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Engineering

利用停流和小角中子散射测量纳米材料的时间演化

Published: August 6, 2021 doi: 10.3791/62873
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1, 1
1NIST Center for Neutron Research, National Institute of Standards and Technology, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of Windsor, 3Department of Physics, University of Windsor

Summary

该协议介绍了使用停止流动的样品环境在小角中子散射测量期间原 位 快速混合多种液体溶液，并研究纳米长度尺度和第二时间尺度上的动力学过程。

Abstract

本文介绍了使用停止流动小角中子散射（SANS）样品环境快速混合液体样品，并在几秒钟到几分钟的时间尺度上研究纳米级动力学过程。停止流动的样品环境使用市售的注射泵混合所需体积的液体样品，然后在大约 1 秒内通过动态混合器注入石英玻璃池。时间分辨SANS数据采集与样品混合同步，以跟踪混合后溶液中纳米结构的演变。

为了最有效地利用中子束时间，我们使用一系列流量选择阀在测量之间自动加载、冲洗和干燥池，从而允许在多次样品进样过程中重复收集数据。重复进样，直到收集到足够的中子散射统计数据。混合设置可以编程为系统地改变条件，以测量不同混合比、样品浓度、添加剂浓度和温度下的动力学。每次进样所需的最小样品量约为 150 μL，具体取决于石英池的光程长度。

在添加剂环糊精存在下，给出了使用这种停止流动样品环境的代表性结果，用于快速脂质交换动力学。囊泡在几秒钟内交换外小叶（外部）脂质，并在数小时内完全交换内部和外部脂质。测量脂质交换动力学需要 原位 混合，以捕获更快（秒）和更慢（分钟）的过程并提取动力学速率常数。相同的样品环境也可用于探测其他类型的液体样品中的分子交换，例如脂质纳米颗粒、蛋白质、表面活性剂、聚合物、乳液或无机纳米颗粒。测量纳米级结构转变和交换或反应系统的动力学将为纳米尺度上演变的过程提供新的见解。

Introduction

小角中子散射 （SANS） 提供了一种独特的方法来测量各种材料的尺寸、形状、相互作用和组织，长度尺度从 ≈1 nm 到 ≈100 nm1，2，3。最近的仪器，包括带有聚焦镜的VSANS（甚小角中子散射）仪器，将极限推向了测量更大长度尺度的极限，最高可达≈1000 nm4，5。通常，中子散射方法固有的独特散射对比在测量纳米级结构的时间演变方面具有几个优势，例如药物制剂中组分的聚集6，聚合物系统中的交联和凝胶反应7，8，膜蛋白的介观结晶9，10，蛋白质的降解和展开11，12，以及二氧化硅基材料的生长13，14，15。独特的散射对比度使时间分辨 SANS （TR-SANS） 成为其他基于停止流量的测量的有用补充。

停止流动混合方法通常在小角X射线散射（SAXS）16，17，18，19，20，21，荧光光谱22，23，24，25，26和光散射27，28，29，30中实现。 31，32 在毫秒时间尺度上研究动力学过程的实验。SANS和SAXS之间的重要区别在于，中子散射是一种无损表征技术，因此，SANS可用于测量同一样品数小时甚至数天，而不会对样品造成电离辐射损伤，这可能发生在高通量的X射线散射实验中33。由于重复的SANS测量不会改变探针分子或样品的化学结构，因此可以在没有光漂白影响的情况下研究时间演变，例如，这可能会使依赖于荧光23，24的动力学测量复杂化。此外，SANS可用于测量高浓度和光学不透明的样品，这些样品通常难以用动态光散射等基于光的技术进行表征。

除了提供纳米尺度的结构信息外，SANS还可用于通过中子散射长度密度对比度的变化来探测这些结构的局部组成。不同元素的散射长度密度（SLD）在元素周期表中随机变化，并且随同一元素的不同同位素而变化。一个常用的例子是氢（1H或H）和氘（2H或D），它们的中子散射长度差异很大。因此，富氢材料，如表面活性剂、脂质、蛋白质、RNA、DNA和其他聚合物，可以使用SANS与氘代溶剂区分开来，而不会显著改变系统的物理性质。然而，需要注意的是，H/D 交换会影响样品中的密度、氢键和相变温度。然而，SANS对富氢材料的独特灵敏度在软物质研究中特别有用，其中感兴趣的样品在基于X射线的技术（如SAXS）中具有较低的散射对比度和信号。同位素取代还使SANS成为通过简单地混合H标记和D标记分子来研究富氢材料中分子交换动力学的有力工具。同位素取代在体积较大的荧光染料大于感兴趣的表面活性剂或脂质分子并且会影响交换动力学的系统中特别有用34，35。

时间分辨 SANS 测量是有利的，因为测量的强度是时间、长度尺度和 SLD 对比度的函数。因此，可以设计TR-SANS实验来探测样品空间分布和组成的时间变化。SANS的这些独特优势为许多软材料系统中的动力学过程提供了重要的见解，例如表面活性剂36，37，38，乳液39，40，41，脂质34，42，43，44，45，46，47，48，49，50和聚合物51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62。大多数TR-SANS研究都集中在几分钟到几小时的时间尺度上。然而，许多感兴趣的动力学过程发生在第二时间尺度上，对于理解潜在的机制至关重要。捕获这些早期时间点需要快速混合并原位测量溶液，其中混合与停止流光散射 27、28、29、30、31、32、荧光22、23、24、25、26 和 X 射线期间的数据收集同步16，17，18，19，20，21次实验。这项工作描述了样品环境的使用，该环境旨在快速混合多个液体样品并将混合物注入石英玻璃池中进行TR-SANS测量。混合装置是最近开发的毛细管流变SANS装置63的改编，使用多个注射泵和阀门来控制样品混合并自动清洁细胞。通过将注射泵连接到一系列流量选择阀，可以重复混合、测量、冲洗和干燥多个入口流，以促进秒级时间尺度上的 TR-SANS 测量。

