Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Nano Ölçekli Malzemelerin Zaman-Evrimini Durdurulmuş Akış ve Küçük Açılı Nötron Saçılması ile Ölçme

Published: August 6, 2021 doi: 10.3791/62873
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1, 1
1NIST Center for Neutron Research, National Institute of Standards and Technology, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of Windsor, 3Department of Physics, University of Windsor

Summary

Bu protokol, küçük açılı nötron saçılma ölçümü sırasında birden fazla sıvı çözeltisini yerinde hızlı bir şekilde karıştırmak ve nanometre uzunluk ölçeklerinde ve ikinci zaman ölçeklerinde kinetik süreçleri incelemek için durdurulmuş akışlı bir numune ortamının kullanımını sunar.

Abstract

Bu makale, sıvı numuneleri hızlı bir şekilde karıştırmak ve nano ölçekli kinetik süreçleri saniyeler ila dakikalar arasındaki zaman ölçeklerinde incelemek için durdurulmuş akışlı küçük açılı nötron saçılması (SANS) numune ortamının kullanımını sunmaktadır. Durdurulmuş akışlı numune ortamı, istenen hacimlerde sıvı numuneleri karıştırmak için piyasada satılan şırınga pompalarını kullanır ve bunlar daha sonra dinamik bir karıştırıcıdan yaklaşık 1 sn içinde bir kuvars cam hücresine enjekte edilir. Zaman çözümlü SANS veri toplama, karıştırmadan sonra çözeltideki nanoyapının evrimini takip etmek için numune karıştırma ile senkronize edilir.

Nötron ışını zamanını en verimli şekilde kullanmak için, ölçümler arasında hücreyi otomatik olarak yüklemek, durulamak ve kurutmak için bir dizi akış seçici valf kullanıyoruz ve bu da birden fazla numune enjeksiyonu boyunca tekrarlanan veri toplanmasına izin veriyor. Yeterli nötron saçılma istatistikleri toplanana kadar numune enjeksiyonları tekrarlanır. Karıştırma kurulumu, farklı karıştırma oranlarında, numune konsantrasyonlarında, katkı konsantrasyonlarında ve sıcaklıklarda kinetiği ölçmek için koşulları sistematik olarak değiştirecek şekilde programlanabilir. Enjeksiyon başına gereken minimum numune hacmi, kuvars hücresinin yol uzunluğuna bağlı olarak yaklaşık 150 μL'dir.

Bu durdurulmuş akışlı numune ortamını kullanan temsili sonuçlar, bir katkı maddesi, siklodekstrin varlığında hızlı lipit değişim kinetiği için sunulmuştur. Veziküller, dış broşür (dış) lipitleri saniyeler içinde değiştirir ve saatler içinde hem iç hem de dış lipitleri tamamen değiştirir. Lipid değişim kinetiğinin ölçülmesi, daha hızlı (saniye) ve daha yavaş (dakika) süreçleri yakalamak ve kinetik hız sabitlerini çıkarmak için yerinde karıştırma gerektirir. Aynı numune ortamı, lipit nanopartikülleri, proteinler, yüzey aktif maddeler, polimerler, emülsiyonlar veya inorganik nanopartiküller gibi diğer sıvı numune türlerinde moleküler değişimi araştırmak için de kullanılabilir. Nano ölçekli yapısal dönüşümleri ve değişim veya reaksiyona giren sistemlerin kinetiğinin ölçülmesi, nano ölçekte gelişen süreçlere yeni bakış açıları sağlayacaktır.

Introduction

Küçük açılı nötron saçılması (SANS), çeşitli malzemelerin boyutlarını, şekillerini, etkileşimlerini ve organizasyonlarını ≈1 nm ila ≈100 nm 1,2,3 arasındaki uzunluk ölçeklerinde ölçmek için benzersiz bir yol sağlar. Odaklama aynalı VSANS (çok küçük açılı nötron saçılımı) cihazları da dahil olmak üzere yeni cihazlar, ≈1000 nm 4,5'e kadar daha büyük uzunluktaki ölçekleri ölçmeye yönelik sınırları zorlamaktadır. Genel olarak, nötron saçılma yöntemlerine özgü benzersiz saçılma kontrastı, farmasötik formülasyonlardaki bileşenlerin toplanması6, polimer sistemlerde çapraz bağlanma ve jelasyon reaksiyonları7,8, membran proteinlerinin mezo kristalizasyonunda 9,10, proteinlerin parçalanması ve açılması11,12 gibi nano ölçekli yapıların zaman evrimini ölçmede çeşitli avantajlar sunar ve silika bazlı malzemelerin büyümesi13,14,15. Benzersiz saçılma kontrastı, zaman çözümlü SANS'I (TR-SANS) diğer durdurulmuş akış tabanlı ölçümler için kullanışlı bir tamamlayıcı haline getirir.

Durdurulmuş akışlı karıştırma yöntemleri genellikle küçük açılı X-ışını saçılması (SAXS)16,17,18,19,20,21, floresan spektroskopisi 22,23,24,25,26 ve ışık saçılması 27,28,29,30, Kinetik süreçleri milisaniye zaman ölçeklerinde incelemek için 31,32 deney. SANS ve SAXS arasındaki önemli bir fark, nötron saçılmasının tahribatsız bir karakterizasyon tekniği olmasıdır ve bu nedenle, SANS, aynı numuneyi, numuneye iyonlaştırıcı radyasyon hasarı vermeden saatlerce hatta günlerce ölçmek için kullanılabilir; bu, daha yüksek akılı X-ışını saçılma deneyleri sırasında meydana gelebilir33. Tekrarlanan SANS ölçümleri prob molekülünün veya numunenin kimyasal yapısını değiştirmeyeceğinden, zaman evrimi, örneğin floresan23,24'e dayanan kinetik ölçümleri zorlaştırabilecek fotobeyazlatmanın etkileri olmadan incelenebilir. Dahası, SANS, dinamik ışık saçılması gibi ışığa dayalı tekniklerle karakterize edilmesi genellikle zor olan yüksek konsantrasyonlu ve optik olarak opak numuneleri ölçmek için kullanılabilir.

Nano ölçekte yapısal bilgi sağlamanın yanı sıra, SANS, nötron saçılma uzunluğu yoğunluk kontrastındaki varyasyon yoluyla bu yapıların yerel bileşimini araştırmak için kullanılabilir. Farklı elementlerin saçılma uzunluğu yoğunluğu (SLD) periyodik tablo boyunca rastgele değişir ve aynı elementin farklı izotoplarına göre değişir. Yaygın olarak kullanılan bir örnek, çok farklı nötron saçılma uzunluklarına sahip olan hidrojen (1H veya H) ve döteryumdur (2H veya D). Bu nedenle, yüzey aktif maddeler, lipitler, proteinler, RNA, DNA ve diğer polimerler gibi hidrojen bakımından zengin malzemeler, sistemin fiziksel özelliklerini önemli ölçüde değiştirmeden SANS kullanılarak deuterated çözücülerden ayırt edilebilir. Bununla birlikte, H / D değişiminin numunedeki yoğunluğu, hidrojen bağını ve faz geçiş sıcaklıklarını etkileyebileceğini belirtmek önemlidir. Bununla birlikte, SANS'ın hidrojen bakımından zengin malzemelere karşı benzersiz duyarlılığı, özellikle ilgilenilen numunelerin SAXS gibi X-ışını tabanlı tekniklerde daha düşük saçılma kontrastına ve sinyaline sahip olduğu yumuşak madde araştırmalarında yararlıdır. İzotopik ikame aynı zamanda SANS'ı, H etiketli ve D etiketli molekülleri karıştırarak hidrojen bakımından zengin malzemelerdeki moleküler değişim kinetiği incelemek için güçlü bir araç haline getirir. İzotopik ikame, hacimli floresan boyaların ilgilenilen yüzey aktif madde veya lipit moleküllerinden daha büyük olduğu ve değişim kinetiğini etkileyebileceği sistemlerde özellikle yararlıdır34,35.

Zaman çözümlü SANS ölçümleri avantajlıdır çünkü ölçülen yoğunluk zaman, uzunluk ölçeği ve SLD kontrastının bir fonksiyonudur. Bu nedenle, TR-SANS deneyleri, mekansal dağılımlardaki ve örneklerin kompozisyonlarındaki zamana bağlı değişiklikleri araştırmak için tasarlanabilir. SANS'ın bu benzersiz avantajları, yüzey aktif maddeler 36,37,38, emülsiyonlar39,40,41, lipitler 34,42,43,44,45,46,47,48,49 gibi birçok yumuşak malzeme sisteminde kinetik süreçler hakkında önemli bilgiler edinmiştir ,50 ve polimerler 51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62. TR-SANS çalışmalarının çoğu, dakikalar ila saatler arasındaki zaman ölçeklerine odaklanmıştır. Bununla birlikte, ilgilenilen birçok kinetik süreç ikinci zaman ölçeğinde meydana gelir ve altta yatan mekanizmaları anlamak için gereklidir. Bu erken zaman noktalarının yakalanması, çözeltilerin hızlı bir şekilde karıştırılmasını ve yerinde ölçülmesini gerektirir; burada karıştırma, durdurulmuş akışlı ışık saçılması 27,28,29,30,31,32, floresan 22,23,24,25,26 ve X-ışını sırasında veri toplama ile senkronize edilir 16,17,18,19,20,21 deney. Bu çalışma, TR-SANS ölçümleri için birden fazla sıvı numuneyi hızlı bir şekilde karıştırmak ve karışımı bir kuvars cam hücresine enjekte etmek için tasarlanmış bir numune ortamının kullanımını açıklamaktadır. Karıştırma cihazı, yakın zamanda geliştirilen kılcal reoSANS cihazı63'ün bir uyarlamasıdır ve numune karıştırmayı kontrol etmek ve hücre temizliğini otomatikleştirmek için birden fazla şırınga pompası ve valfi kullanır. Şırınga pompalarını bir dizi akış seçici vanaya bağlayarak, TR-SANS ölçümlerini saniye zaman ölçeğinde kolaylaştırmak için birden fazla giriş akışı tekrar tekrar karıştırılabilir, ölçülebilir, durulanabilir ve kurutulabilir.

