Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Måling af tidsudviklingen af nanoskalamaterialer med stoppet flow og småvinkel neutronspredning

Published: August 6, 2021 doi: 10.3791/62873
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1, 1
1NIST Center for Neutron Research, National Institute of Standards and Technology, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of Windsor, 3Department of Physics, University of Windsor

Summary

Denne protokol præsenterer brugen af et prøvemiljø med stoppet flow til hurtigt at blande flere flydende opløsninger in situ under en småvinkel neutronspredningsmåling og til at studere kinetiske processer på nanometerlængdeskalaer og anden tidsskalaer.

Abstract

Dette papir præsenterer brugen af et stop-flow småvinkel neutronspredningsprøvemiljø (SANS) til hurtigt at blande væskeprøver og studere kinetiske processer i nanoskala på tidsskalaer fra sekunder til minutter. Prøvemiljøet med stoppet flow bruger kommercielt tilgængelige sprøjtepumper til at blande de ønskede mængder væskeprøver, som derefter injiceres gennem en dynamisk mixer i en kvartsglascelle på ca. 1 s. Tidsopløst SANS-dataindsamling synkroniseres med prøveblandingen for at følge udviklingen af nanostrukturen i opløsning efter blanding.

For at udnytte neutronstråletiden mest effektivt bruger vi en række flowvælgerventiler til automatisk at indlæse, skylle og tørre cellen mellem målingerne, hvilket giver mulighed for gentagen dataindsamling gennem flere prøveinjektioner. Prøveinjektioner gentages, indtil der er indsamlet tilstrækkelige neutronspredningsstatistikker. Blandingsopsætningen kan programmeres til systematisk at variere forholdene for at måle kinetikken ved forskellige blandingsforhold, prøvekoncentrationer, additivkoncentrationer og temperaturer. Det mindste prøvevolumen, der kræves pr. injektion, er ca. 150 μL afhængigt af kvartscellens banelængde.

Repræsentative resultater ved anvendelse af dette stop-flow prøvemiljø præsenteres for hurtig lipidudvekslingskinetik i nærvær af et additiv, cyclodextrin. Vesiklerne udveksler ydre folder (udvendige) lipider i størrelsesordenen sekunder og udveksler fuldt ud både indvendige og udvendige lipider inden for få timer. Måling af lipidudvekslingskinetik kræver in situ-blanding for at fange de hurtigere (sekunder) og langsommere (minutter) processer og ekstrahere kinetiske hastighedskonstanter. Det samme prøvemiljø kan også bruges til at undersøge molekylær udveksling i andre typer væskeprøver, såsom lipidnanopartikler, proteiner, overfladeaktive stoffer, polymerer, emulsioner eller uorganiske nanopartikler. Måling af nanoskalaens strukturelle transformationer og kinetik ved udveksling eller reaktion af systemer vil give ny indsigt i processer, der udvikler sig på nanoskala.

Introduction

Småvinkel neutronspredning (SANS) giver en unik måde at måle størrelser, former, interaktioner og organisering af forskellige materialer på længdeskalaer fra ≈1 nm til ≈100 nm 1,2,3. Nyere instrumenter, herunder VSANS-instrumenter (meget småvinkel neutronspredning) med fokuseringsspejle, skubber grænserne mod måling af endnu større længdeskalaer op til ≈1000 nm 4,5. Generelt giver den unikke spredningskontrast, der er forbundet med neutronspredningsmetoder, flere fordele ved måling af tidsudviklingen af nanoskalastrukturer, såsom aggregering af komponenter i farmaceutiske formuleringer6, tværbindings- og geleringsreaktioner i polymersystemer7,8, i mesokrystallisation af membranproteiner9,10, nedbrydning og udfoldning af proteiner11,12 og vækst af silicabaserede materialer13,14,15. Den unikke spredningskontrast gør tidsopløste SANS (TR-SANS) til et nyttigt supplement til andre stop-flow-baserede målinger.

Stop-flow-blandingsmetoder implementeres ofte i småvinkel røntgenspredning (SAXS)16,17,18,19,20,21, fluorescensspektroskopi 22,23,24,25,26 og lysspredning 27,28,29,30. 31,32 eksperimenter til undersøgelse af kinetiske processer på millisekund tidsskalaer. En vigtig forskel mellem SANS og SAXS er, at neutronspredning er en ikke-destruktiv karakteriseringsteknik, og som sådan kan SANS bruges til at måle den samme prøve i timer eller endda dage uden ioniserende strålingsskader på prøven, hvilket kan ske under røntgenspredningseksperimenter med højere flux33. Da gentagne SANS-målinger ikke vil ændre sondemolekylets eller prøvens kemiske struktur, kan tidsudviklingen studeres uden virkninger af f.eks. fotoblegning, som kan komplicere kinetikmålinger, der er afhængige af fluorescens23,24. Desuden kan SANS bruges til at måle stærkt koncentrerede og optisk uigennemsigtige prøver, der ofte er vanskelige at karakterisere med lysbaserede teknikker såsom dynamisk lysspredning.

Ud over at give strukturelle oplysninger om nanoskala kan SANS bruges til at undersøge den lokale sammensætning af disse strukturer gennem variationen i neutronspredningslængdetæthedskontrast. Spredningslængdetætheden (SLD) af forskellige grundstoffer varierer tilfældigt på tværs af det periodiske system og varierer med forskellige isotoper af det samme element. Et almindeligt udnyttet eksempel er hydrogen (1H eller H) og deuterium (2H eller D), som har meget forskellige neutronspredningslængder. Derfor kan hydrogenrige materialer, såsom overfladeaktive stoffer, lipider, proteiner, RNA, DNA og andre polymerer, skelnes fra deutererede opløsningsmidler ved anvendelse af SANS uden signifikant at ændre systemets fysiske egenskaber. Det er dog vigtigt at bemærke, at H/D-udveksling kan påvirke densiteten, hydrogenbindingen og faseovergangstemperaturerne i prøven. Ikke desto mindre er SANS' unikke følsomhed over for brintrige materialer især nyttig i forskning i blødt stof, hvor prøverne af interesse har lavere spredningskontrast og signal i røntgenbaserede teknikker som SAXS. Isotopsubstitution gør også SANS til et kraftfuldt værktøj til at studere molekylær udvekslingskinetik i hydrogenrige materialer ved blot at blande H-mærkede og D-mærkede molekyler. Isotopsubstitution er særlig nyttig i systemer, hvor voluminøse fluorescerende farvestoffer er større end de overfladeaktive stoffer eller lipidmolekyler af interesse og kan påvirke udvekslingskinetikken34,35.

Tidsopløste SANS-målinger er fordelagtige, fordi den målte intensitet er en funktion af tid, længdeskala og SLD-kontrast. Som sådan kan TR-SANS-eksperimenter designes til at undersøge de tidsafhængige ændringer i de rumlige fordelinger og sammensætningerne af prøverne. Disse unikke fordele ved SANS har ført til vigtig indsigt i kinetiske processer i mange bløde materialesystemer såsom overfladeaktive stoffer 36,37,38, emulsioner 39,40,41, lipider 34,42,43,44,45,46,47,48,49 ,50 og polymerer 51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62. De fleste TR-SANS-undersøgelser har fokuseret på tidsskalaer fra minutter til timer. Imidlertid forekommer mange kinetiske processer af interesse på anden tidsskala og er afgørende for at forstå de underliggende mekanismer. Registrering af disse tidlige tidspunkter kræver, at opløsningerne hurtigt blandes og måles in situ, hvor blandingen synkroniseres med dataindsamling under stoppet flowlysspredning 27,28,29,30,31,32, fluorescens 22,23,24,25,26 og røntgen 16,17,18,19,20,21 eksperimenter. Dette arbejde beskriver brugen af et prøvemiljø designet til hurtigt at blande flere væskeprøver og injicere blandingen i en kvartsglascelle til TR-SANS-målinger. Blandeanordningen er en tilpasning af den nyligt udviklede kapillære rheoSANS enhed63 og bruger flere sprøjtepumper og ventiler til at styre prøveblandingen og automatisere cellerensning. Ved at forbinde sprøjtepumper til en række flowvælgerventiler kan flere indløbsstrømme gentagne gange blandes, måles, skylles og tørres for at lette TR-SANS-målinger på sekunders tidsskala.

Den nuværende procedure forudsætter, at prøverne af interesse er blevet identificeret og forberedt. Vi fokuserer på in situ mix-opsætningen og metoder til at indsamle TR-SANS-data. Neutronspredningsdata blev indsamlet på VSANS-instrumentet ved NIST Center for Neutron Research (NCNR); Proceduren bør dog finde anvendelse på andre SANS-instrumenter. Læsere, der er interesseret i at implementere lignende protokoller på andre SANS-instrumenter, bør rådføre sig med de lokale instrumentforskere for at bestemme den optimale instrumentkonfiguration for at maksimere neutronflux på den ønskede længdeskala og tidsskala, der er mest relevant for de kinetiske processer af interesse. De data, der præsenteres her, blev indsamlet ved hjælp af højflux 'hvid stråle' konfiguration på VSANS for at maksimere neutrontællinger ved tab af rumlig opløsning5. Detektorvognene var placeret til at dække en række spredningsvektorer (q), 0,005 Å-1 < q < 0,5 Å-1, svarende til længdeskalaer på ≈130 nm til ≈13 nm. Spredningsvektoren defineres som q = 4π/λ sin (θ/2), hvor λ er neutronbølgelængden, og θ er spredningsvinklen.