目前的程序假定感兴趣的样品已经确定和制备。我们专注于原位混合设置和收集TR-SANS数据的方法。中子散射数据是在NIST中子研究中心（NCNR）的VSANS仪器上收集的;但是，该程序应适用于其他 SANS 仪器。有兴趣在其他SANS仪器上实施类似协议的读者应咨询当地仪器科学家，以确定最佳仪器配置，以在与感兴趣的动力学过程最相关的所需长度尺度和时间尺度上最大化中子通量。这里提供的数据是使用VSANS上的高通量“白束”配置收集的，以在失去空间分辨率5的情况下最大化中子数。探测器架的位置覆盖一系列散射矢量（q），0.005 Å-1< q<0.5 Å-1，对应于≈130 nm至≈13 nm的长度尺度。散射矢量定义为q = 4 π/λ sin （θ/2），其中λ是中子波长，θ是散射角。

用于TR-SANS测量的停止流动混合装置由多个泵、冲洗注射器、样品注射器、流量选择器以及动态混合器、样品池和混合样品容器组成，如图 1所示。所有密封的流体管路都位于空调外壳内，其中包括注射器、阀门、连接管、动态混合器和样品池。可编程热电空调用于在±1°C内控制10°C至50°C范围内的外壳温度。 请注意，一些外壳绝缘层已被移除，以显示设备的工作部件。主混合装置外壳位于NCNR的NG3 VSANS光束线上的平移台上。使用平移台调整外壳位置，将样品池定位在中子束的路径中（黄色虚线）。

Figure 1
图 1：在 NIST 中子研究中心的 VSANS 光束线上结合停止流混合和小角中子散射测量的示例设置。 该装置包含四个注射泵、两个用于溶剂冲洗的注射器和两个用于样品进样的注射器、四个泵选择阀、两个混合器选择阀、一个动态混合器、一个流通式石英池和一个混合样品容器。入射中子从位于样品池内的混合样品中散射。带有石英窗的绝缘外壳和热电空调装置用于在恒温下控制样品和所有设备。黄色虚线表示中子束路径。比例尺 = 10 厘米。 请点击此处查看此图的大图。

图1所示的设备配置有两个样品注射器、两个冲洗注射器和一个样品池。协议不同步骤的相应流程图如图2所示。将所需体积的两种不同样品注入混合器和样品池（图2A）。样品池填充后，入口开关阀（ISV）和出口开关阀（OSV）关闭，以将样品池与动态混合器隔离，并防止样品在TR-SANS数据收集期间回扩散到池中（图2B）。在动态混合器之前，连接管的长度从10厘米到1米不等，不会影响混合延迟时间。但是，动态混合器和样品池之间的管道连接会影响混合延迟时间和所需的样品进样量。内径为 0.04 英寸（1 毫米）、长度为 100 毫米的预切不锈钢管用于连接动态混合器、混合器选择阀（MSV1 和 MSV2）以及 ISV 和 OSV。内径为 1 mm、长度为 115 mm 的氟化管用于将 ISV 和 OSV（或动态混合器出口）连接到样品池。影响混合延迟时间的总空隙体积包括混合器空隙体积 （0.15 mL）、混合器出口和样品池入口之间的管道 （0.09 mL） 以及样品池体积 （0.16 mL）。在本例中，总空隙体积为 0.4 mL。与管道、混合器和样品池的空隙体积相比，阀门的内部空隙体积可以忽略不计。例如，采用的低压选择阀（0.75 mm 孔径）包含大约 4 μL 的空隙体积，而高压选择阀和开关阀（0.25 mm 孔径）包含大约 0.5 μL 的空隙体积。

TR-SANS测量完成后，用溶剂将样品推出池外，并反复将冲洗溶剂泵入池中以除去残留样品并清洁样品池（图2C）。请注意，冲洗注射器通过泵选择器值连接到较大的溶剂储液槽（例如，水和乙醇），以确保在测量运行之间有足够的溶剂量来清洁样品池。溶剂源、样品源和含有易燃液体的混合样品容器放置在单独的外壳中，没有电气设备，以消除所有可能的点火源。此外，蒸汽锁定瓶盖用于最大限度地减少易燃蒸气和溶剂蒸发。最后，用氮气流干燥样品池以除去残留的冲洗溶剂（图2D）。使用位于氮气瓶上的手动压力调节器，将混合器选择阀的入口氮气压力调节到大约 2 bar（0.2 MPa，表压）。一旦样品池充分清洁和干燥，将新混合的样品注入样品池中以进行下一个测量周期（重复 图2A流程图所示的混合和进样）。

Figure 2
图 2：使用一个样品池、两个样品混合和两种冲洗溶剂进行清洁的示例流程图。 （A）混合样品A（蓝色）和样品B（红色），然后将混合的样品（紫色）流入样品池中。（B）在数据收集期间，ISV和OSV开关阀关闭以隔离样品池并防止样品在数据收集过程中反向扩散的停止流设备状态。（C）数据收集后用SS1（绿色）的漂洗溶剂冲洗样品池的清洁步骤。（D）干燥步骤，其中样品池用氮气（橙色）干燥。缩写：PSV = 泵选择阀;MSV = 混合器选择阀;OSV = 出口开关阀;ISV = 入口开关阀;SS1 = 溶剂源 1;SSA = 样品源 A;N2 = 氮气源。请点击此处查看此图的大图。