Mevcut prosedür, ilgilenilen örneklerin tanımlandığını ve hazırlandığını varsaymaktadır. TR-SANS verilerini toplamak için yerinde karıştırma kurulumuna ve yöntemlerine odaklanıyoruz. Nötron saçılma verileri, NIST Nötron Araştırma Merkezi'ndeki (NCNR) VSANS cihazında toplandı; ancak, prosedür diğer SANS cihazlarına uygulanabilir olmalıdır. Benzer protokolleri diğer SANS cihazlarına uygulamak isteyen okuyucular, ilgilenilen kinetik süreçlerle en alakalı istenen uzunluk ölçeğinde ve zaman ölçeğinde nötron akısını en üst düzeye çıkarmak için en uygun cihaz konfigürasyonunu belirlemek için yerel cihaz bilim insanlarına danışmalıdır. Burada sunulan veriler, uzamsal çözünürlük5 kaybında nötron sayımlarını en üst düzeye çıkarmak için VSANS üzerindeki yüksek akı 'beyaz ışın' konfigürasyonu kullanılarak toplanmıştır. Dedektör taşıyıcıları, ≈130 nm ila ≈13 nm uzunluk ölçeklerine karşılık gelen 0,005 Å-1 < q < 0,5 Å-1 aralığındaki bir dizi saçılma vektörünü (q) kapsayacak şekilde konumlandırılmıştır. Saçılma vektörü, q = 4π / λ günah (θ / 2) olarak tanımlanır; burada λ, nötron dalga boyu ve θ, saçılma açısıdır.

TR-SANS ölçümleri için kullanılan durdurulmuş akışlı karıştırma cihazı, Şekil 1'de görüldüğü gibi birden fazla pompa, durulama şırıngası, numune şırıngası, akış seçicilerin yanı sıra adinamik karıştırıcı, numune hücresi ve karışık numune kabından oluşmaktadır. Tüm sızdırmaz sıvı yolları, şırıngaları, vanaları, bağlantı borularını, dinamik karıştırıcıyı ve numune hücrelerini içeren klimalı bir muhafazanın içine yerleştirilmiştir. Muhafaza sıcaklığını ±1 °C içinde 10 °C ila 50 °C aralığında kontrol etmek için programlanabilir bir termoelektrik klima kullanılır. Cihazın çalışan parçalarını göstermek için muhafaza yalıtımının bir kısmının kaldırıldığını unutmayın. Ana karıştırma cihazı muhafazası, NCNR'deki NG3 VSANS ışın hattındaki bir çeviri aşamasına yerleştirilmiştir. Muhafaza konumu, numune hücresini nötron ışınının yoluna (sarı kesikli çizgi) yerleştirmek için çeviri aşaması kullanılarak ayarlanır.

Figure 1
Şekil 1: NIST Nötron Araştırma Merkezi'ndeki VSANS ışın hattında durdurulmuş akışlı karıştırma ve küçük açılı nötron saçılma ölçümlerini birleştirmek için örnek bir kurulum. Kurulumda dört şırınga pompası, solvent durulama için iki şırınga ve numune enjeksiyonu için iki şırınga, dört pompa seçici valf, iki karıştırıcı seçici valf, bir dinamik karıştırıcı, bir akışlı kuvars hücresi ve bir karışık numune kabı bulunur. Gelen nötronlar, numune hücresinin içinde bulunan karışık numuneyi saçar. Kuvars pencereli yalıtımlı bir muhafaza ve termoelektrik klimalı bir ünite, numuneyi ve tüm ekipmanı sabit bir sıcaklıkta kontrol etmek için kullanılır. Sarı kesikli çizgi nötron ışını yolunu gösterir. Ölçek çubuğu = 10 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 1'de gösterilen cihaz, iki numune şırıngası, iki durulama şırıngası ve bir numune hücresi ile yapılandırılmıştır. Protokolün farklı adımları için karşılık gelen akış diyagramları Şekil 2'de gösterilmiştir. İki farklı numunenin istenilen hacimleri miksere ve numune hücresine enjekte edilir (Şekil 2A). Numune hücresi doldurulduktan sonra, numune hücresini dinamik karıştırıcıdan izole etmek ve TR-SANS veri toplama sırasında numunenin hücreye geri difüzyonunu önlemek için Giriş Anahtar Vanası (ISV) ve Çıkış Anahtar Vanası (OSV) kapatılır (Şekil 2B). Dinamik karıştırıcıdan önce, bağlantı borusunun uzunluğu 10 cm ila 1 m arasında değişir ve karıştırma gecikme süresini etkilemez. Bununla birlikte, dinamik karıştırıcı ile numune hücresi arasındaki boru bağlantıları, karıştırma gecikme süresini ve gerekli numune enjeksiyon hacmini etkileyecektir. Dinamik karıştırıcıyı, Mikser Seçici Vanaları (MSV1 ve MSV2) ve ISV ve OSV'yi bağlamak için 0,04 inç (1 mm) iç çapa ve 100 mm uzunluğa sahip önceden kesilmiş paslanmaz çelik borular kullanılır. ISV ve OSV'yi (veya dinamik karıştırıcı çıkışını) numune hücresine bağlamak için 1 mm iç çapa ve 115 mm uzunluğa sahip florlu boru kullanılır. Karıştırma gecikme süresini etkileyen toplam boşluk hacmi, mikser boşluk hacmini (0,15 mL), karıştırıcı çıkışı ile numune hücresi girişi arasındaki boruyu (0,09 mL) ve numune hücresi hacmini (0,16 mL) içerir. Bu örnekte, toplam boşluk hacmi 0,4 mL'dir. Vanaların iç boşluk hacimleri, boru, karıştırıcı ve numune hücresi boşluk hacimlerine kıyasla ihmal edilebilir. Örneğin, kullanılan düşük basınçlı seçici valfler (0,75 mm delik çapı) yaklaşık 4 μL'lik boşluk hacimleri içerirken, yüksek basınçlı seçici valfler ve anahtar valfleri (0,25 mm delik çapı) yaklaşık 0,5 μL'lik boşluk hacimleri içerir.

TR-SANS ölçümü tamamlandıktan sonra, numune çözücü ile hücre dışına itilir ve artık numuneyi çıkarmak ve numune hücresini temizlemek için durulama çözücüsü hücre içinden tekrar tekrar pompalanır (Şekil 2C). Durulama şırıngalarının, ölçüm çalışmaları arasında numune hücresini temizlemek için yeterli çözücü hacminin mevcut olduğundan emin olmak için pompa seçici değerleri aracılığıyla daha büyük çözücü rezervuarlarına (örn. su ve etanol) bağlandığını unutmayın. Solvent kaynakları, numune kaynakları ve yanıcı sıvılar içeren karışık numune kapları, olası tüm ateşleme kaynaklarını ortadan kaldırmak için elektrikli ekipman içermeyen ayrı bir muhafazaya yerleştirilir. Ek olarak, yanıcı buharları ve çözücü buharlaşmasını en aza indirmek için buhar kilitlemeli şişe kapakları kullanılır. Son olarak, artık durulama çözücüsünü uzaklaştırmak için numune hücresi bir azot gazı akışı ile kurutulur (Şekil 2D). Karıştırıcı seçici vanasına giriş azot gazı basıncı, azot gazı silindiri üzerinde bulunan manuel bir basınç regülatörü kullanılarak yaklaşık 2 bar'a (0,2 MPa, gösterge basıncı) ayarlanır. Numune hücresi yeterince temizlendikten ve kurutulduktan sonra, bir sonraki ölçüm döngüsü için numune hücresine yeni karıştırılmış bir numune enjekte edilir ( Şekil 2A'daki akış diyagramında gösterilen karıştırma ve enjeksiyonu tekrarlayarak).

Figure 2
Şekil 2: Bir numune hücresi, iki numune karıştırma ve temizlik için iki durulama çözücüsü kullanan örnek akış diyagramı . (A) Numune A (mavi) ve numune B'nin (kırmızı) karıştırılması ve daha sonra karıştırılan numunenin (mor) numune hücresine akıtılması. (B) Veri toplama sırasında, numune hücresini izole etmek ve veri toplama sırasında numunenin geri yayılmasını önlemek için ISV ve OSV anahtar valflerinin kapatıldığı durdurulmuş akışlı cihaz durumu. (C) Veri toplandıktan sonra numune hücresinin SS1'den (yeşil) durulama çözücüsü ile durulandığı temizleme adımları. (D) Numune hücresinin azot gazı (turuncu) ile kurutulduğu kurutma adımı. Kısaltmalar: PSV = pompa seçici valf; MSV = mikser seçici vana; OSV = çıkış anahtar valfi; ISV = giriş anahtarı valfi; SS1 = çözücü kaynağı 1; SSA = örnek kaynak A; N2 = azot gazı kaynağı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3, karıştırma kurulumunun aynı şalt vanalarına bağlı iki ayrı numune hücresiyle yapılandırıldığı biraz farklı bir versiyon için akış diyagramlarını göstermektedir (Şekil 3A). TR-SANS verileri Örnek Hücre 1'de toplanırken, Örnek Hücre 2 durulanır (Şekil 3B) ve kurutulur (Şekil 3C). Örnek Hücre 1 için veri toplama tamamlandığında, Giriş Anahtar Vanası yeni karıştırılmış bir numuneyi veri toplama için Örnek Hücre 2'ye yönlendirir (Şekil 3D). TR-SANS verileri Örnek Hücre 2'de toplanırken, Örnek Hücre 1 durulanır ve kurutulur (Şekil 3E). İki numune hücresi arasındaki bu alternatif, paralel işlem, sonraki numune enjeksiyonları arasındaki süreyi en aza indirir ve nötron ışını zamanının kullanımını en üst düzeye çıkarır.