Den stop-flow-blandingsanordning, der anvendes til TR-SANS-målingerne, består af flere pumper, skyllesprøjter, prøvesprøjter, flowselektorer samt en dynamisk mixer, prøvecelle og blandet prøvebeholder som vist i figur 1. Alle forseglede væskebaner er placeret inde i et klimatiseret kabinet, som omfatter sprøjter, ventiler, forbindelsesrør, dynamisk mixer og prøveceller. Et programmerbart termoelektrisk klimaanlæg bruges til at styre kabinettemperaturen i området fra 10 ° C til 50 ° C inden for ± 1 ° C. Bemærk, at noget af kabinetisoleringen blev fjernet for at vise enhedens arbejdsdele. Hovedblandeenhedens kabinet er placeret på et translationelt trin på NG3 VSANS-strålelinjen ved NCNR. Prøvelokalets position justeres ved hjælp af oversættelsestrinnet for at placere prøvecellen i neutronstrålens bane (gul stiplet linje).

Figure 1
Figur 1: Et eksempel på opsætning til kombination af stop-flow blanding og småvinkel neutronspredningsmålinger ved VSANS strålelinjen ved NIST Center for Neutron Research. Opsætningen indeholder fire sprøjtepumper, to sprøjter til skylning med opløsningsmiddel og to sprøjter til prøveinjektion, fire pumpevælgerventiler, to blandevælgerventiler, en dynamisk blander, en gennemstrømningskvartscelle og en blandet prøvebeholder. Indfaldende neutroner spredes fra den blandede prøve, der er placeret inde i prøvecellen. Et isoleret kabinet med kvartsvinduer og en termoelektrisk klimatiseret enhed bruges til at styre prøven og alt udstyr ved en konstant temperatur. Den gule stiplede linje viser neutronstrålens vej. Vægtstang = 10 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Enheden afbildet i figur 1 er konfigureret med to prøvesprøjter, to skyllesprøjter og en prøvecelle. Tilsvarende flowdiagrammer for de forskellige trin i protokollen er illustreret i figur 2. De ønskede volumener af de to forskellige prøver injiceres i blanderen og prøvecellen (figur 2A). Når prøvecellen er fyldt, lukkes indløbskoblingsventilen (ISV) og udløbskoblingsventilen (OSV) for at isolere prøvecellen fra den dynamiske mixer og for at forhindre prøvens tilbagediffusion i cellen under TR-SANS-dataindsamling (figur 2B). Før den dynamiske mixer varierer tilslutningsslangen i længde fra 10 cm til 1 m og påvirker ikke blandingsforsinkelsen. Slangeforbindelser mellem den dynamiske mixer og prøvecellen vil dog påvirke blandingsforsinkelsestiden og det krævede prøveinjektionsvolumen. Forskåret rør i rustfrit stål med 0,04 tommer (1 mm) indvendig diameter og 100 mm længde bruges til at forbinde den dynamiske mixer, mixervælgerventilerne (MSV1 og MSV2) og ISV og OSV. Fluorerede slanger med 1 mm indvendig diameter og 115 mm længde bruges til at forbinde ISV og OSV (eller det dynamiske mixerudløb) til prøvecellen. Det samlede tomrumsvolumen, der påvirker blandingsforsinkelsestiden, inkluderer mixerens hulrumsvolumen (0,15 ml), slangen mellem mixerens udløb og prøvecelleindløbet (0,09 ml) og prøvecellevolumenet (0,16 ml). I dette eksempel er det samlede tomrumsvolumen 0,4 ml. De indre hulrumsvolumener af ventiler er ubetydelige sammenlignet med rør-, blande- og prøvecellehulrumsvolumenerne. For eksempel indeholder de anvendte lavtryksvælgerventiler (0,75 mm borediameter) omtrentlige hulvolumener på 4 μL, mens højtryksvælgerventiler og koblingsventiler (0,25 mm borediameter) indeholder omtrentlige hulvolumener på 0,5 μL.

Når TR-SANS-målingen er afsluttet, skubbes prøven ud af cellen med opløsningsmiddel, og skylleopløsningsmidlet pumpes gentagne gange gennem cellen for at fjerne restprøven og rense prøvecellen (figur 2C). Bemærk, at skyllesprøjterne er forbundet til større opløsningsmiddelbeholdere (f.eks. vand og ethanol) via pumpevælgerværdier for at sikre, at der er tilstrækkelige opløsningsmiddelvolumener til rådighed til at rengøre prøvecellen mellem målekørsler. Opløsningsmiddelkilder, prøvekilder og blandede prøvebeholdere, der indeholder brandfarlige væsker, placeres i et separat kabinet uden elektrisk udstyr for at eliminere alle mulige antændelseskilder. Derudover bruges damplåsende flaskehætter til at minimere brandfarlige dampe og opløsningsmiddelfordampning. Endelig tørres prøvecellen med en nitrogengasstrøm for at fjerne det resterende skyllemiddel (figur 2D). Indløbsnitrogengastrykket til blandevælgerventilen reguleres til ca. 2 bar (0,2 MPa, måletryk) ved hjælp af en manuel trykregulator placeret på nitrogengasflasken. Når prøvecellen er tilstrækkeligt renset og tørret, injiceres en nyblandet prøve i prøvecellen til næste målecyklus (blanding og injektion gentages som vist i flowdiagrammet i figur 2A).

Figure 2
Figur 2: Eksempel på flowdiagram med en prøvecelle, to prøveblandinger og to skylleopløsningsmidler til rengøring . (A) Blanding af prøve A (blå) og prøve B (rød) og derefter flydende den blandede prøve (lilla) ind i prøvecellen. B) Under dataindsamlingen angiver anordningen til standset flow, hvor ISV- og OSV-koblingsventilerne er lukket for at isolere prøvecellen og forhindre tilbagediffusion af prøven under dataindsamlingen. C) De rengøringstrin, hvor prøvecellen skylles med skyllemiddel fra SS1 (grøn) efter dataindsamling. D) Tørringstrin, hvor prøvecellen tørres med nitrogengas (orange). Forkortelser: PSV = pumpevælgerventil; MSV = mixervælgerventil; OSV = udløbsafbryderventil; ISV = indløbsventil; SS1 = opløsningsmiddelkilde 1; SSA = prøvekilde A N2 = nitrogengaskilde. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3 viser flowdiagrammer for en lidt anden version, hvor blandingsopsætningen er konfigureret med to separate prøveceller forbundet til de samme kontaktventiler (figur 3A). Mens TR-SANS-data indsamles i prøvecelle 1, skylles prøvecelle 2 (figur 3B) og tørres (figur 3C). Når dataindsamlingen er fuldført for prøvecelle 1, leder indløbskontaktventilen en nyblandet prøve ind i prøvecelle 2 til dataindsamling (figur 3D). Mens TR-SANS-data indsamles i prøvecelle 2, skylles og tørres prøvecelle 1 (figur 3E). Denne vekslende, parallelle proces mellem to prøveceller minimerer tiden mellem efterfølgende prøveinjektioner og maksimerer brugen af neutronstråletid.

Figure 3
Figur 3: Eksempel på flowdiagram med to prøveceller, blanding af to prøver og to skylleopløsningsmidler til rengøring. (A) Prøve A (blå) og prøve B (rød) blandes, hvorefter den blandede prøve (lilla) blandes i prøvecelle 1. (B) Anordningen til standset flow tilstand under dataindsamling på prøvecelle 1, mens prøvecelle 2 skylles med opløsningsmiddel fra SS1 (grøn). C) Anordningen til standset flow tilstand under dataindsamlingen i prøvecelle 1, mens prøvecelle 2 tørres med nitrogengas (orange). D) Når dataindsamlingen af prøvecelle 1 er afsluttet, blandes en ny prøve (lilla) straks og flyder ind i prøvecelle 2. E) Anordningen til standset flow tilstand under dataindsamling i prøvecelle 2, mens prøvecelle 1 skylles med opløsningsmiddel fra SS1 (grøn). Mens den ene prøvecelle måles, rengøres og tørres den anden prøvecelle. Måleprocessen for stoppet flow skifter mellem to prøveceller for at minimere tiden mellem efterfølgende injektioner af prøveblandinger. Forkortelser: PSV = pumpevælgerventil; MSV = mixervælgerventil; OSV = udløbsafbryderventil; ISV = indløbsventil; SS1 = opløsningsmiddelkilde 1; SSA = prøvekilde A N2 = nitrogengaskilde. Klik her for at se en større version af denne figur.

Nedenfor beskrives en trinvis protokol til tilslutning af pumper og slangeledninger, priming af systemet, skylning og tørring af prøvecellen og injektion af den blandede prøve. Selvom enkeltcellekonfigurationen demonstreres for enkelhed (figur 2), kan den fleksible modulære opsætning, protokol og scripts let ændres til at implementere flere sprøjtepumper, ventiler, blandere eller prøvecellekonfigurationer, såsom to-prøvecellekonfigurationen vist i figur 3. Repræsentative rå neutrontællingshastighedsdata indsamlet gennem blandings- og rengøringsinjektionscyklusser er vist i figur 4, mens lipidudvekslingskinetik målt ved 3 forskellige temperaturer og den ekstraherede normaliserede spredte intensitet svarende til den udvekslede fraktion af lipider er vist i henholdsvis figur 5 og figur 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Opsæt og start det stoppede flowsystem.