图 3 显示了略有不同的版本的流程图，其中混合设置配置为连接到同一开关阀的两个独立样品池（图 3A）。在样品池1中收集TR-SANS数据的同时，对样品池2进行冲洗（图3B）并干燥（图3C）。当样品池 1 的数据收集完成后，入口开关阀将新混合的样品引导到样品池 2 中进行数据收集（图 3D）。在样品池2中收集TR-SANS数据的同时，对样品池1进行冲洗和干燥（图3E）。两个样品池之间的这种交替平行过程最大限度地减少了后续样品进样之间的时间，并最大限度地利用了中子束时间。

Figure 3
图 3：使用两个样品池、两个样品混合和两个冲洗溶剂进行清洁的示例流程图。 （A）混合样品A（蓝色）和样品B（红色），然后将混合样品（紫色）流入样品池1。（B） 样品池 1 上数据收集期间的停止流动设备状态，同时用 SS1（绿色）中的溶剂冲洗样品池 2。（C） 样品池 1 上数据收集期间的停止流动设备状态，同时样品池 2 用氮气（橙色）干燥。（D）样品池1的数据收集完成后，立即混合新样品（紫色）并流入样品池2。（E） 样品池 2 上数据收集期间的停止流动设备状态，同时用 SS1 中的溶剂冲洗样品池 1（绿色）。在测量一个样品池的同时，正在清洁和干燥另一个样品池。停止流量测量过程在两个样品池之间交替进行，以最大限度地缩短后续样品混合进样之间的时间。缩写：PSV = 泵选择阀;MSV = 混合器选择阀;OSV = 出口开关阀;ISV = 入口开关阀;SS1 = 溶剂源 1;SSA = 样品源 A;N2 = 氮气源。请点击此处查看此图的大图。

下面描述了用于连接泵和管路、启动系统、冲洗和干燥样品池以及注入混合样品的分步方案。虽然为了简单起见，演示了单细胞配置（图2），但可以轻松修改灵活的模块化设置、协议和脚本，以实现更多的注射泵、阀门、混合器或样品池配置，例如图3所示的双样品池配置。在整个混合和清洗注射周期中收集的代表性原始中子计数速率数据如图4所示，而在3种不同温度下测量的脂质交换动力学和对应于交换脂质分数的提取归一化散射强度分别显示在图5和图6中。

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Protocol

1. 设置并启动停止流系统。

  1. 使用电源开关打开所有泵电源和动态混合器。
  2. 通过输入设备配置路径并使用命令 bus=qmixbus，在停止流量系统控制图形用户界面 （GUI） 中启动所有泵和阀门。Bus（）， bus.open（）， bus.start（）， pump=qmixpump.Pump（）、pump.enable（） 和 valve=ViciMultiposSelector（）（参见在线开源存储库64 中提供的示例启动代码）。
  3. 在安装注射器之前，使用命令 pump.calibrate（）校准泵。
  4. 确认阀门已启动，并使用命令 valve.setPort（ ） 和 valve.getPort（） 移动到正确的选择器端口。
  5. 使用命令 pump.set_syringe_param（A，B）分配用于每个泵的注射器类型，其中 A 是注射器筒内径（mm）， B 是注射器最大活塞行程距离（mm）。
  6. 将样品注射器连接到注射泵。
    1. 确保泵已校准后，将干净的注射器筒拧入泵顶部的连接处（注射器安装头）。
    2. 使用玻璃注射器时，请确保在分配填充量之前松开注射器安装头，以便玻璃注射器不会因注射器活塞的过大力量而破裂。
    3. 将注射器活塞拧入泵底部的连接处（注射器安装尾部）。
    4. 注射器筒和注射器活塞连接到泵后，使用命令 泵.empty（）分配注射器的填充量，该命令将注射器活塞移动到注射器筒的顶部。
    5. 使用玻璃注射器时，在活塞运动停止后拧紧注射器安装头。
  7. 将管路连接到样品和溶剂源、注射器、阀门、混合器、样品池和混合样品容器。
    1. 将注射泵管连接到泵选择阀。
    2. 将泵选择阀管连接到样品源。
    3. 将泵选择阀管连接到冲洗溶剂源。
    4. 将泵选择阀管连接到混合器选择阀管。
    5. 将混合器选择阀管连接到氮气源。
    6. 将混合器选择阀管连接到混合器入口。
    7. 将混合器出口连接到入口开关阀。
    8. 将入口开关阀连接到样品池入口。
    9. 将样品池出口连接到出口开关阀。
    10. 将出口开关阀连接到混合样品容器。
  8. 通过键入对每个阀门的相应端口号连接，在停止流量系统控制 GUI 中定义所有管道和阀门连接（步骤 1.7）（请参阅在线开源存储库64 中的示例控制代码）。
  9. 计算混合器入口和样品池出口之间管道的空隙体积，该体积定义了每次测量填充样品池所需的最小样品量。

2. 加载样品。

  1. 通过键入所需的数字，在停止流量系统控制GUI中设置所需的样品填充量和溶剂填充量（请参阅在线开源存储库64中的示例控制代码）。
  2. 使用 pump.aspirate （） 命令通过泵选择阀将所需的样品和溶剂体积从其来源吸入（吸出）到样品注射器中。
    注意：首次装入空注射器时，注射器顶部将存在空气，必须在步骤3中清除空气以向系统灌注样品和溶剂。