Figure 3
Şekil 3: İki numuneli hücre, iki numune karıştırma ve temizlik için iki durulama çözücüsü kullanan örnek akış diyagramı. (A) Numune A (mavi) ve numune B'nin (kırmızı) karıştırılması ve daha sonra karıştırılan numunenin (mor) numune hücre 1'e akıtılması. (B) Numune hücresi 2, SS1'den (yeşil) çözücü ile durulanırken, numune hücresi 1'de veri toplama sırasında durdurulan akış cihazı durumu. (C) Numune hücresi 1'de veri toplanması sırasında durdurulan akış cihazı durumu, numune hücresi 2 ise azot gazı (turuncu) ile kurutulur. (D) Örnek hücre 1'in veri toplanması tamamlandıktan sonra, yeni bir numune (mor) derhal karıştırılır ve numune hücresi 2'ye akar. (E) Numune hücresi 1, SS1'den (yeşil) çözücü ile durulanırken, numune hücresi 2'de veri toplama sırasında durdurulan akış cihazı durumu. Bir örnek hücre ölçülürken, diğer örnek hücre temizlenir ve kurutulur. Durdurulmuş akış ölçüm prosesi, sonraki numune karıştırma enjeksiyonları arasındaki süreyi en aza indirmek için iki numune hücresi arasında geçiş yapar. Kısaltmalar: PSV = pompa seçici valf; MSV = mikser seçici vana; OSV = çıkış anahtar valfi; ISV = giriş anahtarı valfi; SS1 = çözücü kaynağı 1; SSA = örnek kaynak A; N2 = azot gazı kaynağı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Pompaların ve boru hatlarının bağlanması, sistemin astarlanması, numune hücresinin durulanması ve kurutulması ve karışık numunenin enjekte edilmesi için adım adım bir protokol aşağıda açıklanmıştır. Tek hücreli konfigürasyon basitlik için gösterilse de (Şekil 2), esnek modüler kurulum, protokol ve komut dosyaları, Şekil 3'te gösterilen iki örnekli hücre konfigürasyonu gibi daha fazla şırınga pompası, vana, karıştırıcı veya numune hücre konfigürasyonu uygulamak için kolayca değiştirilebilir. Karıştırma ve temizleme enjeksiyon döngüleri boyunca toplanan temsili ham nötron sayım oranı verileri Şekil 4'te gösterilirken, 3 farklı sıcaklıkta ölçülen lipit değişim kinetiği ve değiştirilen lipitlerin fraksiyonuna karşılık gelen ekstrakte edilmiş normalize dağılmış yoğunluk sırasıyla Şekil 5 ve Şekil 6'da gösterilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Durdurulan akış sistemini kurun ve başlatın.

  1. Güç düğmesini kullanarak tüm pompa güç kaynaklarını ve dinamik karıştırıcıları açın.
  2. Durdurulan akış sistemi kontrol grafik kullanıcı arabirimindeki (GUI) tüm pompa ve vanaları, cihaz yapılandırma yolunu girerek ve bus=qmixbus komutlarını kullanarak başlatın. Bus(), bus.open(), bus.start(), pump=qmixpump. Pump(), pump.enable() ve valve=ViciMultiposSelector() (çevrimiçi açık kaynak deposu64'te bulunan örnek başlatma koduna bakın).
  3. Şırıngaları takmadan önce pump.calibrate() komutunu kullanarak pompaları kalibre edin.
  4. Valflerin başlatıldığını onaylayın ve valve.setPort() ve valve.getPort() komutlarını kullanarak komutta doğru seçici bağlantı noktasına gidin.
  5. A'nın şırınga namlusu iç çapı (mm) ve B'nin şırınga maksimum piston strok mesafesi (mm) olduğu pump.set_syringe_param(A, B) komutunu kullanarak her pompa için kullanılacak şırınga tipini atayın.
  6. Numune şırıngalarını şırınga pompalarına bağlayın.
    1. Pompaların kalibre edildiğinden emin olduktan sonra, temiz şırınga varillerini pompanın üstündeki bağlantıya (şırınga montaj kafası) vidalayın.
    2. Cam şırıngalar kullanırken, dolum hacmini dağıtmadan önce şırınga montaj kafasının gevşetildiğinden emin olun, böylece cam şırınga, şırınga pistonundan gelen aşırı kuvvet nedeniyle kırılmaz.
    3. Şırınga pistonunu pompanın altındaki bağlantıya vidalayın (şırınga montaj kuyruğu).
    4. Şırınga namlusu ve şırınga pistonu pompaya bağlandıktan sonra, şırınga pistonunu şırınga kovanının üstüne taşıyan pump.empty() komutunu kullanarak şırınga tipinin dolum hacmini dağıtın.
    5. Cam şırıngalar kullanırken, piston hareketi durduktan sonra şırınga montaj kafasını sıkın.
  7. Boruyu numune ve çözücü kaynaklarına, şırıngalara, vanalara, karıştırıcılara, numune hücrelerine ve karışık numune kabına bağlayın.
    1. Şırınga pompası borusunu pompa seçici vanalara bağlayın.
    2. Pompa seçici valf borusunu numune kaynaklarına bağlayın.
    3. Pompa seçici valf borusunu durulama çözücü kaynaklarına bağlayın.
    4. Pompa seçici valf borusunu mikser seçici vana borusuna bağlayın.
    5. Mikser seçici valf borusunu azot gazı kaynağına bağlayın.
    6. Mikser seçici valf borusunu mikser girişlerine bağlayın.
    7. Mikser çıkışını giriş anahtarı vanasına bağlayın.
    8. Giriş anahtarı valfini numune hücresi girişine bağlayın.
    9. Örnek hücre çıkışını çıkış anahtarı vanasına bağlayın.
    10. Çıkış anahtarı vanasını karışık numune kabına bağlayın.
  8. Durdurulan akışlı sistem kontrol GUI'sinde yapılan tüm boru ve valf bağlantılarını tanımlayın (Adım 1.7), her bir vanaya yapılan ilgili bağlantı noktası numarası bağlantılarını yazarak (çevrimiçi açık kaynaklı depo64'teki örnek kontrol koduna bakın).
  9. Her ölçüm için numune hücresini doldurmak için gereken minimum numune miktarını tanımlayan karıştırıcı girişi ile numune hücresi çıkışı arasındaki borunun boşluk hacmini hesaplayın.

2. Numuneyi yükleyin.

  1. İstenilen sayıları yazarak durdurulan akış sistemi kontrol GUI'sinde istenen numune dolum hacmini ve çözücü dolum hacmini ayarlayın (çevrimiçi açık kaynaklı depo64'teki örnek kontrol koduna bakın).
  2. İstenilen numune ve çözücü hacimlerini pompa seçici vanalar aracılığıyla kaynaklarından numune şırıngalarına çekmek (aspire etmek) için pump.aspirate() komutunu kullanın.
    NOT: Boş bir şırıngayı ilk kez yüklerken, şırınganın üst kısmında, 3. adımda sistemi numune ve çözücü ile astarlamak için temizlenmesi gereken hava bulunacaktır.

3. Sistemi astarlayın.

  1. Şırıngalardan, boru hatlarından ve vanalardan gelen tüm havayı dışarı itmek (dağıtmak) için pump.dispense() komutunu kullanın. Şırıngalardan, borulardan ve vanalardan tüm havayı tamamen çıkarmak için her şırıngadan yeterli sıvı hacminin dağıtıldığından emin olun. Herhangi bir borunun içinde hava kabarcıkları görülebiliyorsa, kabarcıklar çıkarılana kadar çözücü veya numune dağıtmaya devam edin.
  2. Hava sistemden temizlendikten sonra, en az bir numune enjeksiyonu ve durulama prosedürü uygulayın (nötron saçılma verileri toplanmadan).
    1. Kontrol GUI'sinde Karıştırma deneyini başlat etiketli hücreyi seçmek için tıklatın.
    2. Bu hücre etkin bir şekilde seçiliyken, kontrol GUI'sinin üst kısmında bulunan Çalıştır düğmesine (sağ üçgen) tıklayın veya klavyede Shift ve Enter tuşlarına birlikte basın.
    3. Hava kabarcıklarının mevcut olmadığını doğrulamak için numune hücresini görsel olarak inceleyin.
      1. Hava kabarcıkları varsa, boru hatlarındaki havayı daha fazla temizlemek için protokol adımları 3.1 ve 3.2'yi tekrarlayın.
      2. Örnek hücrede hava kabarcıkları yoksa, kalan deney protokolü adımlarını tanımlamak için adım 4'e geçin.

4. Program betiğinde durdurulmuş akış karıştırma protokolünü tanımlayın (çevrimiçi açık kaynak deposu64'teki kod örneğine bakın).

  1. Durdurulan akış cihazını çevreleyen yalıtımlı muhafazanın sıcaklığını kontrol eden programlanabilir klima (AC) ünitesinin sıcaklık ayar noktasını girin.
    1. AC kontrol ünitesindeki yıldız düğmesini basılı tutarken, ayar noktası sıcaklığını değiştirmek için yukarı ve aşağı oklara basın. Alternatif olarak, kontrol GUI'sine istediğiniz sıcaklık ayar noktasını yazın ve Çalıştır'a tıklayın.
    2. Kinetik deneylere başlamadan önce muhafaza içinin istenen sıcaklıkta dengelenmesine izin vermek için 15-30 dakika bekleyin.
      NOT: Erişilebilir sıcaklık aralığı şu anda 10 °C ile 50 °C arasındadır ve sıcaklık kararlılığı ± 1 °C'dir.
  2. Kontrol GUI'sine uygun hacimleri, akış hızlarını, süreleri ve tekrarlama sayısını yazarak tüm durulama sırası adımlarını girin.
    1. Enjekte edilecek her numunenin hacmini tanımlayın, bu da toplam akış hızını (Q) tanımlar.
    2. Durulama prosedürü sırasında enjekte edilecek her çözücünün hacmini tanımlayın.
    3. Her durulama alt adımı arasındaki kuruma süresini tanımlayın (tkuru).
    4. Durulama alt adımlarının sayısını tanımlayın.
    5. Sonraki durulama adımları için farklı çözücüler tanımlayın.
    6. Her ölçümden sonra gerçekleştirilecek durulama tekrarlarının sayısını tanımlayın (ndurulama).
    7. Numune hücresinin ve mikserin tamamen kuruması için gereken süreyi tanımlayın ve sonraki numune enjeksiyonu için temiz bir numune hücresi sağlayın (tdry_final).
  3. Durdurulan akış sistemi kontrol GUI'sine uygun hacimleri, akış hızlarını ve zamanları yazarak tüm numune enjeksiyon sırası adımlarını tanımlayın.
    1. Enjekte edilecek her numunenin hacmini ve akış hızını tanımlayın.
    2. Boşluk hacminden (Vboşluk) gecikme süresini (t gecikmesi) ve toplam akış hızını (tgecikmesi = Vboşluk/ Q) hesaplayın.
      NOT: Gecikme süresi, numune hücresini karışık numuneyle doldurmak için gereken süredir.
    3. TR-SANS verileri için istenen edinme zamanını, ilgilenilen tüm kinetik sürecin (tscatt) gerçekleşeceği şekilde tanımlayın.
    4. Saçılma deneyinin sonu ile durulama döngülerinin başlangıcı arasındaki bekleme süresini ayarlayın (tbekleyin).
      NOT: Numune nötron iletimi hücreden durulanmadan önce ölçülecekse, bu bekleme süresi en az 100 s olmalıdır. Verileri mutlak yoğunluğa düşürmek için veri işleme sırasında numune iletimi gereklidir.
    5. Adım 4.2'de (ndöngüsü) tanımlanan her enjeksiyon arasında çalışan durulama sekansları ile gerçekleştirilecek enjeksiyon döngülerinin sayısını tanımlayın.
  4. Denklemi (1) kullanarak tek bir durdurulmuş akış veri toplama döngüsünün (tdöngüsü) toplam süresini hesaplayın.
    tdöngüsü = ndurulama × (t gecikmesi + tkuru) + tdry_final + tgecikmesi + tscatt (1)
    ndurulama = durulama tekrarlarının sayısı (adım 4.2.6); tdelay = durdurulan akış cihazının gecikme süresi (adım 4.3.2); tkuru = her durulama alt adımı arasındaki kuruma süresi (adım 4.2.3); tdry_final = numune hücresinin ve mikserin tamamen kuruması için gereken süre (adım 4.2.7); tscatt = İstenilen TR-SANS veri toplama süresi (adım 4.3.3)

5. SANS cihaz kontrol GUI'sinde küçük açılı nötron saçılma parametrelerini tanımlayın.

  1. Her numune için uzunluk ölçeklerini ve ilgilenilen q-aralığını belirleyin.
  2. Numunedeki nötron akısını en üst düzeye çıkarırken, istenen q-aralığını kapsayacak şekilde cihaz konfigürasyonunu tanımlayın.
  3. SANS cihaz kontrol GUI'sindeki toplam VSANS veri toplama süresini, adım 4.4'teki hesaplanan döngü süresine ayarlayın (nötron saçılma veri toplama süresi = tdöngüsü).
  4. SANS cihaz kontrol GUI'sinde numune iletim ölçüm süresini 100 sn olarak ayarlayın.
  5. SANS enstrüman denetimi GUI'sini kullanarak, komut satırına GenerateEventModeData true yazarak olay modu veri toplamayı açın.