  1. Tænd for alle pumpens strømforsyninger og dynamiske mixere ved hjælp af afbryderen.
  2. Start alle pumper og ventiler i den grafiske brugergrænseflade til styring af systemet med stoppet flow (GUI) ved at indtaste enhedens konfigurationssti og bruge kommandoerne bus=qmixbus. Bus(), bus.open(), bus.start(), pump=qmixpump. Pump(), pump.enable() og valve=ViciMultiposSelector() (se eksempel på initieringskode, der er tilgængelig i et online open source-lager64).
  3. Kalibrer pumperne, før sprøjterne påsættes, ved hjælp af kommandoen pump.calibrate().
  4. Bekræft, at ventilerne er startet, og flyt til den korrekte vælgerport på kommando ved hjælp af kommandoen valve.setPort () og valve.getPort ().
  5. Tildel den sprøjtetype, der skal bruges til hver pumpe, ved hjælp af kommandoen pump.set_syringe_param(A , B), hvor A er sprøjtecylinderens indvendige diameter (mm), og B er sprøjtens maksimale stempelslagafstand (mm).
  6. Tilslut prøvesprøjterne til sprøjtepumperne.
    1. Når du har sikret dig, at pumperne er kalibreret, skrues rene sprøjtetønder i forbindelsen øverst på pumpen (sprøjtemonteringshoved).
    2. Når du bruger glassprøjter, skal du sikre dig, at sprøjtens monteringshoved løsnes, før påfyldningsvolumen dispenseres, så glassprøjten ikke går i stykker på grund af overdreven kraft fra sprøjtestemplet.
    3. Skru sprøjtestemplet i forbindelsen i bunden af pumpen (sprøjtemonteringshale).
    4. Når sprøjtecylinderen og sprøjtestemplet er forbundet til pumpen, skal du dispensere påfyldningsvolumen af sprøjtetypen ved hjælp af kommandoen pump.empty(), som flytter sprøjtestemplet til toppen af sprøjtecylinderen.
    5. Når du bruger glassprøjter, skal du stramme sprøjtens monteringshoved, når stempelbevægelsen stopper.
  7. Tilslut slangen til prøve- og opløsningsmiddelkilderne, sprøjter, ventiler, blandere, prøveceller og blandet prøvebeholder.
    1. Tilslut sprøjtepumpens slange til pumpevælgerventilerne.
    2. Tilslut pumpevælgerventilslangen til prøvekilderne.
    3. Tilslut pumpevælgerventilslangen til skylleopløsningsmiddelkilderne.
    4. Tilslut pumpevælgerventilslangen til mixervælgerventilslangen.
    5. Tilslut mixervælgerventilslangen til nitrogengaskilden.
    6. Tilslut mixervælgerventilslangen til blandeindløbene.
    7. Tilslut blandeudgangen til indløbskontaktventilen.
    8. Tilslut indløbskontaktventilen til prøvecelleindløbet.
    9. Tilslut prøvecelleudløbet til udløbsafbryderventilen.
    10. Tilslut udløbsafbryderventilen til den blandede prøvebeholder.
  8. Definer alle rør- og ventiltilslutninger, der er foretaget (trin 1.7) i stop-flow-systemets kontrol-GUI ved at indtaste de tilsvarende portnummerforbindelser, der er foretaget til hver ventil (se eksempel på kontrolkode i online open source-lager64).
  9. Beregn rørets tomrumsvolumen mellem blandeindtaget og prøvecelleudløbet, som definerer den mindste mængde prøve, der er nødvendig for at fylde prøvecellen for hver måling.

2. Læg prøven i.

  1. Indstil det ønskede prøvepåfyldningsvolumen og opløsningsmiddelpåfyldningsvolumen i stop-flow-systemets kontrol-GUI ved at indtaste de ønskede tal (se eksempel på kontrolkode i online open source-lager64).
  2. Brug kommandoen pump.aspirate( ) til at trække (aspirere) de ønskede prøve- og opløsningsmiddelvolumener fra deres kilder ind i prøvesprøjterne gennem pumpevælgerventilerne.
    BEMÆRK: Når du først lægger en tom sprøjte, vil der være luft til stede øverst på sprøjten, som skal renses for at prime systemet med prøve og solvens i trin 3.

3. Prim systemet.

  1. Brug kommandoen pump.dispense () til at skubbe al luft ud (dispensere) fra sprøjter, slanger og ventiler. Sørg for, at der dispenseres tilstrækkelig væskemængde fra hver sprøjte til helt at fjerne al luft fra sprøjterne, slangen og ventilerne. Hvis luftbobler er synlige inde i en slange, skal du fortsætte med at dispensere opløsningsmiddel eller prøve, indtil boblerne er fjernet.
  2. Når luften er renset fra systemet, skal du udføre mindst én injektions- og skylleprocedure (uden indsamling af neutronspredningsdata).
    1. Klik for at vælge cellen med navnet Start blandingseksperiment i kontrol-GUI'en.
    2. Når denne celle er aktivt valgt, skal du klikke på knappen Kør (højre trekant) øverst på kontrol-GUI'en eller trykke på Shift - og Enter-tasterne sammen på tastaturet.
    3. Undersøg prøvecellen visuelt for at bekræfte, at der ikke er luftbobler til stede.
      1. Hvis der er luftbobler til stede, gentages protokoltrin 3.1 og 3.2 for yderligere at rense luft fra slangeledningerne.
      2. Hvis der ikke er luftbobler i prøvecellen, skal du fortsætte til trin 4 for at definere de resterende trin i eksperimentprotokollen.

4. Definer stop-flow-blandingsprotokollen i programscriptet (se kodeeksempel i online open source-lageret64).

  1. Indtast temperaturindstillingspunktet for det programmerbare klimaanlæg (AC), der styrer temperaturen på det isolerede kabinet, der omgiver enheden til stoppet flow.
    1. Mens du holder stjerneknappen på AC-styreenheden nede, skal du trykke på pil op og pil ned for at ændre sætpunktets temperatur. Alternativt kan du indtaste det ønskede temperatursætpunkt i kontrol-GUI'en og klikke på Kør.
    2. Vent i 15-30 minutter for at lade kabinettets indre ekvilibrere ved den ønskede temperatur, før du starter de kinetiske eksperimenter.
      BEMÆRK: Det tilgængelige temperaturområde er i øjeblikket mellem 10 °C og 50 °C, og temperaturstabiliteten er ± 1 °C.
  2. Indtast alle trin i skyllesekvensen ved at indtaste de relevante mængder, strømningshastigheder, tider og antal gentagelser i kontrol-GUI'en.
    1. Definer volumenet af hver prøve, der skal injiceres, som definerer den samlede strømningshastighed (Q).
    2. Volumenet af hvert opløsningsmiddel, der skal injiceres under skylningen, defineres.
    3. Definer tørretiden mellem hvert skylleundertrin (ttør).
    4. Definer antallet af skylleundertrin.
    5. Definer de forskellige opløsningsmidler til de efterfølgende skylningstrin.
    6. Definer antallet af skyllegentagelser, der skal udføres efter hver måling (nskylning).
    7. Definer tiden til fuldstændig tørring af prøvecellen og blanderen, og sørg for en ren prøvecelle til den efterfølgende prøveinjektion (tdry_final).
  3. Definer alle trin i prøveinjektionssekvensen ved at indtaste de relevante volumener, strømningshastigheder og tider i kontrol-GUI'en for stoppet flowsystem.
    1. Volumen af hver prøve, der skal injiceres, og strømningshastigheden defineres.
    2. Beregn forsinkelsestiden (tforsinkelse) fra tomrumsvolumen (V void) og den samlede strømningshastighed (tdelay = Vvoid / Q).
      BEMÆRK: Forsinkelsestiden er den tid, det tager at fylde prøvecellen med den blandede prøve.
    3. Definer den ønskede anskaffelsestid for TR-SANS-dataene, således at hele den kinetiske proces af interesse har fundet sted (tscatt).
    4. Indstil ventetiden mellem slutningen af spredningseksperimentet og begyndelsen af skyllecyklusserne (tvent).
      BEMÆRK: Denne ventetid skal være mindst 100 s, hvis prøveneutrontransmissionen skal måles, før den skylles ud af cellen. Prøveoverførslen er nødvendig under databehandlingen for at reducere dataene til absolut intensitet.
    5. Definer antallet af injektionscyklusser, der skal udføres med skyllesekvenser mellem hver injektion, der er defineret i trin 4.2 (n-cyklus).
  4. Beregn den samlede tid for en enkelt dataindsamlingscyklus med stoppet flow (t-cyklus) ved hjælp af ligning (1).
    T-cyklus = nskyl × (t-forsinkelse + ttør) + tdry_final +t-forsinkelse + t-scatt (1)
    hvor nskylning = antal skyllegentagelser (trin 4.2.6) tforsinkelse = forsinkelsestid for den standsede flowanordning (trin 4.3.2) ttør = tørretid mellem hvert skylleundertrin (trin 4.2.3) tdry_final = tid til fuldstændig tørring af prøvecellen og blanderen (trin 4.2.7) tscatt = ønsket TR-SANS dataindsamlingstid (trin 4.3.3)

5. Definer småvinkel neutronspredningsparametre i SANS instrument kontrol GUI.

  1. Bestem længdeskalaer og q-interval af interesse for hver prøve.
  2. Definer instrumentkonfigurationen for at dække det ønskede q-område af interesse, samtidig med at neutronfluxen maksimeres ved prøven.
  3. Indstil den samlede VSANS-dataindsamlingstid i GUI'en til styring af SANS til den beregnede cyklustid i trin 4.4 (dataindsamlingstid for neutronspredning =t-cyklus).
  4. Indstil prøvetransmissionens måletid til 100 s i SANS-instrumentets kontrol-GUI.
  5. Brug GUI'en til styring af SANS-instrumentstyring til at aktivere dataindsamling i hændelsestilstand ved at skrive GenerateEventModeData true på kommandolinjen.