3. 启动系统。

  1. 使用 pump.dispense （） 命令从注射器、管路和阀门中推出（分配）所有空气。确保从每个注射器中分配足够的液体量，以完全去除注射器、管路和阀门中的所有空气。如果任何管道内可见气泡，请继续分配溶剂或样品，直到气泡被去除。
  2. 从系统中清除空气后，执行至少一个样品进样和冲洗程序（不收集中子散射数据）。
    1. 单击以在控制 GUI 中选择标记为 “开始混合实验 ”的单元格。
    2. 主动选择此单元格后，单击位于控制 GUI 顶部的 “运行 ”按钮（直角形），或同时按键盘上的 Shift 和 Enter 键。
    3. 目视检查样品池以确认不存在气泡。
      1. 如果存在气泡，请重复协议步骤3.1和3.2以进一步清除管路中的任何空气。
      2. 如果样品池中不存在气泡，请继续执行步骤4以定义剩余的实验方案步骤。

4.在程序脚本中定义停止流混合协议（参见在线开源存储库64中的代码示例）。

  1. 输入可编程空调 （AC） 单元的温度设定点，该单元控制截止流设备周围绝缘外壳的温度。
    1. 按住 AC 控制单元上的 星形 按钮的同时，按 向上 和 向下 箭头更改设定点温度。或者，在控制 GUI 中键入所需的温度设定值，然后单击 运行。
    2. 等待15-30分钟，让外壳内部在所需温度下平衡，然后再开始动力学实验。
      注意：目前可访问的温度范围在 10 °C 和 50 °C 之间，温度稳定性± 1 °C。
  2. 通过在控制 GUI 中输入适当的体积、流速、时间和重复次数，输入所有冲洗序列步骤。
    1. 定义要进样的每个样品的体积，该体积定义总流速 （Q）。
    2. 定义冲洗过程中要注入的每种溶剂的体积。
    3. 定义每个漂洗子步骤之间的干燥时间（t干燥）。
    4. 定义冲洗子步骤的数量。
    5. 为后续冲洗步骤定义不同的溶剂。
    6. 定义每次测量后要执行的冲洗重复次数（n冲洗）。
    7. 定义样品池和混合器完全干燥的时间，为后续样品进样提供干净的样品池（tdry_final）。
  3. 通过在停止流量系统控制 GUI 中键入适当的体积、流速和时间来定义所有样品进样序列步骤。
    1. 定义要进样的每个样品的体积和流速。
    2. 根据空隙体积（V 空隙）和总流速（t 延迟 = V空隙/Q）计算延迟 时间（t延迟）。
      注意：延迟时间是用混合样品填充样品池所需的时间。
    3. 定义TR-SANS数据所需的采集时间，以便发生整个感兴趣的动力学过程（tscatt）。
    4. 设置散射实验结束和漂洗周期开始之间的等待时间（t等待）。
      注意：如果要在从电池中冲洗样品之前测量样品中子传输，则此等待时间应至少为 100 秒。数据处理过程中需要样品传输，以将数据降低到绝对强度。
    5. 定义步骤4.2（n个周期）中定义的每次进样之间运行的冲洗序列要执行的进样循环数。
  4. 使用公式 （1） 计算单个停止流数据收集周期（t周期）的总时间。
    T循环 = N漂洗×（T 延迟 + T干燥）+ Tdry_final + T延迟 + T漂洗 （1）
    其中n漂洗=漂洗 重复次数（步骤4.2.6）;t延迟=停止流动装置的延迟 时间（步骤4.3.2）;tdry = 每个漂洗子步骤之间的干燥时间（步骤 4.2.3）;tdry_final = 样品池和混合器完全干燥的时间（步骤4.2.7）;tscatt = 所需的 TR-SANS 数据采集时间（步骤 4.3.3）

5. 在SANS仪器控制界面中定义小角中子散射参数。

  1. 确定每个样品的长度尺度和感兴趣的q范围。
  2. 定义仪器配置以覆盖所需的目标 q 范围，同时最大限度地提高样品处的中子通量。
  3. 在 SANS 仪器控制 GUI 中将 VSANS 数据采集总时间设置为步骤 4.4 中计算的周期时间（中子散射数据采集时间 = t周期）。
  4. 在 SANS 仪器控制 GUI 中将样品传输测量时间设置为 100 秒。
  5. 使用 SANS 仪器控制 GUI，通过在命令行中键入 GenerateEventModeData true 来打开事件模式数据收集。

6. 在开始停止流实验以处理 TR-SANS 数据之前，收集标准散射测量值以进行数据缩减。

  1. 测量背景散射。
    1. 确保本地仪器快门已关闭。
    2. 将阻挡的光束样品连接到样品孔径的背面，保护本地仪器环境，并打开本地仪器快门。
    3. 在软件中定义阻塞光束散射数据采集时间，并收集阻塞光束散射数据，计算与最长散射数据采集时间（tscatt）相同的持续时间。
    4. 数据收集完成后，关闭仪器快门，并从样品孔径中取出阻挡的光束样品。
  2. 测量空细胞散射。
    1. 确保样品池已彻底冲洗并干燥。
    2. 打开本地仪器快门。
    3. 收集空电池透射测量值100秒。
    4. 收集空细胞散射测量值，至少计算最长的采集时间（tscatt）。

7. 开始停止流动实验。

  1. 在 事件 模式下启动 VSANS 分散数据收集。
    1. 确保本地仪器区域安全，然后打开本地仪器光束快门。
    2. 使用仪器计算机上的 SANS 仪器控制软件开始收集 SANS 数据，方法是将所需的运行拖放到仪器队列中。
      注意：为确保测量最早的时间点，请在开始停止流动混合实验之前开始数据收集。数据将在后面的步骤中进行后处理，以考虑延迟时间（t延迟）。
  2. 在控制 GUI 中启动停止流动混合实验。
    1. 在停止流系统控制 GUI 中选择标记为 开始混合实验 的笔记本单元格。
    2. 主动选择此单元格后，单击位于停止流设备控制程序顶部的 “运行” 按钮（直角形），或同时按键盘上的 Shift 和 Enter 键。
    3. 确认第 4 节中定义的停止流混合协议已开始运行。
    4. 在散射运行后，使用 SANS 仪器控制 GUI 将 100 s 传输测量结果添加到 VSANS 仪器队列中。
    5. 在 SANS 仪器控制 GUI 中，为每个剩余的停止流混合周期（n周期 - 1，步骤 4.3.5）将一个散射测量运行和一个传输测量运行添加到仪器队列中。

8. 处理和减少数据以去除所有背景，校正检测器灵敏度，校正样品传输。

  1. 从服务器下载分散数据文件和关联的事件文件。
    注意：每次VSANS测量后将生成单独的探测器事件文件，每个活动探测器托架（例如，前、中和/或后探测器）生成一个事件文件。
  2. 使用命令 events=Rebin（文件名），后跟命令 e vents.do_rebinning（timebins），将分散数据分箱到所需的时间箱，其中输入文件名对应于所需 SANS 数据文件的名称，timebins 是所需时间箱边界的列表（以秒为单位）。
    注意：如果输入时间箱作为单个数字而不是列表输入，则数据将被分箱到N个具有相同时间宽度的箱中，其中N是输入时间箱（请参阅光束线提供的软件脚本和可用的在线开源存储库64）。
  3. 使用提供的光束线65的软件减少分档散射数据。

9. 分析 TR-SANS 数据。

  1. 使用公式（2）根据测量时间计算感兴趣的过程时间（t过程）。
    t过程 = ti -t 停止 + t延迟 （2）
    其中 ti 是流量停止后开始的测量时间箱，tstop 是流量停止时立即开始的测量时间，t 延迟是延迟 时间。
  2. 使用步骤 8.2 中定义的时间箱和步骤 9.1 中计算的 t 过程，将 q 相关强度 I（q） 绘制为过程时间的函数。
    注意：最早可访问的处理时间受 t延迟的限制。要测量较早的工艺时间点，请增加总流速 （Q） 或减小总空隙体积 （V空隙）。
  3. 从 I（q） 的变化中提取感兴趣的动力学参数作为过程时间的函数。

10. 结束实验。

  1. 通过关闭局部仪器快门关闭中子束。
  2. 在断开任何部件、管道或卸载任何样品或混合样品容器之前，使用光束线提供的辐射监测器进行辐射检查。
  3. 将注射器、管路和混合样品容器转移到健康物理部门。
  4. 填写健康物理表格并等待健康物理人员的评估。

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Representative Results

这里显示的代表性中子数据测量了在甲基-β-环糊精（mβCD）存在下的脂质交换动力学，mβCD是一种以交换速率（ke）催化囊泡之间脂质交换的添加剂66，67。先前的荧光研究表明，ke 取决于mβCD浓度，交换过程的半衰期约为68分钟。本实验使用停止流动TR-SANS在秒时间尺度上测量囊泡之间的mβCD催化脂质交换。制备了两个同位素不同的脂质囊泡群;一个囊泡群用尾氢化二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（ DMPC）脂质（图5中的H脂囊泡）制备，另一个囊泡群用尾部氘代DMPC（DMPC-d54）脂质（ 图5中的D-脂质囊泡）制备。将摩尔分数为 0.05（5 mol%）的带电二苯甲基磷脂酰 （DMPG） 脂质添加到 DMPC 和 DMPC-d54 干脂质粉末中，以促进单层囊泡形成69。

通过在含有45体积重水（D 2 O）和55%体积水（H2O）的溶剂中水合各自的脂质膜来制备单独的H-囊泡和D-囊泡溶液。计算D2 O/H2O溶剂组成使得溶剂的中子散射长度密度（ρ）与H-脂质和D-脂质的随机混合物相匹配（Δρ = ρ脂质-ρ溶剂= 0）。换句话说，随机混合的H / D囊泡对中子来说是“不可见的”，并产生零相干中子散射。单层囊泡溶液通过冻融溶液5次，然后通过具有100 nm直径孔的聚碳酸酯过滤器挤出单个溶液来制备。将囊泡溶液在两个注射器和过滤器之间来回挤出，在30°C下共31次。 随后，将少量在相同的D 2 O/H2O溶剂混合物中制备的浓缩mβCD储备溶液加入到囊泡溶液中。最终脂质浓度为14 mmol/L（mM），mβCD浓度为30 mM。将单个囊泡溶液与添加的mβCD平衡至少30分钟，然后将溶液装入停止流混合装置中的样品注射器中。

图4A显示了在多个注入循环中测得的中子计数率的示例。每个循环由 9 个冲洗步骤、1 个干燥步骤和 1 个样品进样步骤组成。为清楚起见，仅显示了在VSANS仪器的中间探测器托架上测量的计数率。在前探测器托架上也发现了类似的趋势，这与在较大散射角或较高q值下收集的数据相对应。每次冲洗溶剂进样（溶剂S1和溶剂S2）时，计数速率加标，当溶剂用氮气推出细胞并干燥时，计数速率返回到空细胞基线计数。最后一次细胞冲洗是用S2冲洗的，在本例中是乙醇，并且在进样前用氮气最后一次干燥细胞3分钟。将样品注入细胞后不久，中子计数率飙升，并连续收集数据5分钟。图4A示例数据中注入的代表性样品是盐缓冲液背景。测量强度随时间的变化反映了背景中子计数率的变化，并不反映平均样品成分的变化。在图4A的示例中，冲洗，干燥，混合和进样的完整循环重复一次，其中每个循环总共持续15分钟。

将单个H标记和D标记的脂质囊泡溶液在t混合时混合并立即流入样品池。测得的中子计数率在t填充样品池时加标，然后达到最大值，如图4B所示。填充样品池所需的经过时间称为延迟时间t延迟，由t延迟= t填充-t混合物给出。如果混合器和样品池之间的空隙体积（V空隙）已知并且总流速（Q）已知，则t延迟也可以计算为t延迟= V空隙/ Q（参见方案步骤4.3.2），这也是液体样品进入混合器并离开样品池的平均停留时间。达到t填充后，以恒定流速继续流动，以确保电池已填充并达到稳态。然后，流量立即在t停止处停止。平均中子计数率作为t填充和t停止之间测量时间的函数保持不变，因为通过样品池的流速是恒定的，因此中子束路径内的样品处于稳态。换句话说，在 t停止处测量的数据对应于通过 t延迟 = t填充 - t混合 = V空隙/Q 混合和释放的样品。在t停止后立即收集的分箱测量时间ti是感兴趣的主要动力学数据。

在图4C中，混合脂质囊泡样品在三种不同温度下的中子计数被绘制为校正过程时间尺度（t过程）的函数，这是针对稳态流动周期和延迟时间校正的目标过程时间。该过程时间尺度的计算方法是t过程=t-t停止+t延迟，或者等效地，t过程=t-t停止+t填充-t混合。在图4中，SANS数据在所谓的事件模式下连续收集。在事件模式数据收集期间，每个检测到的中子事件都记录在二维中子探测器上具有唯一的时间戳及其x和y位置。然后将事件模式数据后处理到图4B中所需的时间箱（ti）中。

使用在线开源存储库64中可用的协议和脚本，将感兴趣的可访问过程时间窗口内的事件模式数据（即，在图4B中t停止后的每个ti处收集的中子散射）重建为该时间箱的二维（2D）探测器图像。然后使用数据缩减例程处理每个 2D 探测器图像，以减去不同的背景源，校正样品传输和探测器效率，并将 2D 探测器数据方位积分到强度 （I） 与散射矢量 （q） 图中65。图5中的数据被分箱到相等（3 s）的时间箱中，代表了可以从TR-SANS测量中获得的时间和长度尺度相关信息。与图4B所示的总原始计数率类似，随着外小叶中的脂质在不同囊泡之间随机交换和混合，q依赖性强度I（q）随时间降低。

图5显示了在3种不同温度下测量的脂质交换动力学数据。每个图显示混合后前110分钟收集的数据。在36°C和30°C的最低q值下，测得的强度降低一个数量级，对应于脂质液相。同时，在20 °C下，散射强度数据随时间变化明显较慢，表明脂质凝胶期外小叶交换动力学较慢。

测得的散射强度I（q）与SLD对比度Equation 1有关，其中Δρ是囊泡与周围溶剂之间的SLD差值。这种平均SLD对比度与任何给定时间囊泡中H脂质和D脂质的相对数量直接相关。因此，可以对给定时间测量的散射强度进行归一化，以确定已交换的脂质群的比例。这种归一化是通过收集两个额外的测量来实现的，包括：（1）当囊泡之间没有脂质交换时，在时间t = 0时测量的强度I（0）和（2）在时间t = ∞时测量的强度I（∞，当所有脂质交换并且群体已经平衡时。归一化计数率 Equation 242 绘制为图 6 中不同温度下处理时间的函数。在此示例中，I（t） 是处理时 t 时的 q 积分强度（背景减去强度积分为 q 的函数），I（∞） 是所有脂质交换后无限时间的 q 积分强度（应类似于溶剂背景散射），I（0） 是 q-积分 时间t = 0时的强度（无脂质交换）。对于低于20°C相变温度的混合样品测量I（0），其中交换缓慢，I（∞）在40°C下平衡超过36小时并具有并完全交换H脂质和D脂质的单独样品中测量。

归一化计数率应从处理时间t = 0时的R（t） = 1衰减到t = ∞时的R（t） = 0，并且与样品中的SLD对比度直接相关，因此与脂质交换的程度直接相关27，28，29，30，31，32，33，34，35.请注意，最早测量的R（t）数据不是在30°C和36°C的R（t）= 1处开始的，这表明在混合后的前3秒内发生了大量的脂质交换，由于所采用的停止流混合方案的延迟时间（t延迟= 2.4s），这在实验上无法获得。同时，在20°C下测得的R（t）在前（2-3）分钟内保持近似恒定。对于在30 °C和36 °C下测量的脂质交换动力学，R（t）在100 s内迅速衰减至≈0.5，表明外小叶脂质在几分钟内完全交换和平衡。因此，使用停止流动的SANS可以捕获mβCD催化的脂质交换，并且很难通过手动移液器混合捕获。捕获更早的工艺时间点（t < 3 s）将需要不同的混合器类型，具有更小的空隙体积、更小的管材空隙体积和更高的总流速，以减少延迟时间。

R（t）继续在更长的时间内腐烂，因为脂质在内部和外部小叶之间翻转。由于手动移液器混合方法大约需要5分钟，因此可以使用手动混合的离散样品收集较慢触发器过程（t> 5分钟）的TR-SANS数据并加载到标准SANS样品池中。同样，脂质凝胶相中20°C下的脂质交换足够慢，可以混合和离散测量，并且该测量不一定需要使用停止流动混合方法进行研究。当通过手动移液器混合样品时，在几分钟到几小时的时间尺度上测量动力学过程的效率更高。然而，在不到几分钟的时间尺度上的动力学过程将需要这种停止流动混合和TR-SANS测量程序。

Figure 4
图 4：在整个混合和清洁注射周期中收集的具有代表性的原始中子计数速率数据 。 （A）重复冲洗序列、干燥序列和多个循环混合样品进样序列中中子计数速率（中间检测器）作为时间函数的示例。（A）中的样品是盐缓冲背景，强度随时间的变化反映了背景计数率的变化，而不是样品的变化。（B）在30°C下注射混合H-脂质和D-脂质囊泡后，监测归一化中子计数率作为实验时间的函数。 垂直虚线表示混合开始时间 （tmix）、填充时间 （t填充）、流停止时间 （t停止） 和分箱区域时间 （ti）。t停止 后计数率的衰减是由于囊泡之间的脂质交换导致样品中的对比度损失。（C）在（蓝色）20°C，（绿色）30°C和（红色）36°C下监测标准化中子计数率作为实验前100秒交换过程时间的函数。 事件模式数据处理到 1 秒箱中。缩写：S1 = 溶剂 1;S2 = 溶剂 2;tmix = 样品溶液混合的实验时间;t填充 = 填充样品池的实验时间;tstop = 停止流动的实验时间;t 过程 = 计算感兴趣的动力学过程 时间。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 5
图 5：在不同温度下，脂质囊泡外层的催化交换以及散射强度 （I） 作为散射矢量 （q） 函数的相应变化的图示。 示意图显示了 （A） 在 t = 0 和 （B） 由甲基-β-环糊精 （mβCD） 催化的外层交换后 （A） 初始混合后 H-脂质和 D-脂质囊泡之间的脂质交换。降低中子散射强度作为散射波矢量q的函数。在（C）36°C，（D）30°C和（E）20°C下重复停止流动混合实验和VSANS测量。 在每个指定温度下混合后的前10分钟内将所提供的数据分箱为3 s间隔。误差线是计数统计中传播的不确定性，代表一个标准差。缩写：ke = 囊间脂质交换的速率常数;mβCD = 甲基-β-环糊精;kf = 小叶间脂质交换的速率常数，也称为脂质触发器;l（q） = 以cm-1为单位测量的SANS强度;q = 散射矢量。请点击此处查看此图的大图。

Figure 6
图 6：对应于交换的脂质分数的归一化散射强度，可以对其进行建模以提取目标动力学过程的速率常数。 （A）在（蓝色）20°C，（黑色）30°C和（红色）36°C下测量的3秒至600秒之间发生的囊泡外小叶之间的脂质交换。 图中的插图放大了动力学过程的前 60 秒。误差线是散射强度数值积分产生的传播不确定性，代表一个标准差。缩写：R（t） = 归一化散射强度;t 过程 = 目标的校正过程时间。请点击此处查看此图的大图。

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Discussion

当前程序描述了混合装置和执行截止流TR-SANS测量的步骤。该装置和方案针对低粘度液体样品进行了优化，其中感兴趣的时间尺度为 ≈1 秒至 5 分钟。对于大于5 min的时间尺度，手动混合样品并将其加载到标准散射池中可能更容易且可取，特别是对于高粘度样品，凝胶或糊剂。访问小于 1 s 的时间尺度需要不同的混合设备、更低的总空隙体积和更高的总流速来降低延迟时间。同样重要的是要注意，在这些短时间尺度上研究动力学过程可能需要重复进样，以使用 TR-SANS 在毫秒时间尺度上积累足够的散射计数统计数据。如果总样品体积有限，则可能需要使用更高的通量技术，例如光散射或X射线散射，假设光或X射线散射存在足够的散射对比度，则每次进样需要较少的样品进样或更少的样品体积。

与针对中子散射实验进行了优化的市售停止流仪器相比，这种模块化的截止流SANS方法具有几个关键的优点和缺点。主要优点包括（1）在冲洗期间不同样品池之间交替进行TR-SANS测量，以最大限度地利用中子束时间，（2）调整注射器数量，注射器体积和混合器类型以适应三元样品混合或其他更复杂的样品混合要求，以及（3）通过隔离样品池并在更长的时间尺度（>10分钟）消除反向扩散来允许更长的测量周期。虽然这里没有实现，但混合单元设计的模块化也允许使用多种测量方法同时收集数据，例如组合SANS，UV-Vis和荧光测量70。这种模块化设置的两个主要缺点包括：（1）与其他可以提供1 ms至100 ms延迟时间的系统相比，混合延迟时间相对较长（1 s至3 s），以及（2）与其他可用系统相比，工作温度范围更小（10 °C至50 °C），工作温度范围从-20°C到大于80°C。

在进行 原位 混合实验之前，收集目标样品的初步SANS数据对于收集最佳TR-SANS数据非常重要，特别是在旨在监测分子交换动力学的实验中，例如此处介绍的示例。确定 I（0） 和 I（∞） 的准确值对于计算归一化强度 R（t） 的准确值至关重要，该值经过建模以提取所需的动力学参数。I（0）的值可以直接根据单独的H-囊泡和D-囊泡储备的测量散射强度计算，I（∞）可以通过制备由50/50的H-脂质/D-脂质混合物制备的单独囊泡样品来确定。来自这些对照样品的散射数据还可用于确定TR-SANS测量的最佳q范围和SANS仪器配置，以最大化信号并验证TR-SANS实验期间交换动力学的进展。如果混合后第一个时间点的测量强度不等于计算的I（0），则可能需要更快的混合时间来捕获所有感兴趣的过程。一旦测量强度达到I（∞），交换过程就完成了，可以清空和清洁电池，为下一次进样做准备。

为了成功混合TR-SANS的液体样品，必须确保所有注射器，阀门和管道都已灌注且无空气，并且所有管道连接都是安全的以防止泄漏。未能正确执行这些关键步骤可能会导致混合体积不准确或绝对散射强度不准确。例如，由于中子束路径中的样品体积减小，样品池内捕获的气泡将降低测量的SANS强度。或者，由于气液界面处的光束折射，气泡会在探测器上产生高强度的“条纹”或“耀斑”。测量的散射强度随时间的意外变化可能表明样品混合不良、阀门泄漏、样品池中的气泡或样品反向扩散。

在TR-SANS实验期间收集每个样品的透射测量值对于将收集的数据降低到绝对强度至关重要。可以在一些SANS仪器上同时收集散射和传输数据，从而简化了整个TR-SANS数据采集编程;但是，这并非在所有仪器上都可行，包括本协议中使用的VSANS仪器。由于样品透射和样品散射测量需要不同的仪器配置，因此在散射测量结束时收集透射测量值（协议步骤7.2.4），以确保在样品注入细胞后的最早时间点测量散射数据。透射仅取决于总元素组成、样品路径长度和中子波长。因此，如果总元素组成在整个时间分辨实验中保持不变，则传输不应改变。同一样品重复运行之间的透射值差异较大，表明混合样品量不一致、样品池填充不完全、气泡或实验过程中阀门泄漏和样品回流存在问题。

TR-SANS的一个独特优势是测量的强度取决于散射矢量（q），可用于探测纳米尺度的空间变化。当与停止流动混合装置结合使用时，TR-SANS可以在秒到分钟的时间尺度上探测这些纳米级变化，从而深入了解表面活性剂和脂质的自组装和交换，赋形剂添加时的聚合物和蛋白质聚集，纳米颗粒生长和衰变，或乳液中封装产物的交换。截止流装置可配置多个样品注射泵和注射器，以促进两个或多个液体样品的混合。这种灵活性使得能够系统地研究添加剂的目标动力学。例如，可以将不同体积的浓缩抗菌肽溶液与H囊泡和D囊泡溶液混合，以研究肽浓度对脂质交换动力学的影响45，46。此外，由于所有密封的流体路径都封装在温度受控的外壳中，其中包括样品注射器、阀门、混合器和管道，因此可以改变系统的温度以提取与感兴趣的动力学过程相关的热力学参数。

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Disclosures

作者没有利益冲突需要声明。

Acknowledgments

NG3 VSANS由高分辨率中子散射中心提供，该中心是美国国家标准与技术研究所与美国国家科学基金会之间的合作伙伴关系，协议编号为DMR-2010792。M.H.L.N 感谢 Mitacs Globalink（加拿大）提供的资金。识别任何商业产品或商品名称是为了促进理解，并不意味着国家标准与技术研究院的认可或推荐。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynamic mixer Analytical Scientific Instruments 462-0150A Magnetically coupled rotor, binary dynamic mixer assembly (ternary type available), 0.15 mL dead volume (larger dead volume available)
Fluoropolymer tubing IDEX Health & Science 1507L PFA Tubing Natural 1/16 inch OD x 0.040 inch ID x 50 ft
Fluoropolymer 1/4-28 flangeless fittings IDEX Health & Science XP-245 PFA flangeless fitting with ferrules, 1/4-28 threading, 1/16 inch OD tubing
Glass syringes Hamilton Company 81660 Hamilton 1000 series syringes, 10 mL (81660), model 1010 C syr, 1/4"-28 thread termination, other volumes available
High-pressure flow selector valves Vici Valco C85X-1570EUTB Vici 10 position selector valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure switch valves Vici Valco C82X-1574EUHB Vici 4 port switch valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure syringes Cetoni A2019000358 3 mL stainless steel syringe, 510 bar max, 21 mL/min flow rate max
Low-pressure flow selector valves Vici Valco C25-3180EUHB Vici 10 position selector valves, max 250 psi liquid, 0.75 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 1/4-28 threaded ports, USB universal actuator
neMESYS high-pressure syringe pumps Cetoni A3921000103 Max force 2600 N
neMESYS mid-pressure syringe pumps Cetoni A3921000131 Max force 1000 N
Power supply Cetoni A3921000127 Base 600, supplies power for up to 4 high pressure pumps
Quartz flow-through sample cell Starna Scientific 3-2.30-Q-1/TC Quartz micro flow cells, 2 mm path length (1 mm available), 2 mm by 2 mm by 30 mm internal dimension
Quartz windows Technical Glass Products NA GE 124 Clear fused quartz ground and polished plates, 11.75 inch by 23.75 inch by 0.375 inch thick
Stainless steel 10-32 coned compression fittings IDEX Health & Science U-321X, U-320X 316 stainless steel ferrule (U-321X) and nut (U-320X) -Valco type, 10-32 coned, for 1/16 inch OD stainless steel tubing
Stainless steel tubing IDEX Health & Science U-102 Stainless Steel Tubing 1/16 inch OD x 0.020 inch ID, 10 cm, various precut lengths available
Syringe pump control software Cetoni T6000000004 QmixElements software for nemesys pumps, QmixSDK software development kit
Thermoelectric air conditioner EIC Solutions AAC-140C-4XT-HC Thermoelectric air conditioner mounted on insulated enclosure to control the pump, valve, mixer, and sample temperature
T-slot railing McMaster-Carr 47065T103 Aluminum t-slotted railing (1.5 inch by 1.5 inch) cut to various lengths
Vapor locking bottle caps  Cole-Parmer EW-12018-02 Four 304 SS port inserts, 1/4"-28 threads, GL45 bottle cap size, PTFE body, SS threads, PP collar

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本月发表在JoVE上，第174期，小角中子散射（SANS），时间分辨散射，停止流动混合，分子交换动力学，脂质纳米颗粒，脂质膜，囊泡，结构演化
利用停流和小角中子散射测量纳米材料的时间演化
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Kelley, E. G., Nguyen, M. H. L., Marquardt, D., Maranville, B. B., Murphy, R. P. Measuring the Time-Evolution of Nanoscale Materials with Stopped-Flow and Small-Angle Neutron Scattering. J. Vis. Exp. (174), e62873, doi:10.3791/62873 (2021).

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