6. TR-SANS verilerini işlemek için durdurulmuş akış deneyine başlamadan önce veri azaltma için standart saçılma ölçümlerini toplayın.

  1. Arka plan saçılımını ölçün.
    1. Yerel enstrüman deklanşörünün kapalı olduğundan emin olun.
    2. Bloke edilmiş ışın örneğini numune açıklığının arkasına takın, yerel enstrüman ortamını sabitleyin ve yerel enstrüman deklanşörünü açın.
    3. Yazılımda engellenen ışın saçılma veri toplama süresini tanımlayın ve en uzun saçılma veri toplama süresi (tscatt) ile aynı süre boyunca sayarak engellenen ışın saçılma verilerini toplayın.
    4. Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, cihaz deklanşörünü kapatın ve bloke edilmiş ışın örneğini numune açıklığından çıkarın.
  2. Boş hücre saçılımını ölçün.
    1. Numune hücresinin iyice durulandığından ve kurutulduğundan emin olun.
    2. Yerel enstrüman deklanşörünü açın.
    3. 100 sn için boş hücre iletim ölçümünü toplayın.
    4. En azından en uzun edinme süresi (tscatt) için sayarak boş hücre saçılma ölçümünü toplayın.

7. Durdurulmuş akış deneyine başlayın.

  1. VSANS saçılma veri toplamayı olay modunda başlatın.
    1. Yerel enstrüman alanının güvenli olduğundan emin olun ve ardından yerel enstrüman ışını deklanşörünü açın.
    2. Cihaz bilgisayarındaki SANS cihaz kontrol yazılımını kullanarak, istenen çalıştırmaları cihaz kuyruğuna sürükleyip bırakarak SANS veri toplamaya başlayın.
      NOT: En erken zaman noktalarının ölçüldüğünden emin olmak için, durdurulmuş akışlı karıştırma deneyine başlamadan önce veri toplamaya başlayın. Veriler, gecikme süresini (tgecikmesi) hesaba katmak için daha sonraki bir adımda sonradan işlenecektir.
  2. Kontrol GUI'sinde durdurulmuş akış karıştırma deneyini başlatın.
    1. Durdurulan akış sistem denetimi GUI'sinde Karıştırma deneyini başlat etiketli dizüstü bilgisayar hücresini seçin.
    2. Bu hücre etkin bir şekilde seçiliyken, durdurulan akışlı aygıt kontrol programının üst kısmında bulunan Çalıştır düğmesine (sağ üçgen) tıklayın veya klavyede Shift ve Enter tuşlarına birlikte basın.
    3. Bölüm 4'te tanımlanan durdurulmuş akış karıştırma protokolünün çalışmaya başladığını onaylayın.
    4. SANS cihaz kontrol GUI'sini kullanarak saçılma çalışmasından sonra VSANS cihaz kuyruğuna 100 s iletim ölçümünü ekleyin.
    5. SANS cihaz kontrol GUI'sinde kalan her durdurulmuş akışlı karıştırma döngüsü (ndöngüsü - 1, adım 4.3.5) için cihaz kuyruğuna bir saçılma ölçüm çalıştırması ve bir iletim ölçüm çalıştırması ekleyin.

8. Tüm arka planları kaldırmak, dedektör hassasiyeti için doğru ve numune iletimi için doğru olmak üzere verileri işleyin ve azaltın.

  1. Dağılım veri dosyalarını ve ilişkili olay dosyalarını sunucudan indirin.
    NOT: Her VSANS ölçümünden sonra ayrı dedektör olay dosyaları, her aktif dedektör taşıyıcısı için bir olay dosyası (ör. ön, orta ve/veya arka dedektör) oluşturulur.
  2. Events=Rebin(filename) komutunu kullanarak saçılma verilerini istenen zaman kutularına saçın ve ardından e vents.do_rebinning(timebins) komutunu kullanın, burada giriş dosyası adı istenen SANS veri dosyasının adına karşılık gelir vetimebins saniye cinsinden istenen zaman kutusu sınırlarının bir listesidir.
    NOT: Giriş zaman kutuları liste yerine tek bir sayı olarak girilirse, veriler eşit zaman genişliklerine sahip N sayıda bölmeye bağlanır, burada N giriş zaman kutularıdır (bkz. ışın çizgisi tarafından sağlanan yazılım komut dosyaları ve mevcut çevrimiçi açık kaynaklı depo64).
  3. Beamline65 yazılımı kullanarak ciltlenmiş saçılma verilerini azaltın.

9. TR-SANS verilerini analiz eder.

  1. Denklemi (2) kullanarak ölçüm sürelerinden ilgilenilen işlem süresini (t süreci) hesaplayın.
    tişlemi = ti - tdurdurma + tgecikme (2)
    Burada ti , akış durdurulduktan sonra başlayan ölçüm zaman kutularıdır, tdurdurma , akış durdurulduğunda hemen ölçüm süresidir ve tgecikmesi , gecikme süresidir.
  2. Adım 8.2'de tanımlanan zaman kutularını ve adım 9.1'de hesaplanan tişlemini kullanarak q'ya bağımlı yoğunluk I(q)'yi işlem süresinin bir fonksiyonu olarak çizin.
    NOT: Erişilebilir en erken işlem süresi tgecikmesi ile sınırlıdır. Daha önceki proses zaman noktalarını ölçmek için toplam akış hızını (Q) artırın veya toplam boşluk hacmini (Vboşluğu) azaltın.
  3. İşlem süresinin bir fonksiyonu olarak I(q)'daki değişiklikten ilgilenilen kinetik parametreleri ayıklayın.

10. Denemeyi sonlandırın.

  1. Yerel enstrüman deklanşörünü kapatarak nötron ışınını kapatın.
  2. Herhangi bir parçanın, borunun bağlantısını kesmeden veya numuneleri veya karışık numune kaplarını boşaltmadan önce ışın hattı tarafından sağlanan bir radyasyon monitörünü kullanarak radyasyon kontrolü yapın.
  3. Şırıngaları, tüpleri ve karışık numune kabını sağlık fiziği bölümüne aktarın.
  4. Sağlık fiziği formlarını doldurun ve sağlık fiziği personeli tarafından değerlendirilmesini bekleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada gösterilen temsili nötron verileri, veziküller arasındaki lipit değişimini (ke) 66,67 döviz kuru ile katalize eden bir katkı maddesi olan metil-β-siklodekstrin (mβCD) varlığında lipit değişim kinetiğini ölçer. Önceki floresan çalışmaları,k'nin mβCD konsantrasyonuna bağlı olduğunu ve değişim işleminin yarı ömrünündakika 68 mertebesinde olduğunu göstermiştir. Mevcut deneyler, saniye zaman ölçeğinde veziküller arasındaki mβCD katalizörlü lipit değişimini ölçmek için durdurulmuş akışlı TR-SANS kullanmaktadır. İzotopik olarak birbirinden farklı iki lipid vezikül popülasyonu hazırlandı; bir vezikül popülasyonu kuyruk-hidrojene dimiristoylfosfatidilkolin (DMPC) lipitleri (Şekil 5'te H-lipid vezikülleri), diğer vezikül popülasyonu ise kuyruk deuterated DMPC (DMPC-d54) lipitleri (Şekil 5'te D-lipid vezikülleri) ile hazırlandı. Unilameller vezikül oluşumunu teşvik etmek için hem DMPC hem de DMPC-d54 kuru lipid tozlarına yüklü dimiriyotilfosfatidilglyerkol (DMPG) lipitinin 0.05 (% 5 mol) mol fraksiyonu eklendi69.

Ayrı H-vezikül ve D-vezikül çözeltileri, ilgili lipit filmlerin hacimsel ağır su (D2 O) ve% 55 hacimsel su (H2O) içeren bir çözücü içinde hidratılmasıyla hazırlanmıştır. D 2 O/ H2O çözücü bileşimi, çözücünün nötron saçılma uzunluğu yoğunluğu (ρ), H-lipitlerin ve D-lipitlerin rastgele bir karışımıyla eşleşecek şekilde hesaplanmıştır (Δρ = ρlipit- ρçözücü = 0). Başka bir deyişle, rastgele karıştırılmış bir H / D-vezikülü nötronlar için 'görünmez' olacak ve sıfır tutarlı nötron saçılması üretecektir. Unilameller vezikül çözeltileri, çözeltilerin beş kez dondurularak çözülmesi ve daha sonra bireysel çözeltilerin 100 nm çapında gözeneklere sahip bir polikarbonat filtreden geçirilmesiyle hazırlandı. Vezikül çözeltileri, iki şırınga ve filtre arasında 30 ° C'de toplam 31 kez ileri geri ekstrüde edildi. Daha sonra, vezikül çözeltilerine aynı D 2 O / H2O çözücü karışımındahazırlanan konsantre bir mβCD stok çözeltisinin küçük bir hacmi eklenmiştir. Son lipid konsantrasyonu 14 mmol/L (mM) ve mβCD konsantrasyonu 30 mM idi. Bireysel vezikül çözeltileri, çözeltiler durdurulmuş akışlı karıştırma cihazındaki numune şırıngalarına yüklenmeden önce eklenen mβCD ile en az 30 dakika boyunca dengelendi.