6. Indsaml standardspredningsmålinger til datareduktion, før du begynder det stoppede flow-eksperiment for at behandle TR-SANS-dataene.

  1. Mål baggrundsspredningen.
    1. Sørg for, at den lokale instrumentlukker er lukket.
    2. Fastgør den blokerede stråleprøve bag på prøveåbningen, fastgør det lokale instrumentmiljø, og åbn den lokale instrumentlukker.
    3. Definer den blokerede tid til indsamling af strålespredningsdata i softwaren, og indsaml blokerede strålespredningsdata, der tæller i samme varighed som den længste spredningsdataindsamlingstid (tscatt).
    4. Når dataindsamlingen er fuldført, skal du lukke instrumentlukkeren og fjerne den blokerede stråleprøve fra prøveåbningen.
  2. Mål den tomme cellespredning.
    1. Sørg for, at prøvecellen er skyllet grundigt og tørret.
    2. Åbn den lokale instrumentlukker.
    3. Opsaml den tomme celletransmissionsmåling i 100 s.
    4. Indsaml målingen af den tomme cellespredning, der tæller mindst den længste anskaffelsestid (tscatt).

7. Start eksperimentet med stoppet flow.

  1. Start VSANS spredning af dataindsamling i hændelsestilstand .
    1. Sørg for, at det lokale instrumentområde er sikkert, og åbn derefter lukkeren til det lokale instrumentlys.
    2. Start SANS-dataindsamlingen ved hjælp af SANS-instrumentstyringssoftwaren på instrumentcomputeren ved at trække og slippe de ønskede kørsler i instrumentkøen.
      BEMÆRK: For at sikre, at de tidligste tidspunkter måles, skal du starte dataindsamlingen, før du starter blandingseksperimentet med stoppet flow. Dataene vil blive efterbehandlet på et senere trin for at tage højde for forsinkelsestiden (tforsinkelse).
  2. Start blandingseksperimentet med stoppet flow i kontrol-GUI'en.
    1. Vælg notesbogcellen med navnet Start blandingseksperiment i systemstyrings-GUI'en for stoppet flow.
    2. Når denne celle er aktivt valgt, skal du klikke på knappen Kør (højre trekant) øverst i enhedskontrolprogrammet med stoppet flow eller trykke på Shift - og Enter-tasterne sammen på tastaturet.
    3. Bekræft, at den stop-flow-blandingsprotokol, der er defineret i afsnit 4, er begyndt at fungere.
    4. Føj 100 s transmissionsmåling til VSANS-instrumentkøen efter spredningskørslen ved hjælp af SANS-instrumentstyrings-GUI'en.
    5. Tilføj en spredningsmålekørsel og en transmissionsmålekørsel til instrumentkøen for hver resterende stop-flow-blandingscyklus (ncyklus - 1, trin 4.3.5) i SANS-instrumentstyrings-GUI'en.

8. Behandl og reducer data for at fjerne alle baggrunde, korrigere for detektorfølsomhed og korrigere for prøveoverførsel.

  1. Download spredningsdatafilerne og tilknyttede hændelsesfiler fra serveren.
    BEMÆRK: Der genereres separate detektorhændelsesfiler efter hver VSANS-måling, en hændelsesfil for hver aktiv detektorvogn (f.eks. for-, midter- og/eller bagdetektor).
  2. Binspredningsdataene til ønskede tidsbakker ved hjælp af kommandoen events = Rebin (filnavn) efterfulgt af kommandoen e vents.do_rebinning (timebins), hvor inputfilnavnet svarer til navnet på den ønskede SANS-datafil, og timebins er en liste over de ønskede tidsbingrænser i sekunder.
    BEMÆRK: Hvis input-timebins indtastes som et enkelt tal i stedet for en liste, vil dataene blive binned i N antal bins med samme tidsbredder, hvor N er input-timebins (se softwarescripts leveret af beamline og tilgængeligt online open source-lager 64).
  3. Reducer de binnede spredningsdata ved hjælp af softwaren, der leveres beamline65.

9. Analyser TR-SANS-dataene.

  1. Beregn procestiden af interesse (tproces) fra måletiderne ved hjælp af ligning (2).
    tproces = ti - tstop + tforsinkelse (2)
    Hvor ti er måletidsbeholderne, der starter, efter at flowet er stoppet, tstop er måletiden straks, når flowet stoppes, og tforsinkelse er forsinkelsestiden.
  2. Den q-afhængige intensitet I(q) afbildes som funktion af procestiden ved hjælp af de tidsplaceringer, der er defineret i trin 8.2, ogt-processen beregnet i trin 9.1.
    BEMÆRK: Den tidligste tilgængelige procestid er begrænset aft-forsinkelse. For at måle tidligere procestidspunkter skal du øge den samlede strømningshastighed (Q) eller reducere det samlede tomrumsvolumen (Vvoid).
  3. Uddrag de kinetiske parametre af interesse fra ændringen i I (q) som en funktion af procestiden.

10. Afslut eksperimentet.

  1. Sluk for neutronstrålen ved at lukke den lokale instrumentlukker.
  2. Udfør en strålingskontrol ved hjælp af en strålingsmonitor, der leveres af strålelinjen, før du frakobler dele, slanger eller losser prøver eller blandede prøvebeholdere.
  3. Overfør sprøjterne, slangen og den blandede prøvebeholder til sundhedsfysikafdelingen.
  4. Udfyld sundhedsfysiske formularer og vent på evaluering af sundhedsfysikpersonale.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De repræsentative neutrondata, der er vist her, måler lipidudvekslingskinetik i nærvær af methyl-β-cyclodextrin (mβCD), et additiv, der katalyserer lipidudvekslingen mellem vesikler med valutakursen (ke)66,67. Tidligere fluorescensundersøgelser har vist, at ke afhænger af mβCD-koncentrationen, og halveringstiden for udskiftningsprocessen er i størrelsesordenenminutter 68. De nuværende eksperimenter bruger stop-flow TR-SANS til at måle mβCD-katalyseret lipidudveksling mellem vesikler på sekunders tidsskala. To isotopisk forskellige lipidvesikelpopulationer blev fremstillet; den ene vesikelpopulation blev fremstillet med halehydrogenerede dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) lipider (H-lipidvesikler i figur 5), og den anden vesikelpopulation blev forberedt med hale-deutererede DMPC (DMPC-d54) lipider (D-lipidvesikler i figur 5). En molfraktion på 0,05 (5 mol%) ladet dimyrisotylphosphatidylglyercol (DMPG) lipid blev tilsat til både DMPC og DMPC-d54 tørre lipidpulvere for at fremme unilamellær vesikeldannelse69.

Separate H-vesikel- og D-vesikelopløsninger blev fremstillet ved hydrering af de respektive lipidfilm i et opløsningsmiddel indeholdende 45 volumenprocent tungt vand (D2O) og 55 volumenprocent vand (H2O). D2O/H2O-opløsningsmiddelsammensætningen blev beregnet således, at opløsningsmidlets neutronspredningslængdetæthed (ρ) matchede en tilfældig blanding af H-lipiderne og D-lipiderne (Δρ = ρ lipid- ρsolvent = 0). Med andre ord ville en tilfældigt blandet H/D-vesikel være 'usynlig' for neutronerne og generere nul sammenhængende neutronspredning. Unilamellære vesikelopløsninger blev fremstillet ved at fryse-optø opløsningerne fem gange og derefter ekstrudere de enkelte opløsninger gennem et polycarbonatfilter med porer med en diameter på 100 nm. Vesikelopløsningerne blev ekstruderet frem og tilbage mellem to sprøjter og filteret i alt 31 gange ved 30 °C. Derefter blev et lille volumen af en koncentreret mβCD stamopløsning fremstillet i den samme D2O/H2O opløsningsmiddelblanding tilsat til vesikelopløsningerne. Den endelige lipidkoncentration var 14 mmol/L (mM) og mβCD koncentrationen var 30 mM. De enkelte vesikelopløsninger blev ekvilibreret i mindst 30 minutter med den tilsatte mβCD, før opløsningerne blev lagt i prøvesprøjterne i blandingsanordningen med stoppet flow.

Et eksempel på de målte neutrontal over flere injektionscyklusser er vist i figur 4A. Hver cyklus bestod af 9 skylletrin, 1 tørretrin og 1 prøveinjektionstrin. Kun tællehastigheder målt på den midterste detektorvogn i VSANS-instrumentet vises for klarhedens skyld. Lignende tendenser blev fundet på den forreste detektorvogn, hvilket svarede til data indsamlet ved større spredningsvinkler eller højere q-værdier. Tællehastigheden steg med hver skylningsmiddelinjektion (opløsningsmiddel S1 og opløsningsmiddel S2) og vendte tilbage til de tomme cellebaselinetællinger, når opløsningsmidlet blev skubbet ud af cellen med nitrogengas og tørret. Den sidste celleskylning var med S2, som var ethanol i dette eksempel, og cellen blev tørret en sidste gang med nitrogengas i 3 minutter før prøveinjektion. Kort efter at prøven blev injiceret i cellen, steg neutrontællingshastigheden, og data blev indsamlet kontinuerligt i 5 minutter. Den repræsentative prøve, der blev injiceret i eksempeldataene i figur 4A , var en saltbufferbaggrund. Udsvingene i den målte intensitet over tid afspejler variationerne i baggrundsneutrontalshastigheden og afspejler ikke en ændring i den gennemsnitlige prøvesammensætning. Den komplette cyklus med skylning, tørring, blanding og injektion af prøven blev gentaget en ekstra gang i eksemplet i figur 4A, hvor hver cyklus varede i alt 15 minutter.

De individuelle H-mærkede og D-mærkede lipidvesikelopløsninger blev blandet på tidspunktet fort-blanding og flød straks ind i prøvecellen. Den målte neutrontalshastighed steg og nåede derefter en maksimal værdi, når prøvecellen blev fyldt vedt-påfyldning, som vist i figur 4B. Den forløbne tid, der kræves for at udfylde prøvecellen, kaldes forsinkelsestiden t forsinkelse og er givet ved tforsinkelse = tfyld- tblanding. Hvis hulrumsvolumen (V void) mellem blanderen og prøvecellen er kendt, og den samlede strømningshastighed (Q) er kendt, kan t-forsinkelsen også beregnes somt-forsinkelse = V void/Q (se protokoltrin 4.3.2), som også er den gennemsnitlige opholdstid for væskeprøven til at komme ind i blanderen og forlade prøvecellen. Efter at have nåett-fyldning blev strømmen fortsat med en konstant strømningshastighed for at sikre, at cellen var fyldt og nået stabil tilstand. Strømmen blev derefter straks stoppet ved tstop. Den gennemsnitlige neutrontællingshastighed forblev konstant som funktion af måletiden mellemt-fyld ogt-stop, fordi strømningshastigheden gennem prøvecellen var konstant, og prøven inden for neutronstrålebanen derfor var i stabil tilstand. Med andre ord svarer de data, der måles ved t-stop, til den prøve, der er blevet blandet og udviklet vedt-forsinkelse = tfill- t-blanding = Vvoid/Q. De binnede måletider ti indsamlet umiddelbart efter tstop er de vigtigste kinetiske data af interesse.

I figur 4C afbildes neutrontællingerne fra prøven af blandede lipidvesikler ved tre forskellige temperaturer som en funktion af den korrigerede procestidsskala (t-proces), som er den procestid af interesse, der er korrigeret for steady-state-strømningsperioden og forsinkelsestiden. Procestidsskalaen blev beregnet ved t proces = t i- t stop + tforsinkelse eller tilsvarende tproces = t i- tstop + t fyld- tmix. SANS-data blev indsamlet løbende i figur 4 i såkaldt hændelsestilstand. Under dataindsamling i hændelsestilstand registreres hver detekteret neutronhændelse med et unikt tidsstempel og dets x- og y-placering på den todimensionelle neutrondetektor. Data om hændelsestilstand efterbehandles derefter i de ønskede tidsbeholdere (t i)i figur 4B.

Data om hændelsestilstand inden for det tilgængelige procestidsvindue af interesse (dvs. neutronspredning indsamlet ved hvert t i eftert stop i figur 4B) blev rekonstrueret til et todimensionelt (2D) detektorbillede for den pågældende tidsbeholder ved hjælp af protokoller og scripts, der er tilgængeligei online open source-lageret64. Hvert 2D-detektorbillede blev derefter behandlet ved hjælp af datareduktionsrutiner for at trække de forskellige baggrundskilder fra, korrigere for prøvetransmission og detektoreffektivitet og azimutalt integrere 2D-detektordataene i intensitet (I) vs. spredningsvektor (q) plots65. Dataene i figur 5 blev bindet i lige (3 s) tidsbeholdere og er repræsentative for den tids- og længdeskalaafhængige information, der kan opnås fra en TR-SANS-måling. I lighed med den totale råtællingshastighed, der er vist i figur 4B, falder den q-afhængige intensitet I(q) i tid, når lipiderne i den ydre folder udveksles og blandes tilfældigt mellem forskellige vesikler.

Data er vist i figur 5 for lipidudvekslingskinetikken målt ved 3 forskellige temperaturer. Hvert plot viser de data, der er indsamlet i de første 110 minutter efter blanding. Den målte intensitet falder med en størrelsesorden ved de laveste q-værdier ved 36 °C og 30 °C, hvilket svarer til lipidvæskefasen. I mellemtiden ændres dataene om spredt intensitet betydeligt langsommere med tiden ved 20 °C, hvilket indikerer, at kinetikken for udveksling af ydre foldere er meget langsommere i lipidgelfasen.

Den målte spredningsintensitet, I(q), er relateret til SLD-kontrasten som Equation 1, hvor Δρ er SLD-forskellen mellem vesiklen og det omgivende opløsningsmiddel. Denne gennemsnitlige SLD-kontrast er direkte relateret til det relative antal H-lipider og D-lipider i en vesikel på et givet tidspunkt. Som sådan kan den målte spredningsintensitet på et givet tidspunkt normaliseres for at bestemme den brøkdel af lipidpopulationen, der er udvekslet. Denne normalisering opnås ved at indsamle to yderligere målinger, herunder: (1) den målte intensitet I(0) på tidspunktet t = 0, når der ikke er lipidudveksling mellem vesikler, og (2) den målte intensitet I(∞) på tidspunktet t = ∞, når alle lipiderne er udvekslet, og populationerne er ligevægtede. Den normaliserede tællehastighed, 42, Equation 2 er plottet som en funktion af procestiden for de forskellige temperaturer i figur 6. I dette eksempel er I(t) den q-integrerede intensitet ved procestidspunktet t (baggrundssubtraheret intensitet integreret som funktion af q), I(∞) er den q-integrerede intensitet på uendelig tid, efter at alle lipider er udvekslet (hvilket skal svare til opløsningsmiddelbaggrundsspredningen), og I(0) er den q-integrerede intensitet på tidspunktet t = 0 (uden lipidudveksling). I(0) blev målt for en blandet prøve under faseovergangstemperaturen ved 20 °C, hvor udskiftningen var langsom, og I(∞) blev målt i en separat prøve, der havde ekvilibreret i mere end 36 timer ved 40 °C og havde og fuldt udskiftet H-lipider og D-lipider.

Den normaliserede tællehastighed skal henfalde fra R(t) = 1 ved procestidspunktet t = 0 til R(t) = 0 ved t = ∞ og er direkte relateret til SLD-kontrast i prøven og derfor omfanget af lipidudveksling 27,28,29,30,31,32,33,34,35 . Bemærk, at de tidligste målte R(t)-data ikke begynder ved R(t)=1 ved 30 °C og 36 °C, hvilket indikerer, at der forekom en signifikant mængde lipidudveksling i løbet af de første 3 sekunder efter blanding, som ikke var eksperimentelt tilgængelig på grund af forsinkelsestiden (t-forsinkelse = 2,4 s) for den anvendte blandingsprotokol for stoppet flow. I mellemtiden forblev den målte R(t) ved 20 °C omtrent konstant i de første (2-3) minutter. For lipidudvekslingskinetikken målt ved 30 °C og 36 °C henfaldt R(t) hurtigt til ≈0,5 inden for 100 s, hvilket tyder på, at de ydre indlægsseddellipider er fuldstændigt udvekslet og ekvilibreret inden for få minutter. Derfor blev indfangning af den mβCD-katalyserede lipidudveksling muliggjort ved hjælp af standset flow SANS og ville være vanskelig at fange med manuel pipetteblanding. Indfangning af endnu tidligere procestidspunkter (t < 3 s) kræver en anden mixertype med mindre tomrumsvolumen, mindre slangehulrumsvolumener og højere samlede strømningshastigheder for at reducere forsinkelsestiden.

R(t) fortsatte med at henfalde i længere tid, da lipiderne flip-flop mellem de indre og ydre foldere. TR-SANS-data for den langsommere flip-flop-proces (t > 5 min) kan indsamles med diskrete prøver blandet manuelt og lægges i standard SANS-prøveceller, da den manuelle pipetteblandingsmetode tager ca. 5 min. Tilsvarende var lipidudvekslingen ved 20 °C i lipidgelfasen langsom nok til at blive blandet og målt diskret, og denne måling behøvede ikke nødvendigvis at blive undersøgt med stop-flow-blandingsmetoden. Målinger af kinetikprocesser på tidsskalaer på flere minutter til timer er mere effektive, når prøverne blandes ved manuel pipetteblanding. Imidlertid vil kinetiske processer på tidsskalaer mindre end minutter kræve denne stop-flow-blanding og TR-SANS-måleprocedure.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative data om rå neutrontal indsamlet gennem blandings- og rengøringsinjektionscyklusser . A) Eksempel på neutrontalshastigheden (midterste detektor) som funktion af tiden under gentagne skyllesekvenser, tørresekvens og injektionssekvens for blandede prøver over flere cyklusser. Prøven i (A) var en saltbufferbaggrund, og ændringerne i intensitet over tid afspejler variationerne i baggrundstællingshastigheden, ikke en ændring i prøven. B) Monitornormaliseret neutrontalshastighed som funktion af forsøgstiden efter injektion af blandede H-lipid- og D-lipidvesikler ved 30 °C. De lodrette stiplede linjer angiver blandingens starttid (tmix), påfyldningstiden (tfill), flowstoptiden (tstop) og time binning region (ti). Henfaldet i tællehastighed efter tstop skyldes tab af kontrast i prøven som lipidudveksling mellem vesikler. (C) Normaliserede neutrontalshastigheder overvåges som funktion af udvekslingsprocestiden for de første 100 sekunder af eksperimentet ved (blå) 20 °C, (grøn) 30 °C og (rød) 36 °C. Hændelsestilstandsdataene behandles i 1 s bakker. Forkortelser: S1 = opløsningsmiddel 1; S2 = opløsningsmiddel 2; tmix = forsøgstidspunkt, hvor prøveopløsningerne blandes tfyld = forsøgstidspunkt, hvor prøvecellen fyldes tstop = forsøgstidspunkt, hvor strømmen stoppes tproces = beregnet kinetisk procestid af interesse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Illustration af katalyseret udveksling af det ydre lag af lipidvesikler og tilsvarende ændringer i den spredte intensitet (I) som funktion af spredningsvektoren (q) ved forskellige temperaturer. Skematisk visning af lipidudveksling mellem H-lipid- og D-lipidvesikler efter (A) indledende blanding ved t = 0 og (B) udveksling af det ydre lag katalyseret af methyl-β-cyclodextrin (mβCD). Reduceret neutronspredningsintensitet som funktion af spredningsbølgevektor q. Eksperimenter med blanding med stoppet flow og VSANS-målinger blev gentaget ved (C) 36 °C, (D) 30 °C og (E) 20 °C. De præsenterede data blev binned i 3 s intervaller i løbet af de første 10 minutter efter blanding ved hver specificeret temperatur. Fejlbjælker er den udbredte usikkerhed fra optællingsstatistikken og repræsenterer en standardafvigelse. Forkortelser: ke = hastighedskonstant for intervesikellipidudveksling; mβCD = methyl-β-cyclodextrin; kf = hastighedskonstant for inter-brochure lipidudveksling, også kaldet lipid flip-flop; l(q) = målt SANS-intensitet med enheder af cm-1 ; q = spredningsvektor. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Normaliseret spredt intensitet svarende til den brøkdel af lipider, der udveksles, der kan modelleres for at ekstrahere hastighedskonstanter for de kinetiske processer af interesse . A) Lipidudveksling mellem vesiklernes ydre folder forekommer på en tidsskala mellem 3 s og 600 s målt ved (blå) 20 °C, (sort) 30 °C og (rød) 36 °C. Indsatsen i figuren zoomer ind på de første 60 sekunder af den kinetiske proces. Fejlbjælker er den udbredte usikkerhed fra den numeriske integration af spredningsintensiteterne og repræsenterer en standardafvigelse. Forkortelser: R(t) = normaliseret spredt intensitet; tproces = korrigeret procestid af interesse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den aktuelle procedure beskriver blandeanordningen og trinnene til udførelse af TR-SANS-målinger med stoppet flow. Enheden og protokollen er optimeret til væskeprøver med lav viskositet, hvor tidsskalaerne af interesse er ≈1 s til 5 min. For tidsskalaer på mere end 5 minutter kan det være lettere og ønskeligt manuelt at blande prøverne og indlæse dem i standardspredningsceller, især for prøver med høj viskositet, geler eller pastaer. Adgang til tidsskalaer mindre end 1 s kræver et andet blandingsapparat, lavere totale tomrumsvolumener og højere samlede strømningshastigheder for at sænke forsinkelsestiden. Det er også vigtigt at bemærke, at undersøgelse af kinetiske processer på disse korte tidsskalaer sandsynligvis vil kræve gentagne prøveinjektioner for at akkumulere tilstrækkelig spredningstællingsstatistik på millisekundtidsskalaen med TR-SANS. Hvis det samlede prøvevolumen er begrænset, kan det være ønskeligt at anvende en teknik med højere flux, såsom lysspredning eller røntgenspredning, som kræver færre prøveinjektioner eller mindre prøvevolumen pr. injektion, forudsat at der er tilstrækkelig spredningskontrast med lys eller røntgenspredning.

Denne modulære stop-flow SANS-tilgang skaber flere vigtige fordele og ulemper sammenlignet med kommercielt tilgængelige stop-flow-instrumenter, der er optimeret til neutronspredningseksperimenter. De vigtigste fordele omfatter (1) vekslende TR-SANS-målinger mellem forskellige prøveceller i skylleperioder for at maksimere brugen af neutronstråletid, (2) tilpasning af antallet af sprøjter, sprøjtevolumener og mixertyper til ternær prøveblanding eller andre mere komplekse krav til prøveblanding og (3) mulighed for længere måleperioder ved at isolere prøvecellen og eliminere tilbagediffusion på længere tidsskalaer (>10 min). Selvom det ikke er implementeret her, vil modulariteten af blandingscelledesignet også muliggøre samtidig dataindsamling med flere målemetoder, såsom kæmning af SANS-, UV-Vis- og fluorescensmålinger70. To vigtige ulemper ved denne modulære opsætning inkluderer (1) relativt længere blandingsforsinkelsestider (1 s til 3 s) sammenlignet med andre systemer, der kan give 1 ms til 100 ms forsinkelsestider, og (2) et mindre driftstemperaturområde (10 °C til 50 °C) sammenlignet med andre tilgængelige systemer, der kan få adgang til driftstemperaturer fra -20 °C til mere end 80 °C.

Indsamling af foreløbige SANS-data om prøver af interesse inden udførelse af in situ-blandingseksperimenter er vigtig for at indsamle de bedste TR-SANS-data, især i eksperimenter designet til at overvåge molekylær udvekslingskinetik som eksemplet præsenteret her. Bestemmelse af nøjagtige værdier af I (0) og I (∞) er afgørende for beregning af nøjagtige værdier af den normaliserede intensitet, R (t), der er modelleret for at udtrække de ønskede kinetiske parametre. Værdien af I(0) kan beregnes direkte ud fra de målte spredningsintensiteter for de separate H-vesikel- og D-vesikelstammer, og I(∞) kan bestemmes ved at fremstille en separat vesikelprøve fremstillet af en 50/50 blanding af H-lipider/D-lipider. Spredningsdataene fra disse kontrolprøver kan også bruges til at bestemme det optimale q-område og SANS-instrumentkonfigurationen til TR-SANS-målingen for at maksimere signalet og verificere progressionen af udvekslingskinetik under TR-SANS-eksperimenterne. Hvis den målte intensitet på det første tidspunkt efter blanding ikke er lig med den beregnede I(0), kan det være nødvendigt med hurtigere blandingstider for at registrere alle de relevante processer. Når den målte intensitet har nået I(∞), er udskiftningsprocessen afsluttet, og cellen kan tømmes og rengøres som forberedelse til den næste injektion.

For succesfuldt at blande væskeprøve til TR-SAN er det afgørende at sikre, at alle sprøjter, ventiler og slangeledninger er grundet og luftfri, og at alle slangeforbindelser er sikre for at forhindre lækage. Hvis disse kritiske trin ikke udføres korrekt, kan det resultere i unøjagtige blandingsvolumener eller unøjagtige absolutte spredningsintensiteter. For eksempel vil luftbobler fanget i prøvecellen reducere den målte SANS-intensitet på grund af reduceret prøvevolumen i neutronstrålebanen. Alternativt kan luftbobler producere 'striber' eller 'flares' af høj intensitet på detektoren på grund af strålebrydning ved luft-væske-grænsefladen. Uventede ændringer i den målte spredningsintensitet over tid kan indikere dårlig prøveblanding, ventillækage, luftbobler i prøvecellen eller prøvens tilbagediffusion.

Indsamling af en transmissionsmåling for hver prøve under et TR-SANS-eksperiment er afgørende for at reducere de indsamlede data til en absolut intensitet. Det er muligt samtidig at indsamle sprednings- og transmissionsdata på nogle SANS-instrumenter, hvilket forenkler den overordnede TR-SANS-dataindsamlingsprogrammering; Dette er dog ikke muligt på alle instrumenter, herunder VSANS-instrumentet, der anvendes i denne protokol. Da målingerne af prøvetransmission og prøvespredning krævede forskellige instrumentkonfigurationer, blev transmissionsmålinger indsamlet i slutningen af spredningsmålingerne (protokoltrin 7.2.4) for at sikre, at spredningsdata blev målt på de tidligste tidspunkter, efter at prøven blev injiceret i cellen. Transmissionen afhænger kun af den samlede elementære sammensætning, prøvebanelængden og neutronbølgelængden. Derfor bør transmissionen ikke ændres, hvis den samlede elementære sammensætning forbliver konstant gennem hele det tidsopløste eksperiment. Store forskelle i transmissionsværdierne mellem gentagne kørsler af den samme prøve indikerer et problem fra enten inkonsekvente blandingsprøvevolumener, ufuldstændig påfyldning af prøvecellen, luftbobler eller ventillækage og prøvetilbagestrømning under eksperimentet.

En unik fordel ved TR-SANS er, at den målte intensitet er afhængig af spredningsvektoren (q) og kan bruges til at undersøge rumlige ændringer på nanoskala. Når TR-SANS kombineres med stop-flow-blandingsanordningen, kan TR-SANS undersøge disse nanoskalaændringer på anden til minut-tidsskalaen, hvilket giver indsigt i selvmontering og udveksling af overfladeaktive stoffer og lipider, polymer- og proteinaggregering ved tilsætning af hjælpestoffer, nanopartikelvækst og henfald eller udveksling af indkapslede produkter i emulsioner. Anordningen til stoppet flow kan konfigureres med flere prøvesprøjtepumper og sprøjter for at lette blandingen af to eller flere væskeprøver. Denne fleksibilitet muliggør systematisk undersøgelse af additiver på kinetik af interesse. For eksempel kunne forskellige volumener af en koncentreret antimikrobiel peptidopløsning blandes med H-vesikel- og D-vesikelopløsninger for at studere virkningerne af peptidkoncentration på lipidudvekslingskinetik45,46. Da alle forseglede væskebaner desuden er indkapslet i et temperaturstyret kabinet, som omfatter prøvesprøjter, ventiler, blandere og slanger, kan systemets temperatur ændres for at ekstrahere de termodynamiske parametre relateret til de kinetiske processer af interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Adgang til NG3 VSANS blev leveret af Center for High-Resolution Neutron Scattering, et partnerskab mellem National Institute of Standards and Technology og National Science Foundation under aftale nr. DMR-2010792. M.H.L.N anerkender finansieringen fra Mitacs Globalink (Canada). Identifikationen af kommercielle produkter eller handelsnavne er for at fremme forståelsen og indebærer ikke godkendelse eller anbefaling fra National Institute of Standards and Technology.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynamic mixer Analytical Scientific Instruments 462-0150A Magnetically coupled rotor, binary dynamic mixer assembly (ternary type available), 0.15 mL dead volume (larger dead volume available)
Fluoropolymer tubing IDEX Health & Science 1507L PFA Tubing Natural 1/16 inch OD x 0.040 inch ID x 50 ft
Fluoropolymer 1/4-28 flangeless fittings IDEX Health & Science XP-245 PFA flangeless fitting with ferrules, 1/4-28 threading, 1/16 inch OD tubing
Glass syringes Hamilton Company 81660 Hamilton 1000 series syringes, 10 mL (81660), model 1010 C syr, 1/4"-28 thread termination, other volumes available
High-pressure flow selector valves Vici Valco C85X-1570EUTB Vici 10 position selector valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure switch valves Vici Valco C82X-1574EUHB Vici 4 port switch valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure syringes Cetoni A2019000358 3 mL stainless steel syringe, 510 bar max, 21 mL/min flow rate max
Low-pressure flow selector valves Vici Valco C25-3180EUHB Vici 10 position selector valves, max 250 psi liquid, 0.75 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 1/4-28 threaded ports, USB universal actuator
neMESYS high-pressure syringe pumps Cetoni A3921000103 Max force 2600 N
neMESYS mid-pressure syringe pumps Cetoni A3921000131 Max force 1000 N
Power supply Cetoni A3921000127 Base 600, supplies power for up to 4 high pressure pumps
Quartz flow-through sample cell Starna Scientific 3-2.30-Q-1/TC Quartz micro flow cells, 2 mm path length (1 mm available), 2 mm by 2 mm by 30 mm internal dimension
Quartz windows Technical Glass Products NA GE 124 Clear fused quartz ground and polished plates, 11.75 inch by 23.75 inch by 0.375 inch thick
Stainless steel 10-32 coned compression fittings IDEX Health & Science U-321X, U-320X 316 stainless steel ferrule (U-321X) and nut (U-320X) -Valco type, 10-32 coned, for 1/16 inch OD stainless steel tubing
Stainless steel tubing IDEX Health & Science U-102 Stainless Steel Tubing 1/16 inch OD x 0.020 inch ID, 10 cm, various precut lengths available
Syringe pump control software Cetoni T6000000004 QmixElements software for nemesys pumps, QmixSDK software development kit
Thermoelectric air conditioner EIC Solutions AAC-140C-4XT-HC Thermoelectric air conditioner mounted on insulated enclosure to control the pump, valve, mixer, and sample temperature
T-slot railing McMaster-Carr 47065T103 Aluminum t-slotted railing (1.5 inch by 1.5 inch) cut to various lengths
Vapor locking bottle caps  Cole-Parmer EW-12018-02 Four 304 SS port inserts, 1/4"-28 threads, GL45 bottle cap size, PTFE body, SS threads, PP collar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Melnichenko, Y. B., Wignall, G. D. Small-angle neutron scattering in materials science: Recent practical applications. Journal of Applied Physics. 102 (2), 021101 (2007).
  2. Grillo, I. Small-angle neutron scattering and applications in soft condensed matter. Soft Matter Characterization. Borsali, R., Pecora, R. , Springer. Dordrecht. (2008).
  3. Hollamby, M. J. Practical applications of small-angle neutron scattering. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (26), 10566-10579 (2013).
  4. Pipich, V., Fu, Z. KWS-3: Very small angle diffractor with focusing mirror. Journal of large-scale research. 1, 31 (2015).
  5. Kline, S. 2019 NCNR Annual Report, Special Publication (NIST SP). , National Institute of Standards and Technology. Gaithersburg, MD. (2019).
  6. Gilbert, P. H., et al. Preservative induced polysorbate 80 micelle aggregation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 10 (6), 2395-2404 (2021).
  7. Terashima, T., et al. In situ and time-resolved small-angle neutron scattering observation of star polymer formation via arm-linking reaction in ruthenium-catalyzed living radical polymerization. Macromolecules. 43 (19), 8218-8232 (2010).
  8. Hashimoto, K., Fujii, K., Nishi, K., Shibayama, M. Ion gel network formation in an ionic liquid studied by time-resolved small-angle neutron scattering. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (40), 9419-9424 (2018).
  9. Conn, C. E., et al. Membrane protein structures in lipid bilayers; small-Angle neutron scattering with contrast-matched bicontinuous cubic phases. Frontiers in Chemistry. 8, 619470 (2021).
  10. van't Hag, L., et al. Protein-eye view of the in meso crystallization mechanism. Langmuir. 35 (25), 8344-8356 (2019).
  11. Mahieu, E., et al. Observing protein degradation by the PAN-20S proteasome by time-resolved neutron scattering. Biophysical Journal. 119 (2), 375-388 (2020).
  12. Ibrahim, Z., et al. Time-resolved neutron scattering provides new insight into protein substrate processing by a AAA+ unfoldase. Scientific Reports. 7 (1), 40948 (2017).
  13. Hollamby, M. J., et al. Growth of mesoporous silica nanoparticles monitored by time-resolved small-angle neutron scattering. Langmuir. 28 (9), 4425-4433 (2012).
  14. Blin, J. L., Impéror-Clerc, M. Mechanism of self-assembly in the synthesis of silica mesoporous materials: in situ studies by X-ray and neutron scattering. Chemical Society Reviews. 42 (9), 4071-4082 (2013).
  15. Impéror-Clerc, M., Grillo, I., Khodakov, A. Y., Durand, D., Zholobenko, V. L. New insights into the initial steps of the formation of SBA-15 materials: an in situ small angle neutron scattering investigation. Chemical Communications. 8, 834-836 (2007).
  16. Narayanan, T., Rüter, A., Olsson, U. SAXS/WAXS investigation of amyloid-β(16-22) peptide nanotubes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 654349 (2021).
  17. Angelov, B., et al. DNA/Fusogenic lipid nanocarrier assembly: millisecond structural dynamics. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (11), 1959-1964 (2013).
  18. Amann, M., et al. Kinetic pathways for polyelectrolyte coacervate micelle formation revealed by time-resolved synchrotron SAXS. Macromolecules. 52 (21), 8227 (2019).
  19. Varga, Z., Wacha, A., Bóta, A. Osmotic shrinkage of sterically stabilized liposomes as revealed by time-resolved small-angle X-ray scattering. Journal of Applied Crystallography. 47 (1), 35-40 (2014).
  20. Panine, P., Finet, S., Weiss, T. M., Narayanan, T. Probing fast kinetics in complex fluids by combined rapid mixing and small-angle X-ray scattering. Advances in Colloid and Interface Science. 127 (1), 9-18 (2006).
  21. Grillo, I. Applications of stopped-flow in SAXS and SANS. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 14 (6), 402-408 (2009).
  22. Gomez-Hens, A., Perez-Bendito, D. The stopped-flow technique in analytical chemistry. Analytica Chimica Acta. 242, 147-177 (1991).
  23. Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. Use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the ATP turnover cycle of kinesins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52142 (2014).
  24. Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of stopped-flow kinetics methods to investigate the mechanism of action of a DNA repair protein. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1874 (2010).
  25. Raney, K. D., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. A fluorescence-based assay for monitoring helicase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6644-6648 (1994).
  26. Roder, H., Maki, K., Cheng, H. Early events in protein folding explored by rapid mixing methods. Chemical reviews. 106 (5), 1836-1861 (2006).
  27. Milon, A., et al. Osmotic swelling of unilamellar vesicles by the stopped-flow light scattering method. Influence of vesicle size, solute, temperature, cholesterol and three α,ω-dihydroxycarotenoids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 859 (1), 1-9 (1986).
  28. Gast, K., Nöppert, A., Müller-Frohne, M., Zirwer, D., Damaschun, G. Stopped-flow dynamic light scattering as a method to monitor compaction during protein folding. European Biophysics Journal. 25 (3), 211-219 (1997).
  29. Antoun, A., Pavlov, M. Y., Tenson, T., Ehrenberg, M. M. Ribosome formation from subunits studied by stopped-flow and Rayleigh light scattering. Biological Procedures Online. 6, 35-54 (2004).
  30. Zhu, Z., Armes, S. P., Liu, S. pH-Induced micellization kinetics of ABC triblock copolymers measured by stopped-flow light scattering. Macromolecules. 38 (23), 9803-9812 (2005).
  31. Ye, J., et al. Comparative study of temperature-induced association of cyclic and linear poly(N-isopropylacrylamide) chains in dilute solutions by laser light scattering and stopped-flow temperature jump. Macromolecules. 41 (12), 4416-4422 (2008).
  32. Liu, X., et al. Early stage kinetics of polyelectrolyte complex coacervation monitored through stopped-flow light scattering. Soft Matter. 12 (44), 9030-9038 (2016).
  33. Garman, E. F., Weik, M. X-ray radiation damage to biological samples: recent progress. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (4), 907-911 (2019).
  34. Garg, S., Porcar, L., Woodka, A. C., Butler, P. D., Perez-Salas, U. Noninvasive neutron scattering measurements reveal slower cholesterol transport in model lipid membranes. Biophysical Journal. 101 (2), 370-377 (2011).
  35. Marquardt, D., et al. 1H NMR shows slow phospholipid flip-flop in gel and fluid bilayers. Langmuir. 33 (15), 3731-3741 (2017).
  36. Egelhaaf, S. U., Olsson, U., Schurtenberger, P. Time-resolved SANS for surfactant phase transitions. Physica B: Condensed Matter. 276-278, 326-329 (2000).
  37. Tabor, R. F., Eastoe, J., Grillo, I. Time-resolved small-angle neutron scattering as a lamellar phase evolves into a microemulsion. Soft Matter. 5 (10), 2125-2129 (2009).
  38. Gradzielski, M., Bergmeier, M., Hoffmann, H., Müller, M., Grillo, I. Vesicle gel formed by a self-organization process. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (49), 11594-11597 (2000).
  39. Lee, Y. -T., Li, D. S., Pozzo, L. D. Kinetic analysis of ultrasound-induced oil exchange in oil-in-water emulsions through contrast variation time-resolved small-sngle neutron scattering. Langmuir. 35 (47), 15204-15213 (2019).
  40. Lee, Y. -T., Pozzo, L. D. Contrast-variation time-resolved small-angle neutron scattering analysis of oil-exchange kinetics between oil-in-water emulsions stabilized by anionic surfactants. Langmuir. 35 (47), 15192-15203 (2019).
  41. Roger, K., Olsson, U., Schweins, R., Cabane, B. Emulsion ripening through molecular exchange at droplet contacts. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1452-1455 (2015).
  42. Nakano, M., Fukuda, M., Kudo, T., Endo, H., Handa, T. Determination of Interbilayer and Transbilayer Lipid Transfers by Time-Resolved Small-Angle Neutron Scattering. Physical Review Letters. 98 (23), 238101 (2007).
  43. Nakano, M., et al. Flip-flop of phospholipids in vesicles: kinetic analysis with time-resolved small-angle neutron scattering. The Journal of Physical Chemistry B. 113 (19), 6745-6748 (2009).
  44. Nguyen, M. H. L., et al. Methanol accelerates DMPC flip-flop and transfer: A SANS study on lipid dynamics. Biophysical Journal. 116 (5), 755-759 (2019).
  45. Nguyen, M. H. L., et al. Peptide-induced Lipid flip-flop in asymmetric liposomes measured by small angle neutron scattering. Langmuir. 35 (36), 11735-11744 (2019).
  46. Nguyen, M. H. L., et al. Time-resolved SANS reveals pore-forming peptides cause rapid lipid reorganization. New Journal of Chemistry. 45 (1), 447-456 (2021).
  47. Xia, Y., et al. Effects of nanoparticle morphology and acyl chain length on spontaneous lipid transfer rates. Langmuir. 31 (47), 12920-12928 (2015).
  48. Xia, Y., et al. Morphology-induced defects enhance lipid transfer rates. Langmuir. 32 (38), 9757-9764 (2016).
  49. Maric, S., et al. Time-resolved small-angle neutron scattering as a probe for the dynamics of lipid exchange between human lipoproteins and naturally derived membranes. Scientific Reports. 9 (1), 7591 (2019).
  50. Nielsen, J. E., Bjørnestad, V. A., Pipich, V., Jenssen, H., Lund, R. Beyond structural models for the mode of action: How natural antimicrobial peptides affect lipid transport. Journal of Colloid and Interface Science. 582, 793-802 (2021).
  51. Willner, L., Poppe, A., Allgaier, J., Mokenbusch, M., Richter, D. TIme-resolved SANS for the determintioan of unimer exchange kinetics in block copolymer micelles. Europhysics Letters. 55 (5), 667 (2001).
  52. Lund, R., Willner, L., Stellbrink, J., Lindner, P., Richter, D. Logarithmic chain-exchange kinetics of diblock copolymer micelles. Physical Review Letters. 96 (6), 068302 (2006).
  53. Lund, R., Willner, L., Richter, D., Dormidontova, E. E. Equilibrium chain exchange kinetics of diblock copolymer micelles: Tuning and logarithmic relaxation. Macromolecules. 39 (13), 4566-4575 (2006).
  54. Lund, R., Willner, L., Richter, D. Kinetics of block copolymer micelles studied by small-angle scattering methods. in Controlled Polymerization and Polymeric Structures. Advances in Polymer Science. Abe, A., Lee, K. S., Leibler, L., Kobayashi, S. , Springer. Cham. 51 (2013).
  55. Choi, S. -H., Lodge, T. P., Bates, F. S. Mechanism of molecular exchange in diblock copolymer micelles: hypersensitivity to core chain length. Physical Review Letters. 104 (4), 047802 (2010).
  56. Choi, S. -H., Bates, F. S., Lodge, T. P. Molecular exchange in ordered diblock copolymer micelles. Macromolecules. 44 (9), 3594-3604 (2011).
  57. Lu, J., Bates, F. S., Lodge, T. P. Chain exchange in binary copolymer micelles at equilibrium: confirmation of the independent chain hypothesis. ACS Macro Letters. 2 (5), 451-455 (2013).
  58. Lu, J., Bates, F. S., Lodge, T. P. Remarkable effect of molecular architecture on chain exchange in triblock copolymer micelles. Macromolecules. 48 (8), 2667-2676 (2015).
  59. Kelley, E. G., et al. Size evolution of highly amphiphilic macromolecular solution assemblies via a distinct bimodal pathway. Nature Communications. 5 (1), 3599 (2014).
  60. Murphy, R. P., Kelley, E. G., Rogers, S. A., Sullivan, M. O., Epps, T. H. Unlocking chain exchange in highly amphiphilic block polymer micellar systems: influence of agitation. ACS Macro Letters. 3 (11), 1106-1111 (2014).
  61. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50 (6), 2484-2494 (2017).
  62. Lantz, K. A., et al. Cavitation enables switchable and rapid block polymer exchange under high-χN conditions. Macromolecules. 51 (17), 6967-6975 (2018).
  63. Murphy, R. P., et al. Capillary RheoSANS: measuring the rheology and nanostructure of complex fluids at high shear rates. Soft Matter. 16 (27), 6285-6293 (2020).
  64. Stopped Flow Sans. usnistgov. , Available from: https://github.com/usnistgov/stopped-flow-sans (2021).
  65. Kline, S. Reduction and analysis of SANS and USANS data using IGOR Pro. Journal of Applied Crystallography. 39 (6), 895-900 (2006).
  66. Doktorova, M., et al. Preparation of asymmetric phospholipid vesicles for use as cell membrane models. Nature Protocols. 13 (9), 2086-2101 (2018).
  67. Huang, Z., London, E. Effect of cyclodextrin and membrane lipid structure upon cyclodextrin-lipid interaction. Langmuir. 29 (47), 14631-14638 (2013).
  68. Sugiura, T., Ikeda, K., Nakano, M. Kinetic analysis of the methyl-β-cyclodextrin-mediated intervesicular transfer of pyrene-labeled phospholipids. Langmuir. 32 (51), 13697-13705 (2016).
  69. Scott, H. L., et al. On the mechanism of bilayer separation by extrusion, or why your LUVs are not really unilamellar. Biophysical Journal. 117 (8), 1381-1386 (2019).
  70. Dicko, C., et al. NUrF-Optimization of in situ UV-vis and fluorescence and autonomous characterization techniques with small-angle neutron scattering instrumentation. Review of Scientific Instruments. 91 (7), 075111 (2020).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 174 Småvinkel neutronspredning (SANS) tidsopløst spredning stoppet flowblanding molekylær udvekslingskinetik lipidnanopartikler lipidmembraner vesikler strukturel udvikling
Måling af tidsudviklingen af nanoskalamaterialer med stoppet flow og småvinkel neutronspredning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelley, E. G., Nguyen, M. H. L.,… More

Kelley, E. G., Nguyen, M. H. L., Marquardt, D., Maranville, B. B., Murphy, R. P. Measuring the Time-Evolution of Nanoscale Materials with Stopped-Flow and Small-Angle Neutron Scattering. J. Vis. Exp. (174), e62873, doi:10.3791/62873 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter