est la plage de temps de mesure commençant après l’arrêt du flux, tstop est le temps de mesure immédiatement lorsque le flux est arrêté, et tdelay est le temps de retard.
  2. Tracer l’intensité q-dépendante I(q) en fonction du temps de traitement à l’aide des intervalles de temps définis à l’étape 8.2 et duprocessus t calculé à l’étape 9.1.
    REMARQUE : Le temps de traitement accessible le plus tôt est limité par ledélai t. Pour mesurer les points temporels de traitement antérieurs, augmentez le débit total (Q) ou diminuez le volume total de vide (vide V).
  3. Extraire les paramètres cinétiques d’intérêt de la variation de I(q) en fonction du temps de traitement.

10. Terminez l’expérience.

  1. Éteignez le faisceau de neutrons en fermant l’obturateur local de l’instrument.
  2. Effectuer une vérification du rayonnement à l’aide d’un moniteur de rayonnement fourni par la ligne de faisceau avant de débrancher des pièces, des tubes ou de décharger des échantillons ou des contenants d’échantillons mixtes.
  3. Transférez les seringues, les tubes et le récipient d’échantillon mixte au département de physique de la santé.
  4. Remplissez les formulaires de physique de la santé et attendez l’évaluation par le personnel de physique de la santé.

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Representative Results

Les données représentatives sur les neutrons présentées ici mesurent la cinétique d’échange lipidique en présence de méthyl-β-cyclodextrine (mβCD), un additif qui catalyse l’échange lipidique entre les vésicules avec le taux d’échange (ke)66,67. Des études de fluorescence antérieures ont montré que ke dépend de la concentration en mβCD et que la demi-vie du processus d’échange est de l’ordre de laminute 68. Les présentes expériences utilisent TR-SANS à flux arrêté pour mesurer l’échange lipidique catalysé par mβCD entre les vésicules sur l’échelle de temps des secondes. Deux populations de vésicules lipidiques isotopiquement distinctes ont été préparées; une population de vésicules a été préparée avec des lipides de dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC) hydrogénés de la queue (vésicules de lipides H à la figure 5), et l’autre population de vésicules a été préparée avec des lipides DMPC (DMPC-d54) deutérés (vésicules de lipides D à la figure 5). Une fraction molaire de 0,05 (5 mol%) de lipides dimyrisotylphosphatidylglyercol (DMPG) chargés a été ajoutée aux poudres lipidiques sèches DMPC et DMPC-d54 pour favoriser la formation de vésicules unilamellaires69.

Des solutions séparées de vésicules H et de vésicules D ont été préparées en hydratant les films lipidiques respectifs dans un solvant contenant 45%en volume d’eau lourde (D 2 O) et 55% en volume d’eau (H2O). La composition du solvantD2O/H2Oa été calculée de telle sorte que la densité de longueur de diffusion des neutrons (ρ) du solvant corresponde à un mélange aléatoire des lipides H et des lipides D (Δρ = ρlipid- ρsolvant = 0). En d’autres termes, une vésicule H/D mélangée aléatoirement serait « invisible » pour les neutrons et générerait une diffusion de neutrons cohérente nulle. Les solutions de vésicules unilamellaires ont été préparées en congelant-décongelant les solutions cinq fois, puis en extrudant les solutions individuelles à travers un filtre en polycarbonate avec des pores de 100 nm de diamètre. Les solutions de vésicules ont été extrudées d’avant en arrière entre deux seringues et le filtre pour un total de 31 fois à 30 °C. Par la suite, on ajoute aux solutions de vésicules un petit volume d’une solution mère concentrée de mβCD préparée dans le même mélange de solvantsD2O/H2O. La concentration lipidique finale était de 14 mmol/L (mM) et la concentration de mβCD était de 30 mM. Les solutions individuelles de vésicules ont été équilibrées pendant au moins 30 minutes avec le mβCD ajouté avant que les solutions ne soient chargées dans les seringues d’échantillon dans le dispositif de mélange à flux arrêté.

Un exemple des taux de numération des neutrons mesurés sur plusieurs cycles d’injection est présenté à la figure 4A. Chaque cycle comprenait 9 étapes de rinçage, 1 étape de séchage et 1 étape d’injection d’échantillon. Seules les fréquences de comptage mesurées sur le chariot du détecteur intermédiaire dans l’instrument VSANS sont présentées pour plus de clarté. Des tendances similaires ont été observées sur le chariot du détecteur frontal, qui correspondait aux données recueillies à des angles de diffusion plus importants ou à des valeurs q plus élevées. Le taux de comptage a augmenté à chaque injection de solvant de rinçage (solvant S1 et solvant S2) et est revenu au nombre de base de cellules vides lorsque le solvant a été expulsé de la cellule avec de l’azote gazeux et séché. Le rinçage final de la cellule était avec S2, qui était de l’éthanol dans cet exemple, et la cellule a été séchée une dernière fois avec de l’azote gazeux pendant 3 minutes avant l’injection de l’échantillon. Peu de temps après l’injection de l’échantillon dans la cellule, le taux de numération des neutrons a augmenté et les données ont été recueillies en continu pendant 5 minutes. L’échantillon représentatif injecté dans les exemples de données de la figure 4A était un fond tampon de sel. Les fluctuations de l’intensité mesurée au fil du temps reflètent les variations du taux de comptage des neutrons de fond et ne reflètent pas un changement dans la composition moyenne de l’échantillon. Le cycle complet de rinçage, de séchage, de mélange et d’injection de l’échantillon a été répété une fois de plus dans l’exemple de la figure 4A, où chaque cycle a duré 15 minutes au total.

Les solutions individuelles de vésicules lipidiques marquées H et D ont été mélangées au mélanget et ont immédiatement coulé dans la cellule d’échantillon. Le taux de numération des neutrons mesuré a augmenté puis a atteint une valeur maximale lorsque la cellule d’échantillon a été remplie auremplissage t, comme le montre la figure 4B. Le temps écoulé nécessaire pour remplir la cellule d’échantillon est appelé temps de retard tretard et est donné par tretard = tremplissage tmélange. Si le volume de vide (V vide) entre le mélangeur et la cellule d’échantillonnage est connu et que le débit total (Q) est connu, le retard t peut également être calculé comme tretard = Vvide/Q (voir l’étape 4.3.2 du protocole), qui est également le temps de séjour moyen de l’échantillon liquide pour entrer dans le mélangeur et quitter la cellule d’échantillonnage. Après avoir atteint leremplissage t, le débit a été poursuivi à un débit constant pour s’assurer que la cellule s’était remplie et avait atteint l’état stable. L’écoulement a ensuite été immédiatement arrêté àl’arrêt t. Le taux moyen de comptage des neutrons est resté constant en fonction du temps de mesure entre tde remplissage et tstop parce que le débit à travers la cellule d’échantillon était constant et, par conséquent, l’échantillon dans le trajet du faisceau de neutrons était à l’état d’équilibre. En d’autres termes, les données mesurées à tstop correspondent à l’échantillon qui a été mélangé et évolué par tdelay = tfill- tmix = Vvoid/Q. Les temps de mesure groupés ti collectés immédiatement après tstop sont les principales données cinétiques d’intérêt.

Dans la figure 4C, le nombre de neutrons de l’échantillon de vésicules lipidiques mixtes à trois températures différentes est tracé en fonction de l’échelle de temps de traitement corrigée (processus t), qui est le temps de traitement d’intérêt qui a été corrigé pour la période d’écoulement à l’état d’équilibre et le temps de retard. L’échelle de temps de traitement a été calculée par t process = t i- t stop + tdelay, ou de manière équivalente, tprocess = ti- tstop + tfill- tmix. Les données SANS ont été collectées en continu dans la figure 4 en mode événementiel. Lors de la collecte de données en mode événement, chaque événement neutronique détecté est enregistré avec un horodatage unique et son emplacement x et y sur le détecteur de neutrons bidimensionnel. Les données en mode événement sont ensuite post-traitées dans les compartiments temporels souhaités (ti) de la figure 4B.

Les données en mode événement dans la fenêtre temporelle de traitement accessible d’intérêt (c.-à-d. la diffusion des neutrons recueillies à chaque ti aprèsl’arrêt t de la figure 4B) ont été reconstruites en une image de détecteur bidimensionnelle (2D) pour ce bac temporel à l’aide de protocoles et de scripts disponibles dans le dépôt en ligneopen source 64. Chaque image du détecteur 2D a ensuite été traitée à l’aide de routines de réduction des données pour soustraire les différentes sources de fond, corriger la transmission de l’échantillon et l’efficacité du détecteur, et intégrer azimutalement les données du détecteur 2D dans les diagrammes d’intensité (I) par rapport au vecteur de diffusion (q)65. Les données de la figure 5 ont été regroupées dans des intervalles de temps égaux (3 s) et sont représentatives des informations dépendantes de l’échelle de temps et de longueur qui peuvent être obtenues à partir d’une mesure TR-SANS. Semblable au taux de comptage brut total illustré à la figure 4B, l’intensité q-dépendante I(q) diminue avec le temps à mesure que les lipides dans le feuillet externe s’échangent et se mélangent au hasard entre différentes vésicules.

Les données sont présentées à la figure 5 pour la cinétique d’échange lipidique mesurée à 3 températures différentes. Chaque graphique montre les données recueillies pendant les 110 premières minutes après le mélange. L’intensité mesurée diminue d’un ordre de grandeur aux valeurs q les plus basses à 36 °C et 30 °C, qui correspondent à la phase liquide lipidique. Pendant ce temps, les données d’intensité dispersées changent significativement plus lentement avec le temps à 20 ° C, ce qui indique que la cinétique d’échange de folioles externes est beaucoup plus lente dans la phase de gel lipidique.

L’intensité de diffusion mesurée, I(q), est liée au contraste SLD comme Equation 1, dans lequel Δρ est la différence SLD entre la vésicule et le solvant environnant. Ce contraste SLD moyen est directement lié au nombre relatif de lipides H et D dans une vésicule à un moment donné. Ainsi, l’intensité de diffusion mesurée à un moment donné peut être normalisée pour déterminer la fraction de la population lipidique qui a échangé. Cette normalisation est obtenue en collectant deux mesures supplémentaires, notamment: (1) l’intensité mesurée I(0) au temps t = 0, lorsqu’il n’y a pas d’échange lipidique entre les vésicules, et (2) l’intensité mesurée I(∞) au temps t = ∞, lorsque tous les lipides ont échangé et que les populations se sont équilibrées. Le taux de comptage normalisé, Equation 242, est représenté en fonction du temps de traitement pour les différentes températures de la figure 6. Dans cet exemple, I(t) est l’intensité q-intégrée au temps de traitement t (intensité soustraite de fond intégrée en fonction de q), I(∞) est l’intensité q-intégrée à un temps infini après que tous les lipides ont échangé (ce qui devrait être similaire à la diffusion de fond du solvant), et I(0) est l’intensité q-intégrée intensité au temps t = 0 (sans échange lipidique). I(0) a été mesuré pour un échantillon mélangé en dessous de la température de transition de phase à 20 °C où l’échange était lent, et I(∞) a été mesuré dans un échantillon séparé qui s’était équilibré pendant plus de 36 h à 40 °C et avait et avait entièrement échangé des lipides H et des lipides D.

Le taux de comptage normalisé devrait se désintégrer de R(t) = 1 au temps de traitement t = 0, à R(t) = 0 à t = ∞, et est directement lié au contraste SLD dans l’échantillon et donc à l’étendue de l’échange lipidique 27,28,29,30,31,32,33,34,35 . Notez que les premières données mesurées de R(t) ne commencent pas à R(t)=1 à 30 °C et 36 °C, ce qui indique qu’une quantité importante d’échange lipidique s’est produite pendant les 3 premières s après le mélange, ce qui n’était pas accessible expérimentalement en raison du temps de retard (retard t = 2,4 s) du protocole de mélange à flux arrêté utilisé. Pendant ce temps, le R(t) mesuré à 20 °C est resté approximativement constant pendant les premières (2-3) minutes. Pour la cinétique d’échange lipidique mesurée à 30 °C et 36 °C, R(t) a rapidement diminué à ≈0,5 en 100 s, ce qui suggère que les lipides du feuillet externe se sont complètement échangés et équilibrés en quelques minutes. En conséquence, la capture de l’échange lipidique catalysé par mβCD a été rendue possible à l’aide de SANS à flux arrêté et serait difficile à capturer avec un mélange manuel de pipettes. La capture de points de temps de traitement encore plus précoces (t < 3 s) nécessitera un type de mélangeur différent avec un volume de vide plus petit, des volumes de vide de tubes plus petits et des débits totaux plus élevés pour réduire le temps de retard.

Le R(t) a continué à se désintégrer plus longtemps lorsque les lipides basculent entre les feuillets interne et externe. Les données TR-SANS pour le processus de bascule plus lent (t > 5 min) peuvent être collectées avec des échantillons discrets mélangés à la main et chargés dans des cellules d’échantillonnage SANS standard, car la méthode de mélange manuel par pipette prend environ 5 minutes. De même, l’échange lipidique à 20 °C dans la phase de gel lipidique était suffisamment lent pour être mélangé et mesuré discrètement, et cette mesure n’a pas nécessairement nécessité d’être étudiée avec la méthode de mélange à flux arrêté. Les mesures des processus cinétiques sur des échelles de temps de plusieurs minutes à quelques heures sont plus efficaces lorsque les échantillons sont mélangés par mélange manuel de pipettes. Cependant, les processus cinétiques sur des échelles de temps inférieures à quelques minutes nécessiteront ce mélange à flux arrêté et cette procédure de mesure TR-SANS.

Figure 4
Figure 4 : Données représentatives sur le taux brut de numération des neutrons recueillies tout au long des cycles d’injection de mélange et de nettoyage. (A) Exemple du taux de comptage des neutrons (détecteur intermédiaire) en fonction du temps pendant les séquences de rinçage répétées, la séquence de séchage et la séquence d’injection d’échantillons mixtes sur plusieurs cycles. L’échantillon en (A) était un fond tampon de sel, et les changements d’intensité au fil du temps reflètent les variations du taux de comptage de fond, et non un changement dans l’échantillon. (B) Taux de comptage des neutrons normalisé par le moniteur en fonction du temps d’expérience après l’injection de vésicules mixtes de lipide H et de lipide D à 30 °C. Les lignes pointillées verticales indiquent l’heure de début du mélange(mélange t), le temps de remplissage(remplissage t), le temps d’arrêt du débit(arrêt t) et la région de regroupement temporel (ti). La décroissance du taux de comptage aprèsl’arrêt t est due à la perte de contraste dans l’échantillon comme l’échange lipidique entre les vésicules. (C) Surveiller les taux normalisés de comptage des neutrons en fonction du temps de traitement d’échange pendant les 100 premières s de l’expérience à (bleu) 20 °C, (vert) 30 °C et (rouge) 36 °C. Les données du mode événement sont traitées dans des bacs de 1 s. Abréviations : S1 = solvant 1; S2 = solvant 2; tmélange = temps d’expérience auquel les solutions échantillons sont mélangées; tremplissage = temps d’expérience auquel la cellule d’échantillon est remplie; tstop = temps d’expérience auquel l’écoulement est arrêté; tprocess = temps de processus cinétique calculé d’intérêt. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Illustration de l’échange catalysé de la couche externe de vésicules lipidiques et des changements correspondants de l’intensité diffusée (I) en fonction du vecteur de diffusion (q) à différentes températures. Schéma montrant l’échange lipidique entre les vésicules H-lipid et D-lipidique après (A) mélange initial à t = 0 et (B) échange de la couche externe catalysé par la méthyl-β-cyclodextrine (mβCD). Réduction de l’intensité de diffusion des neutrons en fonction du vecteur d’onde de diffusion q. Les expériences de mélange à écoulement arrêté et les mesures VSANS ont été répétées à (C) 36 °C, (D) 30 °C et (E) 20 °C. Les données présentées ont été regroupées en intervalles de 3 s au cours des 10 premières minutes après mélange à chaque température spécifiée. Les barres d’erreur sont l’incertitude propagée à partir des statistiques de comptage et représentent un écart-type. Abréviations : ke = constante de vitesse pour l’échange lipidique entre vésicules; mβCD = méthyl-β-cyclodextrine; kf = constante de vitesse pour l’échange lipidique entre folioles, également appelée bascule lipidique; l(q) = intensité SANS mesurée avec des unités de cm-1 ; q = vecteur de diffusion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Intensité diffusée normalisée correspondant à la fraction de lipides échangés pouvant être modélisée pour extraire les constantes de vitesse pour les processus cinétiques d’intérêt. (A) Échange lipidique entre le feuillet externe des vésicules se produisant à des échelles de temps comprises entre 3 s et 600 s mesuré à (bleu) 20 °C, (noir) 30 °C et (rouge) 36 °C. L’encart de la figure effectue un zoom avant sur les 60 premières secondes du processus cinétique. Les barres d’erreur sont l’incertitude propagée à partir de l’intégration numérique des intensités de diffusion et représentent un écart-type. Abréviations : R(t) = intensité dispersée normalisée; tprocess = temps de traitement corrigé d’intérêt. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

La procédure actuelle décrit le dispositif de mélange et les étapes pour effectuer des mesures TR-SANS à débit arrêté. L’appareil et le protocole sont optimisés pour les échantillons liquides à faible viscosité où les échelles de temps d’intérêt sont de ≈1 s à 5 min. Pour les échelles de temps supérieures à 5 minutes, mélanger manuellement les échantillons et les charger dans des cellules de diffusion standard peut être plus facile et souhaitable, en particulier pour les échantillons, les gels ou les pâtes à haute viscosité. L’accès à des échelles de temps inférieures à 1 s nécessite un appareil de mélange différent, des volumes de vide totaux plus faibles et des débits totaux plus élevés pour réduire le temps de retard. Il est également important de noter que l’étude des processus cinétiques sur ces courtes échelles de temps nécessitera probablement des injections répétées d’échantillons pour accumuler suffisamment de statistiques de comptage de diffusion sur l’échelle de temps de la milliseconde avec TR-SANS. Si les volumes totaux de l’échantillon sont limités, il peut être souhaitable d’utiliser une technique de flux plus élevé, telle que la diffusion de la lumière ou la diffusion des rayons X, qui nécessite moins d’injections d’échantillons ou moins de volume d’échantillon par injection, en supposant qu’il existe un contraste de diffusion suffisant avec la diffusion de la lumière ou des rayons X.

Cette approche modulaire SANS à flux arrêté crée plusieurs avantages et inconvénients clés par rapport aux instruments à flux arrêté disponibles dans le commerce qui ont été optimisés pour les expériences de diffusion de neutrons. Les principaux avantages comprennent (1) l’alternance des mesures TR-SANS entre différentes cellules d’échantillonnage pendant les périodes de rinçage afin de maximiser l’utilisation du temps de faisceau de neutrons, (2) l’adaptation du nombre de seringues, de volumes de seringues et de types de mélangeurs pour le mélange ternaire d’échantillons ou d’autres exigences de mélange d’échantillons plus complexes, et (3) l’autorisation de périodes de mesure plus longues en isolant la cellule d’échantillon et en éliminant la rétrodiffusion à des échelles de temps plus longues (>10 min). Bien qu’elle ne soit pas mise en œuvre ici, la modularité de la conception de la cellule de mélange permettrait également la collecte simultanée de données avec plusieurs méthodes de mesure, telles que le peignage SANS, UV-Vis et les mesures de fluorescence70. Deux inconvénients clés de cette configuration modulaire sont (1) des temps de retard de mélange relativement plus longs (1 s à 3 s) par rapport à d’autres systèmes pouvant fournir des temps de retard de 1 ms à 100 ms, et (2) une plage de températures de fonctionnement plus petite (10 °C à 50 °C) par rapport aux autres systèmes disponibles qui peuvent accéder à des températures de fonctionnement de -20 °C à plus de 80 °C.

La collecte de données SANS préliminaires sur les échantillons d’intérêt avant d’effectuer des expériences de mélange in situ est importante pour recueillir les meilleures données TR-SANS, en particulier dans les expériences conçues pour surveiller la cinétique d’échange moléculaire, comme l’exemple présenté ici. La détermination des valeurs exactes de I(0) et I(∞) est essentielle pour calculer des valeurs précises de l’intensité normalisée, R(t), qui est modélisée pour extraire les paramètres cinétiques souhaités. La valeur de I(0) peut être directement calculée à partir des intensités de diffusion mesurées des stocks séparés de vésicules H et de vésicules D, et I(∞) peut être déterminée en préparant un échantillon séparé de vésicules préparé à partir d’un mélange 50/50 de lipides H/lipides D. Les données de diffusion de ces échantillons de contrôle peuvent également être utilisées pour déterminer la gamme q optimale et la configuration de l’instrument SANS pour la mesure TR-SANS afin de maximiser le signal et de vérifier la progression de la cinétique d’échange pendant les expériences TR-SANS. Si l’intensité mesurée au premier point temporel après le mélange n’est pas égale au I(0) calculé, des temps de mélange plus rapides peuvent être nécessaires pour capturer tous les processus d’intérêt. Une fois que l’intensité mesurée a atteint I(∞), le processus d’échange est terminé et la cellule peut être vidée et nettoyée en vue de la prochaine injection.

Pour réussir à mélanger un échantillon liquide pour TR-SANS, il est essentiel de s’assurer que toutes les seringues, valves et conduites de tubes sont amorcées et sans air, et que tous les raccords de tuyauterie sont sécurisés pour éviter les fuites. Si vous n’effectuez pas correctement ces étapes critiques, vous risquez d’entraîner des volumes de mélange inexacts ou des intensités de diffusion absolues inexactes. Par exemple, les bulles d’air piégées dans la cellule d’échantillonnage diminueront l’intensité SANS mesurée en raison du volume réduit de l’échantillon dans le trajet du faisceau de neutrons. Alternativement, les bulles d’air peuvent produire des « stries » ou des « fusées » de haute intensité sur le détecteur en raison de la réfraction du faisceau à l’interface air-liquide. Des changements inattendus dans l’intensité de diffusion mesurée au fil du temps peuvent indiquer un mauvais mélange de l’échantillon, une fuite de la vanne, des bulles d’air dans la cellule d’échantillon ou une rétrodiffusion de l’échantillon.

La collecte d’une mesure de transmission pour chaque échantillon au cours d’une expérience TR-SANS est essentielle pour réduire les données collectées à une intensité absolue. Il est possible de collecter simultanément des données de diffusion et de transmission sur certains instruments SANS, ce qui simplifie la programmation globale de l’acquisition de données TR-SANS; toutefois, cela n’est pas possible sur tous les instruments, y compris l’instrument VSANS utilisé dans ce protocole. Étant donné que les mesures de transmission et de diffusion d’échantillon nécessitaient des configurations d’instruments différentes, les mesures de transmission ont été recueillies à la fin des mesures de diffusion (étape 7.2.4 du protocole) pour s’assurer que les données de diffusion étaient mesurées aux premiers points temporels après l’injection de l’échantillon dans la cellule. La transmission ne dépend que de la composition élémentaire totale, de la longueur du trajet de l’échantillon et de la longueur d’onde des neutrons. Par conséquent, la transmission ne devrait pas changer si la composition élémentaire totale reste constante tout au long de l’expérience résolue dans le temps. De grandes différences dans les valeurs de transmission entre les cycles répétés d’un même échantillon indiquent un problème dû soit à des volumes d’échantillons de mélange incohérents, soit à un remplissage incomplet de la cellule d’échantillon, à des bulles d’air ou à une fuite de valve et à un refoulement de l’échantillon pendant l’expérience.

Un avantage unique de TR-SANS est que l’intensité mesurée dépend du vecteur de diffusion (q) et peut être utilisée pour sonder les changements spatiaux à l’échelle nanométrique. Lorsqu’il est combiné avec le dispositif de mélange à flux arrêté, TR-SANS peut sonder ces changements à l’échelle nanométrique sur des échelles de temps de seconde à minute, fournissant des informations sur l’auto-assemblage et l’échange de tensioactifs et de lipides, l’agrégation de polymères et de protéines lors de l’ajout d’excipient, la croissance et la désintégration de nanoparticules, ou l’échange de produits encapsulés dans des émulsions. Le dispositif à débit arrêté peut être configuré avec plusieurs pompes à seringue et seringues pour faciliter le mélange de deux échantillons liquides ou plus. Cette flexibilité permet l’étude systématique d’additifs sur la cinétique d’intérêt. Par exemple, différents volumes d’une solution peptidique antimicrobienne concentrée pourraient être mélangés avec des solutions de vésicules H et de vésicules D pour étudier les effets de la concentration peptidique sur la cinétique d’échange lipidique45,46. De plus, comme tous les chemins de fluide scellés sont enfermés dans une enceinte à température contrôlée, qui comprend les seringues d’échantillon, les vannes, les mélangeurs et les tubes, la température du système peut être modifiée pour extraire les paramètres thermodynamiques liés aux processus cinétiques d’intérêt.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

L’accès au VSANS NG3 a été fourni par le Center for High-Resolution Neutron Scattering, un partenariat entre le National Institute of Standards and Technology et la National Science Foundation en vertu de l’accord NO. DMR-2010792. M.H.L.N reconnaît le financement fourni par Mitacs Globalink (Canada). L’identification de tout produit commercial ou nom commercial vise à favoriser la compréhension et n’implique pas l’approbation ou la recommandation de l’Institut national des normes et de la technologie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynamic mixer Analytical Scientific Instruments 462-0150A Magnetically coupled rotor, binary dynamic mixer assembly (ternary type available), 0.15 mL dead volume (larger dead volume available)
Fluoropolymer tubing IDEX Health & Science 1507L PFA Tubing Natural 1/16 inch OD x 0.040 inch ID x 50 ft
Fluoropolymer 1/4-28 flangeless fittings IDEX Health & Science XP-245 PFA flangeless fitting with ferrules, 1/4-28 threading, 1/16 inch OD tubing
Glass syringes Hamilton Company 81660 Hamilton 1000 series syringes, 10 mL (81660), model 1010 C syr, 1/4"-28 thread termination, other volumes available
High-pressure flow selector valves Vici Valco C85X-1570EUTB Vici 10 position selector valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure switch valves Vici Valco C82X-1574EUHB Vici 4 port switch valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure syringes Cetoni A2019000358 3 mL stainless steel syringe, 510 bar max, 21 mL/min flow rate max
Low-pressure flow selector valves Vici Valco C25-3180EUHB Vici 10 position selector valves, max 250 psi liquid, 0.75 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 1/4-28 threaded ports, USB universal actuator
neMESYS high-pressure syringe pumps Cetoni A3921000103 Max force 2600 N
neMESYS mid-pressure syringe pumps Cetoni A3921000131 Max force 1000 N
Power supply Cetoni A3921000127 Base 600, supplies power for up to 4 high pressure pumps
Quartz flow-through sample cell Starna Scientific 3-2.30-Q-1/TC Quartz micro flow cells, 2 mm path length (1 mm available), 2 mm by 2 mm by 30 mm internal dimension
Quartz windows Technical Glass Products NA GE 124 Clear fused quartz ground and polished plates, 11.75 inch by 23.75 inch by 0.375 inch thick
Stainless steel 10-32 coned compression fittings IDEX Health & Science U-321X, U-320X 316 stainless steel ferrule (U-321X) and nut (U-320X) -Valco type, 10-32 coned, for 1/16 inch OD stainless steel tubing
Stainless steel tubing IDEX Health & Science U-102 Stainless Steel Tubing 1/16 inch OD x 0.020 inch ID, 10 cm, various precut lengths available
Syringe pump control software Cetoni T6000000004 QmixElements software for nemesys pumps, QmixSDK software development kit
Thermoelectric air conditioner EIC Solutions AAC-140C-4XT-HC Thermoelectric air conditioner mounted on insulated enclosure to control the pump, valve, mixer, and sample temperature
T-slot railing McMaster-Carr 47065T103 Aluminum t-slotted railing (1.5 inch by 1.5 inch) cut to various lengths
Vapor locking bottle caps  Cole-Parmer EW-12018-02 Four 304 SS port inserts, 1/4"-28 threads, GL45 bottle cap size, PTFE body, SS threads, PP collar

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References

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Ce mois-ci dans JoVE numéro 174 Diffusion neutronique aux petits angles (SANS) diffusion résolue dans le temps mélange à flux arrêté cinétique d’échange moléculaire nanoparticules lipidiques membranes lipidiques vésicules évolution structurelle
Mesure de l’évolution temporelle des matériaux à l’échelle nanométrique avec flux arrêté et diffusion neutronique aux petits angles
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Kelley, E. G., Nguyen, M. H. L., Marquardt, D., Maranville, B. B., Murphy, R. P. Measuring the Time-Evolution of Nanoscale Materials with Stopped-Flow and Small-Angle Neutron Scattering. J. Vis. Exp. (174), e62873, doi:10.3791/62873 (2021).

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