Çoklu enjeksiyon döngüleri boyunca ölçülen nötron sayım oranlarının bir örneği Şekil 4A'da gösterilmiştir. Her döngü 9 durulama adımı, 1 kurutma adımı ve 1 numune enjeksiyon adımından oluşuyordu. Netlik için yalnızca VSANS cihazındaki orta dedektör taşıyıcısında ölçülen sayım oranları sunulur. Ön dedektör taşıyıcısında, daha büyük saçılma açılarında veya daha yüksek q değerlerinde toplanan verilere karşılık gelen benzer eğilimler bulundu. Sayım oranı, her durulama çözücüsü enjeksiyonu (çözücü S1 ve çözücü S2) ile yükseldi ve çözücü azot gazı ile hücrenin dışına itildiğinde ve kurutulduğunda boş hücre taban çizgisi sayımlarına geri döndü. Son hücre durulaması, bu örnekte etanol olan S2 ile yapıldı ve hücre, numune enjeksiyonundan önce 3 dakika boyunca azot gazı ile son kez kurutuldu. Numune hücreye enjekte edildikten kısa bir süre sonra, nötron sayım hızı yükseldi ve veriler 5 dakika boyunca sürekli olarak toplandı. Şekil 4A'daki örnek verilere enjekte edilen temsili örnek, bir tuz tamponu arka planıydı. Zaman içinde ölçülen yoğunluktaki dalgalanmalar, arka plan nötron sayım hızındaki değişimleri yansıtır ve ortalama numune bileşimindeki bir değişikliği yansıtmaz. Numunenin durulanması, kurutulması, karıştırılması ve enjekte edilmesinin tüm döngüsü, her bir döngünün toplam 15 dakika sürdüğü Şekil 4A'daki örnekte ek bir süre daha tekrarlanmıştır.

Bireysel H-etiketli ve D-etiketli lipit vezikül çözeltileri, tkarışımı zamanında karıştırıldı ve hemen numune hücresine aktı. Ölçülen nötron sayısı oranı yükseldi ve daha sonra Şekil 4B'de gösterildiği gibi numune hücresi tdolumunda doldurulduğunda maksimum bir değere ulaştı. Numune hücresini doldurmak için gereken geçen süreye gecikme süresi tgecikmesi denir ve tdelay = tfill- tkarışımı ile verilir. Karıştırıcı ile numune hücresi arasındaki boşluk hacmi (Vboşluğu) biliniyorsa ve toplam akış hızı (Q) biliniyorsa, t gecikmesi tgecikmesi = Vboşluk/Q olarak da hesaplanabilir (bkz. protokol adımı 4.3.2), bu aynı zamanda sıvı numunenin miksere girip numune hücresinden ayrılması için ortalama kalma süresidir. Tdolgusuna ulaştıktan sonra, hücrenin dolmasını ve kararlı duruma ulaşmasını sağlamak için akış sabit bir akış hızında devam ettirildi. Akış daha sonra tdurağında hemen durduruldu. Ortalama nötron sayım hızı, tdolgusu ile tdurağı arasındaki ölçüm süresinin bir fonksiyonu olarak sabit kalmıştır, çünkü numune hücresi boyunca akış hızı sabittir ve bu nedenle nötron ışını yolu içindeki numune kararlı durumdaydı. Başka bir deyişle, tdurağında ölçülen veriler, tdelay = tfill- tmix = Vvoid / Q ile karıştırılan ve geliştirilen numuneye karşılık gelir. Tdurağından hemen sonra toplanant'nin binned ölçüm süreleri, ilgilenilen ana kinetik verilerdir.

Şekil 4C'de, üç farklı sıcaklıktaki karışık lipit vezikülleri örneğinden nötron sayımları, kararlı durum akış periyodu ve gecikme süresi için düzeltilmiş olan işlem süresi olan düzeltilmiş işlem zaman ölçeğinin (tişlemi) bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. İşlem süresi ölçeği t process = ti- tstop + tdelay veya eşdeğer olarak, tprocess = ti- tstop + t fill- t karışımı ile hesaplanmıştır. SANS verileri Şekil 4'te olay modu olarak adlandırılan modda sürekli olarak toplanmıştır. Olay modu veri toplama sırasında, tespit edilen her nötron olayı benzersiz bir zaman damgası ve iki boyutlu nötron dedektöründeki x ve y konumu ile kaydedilir. Olay modu verileri daha sonra Şekil 4B'de istenen zaman kutularına (ti) sonradan işlenir.

İlgilenilen erişilebilir işlem zaman penceresindeki olay modu verileri (yani, Şekil 4B'deki tdurağından sonra her ti'de toplanan nötron saçılması), çevrimiçi açık kaynaklı depo64'te bulunan protokoller ve komut dosyaları kullanılarak o zaman kutusu için iki boyutlu (2B) bir dedektör görüntüsüne yeniden yapılandırılmıştır. Her 2B dedektör görüntüsü daha sonra farklı arka plan kaynaklarını çıkarmak, numune iletimi ve dedektör verimliliğini düzeltmek ve 2B dedektör verilerini yoğunluk (I) ve saçılma vektörü (q) grafiklerine azimutal olarak entegre etmek için veri azaltma rutinleri kullanılarak işlendi65. Şekil 5'teki veriler eşit (3 sn) zaman kutularına bağlanmıştır ve bir TR-SANS ölçümünden elde edilebilecek zamana ve uzunluk ölçeğine bağlı bilgileri temsil etmektedir. Şekil 4B'de gösterilen toplam ham sayım oranına benzer şekilde, q-bağımlı yoğunluk I(q), dış broşürdeki lipitler değiş tokuş ettikçe ve farklı veziküller arasında rastgele karıştıkça zamanla azalır.

3 farklı sıcaklıkta ölçülen lipit değişim kinetiği için veriler Şekil 5'te sunulmuştur. Her grafik, karıştırmadan sonraki ilk 110 dakika boyunca toplanan verileri gösterir. Ölçülen yoğunluk, lipit sıvı fazına karşılık gelen 36 ° C ve 30 ° C'deki en düşük q değerlerinde bir büyüklük sırasına göre azalır. Bu arada, dağınık yoğunluk verileri 20 ° C'de zamanla önemli ölçüde daha yavaş değişir, bu da dış broşür değişim kinetiğinin lipit jel fazında çok daha yavaş olduğunu gösterir.

Ölçülen saçılma yoğunluğu, I(q), SLD kontrastı Equation 1ile ilişkilidir, burada Δρ, vezikül ve çevresindeki çözücü arasındaki SLD farkıdır. Bu ortalama SLD kontrastı, herhangi bir zamanda bir veziküldeki H-lipitlerin ve D-lipitlerin göreceli sayıları ile doğrudan ilişkilidir. Bu nedenle, belirli bir zamanda ölçülen saçılma yoğunluğu, değiş tokuş edilen lipit popülasyonunun fraksiyonunu belirlemek için normalleştirilebilir. Bu normalizasyon, aşağıdakiler de dahil olmak üzere iki ek ölçüm toplanarak elde edilir: (1) veziküller arasında lipit değişimi olmadığında t = 0 zamanında ölçülen yoğunluk I (0) ve (2) tüm lipitlerin değiş tokuş ettiği ve popülasyonların dengelendiği t = ∞ zamanında ölçülen yoğunluk I (∞). Normalleştirilmiş sayım oranı, 42, Equation 2Şekil 6'daki farklı sıcaklıklar için işlem süresinin bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. Bu örnekte, I(t), t işlem zamanındaki q-entegre yoğunluğudur (q'nun bir fonksiyonu olarak entegre edilmiş arka plan çıkarılmış yoğunluk), I(∞), tüm lipitler değiş tokuş edildikten sonra sonsuz zamanda q-entegre yoğunluğudur (çözücü arka plan saçılmasına benzer olmalıdır) ve I (0) q-entegredir t = 0 zamanındaki yoğunluk (lipit değişimi olmadan). I (0), değişimin yavaş olduğu 20 ° C'de faz geçiş sıcaklığının altındaki karışık bir numune için ölçüldü ve I (∞), 40 ° C'de 36 saatten fazla dengelenmiş ve H-lipitleri ve D-lipitleri olan ve tamamen değiş tokuş eden ayrı bir numunede ölçüldü.

Normalleştirilmiş sayım oranı, t = 0 işlem zamanında R(t) = 1'den, t = ∞'da R(t) = 0'a düşmelidir ve örneklemdeki SLD kontrastı ve dolayısıyla lipit değişiminin derecesi ile doğrudan ilişkilidir 27,28,29,30,31,32,33,34,35 . En erken ölçülen R(t) verilerinin 30 °C ve 36 °C'de R(t)=1'de başlamadığına dikkat edin, bu da karıştırmadan sonraki ilk 3 sn boyunca önemli miktarda lipit değişiminin meydana geldiğini gösterir; bu, kullanılan durdurulmuş akışlı karıştırma protokolünün gecikme süresi (tgecikmesi = 2,4 sn) nedeniyle deneysel olarak erişilemez. Bu arada, 20 ° C'de ölçülen R (t) ilk (2-3) dakika boyunca yaklaşık olarak sabit kalmıştır. 30 °C ve 36 °C'de ölçülen lipit değişim kinetiği için, R (t) 100 s içinde hızla ≈0.5'e bozundu, bu da dış yaprakçık lipitlerinin dakikalar içinde tamamen değiştiğini ve dengelendiğini gösteriyor. Buna göre, mβCD katalizörlü lipit değişiminin yakalanması, durdurulmuş akışlı SANS kullanılarak mümkün kılınmıştır ve manuel pipet karıştırma ile yakalanması zor olacaktır. Daha erken proses zaman noktalarının (t < 3 s) yakalanması, gecikme süresini azaltmak için daha küçük boşluk hacmi, daha küçük boru boşluk hacimleri ve daha yüksek toplam akış hızlarına sahip farklı bir karıştırıcı tipi gerektirecektir.

R (t), lipitler iç ve dış broşürler arasında ters döndükçe daha uzun sürelerde çürümeye devam etti. Daha yavaş parmak arası terlik prosesi (t > 5 dakika) için TR-SANS verileri, elle karıştırılan ve standart SANS numune hücrelerine yüklenen ayrı numunelerle toplanabilir, çünkü manuel pipet karıştırma yöntemi yaklaşık 5 dakika sürer. Benzer şekilde, lipit jel fazında 20 ° C'deki lipit değişimi, karıştırılacak ve ayrı ayrı ölçülecek kadar yavaştı ve bu ölçümün mutlaka durdurulmuş akışlı karıştırma yöntemiyle incelenmesi gerekmiyordu. Kinetik proseslerin birkaç dakika ila saatler arasındaki zaman ölçeklerinde ölçülmesi, numuneler manuel pipet karıştırma ile karıştırıldığında daha verimlidir. Bununla birlikte, dakikalardan daha kısa zaman ölçeklerinde kinetik işlemler bu durdurulmuş akışlı karıştırma ve TR-SANS ölçüm prosedürünü gerektirecektir.

Figure 4
Şekil 4: Karıştırma ve temizleme enjeksiyon döngüleri boyunca toplanan temsili ham nötron sayısı oranı verileri . (A) Tekrarlanan durulama dizileri, kurutma sırası ve çoklu döngüler boyunca karışık numune enjeksiyon dizisi sırasında zamanın bir fonksiyonu olarak nötron sayım hızının (orta dedektör) örneği. (A)'daki örnek bir tuz tamponu arka planıydı ve zaman içindeki yoğunluktaki değişiklikler, örneklemdeki bir değişikliği değil, arka plan sayım oranındaki değişiklikleri yansıtır. (B) 30 ° C'de karışık H-lipid ve D-lipid veziküllerinin enjeksiyonundan sonraki deney süresinin bir fonksiyonu olarak monitör-normalize nötron sayım oranı. Dikey kesikli çizgiler, karıştırma başlangıç zamanını (tmix), doldurma süresini (tfill), akış durdurma süresini (tstop) ve zaman bölme bölgesini (ti) gösterir. Tdurmasından sonra sayım hızındaki bozulma, veziküller arasındaki lipit değişimi olarak numunedeki kontrast kaybından kaynaklanmaktadır. (C) Normalleştirilmiş nötron sayım oranlarını, deneyin ilk 100 saniyesi için değişim işlem süresinin bir fonksiyonu olarak (mavi) 20 °C, (yeşil) 30 °C ve (kırmızı) 36 °C'de izleyin. Olay modu verileri 1 s kutularına işlenir. Kısaltmalar: S1 = çözücü 1; S2 = çözücü 2; tmix = numune çözeltilerinin karıştırıldığı deney süresi; tfill = örnek hücrenin doldurulduğu deney süresi; tstop = akışın durdurulduğu deney süresi; tişlemi = hesaplanan kinetik işlem süresi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Lipid veziküllerinin dış tabakasının katalizörlü değişiminin ve çeşitli sıcaklıklarda saçılma vektörünün (q) bir fonksiyonu olarak saçılma yoğunluğundaki (I) karşılık gelen değişikliklerin gösterimi. (A) t = 0'da ilk karıştırmadan sonra H-lipid ve D-lipid vezikülleri arasındaki lipit değişimini ve (B) metil-β-siklodekstrin (mβCD) tarafından katalize edilen dış tabakanın değişimini gösteren şematik. Saçılma dalgası vektörü q'nun bir fonksiyonu olarak azaltılmış nötron saçılma yoğunluğu. Durdurulmuş akışlı karıştırma deneyleri ve VSANS ölçümleri (C) 36 °C, (D) 30 °C ve (E) 20 °C'de tekrarlanmıştır. Sunulan veriler, belirtilen her sıcaklıkta karıştırıldıktan sonra ilk 10 dakika boyunca 3 s aralıklarla birleştirildi. Hata çubukları, sayım istatistiklerinden yayılan belirsizliktir ve bir standart sapmayı temsil eder. Kısaltmalar: ke = veziküller arası lipid değişimi için oran sabiti; mβCD = metil-β-siklodekstrin; kf = lipid flip-flop olarak da adlandırılan broşürler arası lipit değişimi için oran sabiti; l(q) = cm-1 birimleri ile ölçülen SANS yoğunluğu; q = saçılma vektörü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Değiş tokuş edilen lipitlerin fraksiyonuna karşılık gelen normalleştirilmiş dağınık yoğunluk, ilgilenilen kinetik süreçler için oran sabitlerini çıkarmak üzere modellenebilir. (A) Veziküllerin dış yaprağı arasında (mavi) 20 °C, (siyah) 30 °C ve (kırmızı) 36 °C'de ölçülen 3 s ile 600 s arasındaki zaman ölçeklerinde meydana gelen lipit değişimi. Şekildeki girinti, kinetik işlemin ilk 60 saniyesini yakınlaştırır. Hata çubukları, saçılma yoğunluklarının sayısal entegrasyonundan yayılan belirsizliktir ve bir standart sapmayı temsil eder. Kısaltmalar: R(t) = normalleştirilmiş dağınık yoğunluk; tsüreci = ilgilenilen düzeltilmiş işlem süresi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mevcut prosedür, karıştırma cihazını ve durdurulmuş akışlı TR-SANS ölçümlerini gerçekleştirme adımlarını açıklamaktadır. Cihaz ve protokol, ilgilenilen zaman ölçeklerinin ≈1 s ila 5 dakika olduğu düşük viskoziteli sıvı numuneler için optimize edilmiştir. 5 dakikadan daha uzun zaman ölçekleri için, numunelerin manuel olarak karıştırılması ve standart saçılma hücrelerine yüklenmesi, özellikle yüksek viskoziteli numuneler, jeller veya macunlar için daha kolay ve arzu edilebilir olabilir. 1 sn'den daha düşük zaman ölçeklerine erişmek, gecikme süresini azaltmak için farklı bir karıştırma aparatı, daha düşük toplam boşluk hacimleri ve daha yüksek toplam akış hızları gerektirir. Kinetik süreçlerin bu kısa zaman ölçeklerinde incelenmesinin, TR-SANS ile milisaniye zaman ölçeğinde yeterli saçılma sayımı istatistiklerini biriktirmek için tekrarlanan numune enjeksiyonlarını gerektireceğini belirtmek de önemlidir. Toplam numune hacimleri sınırlıysa, ışık veya X-ışını saçılması ile yeterli saçılma kontrastının mevcut olduğu varsayılarak, enjeksiyon başına daha az numune enjeksiyonu veya daha az numune hacmi gerektiren ışık saçılması veya X-ışını saçılması gibi daha yüksek bir akı tekniğinin kullanılması istenebilir.

Bu modüler durdurulmuş akışlı SANS yaklaşımı, nötron saçılma deneyleri için optimize edilmiş ticari olarak temin edilebilen durdurulmuş akışlı cihazlara kıyasla birçok önemli avantaj ve dezavantaj yaratır. Temel avantajlar arasında (1) nötron ışını süresinin kullanımını en üst düzeye çıkarmak için durulama periyotları sırasında farklı numune hücreleri arasında TR-SANS ölçümlerinin değiştirilmesi, (2) üçlü numune karıştırma veya diğer daha karmaşık numune karıştırma gereksinimleri için şırıngaların, şırınga hacimlerinin ve karıştırıcı tiplerinin sayısının uyarlanması ve (3) numune hücresinin izole edilmesi ve daha uzun zaman ölçeklerinde (>10 dakika) geri difüzyonun ortadan kaldırılması yoluyla daha uzun ölçüm sürelerine izin verilmesi yer almaktadır. Burada uygulanmamasına rağmen, karıştırma hücresi tasarımının modülerliği, SANS, UV-Vis ve floresan ölçümlerinin taranması gibi çoklu ölçüm yöntemleriyle eşzamanlı veri toplanmasına da izin verecektir70. Bu modüler kurulumun iki önemli dezavantajı arasında (1) 1 ms ila 100 ms gecikme süreleri sağlayabilen diğer sistemlere kıyasla nispeten daha uzun karıştırma gecikme süreleri (1 s ila 3 s) ve (2) -20 °C ila 80 °C'den yüksek çalışma sıcaklıklarına erişebilen diğer mevcut sistemlere kıyasla daha küçük bir çalışma sıcaklığı aralığı (10 °C ila 50 °C) bulunmaktadır.

Yerinde karıştırma deneyleri yapmadan önce ilgilenilen numuneler hakkında ön SANS verilerinin toplanması, özellikle burada sunulan örnek gibi moleküler değişim kinetiğinin izlenmesi için tasarlanmış deneylerde, en iyi TR-SANS verilerinin toplanması için önemlidir. I(0) ve I(∞) değerlerinin doğru değerlerinin belirlenmesi, istenen kinetik parametreleri çıkarmak için modellenen normalleştirilmiş yoğunluğun (R(t) doğru değerlerini hesaplamak için kritik öneme sahiptir. I(0)'ın değeri, ayrı H-vezikül ve D-vezikül stoklarının ölçülen saçılma yoğunluklarından doğrudan hesaplanabilir ve I(∞), 50/50 H-lipid/D-lipit karışımından hazırlanan ayrı bir vezikül numunesi hazırlanarak belirlenebilir. Bu kontrol numunelerinden elde edilen saçılma verileri, TR-SANS deneyleri sırasında sinyali en üst düzeye çıkarmak ve değişim kinetiğinin ilerlemesini doğrulamak amacıyla TR-SANS ölçümü için optimum q-aralığını ve SANS cihaz konfigürasyonunu belirlemek için de kullanılabilir. Karıştırmadan sonra ilk zaman noktasında ölçülen yoğunluk hesaplanan I(0)'a eşit değilse, ilgilenilen tüm prosesleri yakalamak için daha hızlı karıştırma süreleri gerekebilir. Ölçülen yoğunluk I(∞) değerine ulaştığında, değişim işlemi tamamlanır ve hücre bir sonraki enjeksiyona hazırlık olarak boşaltılabilir ve temizlenebilir.

TR-SANS için sıvı numuneyi başarılı bir şekilde karıştırmak için, tüm şırıngaların, vanaların ve boru hatlarının astarlanmış ve havasız olduğundan ve sızıntıyı önlemek için tüm boru bağlantılarının güvenli olduğundan emin olmak çok önemlidir. Bu kritik adımların doğru bir şekilde gerçekleştirilmemesi, yanlış karıştırma hacimlerine veya yanlış mutlak saçılma yoğunluklarına neden olabilir. Örneğin, numune hücresi içinde sıkışan hava kabarcıkları, nötron ışını yolundaki numune hacminin azalması nedeniyle ölçülen SANS yoğunluğunu azaltacaktır. Alternatif olarak, hava kabarcıkları, hava-sıvı arayüzündeki ışın kırılması nedeniyle dedektör üzerinde yüksek yoğunluklu 'çizgiler' veya 'parlamalar' üretebilir. Zaman içinde ölçülen saçılma yoğunluğundaki beklenmedik değişiklikler, zayıf numune karıştırma, valf sızıntısı, numune hücresindeki hava kabarcıkları veya numune geri difüzyonu anlamına gelebilir.

Bir TR-SANS deneyi sırasında her numune için bir iletim ölçümü toplanması, toplanan verilerin mutlak yoğunluğa indirilmesi açısından kritik öneme sahiptir. Bazı SANS cihazlarında saçılma ve iletim verilerini aynı anda toplamak mümkündür, bu da genel TR-SANS veri toplama programlamasını basitleştirir; ancak bu, bu protokolde kullanılan VSANS cihazı da dahil olmak üzere tüm cihazlarda mümkün değildir. Numune iletimi ve numune saçılma ölçümleri farklı cihaz konfigürasyonları gerektirdiğinden, saçılma ölçümlerinin sonunda (protokol adımı 7.2.4) saçılma ölçümlerinin, numune hücreye enjekte edildikten sonra saçılma verilerinin en erken zaman noktalarında ölçülmesini sağlamak için iletim ölçümleri toplanmıştır. İletim sadece toplam element bileşimine, numune yolu uzunluğuna ve nötron dalga boyuna bağlıdır. Bu nedenle, toplam element bileşimi zaman içinde çözülen deney boyunca sabit kalırsa iletim değişmemelidir. Aynı numunenin tekrarlanan çalışmaları arasındaki iletim değerlerindeki büyük farklılıklar, tutarsız karıştırma numunesi hacimlerinden, numune hücresinin eksik doldurulmasından, hava kabarcıklarından veya valf sızıntısından ve deney sırasında numune geri akışından kaynaklanan bir sorunu gösterir.

TR-SANS'ın benzersiz bir avantajı, ölçülen yoğunluğun saçılma vektörüne (q) bağlı olması ve nano ölçekte uzamsal değişiklikleri araştırmak için kullanılabilmesidir. Durdurulmuş akışlı karıştırma cihazı ile birleştirildiğinde, TR-SANS bu nano ölçekli değişiklikleri saniyeden dakikaya kadar zaman ölçeklerinde araştırabilir, yüzey aktif maddelerin ve lipitlerin kendi kendine montajı ve değişimi, eksipiyan ilavesi üzerine polimer ve protein agregasyonu, nanopartikül büyümesi ve çürümesi veya emülsiyonlarda kapsüllenmiş ürünlerin değişimi hakkında bilgi sağlar. Durdurulan akış cihazı, iki veya daha fazla sıvı numunenin karıştırılmasını kolaylaştırmak için birden fazla numune şırınga pompası ve şırıngası ile yapılandırılabilir. Bu esneklik, katkı maddelerinin ilgilenilen kinetik üzerinde sistematik olarak araştırılmasını sağlar. Örneğin, konsantre bir antimikrobiyal peptit çözeltisinin farklı hacimleri, peptid konsantrasyonunun lipit değişim kinetiği üzerindeki etkilerini incelemek için H-vezikül ve D-vezikül çözeltileri ile karıştırılabilir45,46. Ek olarak, tüm sızdırmaz sıvı yolları, numune şırıngalarını, vanaları, karıştırıcıları ve boruları içeren sıcaklık kontrollü bir muhafaza içine alındığından, sistemin sıcaklığı, ilgilenilen kinetik işlemlerle ilgili termodinamik parametreleri çıkarmak için değiştirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgments

NG3 VSANS'a erişim, DMR-2010792 sayılı Anlaşma kapsamında Ulusal Standartlar ve Teknoloji Enstitüsü ile Ulusal Bilim Vakfı arasındaki bir ortaklık olan Yüksek Çözünürlüklü Nötron Saçılma Merkezi tarafından sağlanmıştır. M.H.L.N, Mitacs Globalink (Kanada) tarafından sağlanan finansmanı kabul eder. Herhangi bir ticari ürünün veya ticari adın tanımlanması, anlayışı teşvik etmek içindir ve Ulusal Standartlar ve Teknoloji Enstitüsü tarafından onaylandığı veya tavsiye edildiği anlamına gelmez.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynamic mixer Analytical Scientific Instruments 462-0150A Magnetically coupled rotor, binary dynamic mixer assembly (ternary type available), 0.15 mL dead volume (larger dead volume available)
Fluoropolymer tubing IDEX Health & Science 1507L PFA Tubing Natural 1/16 inch OD x 0.040 inch ID x 50 ft
Fluoropolymer 1/4-28 flangeless fittings IDEX Health & Science XP-245 PFA flangeless fitting with ferrules, 1/4-28 threading, 1/16 inch OD tubing
Glass syringes Hamilton Company 81660 Hamilton 1000 series syringes, 10 mL (81660), model 1010 C syr, 1/4"-28 thread termination, other volumes available
High-pressure flow selector valves Vici Valco C85X-1570EUTB Vici 10 position selector valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure switch valves Vici Valco C82X-1574EUHB Vici 4 port switch valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure syringes Cetoni A2019000358 3 mL stainless steel syringe, 510 bar max, 21 mL/min flow rate max
Low-pressure flow selector valves Vici Valco C25-3180EUHB Vici 10 position selector valves, max 250 psi liquid, 0.75 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 1/4-28 threaded ports, USB universal actuator
neMESYS high-pressure syringe pumps Cetoni A3921000103 Max force 2600 N
neMESYS mid-pressure syringe pumps Cetoni A3921000131 Max force 1000 N
Power supply Cetoni A3921000127 Base 600, supplies power for up to 4 high pressure pumps
Quartz flow-through sample cell Starna Scientific 3-2.30-Q-1/TC Quartz micro flow cells, 2 mm path length (1 mm available), 2 mm by 2 mm by 30 mm internal dimension
Quartz windows Technical Glass Products NA GE 124 Clear fused quartz ground and polished plates, 11.75 inch by 23.75 inch by 0.375 inch thick
Stainless steel 10-32 coned compression fittings IDEX Health & Science U-321X, U-320X 316 stainless steel ferrule (U-321X) and nut (U-320X) -Valco type, 10-32 coned, for 1/16 inch OD stainless steel tubing
Stainless steel tubing IDEX Health & Science U-102 Stainless Steel Tubing 1/16 inch OD x 0.020 inch ID, 10 cm, various precut lengths available
Syringe pump control software Cetoni T6000000004 QmixElements software for nemesys pumps, QmixSDK software development kit
Thermoelectric air conditioner EIC Solutions AAC-140C-4XT-HC Thermoelectric air conditioner mounted on insulated enclosure to control the pump, valve, mixer, and sample temperature
T-slot railing McMaster-Carr 47065T103 Aluminum t-slotted railing (1.5 inch by 1.5 inch) cut to various lengths
Vapor locking bottle caps  Cole-Parmer EW-12018-02 Four 304 SS port inserts, 1/4"-28 threads, GL45 bottle cap size, PTFE body, SS threads, PP collar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Melnichenko, Y. B., Wignall, G. D. Small-angle neutron scattering in materials science: Recent practical applications. Journal of Applied Physics. 102 (2), 021101 (2007).
  2. Grillo, I. Small-angle neutron scattering and applications in soft condensed matter. Soft Matter Characterization. Borsali, R., Pecora, R. , Springer. Dordrecht. (2008).
  3. Hollamby, M. J. Practical applications of small-angle neutron scattering. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (26), 10566-10579 (2013).
  4. Pipich, V., Fu, Z. KWS-3: Very small angle diffractor with focusing mirror. Journal of large-scale research. 1, 31 (2015).
  5. Kline, S. 2019 NCNR Annual Report, Special Publication (NIST SP). , National Institute of Standards and Technology. Gaithersburg, MD. (2019).
  6. Gilbert, P. H., et al. Preservative induced polysorbate 80 micelle aggregation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 10 (6), 2395-2404 (2021).
  7. Terashima, T., et al. In situ and time-resolved small-angle neutron scattering observation of star polymer formation via arm-linking reaction in ruthenium-catalyzed living radical polymerization. Macromolecules. 43 (19), 8218-8232 (2010).
  8. Hashimoto, K., Fujii, K., Nishi, K., Shibayama, M. Ion gel network formation in an ionic liquid studied by time-resolved small-angle neutron scattering. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (40), 9419-9424 (2018).
  9. Conn, C. E., et al. Membrane protein structures in lipid bilayers; small-Angle neutron scattering with contrast-matched bicontinuous cubic phases. Frontiers in Chemistry. 8, 619470 (2021).
  10. van't Hag, L., et al. Protein-eye view of the in meso crystallization mechanism. Langmuir. 35 (25), 8344-8356 (2019).
  11. Mahieu, E., et al. Observing protein degradation by the PAN-20S proteasome by time-resolved neutron scattering. Biophysical Journal. 119 (2), 375-388 (2020).
  12. Ibrahim, Z., et al. Time-resolved neutron scattering provides new insight into protein substrate processing by a AAA+ unfoldase. Scientific Reports. 7 (1), 40948 (2017).
  13. Hollamby, M. J., et al. Growth of mesoporous silica nanoparticles monitored by time-resolved small-angle neutron scattering. Langmuir. 28 (9), 4425-4433 (2012).
  14. Blin, J. L., Impéror-Clerc, M. Mechanism of self-assembly in the synthesis of silica mesoporous materials: in situ studies by X-ray and neutron scattering. Chemical Society Reviews. 42 (9), 4071-4082 (2013).
  15. Impéror-Clerc, M., Grillo, I., Khodakov, A. Y., Durand, D., Zholobenko, V. L. New insights into the initial steps of the formation of SBA-15 materials: an in situ small angle neutron scattering investigation. Chemical Communications. 8, 834-836 (2007).
  16. Narayanan, T., Rüter, A., Olsson, U. SAXS/WAXS investigation of amyloid-β(16-22) peptide nanotubes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 654349 (2021).
  17. Angelov, B., et al. DNA/Fusogenic lipid nanocarrier assembly: millisecond structural dynamics. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (11), 1959-1964 (2013).
  18. Amann, M., et al. Kinetic pathways for polyelectrolyte coacervate micelle formation revealed by time-resolved synchrotron SAXS. Macromolecules. 52 (21), 8227 (2019).
  19. Varga, Z., Wacha, A., Bóta, A. Osmotic shrinkage of sterically stabilized liposomes as revealed by time-resolved small-angle X-ray scattering. Journal of Applied Crystallography. 47 (1), 35-40 (2014).
  20. Panine, P., Finet, S., Weiss, T. M., Narayanan, T. Probing fast kinetics in complex fluids by combined rapid mixing and small-angle X-ray scattering. Advances in Colloid and Interface Science. 127 (1), 9-18 (2006).
  21. Grillo, I. Applications of stopped-flow in SAXS and SANS. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 14 (6), 402-408 (2009).
  22. Gomez-Hens, A., Perez-Bendito, D. The stopped-flow technique in analytical chemistry. Analytica Chimica Acta. 242, 147-177 (1991).
  23. Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. Use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the ATP turnover cycle of kinesins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52142 (2014).
  24. Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of stopped-flow kinetics methods to investigate the mechanism of action of a DNA repair protein. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1874 (2010).
  25. Raney, K. D., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. A fluorescence-based assay for monitoring helicase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6644-6648 (1994).
  26. Roder, H., Maki, K., Cheng, H. Early events in protein folding explored by rapid mixing methods. Chemical reviews. 106 (5), 1836-1861 (2006).
  27. Milon, A., et al. Osmotic swelling of unilamellar vesicles by the stopped-flow light scattering method. Influence of vesicle size, solute, temperature, cholesterol and three α,ω-dihydroxycarotenoids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 859 (1), 1-9 (1986).
  28. Gast, K., Nöppert, A., Müller-Frohne, M., Zirwer, D., Damaschun, G. Stopped-flow dynamic light scattering as a method to monitor compaction during protein folding. European Biophysics Journal. 25 (3), 211-219 (1997).
  29. Antoun, A., Pavlov, M. Y., Tenson, T., Ehrenberg, M. M. Ribosome formation from subunits studied by stopped-flow and Rayleigh light scattering. Biological Procedures Online. 6, 35-54 (2004).
  30. Zhu, Z., Armes, S. P., Liu, S. pH-Induced micellization kinetics of ABC triblock copolymers measured by stopped-flow light scattering. Macromolecules. 38 (23), 9803-9812 (2005).
  31. Ye, J., et al. Comparative study of temperature-induced association of cyclic and linear poly(N-isopropylacrylamide) chains in dilute solutions by laser light scattering and stopped-flow temperature jump. Macromolecules. 41 (12), 4416-4422 (2008).
  32. Liu, X., et al. Early stage kinetics of polyelectrolyte complex coacervation monitored through stopped-flow light scattering. Soft Matter. 12 (44), 9030-9038 (2016).
  33. Garman, E. F., Weik, M. X-ray radiation damage to biological samples: recent progress. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (4), 907-911 (2019).
  34. Garg, S., Porcar, L., Woodka, A. C., Butler, P. D., Perez-Salas, U. Noninvasive neutron scattering measurements reveal slower cholesterol transport in model lipid membranes. Biophysical Journal. 101 (2), 370-377 (2011).
  35. Marquardt, D., et al. 1H NMR shows slow phospholipid flip-flop in gel and fluid bilayers. Langmuir. 33 (15), 3731-3741 (2017).
  36. Egelhaaf, S. U., Olsson, U., Schurtenberger, P. Time-resolved SANS for surfactant phase transitions. Physica B: Condensed Matter. 276-278, 326-329 (2000).
  37. Tabor, R. F., Eastoe, J., Grillo, I. Time-resolved small-angle neutron scattering as a lamellar phase evolves into a microemulsion. Soft Matter. 5 (10), 2125-2129 (2009).
  38. Gradzielski, M., Bergmeier, M., Hoffmann, H., Müller, M., Grillo, I. Vesicle gel formed by a self-organization process. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (49), 11594-11597 (2000).
  39. Lee, Y. -T., Li, D. S., Pozzo, L. D. Kinetic analysis of ultrasound-induced oil exchange in oil-in-water emulsions through contrast variation time-resolved small-sngle neutron scattering. Langmuir. 35 (47), 15204-15213 (2019).
  40. Lee, Y. -T., Pozzo, L. D. Contrast-variation time-resolved small-angle neutron scattering analysis of oil-exchange kinetics between oil-in-water emulsions stabilized by anionic surfactants. Langmuir. 35 (47), 15192-15203 (2019).
  41. Roger, K., Olsson, U., Schweins, R., Cabane, B. Emulsion ripening through molecular exchange at droplet contacts. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1452-1455 (2015).
  42. Nakano, M., Fukuda, M., Kudo, T., Endo, H., Handa, T. Determination of Interbilayer and Transbilayer Lipid Transfers by Time-Resolved Small-Angle Neutron Scattering. Physical Review Letters. 98 (23), 238101 (2007).
  43. Nakano, M., et al. Flip-flop of phospholipids in vesicles: kinetic analysis with time-resolved small-angle neutron scattering. The Journal of Physical Chemistry B. 113 (19), 6745-6748 (2009).
  44. Nguyen, M. H. L., et al. Methanol accelerates DMPC flip-flop and transfer: A SANS study on lipid dynamics. Biophysical Journal. 116 (5), 755-759 (2019).
  45. Nguyen, M. H. L., et al. Peptide-induced Lipid flip-flop in asymmetric liposomes measured by small angle neutron scattering. Langmuir. 35 (36), 11735-11744 (2019).
  46. Nguyen, M. H. L., et al. Time-resolved SANS reveals pore-forming peptides cause rapid lipid reorganization. New Journal of Chemistry. 45 (1), 447-456 (2021).
  47. Xia, Y., et al. Effects of nanoparticle morphology and acyl chain length on spontaneous lipid transfer rates. Langmuir. 31 (47), 12920-12928 (2015).
  48. Xia, Y., et al. Morphology-induced defects enhance lipid transfer rates. Langmuir. 32 (38), 9757-9764 (2016).
  49. Maric, S., et al. Time-resolved small-angle neutron scattering as a probe for the dynamics of lipid exchange between human lipoproteins and naturally derived membranes. Scientific Reports. 9 (1), 7591 (2019).
  50. Nielsen, J. E., Bjørnestad, V. A., Pipich, V., Jenssen, H., Lund, R. Beyond structural models for the mode of action: How natural antimicrobial peptides affect lipid transport. Journal of Colloid and Interface Science. 582, 793-802 (2021).
  51. Willner, L., Poppe, A., Allgaier, J., Mokenbusch, M., Richter, D. TIme-resolved SANS for the determintioan of unimer exchange kinetics in block copolymer micelles. Europhysics Letters. 55 (5), 667 (2001).
  52. Lund, R., Willner, L., Stellbrink, J., Lindner, P., Richter, D. Logarithmic chain-exchange kinetics of diblock copolymer micelles. Physical Review Letters. 96 (6), 068302 (2006).
  53. Lund, R., Willner, L., Richter, D., Dormidontova, E. E. Equilibrium chain exchange kinetics of diblock copolymer micelles: Tuning and logarithmic relaxation. Macromolecules. 39 (13), 4566-4575 (2006).
  54. Lund, R., Willner, L., Richter, D. Kinetics of block copolymer micelles studied by small-angle scattering methods. in Controlled Polymerization and Polymeric Structures. Advances in Polymer Science. Abe, A., Lee, K. S., Leibler, L., Kobayashi, S. , Springer. Cham. 51 (2013).
  55. Choi, S. -H., Lodge, T. P., Bates, F. S. Mechanism of molecular exchange in diblock copolymer micelles: hypersensitivity to core chain length. Physical Review Letters. 104 (4), 047802 (2010).
  56. Choi, S. -H., Bates, F. S., Lodge, T. P. Molecular exchange in ordered diblock copolymer micelles. Macromolecules. 44 (9), 3594-3604 (2011).
  57. Lu, J., Bates, F. S., Lodge, T. P. Chain exchange in binary copolymer micelles at equilibrium: confirmation of the independent chain hypothesis. ACS Macro Letters. 2 (5), 451-455 (2013).
  58. Lu, J., Bates, F. S., Lodge, T. P. Remarkable effect of molecular architecture on chain exchange in triblock copolymer micelles. Macromolecules. 48 (8), 2667-2676 (2015).
  59. Kelley, E. G., et al. Size evolution of highly amphiphilic macromolecular solution assemblies via a distinct bimodal pathway. Nature Communications. 5 (1), 3599 (2014).
  60. Murphy, R. P., Kelley, E. G., Rogers, S. A., Sullivan, M. O., Epps, T. H. Unlocking chain exchange in highly amphiphilic block polymer micellar systems: influence of agitation. ACS Macro Letters. 3 (11), 1106-1111 (2014).
  61. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50 (6), 2484-2494 (2017).
  62. Lantz, K. A., et al. Cavitation enables switchable and rapid block polymer exchange under high-χN conditions. Macromolecules. 51 (17), 6967-6975 (2018).
  63. Murphy, R. P., et al. Capillary RheoSANS: measuring the rheology and nanostructure of complex fluids at high shear rates. Soft Matter. 16 (27), 6285-6293 (2020).
  64. Stopped Flow Sans. usnistgov. , Available from: https://github.com/usnistgov/stopped-flow-sans (2021).
  65. Kline, S. Reduction and analysis of SANS and USANS data using IGOR Pro. Journal of Applied Crystallography. 39 (6), 895-900 (2006).
  66. Doktorova, M., et al. Preparation of asymmetric phospholipid vesicles for use as cell membrane models. Nature Protocols. 13 (9), 2086-2101 (2018).
  67. Huang, Z., London, E. Effect of cyclodextrin and membrane lipid structure upon cyclodextrin-lipid interaction. Langmuir. 29 (47), 14631-14638 (2013).
  68. Sugiura, T., Ikeda, K., Nakano, M. Kinetic analysis of the methyl-β-cyclodextrin-mediated intervesicular transfer of pyrene-labeled phospholipids. Langmuir. 32 (51), 13697-13705 (2016).
  69. Scott, H. L., et al. On the mechanism of bilayer separation by extrusion, or why your LUVs are not really unilamellar. Biophysical Journal. 117 (8), 1381-1386 (2019).
  70. Dicko, C., et al. NUrF-Optimization of in situ UV-vis and fluorescence and autonomous characterization techniques with small-angle neutron scattering instrumentation. Review of Scientific Instruments. 91 (7), 075111 (2020).

Tags

JoVE'de Bu Ay Sayı 174 Küçük açılı nötron saçılması (SANS) zamana bağlı saçılma durdurulmuş akışlı karıştırma moleküler değişim kinetiği lipit nanopartikülleri lipit membranları veziküller yapısal evrim
Nano Ölçekli Malzemelerin Zaman-Evrimini Durdurulmuş Akış ve Küçük Açılı Nötron Saçılması ile Ölçme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelley, E. G., Nguyen, M. H. L.,… More

Kelley, E. G., Nguyen, M. H. L., Marquardt, D., Maranville, B. B., Murphy, R. P. Measuring the Time-Evolution of Nanoscale Materials with Stopped-Flow and Small-Angle Neutron Scattering. J. Vis. Exp. (174), e62873, doi:10.3791/62873 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter