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Engineering

Misurare l'evoluzione temporale di materiali su scala nanometrica con scattering neutronico a flusso interrotto e a piccolo angolo

Published: August 6, 2021 doi: 10.3791/62873
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1, 1
1NIST Center for Neutron Research, National Institute of Standards and Technology, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of Windsor, 3Department of Physics, University of Windsor

Summary

Questo protocollo presenta l'uso di un ambiente di campionamento a flusso interrotto per miscelare rapidamente più soluzioni liquide in situ durante una misura di scattering neutronico a piccolo angolo e per studiare i processi cinetici su scale di lunghezza nanometrica e seconde scale temporali.

Abstract

Questo articolo presenta l'uso di un ambiente di campionamento SANS (small-angle neutron-scattering) a flusso interrotto per miscelare rapidamente campioni liquidi e studiare processi cinetici su scala nanometrica su scale temporali da secondi a minuti. L'ambiente di campionamento a flusso interrotto utilizza pompe a siringa disponibili in commercio per miscelare i volumi desiderati di campioni liquidi che vengono quindi iniettati attraverso un miscelatore dinamico in una cella di vetro al quarzo in circa 1 s. L'acquisizione dei dati SANS risolta nel tempo viene sincronizzata con la miscelazione del campione per seguire l'evoluzione della nanostruttura in soluzione dopo la miscelazione.

Per utilizzare al meglio il tempo del fascio di neutroni, utilizziamo una serie di valvole selettrici di flusso per caricare, risciacquare e asciugare automaticamente la cella tra una misurazione e l'altra, consentendo la raccolta ripetuta dei dati durante più iniezioni di campioni. Le iniezioni di campioni vengono ripetute fino a quando non vengono raccolte sufficienti statistiche di diffusione dei neutroni. La configurazione di miscelazione può essere programmata per variare sistematicamente le condizioni per misurare la cinetica a diversi rapporti di miscelazione, concentrazioni di campione, concentrazioni di additivi e temperature. Il volume minimo di campione richiesto per iniezione è di circa 150 μL a seconda della lunghezza del percorso della cella al quarzo.

I risultati rappresentativi utilizzando questo ambiente campione a flusso interrotto sono presentati per una rapida cinetica di scambio lipidico in presenza di un additivo, la ciclodestrina. Le vescicole si scambiano lipidi esterni (esterni) nell'ordine di secondi e scambiano completamente i lipidi interni ed esterni in poche ore. La misurazione della cinetica dello scambio lipidico richiede una miscelazione in situ per catturare i processi più veloci (secondi) e più lenti (minuti) ed estrarre le costanti di velocità cinetica. Lo stesso ambiente di campionamento può anche essere utilizzato per sondare lo scambio molecolare in altri tipi di campioni liquidi come nanoparticelle lipidiche, proteine, tensioattivi, polimeri, emulsioni o nanoparticelle inorganiche. Misurare le trasformazioni strutturali su scala nanometrica e la cinetica dei sistemi di scambio o reazione fornirà nuove informazioni sui processi che si evolvono su scala nanometrica.

Introduction

Lo scattering neutronico a piccolo angolo (SANS) fornisce un modo unico per misurare le dimensioni, le forme, le interazioni e l'organizzazione di vari materiali su scale di lunghezza da ≈1 nm a ≈100 nm 1,2,3. Strumenti recenti, tra cui gli strumenti VSANS (Very small-angle neutron scattering) con specchi di messa a fuoco, spingono i limiti verso la misurazione di scale di lunghezza ancora più grandi fino a ≈1000 nm 4,5. In generale, il contrasto di scattering unico inerente ai metodi di scattering neutronico offre diversi vantaggi nella misurazione dell'evoluzione temporale delle strutture su scala nanometrica, come l'aggregazione di componenti nelle formulazioni farmaceutiche6, le reazioni di reticolazione e gelificazione nei sistemi polimerici7,8, nella meso cristallizzazione delle proteine di membrana9,10, la degradazione e lo spiegamento delle proteine11,12 e crescita di materiali a base di silice13,14,15. L'esclusivo contrasto di dispersione rende SANS (TR-SANS) risolto nel tempo un utile complemento ad altre misurazioni basate sul flusso interrotto.

I metodi di miscelazione a flusso interrotto sono spesso implementati nello scattering di raggi X a piccolo angolo (SAXS)16,17,18,19,20,21, nella spettroscopia di fluorescenza 22,23,24,25,26 e nella diffusione della luce27,28,29,30, 31,32 esperimenti per studiare i processi cinetici su scale temporali al millisecondo. Un'importante differenza tra SANS e SAXS è che lo scattering neutronico è una tecnica di caratterizzazione non distruttiva e, come tale, SANS può essere utilizzato per misurare lo stesso campione per ore o addirittura giorni senza danni da radiazioni ionizzanti al campione, che possono verificarsi durante esperimenti di diffusione dei raggi X ad alto flusso33. Poiché le misurazioni SANS ripetute non alterano la struttura chimica della molecola o del campione della sonda, l'evoluzione temporale può essere studiata senza effetti del fotosbiancamento, ad esempio, che può complicare le misurazioni cinetiche che si basano sulla fluorescenza23,24. Inoltre, SANS può essere utilizzato per misurare campioni altamente concentrati e otticamente opachi che sono spesso difficili da caratterizzare con tecniche basate sulla luce come la diffusione dinamica della luce.

Oltre a fornire informazioni strutturali su scala nanometrica, SANS può essere utilizzato per sondare la composizione locale di queste strutture attraverso la variazione del contrasto della densità della lunghezza di diffusione dei neutroni. La densità della lunghezza di scattering (SLD) di diversi elementi varia casualmente attraverso la tavola periodica e varia con diversi isotopi dello stesso elemento. Un esempio comunemente sfruttato è l'idrogeno (1H o H) e il deuterio (2H o D), che hanno lunghezze di scattering neutronico molto diverse. Pertanto, i materiali ricchi di idrogeno, come tensioattivi, lipidi, proteine, RNA, DNA e altri polimeri, possono essere distinti dai solventi deuterati utilizzando SANS senza modificare significativamente le proprietà fisiche del sistema. Tuttavia, è importante notare che lo scambio H/D può influenzare la densità, il legame idrogeno e le temperature di transizione di fase nel campione. Tuttavia, la sensibilità unica di SANS ai materiali ricchi di idrogeno è particolarmente utile nella ricerca sulla materia soffice in cui i campioni di interesse hanno un contrasto di diffusione e un segnale inferiori nelle tecniche basate sui raggi X come SAXS. La sostituzione isotopica rende anche SANS un potente strumento per studiare la cinetica di scambio molecolare in materiali ricchi di idrogeno semplicemente mescolando molecole marcate H e D. La sostituzione isotopica è particolarmente utile nei sistemi in cui i coloranti fluorescenti voluminosi sono più grandi delle molecole tensioattive o lipidiche di interesse e possono influenzare la cinetica di scambio34,35.

Le misurazioni SANS risolte nel tempo sono vantaggiose perché l'intensità misurata è una funzione del tempo, della scala di lunghezza e del contrasto SLD. Come tale, gli esperimenti TR-SANS possono essere progettati per sondare i cambiamenti dipendenti dal tempo nelle distribuzioni spaziali e nelle composizioni dei campioni. Questi vantaggi unici di SANS hanno portato a importanti informazioni sui processi cinetici in molti sistemi di materiali morbidi come tensioattivi 36,37,38, emulsioni 39,40,41, lipidi 34,42,43,44,45,46,47,48,49 ,50, e polimeri 51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62. La maggior parte degli studi TR-SANS si sono concentrati su scale temporali da minuti a ore. Tuttavia, molti processi cinetici di interesse si verificano sulla seconda scala temporale e sono essenziali per comprendere i meccanismi sottostanti. L'acquisizione di questi primi punti temporali richiede che le soluzioni siano rapidamente miscelate e misurate in situ, in cui la miscelazione è sincronizzata con la raccolta dei dati durante la diffusione della luce a flusso interrotto 27,28,29,30,31,32, fluorescenza 22,23,24,25,26 e raggi X 16,17,18,19,20,21 esperimenti. Questo lavoro descrive l'uso di un ambiente di campionamento progettato per miscelare rapidamente più campioni liquidi e iniettare la miscela in una cella di vetro al quarzo per le misurazioni TR-SANS. Il dispositivo di miscelazione è un adattamento del dispositivo reoSANS capillare63 recentemente sviluppato e utilizza più pompe e valvole a siringa per controllare la miscelazione del campione e automatizzare la pulizia delle celle. Collegando le pompe a siringa a una serie di valvole selettrici di flusso, è possibile miscelare, misurare, risciacquare e asciugare ripetutamente più flussi di ingresso per facilitare le misurazioni TR-SANS sulla scala dei secondi.

La procedura attuale presuppone che i campioni di interesse siano stati identificati e preparati. Ci concentriamo sulla configurazione di miscelazione in situ e sui metodi per raccogliere i dati TR-SANS. I dati di diffusione dei neutroni sono stati raccolti sullo strumento VSANS presso il NIST Center for Neutron Research (NCNR); tuttavia, la procedura dovrebbe essere applicabile ad altri strumenti SANS. I lettori interessati a implementare protocolli simili su altri strumenti SANS dovrebbero consultare gli scienziati locali per determinare la configurazione ottimale dello strumento per massimizzare il flusso di neutroni alla scala di lunghezza desiderata e alla scala temporale più rilevante per i processi cinetici di interesse. I dati qui presentati sono stati raccolti utilizzando la configurazione ad alto flusso "white beam" su VSANS per massimizzare il conteggio dei neutroni alla perdita di risoluzione spaziale5. I carrelli del rivelatore sono stati posizionati per coprire una gamma di vettori di scattering (q), 0,005 Å-1 < q < 0,5 Å-1, corrispondenti a scale di lunghezza da ≈130 nm a ≈13 nm. Il vettore di scattering è definito come q = 4π/λ sin (θ/2) in cui λ è la lunghezza d'onda del neutrone e θ è l'angolo di scattering.

Il dispositivo di miscelazione a flusso interrotto utilizzato per le misurazioni TR-SANS è costituito da più pompe, siringhe di risciacquo, siringhe per campioni, selettori di flusso, nonché un miscelatore dinamico, una cella di campionamento e un contenitore di campioni misti, come mostrato nella Figura 1. Tutti i percorsi sigillati dei fluidi si trovano all'interno di un involucro climatizzato, che include siringhe, valvole, tubi di collegamento, miscelatore dinamico e celle di campionamento. Un condizionatore d'aria termoelettrico programmabile viene utilizzato per controllare la temperatura dell'involucro nell'intervallo da 10 °C a 50 °C entro ±1 °C. Si noti che parte dell'isolamento della custodia è stato rimosso per mostrare le parti funzionanti del dispositivo. L'involucro principale del dispositivo di miscelazione è posizionato su uno stadio traslazionale sulla linea del fascio NG3 VSANS presso l'NCNR. La posizione dell'involucro viene regolata utilizzando lo stadio di traslazione per posizionare la cella campione nel percorso del fascio di neutroni (linea tratteggiata gialla).

Figure 1
Figura 1: Una configurazione di esempio per combinare la miscelazione a flusso interrotto e le misure di scattering neutronico a piccolo angolo sulla linea di fascio VSANS presso il NIST Center for Neutron Research. La configurazione contiene quattro pompe a siringa, due siringhe per il risciacquo con solvente e due siringhe per l'iniezione del campione, quattro valvole selettrici per pompe, due valvole di selezione del miscelatore, un miscelatore dinamico, una cella al quarzo a flusso continuo e un contenitore di campioni misti. I neutroni incidenti si disperdono dal campione misto situato all'interno della cellula campione. Un involucro isolato con finestre al quarzo e un'unità termoelettrica climatizzata viene utilizzata per controllare il campione e tutte le apparecchiature a temperatura costante. La linea tratteggiata gialla mostra il percorso del fascio di neutroni. Barra scala = 10 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il dispositivo illustrato nella Figura 1 è configurato con due siringhe campione, due siringhe di risciacquo e una cella campione. I diagrammi di flusso corrispondenti per le diverse fasi del protocollo sono illustrati nella Figura 2. I volumi desiderati dei due diversi campioni vengono iniettati nel miscelatore e nella cella campione (Figura 2A). Una volta riempita la cella di campionamento, la valvola dell'interruttore di ingresso (ISV) e la valvola dell'interruttore di uscita (OSV) vengono chiuse per isolare la cella del campione dal miscelatore dinamico e per impedire la diffusione del campione nella cella durante la raccolta dei dati TR-SANS (Figura 2B). Prima del miscelatore dinamico, il tubo di collegamento varia in lunghezza da 10 cm a 1 m e non influisce sul tempo di ritardo della miscelazione. Tuttavia, i collegamenti dei tubi tra il miscelatore dinamico e la cella di campionamento influiscono sul tempo di ritardo della miscelazione e sul volume di iniezione del campione richiesto. I tubi in acciaio inossidabile pretagliati con diametro interno di 0,04 pollici (1 mm) e lunghezza di 100 mm vengono utilizzati per collegare il miscelatore dinamico, le valvole di selezione del miscelatore (MSV1 e MSV2), ISV e OSV. I tubi fluorurati con diametro interno di 1 mm e lunghezza di 115 mm vengono utilizzati per collegare l'ISV e l'OSV (o l'uscita del miscelatore dinamico) alla cella di campionamento. Il volume totale di vuoto che influenza il tempo di ritardo di miscelazione include il volume di vuoto del miscelatore (0,15 ml), il tubo tra l'uscita del miscelatore e l'ingresso della cella del campione (0,09 ml) e il volume della cella del campione (0,16 ml). In questo esempio, il volume totale del vuoto è 0,4 ml. I volumi di vuoto interno delle valvole sono trascurabili rispetto ai volumi di vuoto di tubi, miscelatori e celle di campionamento. Ad esempio, le valvole selettrici a bassa pressione impiegate (diametro del foro 0,75 mm) contengono volumi di vuoto approssimativi di 4 μL, mentre le valvole selettrici e le valvole di commutazione ad alta pressione (diametro del foro 0,25 mm) contengono volumi vuoti approssimativi di 0,5 μL.

Al termine della misurazione TR-SANS, il campione viene spinto fuori dalla cella con solvente e il solvente di risciacquo viene ripetutamente pompato attraverso la cella per rimuovere il campione residuo e pulire la cella del campione (Figura 2C). Si noti che le siringhe di risciacquo sono collegate a serbatoi di solventi più grandi (ad esempio, acqua ed etanolo) tramite valori di selezione della pompa per garantire che siano disponibili volumi di solvente adeguati per pulire la cella di campionamento tra una corsa e l'altra. Le fonti di solventi, le fonti di campionamento e i contenitori di campioni misti che contengono liquidi infiammabili sono posizionati in un involucro separato senza apparecchiature elettriche per eliminare tutte le possibili fonti di accensione. Inoltre, vengono utilizzati tappi di bottiglia con bloccaggio del vapore per ridurre al minimo i vapori infiammabili e l'evaporazione del solvente. Infine, la cella del campione viene essiccata con un flusso di azoto gassoso per rimuovere il solvente di risciacquo residuo (Figura 2D). La pressione del gas di azoto in ingresso alla valvola selettiva del miscelatore è regolata a circa 2 bar (0,2 MPa, pressione manometrica) utilizzando un regolatore di pressione manuale situato sulla bombola del gas di azoto. Una volta che la cella del campione è sufficientemente pulita ed essiccata, un campione appena miscelato viene iniettato nella cella campione per il successivo ciclo di misurazione (ripetendo la miscelazione e l'iniezione illustrate nel diagramma di flusso nella figura 2A).

Figure 2
Figura 2: Diagramma di flusso di esempio utilizzando una cella campione, due campioni di miscelazione e due solventi di risciacquo per la pulizia . (A) Miscelazione del campione A (blu) e del campione B (rosso) e quindi flusso del campione misto (viola) nella cella del campione. (B) Durante la raccolta dei dati, lo stato del dispositivo a flusso interrotto in cui le valvole di commutazione ISV e OSV sono chiuse per isolare la cella del campione e impedire la retrodiffusione del campione durante la raccolta dei dati. (C) Le fasi di pulizia in cui la cella campione viene risciacquata con solvente di risciacquo da SS1 (verde) dopo la raccolta dei dati. (D) Fase di essiccazione in cui la cella campione viene essiccata con azoto gassoso (arancione). Abbreviazioni: PSV = valvola selettrice pompa; MSV = valvola selettrice miscelatrice; OSV = valvola interruttore di uscita; ISV = valvola interruttore di ingresso; SS1 = fonte di solvente 1; SSA = fonte di campionamento A; N2 = fonte di azoto gassoso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La Figura 3 mostra i diagrammi di flusso per una versione leggermente diversa in cui la configurazione di miscelazione è configurata con due celle di campionamento separate collegate alle stesse valvole di commutazione (Figura 3A). Mentre i dati TR-SANS vengono raccolti nella cella campione 1, la cella campione 2 viene risciacquata (Figura 3B) e asciugata (Figura 3C). Quando la raccolta dei dati è completa per la cella campione 1, la valvola dell'interruttore di ingresso indirizza un campione appena miscelato nella cella campione 2 per la raccolta dei dati (Figura 3D). Mentre i dati TR-SANS vengono raccolti nella cella campione 2, la cella campione 1 viene risciacquata e asciugata (Figura 3E). Questo processo parallelo e alternato tra due celle campione riduce al minimo il tempo tra le successive iniezioni di campioni e massimizza l'uso del tempo del fascio di neutroni.

Figure 3
Figura 3: Diagramma di flusso di esempio utilizzando due celle a campione, due campioni che si mescolano e due solventi di risciacquo per la pulizia. (A) Mescolare il campione A (blu) e il campione B (rosso) e quindi far confluire il campione misto (viola) nella cella 1. (B) Lo stato del dispositivo di arresto del flusso durante la raccolta dei dati sulla cella campione 1 mentre la cella campione 2 viene risciacquata con solvente da SS1 (verde). (C) Lo stato del dispositivo di interruzione del flusso durante la raccolta dei dati sulla cella campione 1 mentre la cella campione 2 è essiccata con azoto gassoso (arancione). (D) Una volta completata la raccolta dei dati della cella campione 1, un nuovo campione (viola) viene immediatamente miscelato e confluito nella cella campione 2. (E) Lo stato del dispositivo di arresto del flusso durante la raccolta dei dati sulla cella campione 2 mentre la cella campione 1 viene risciacquata con solvente da SS1 (verde). Mentre una cella campione viene misurata, l'altra cella campione viene pulita e asciugata. Il processo di misurazione del flusso interrotto alterna due celle campione per ridurre al minimo il tempo tra le successive iniezioni di miscelazione del campione. Abbreviazioni: PSV = valvola selettrice pompa; MSV = valvola selettrice miscelatrice; OSV = valvola interruttore di uscita; ISV = valvola interruttore di ingresso; SS1 = fonte di solvente 1; SSA = fonte di campionamento A; N2 = fonte di azoto gassoso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Di seguito è descritto un protocollo passo-passo per collegare le pompe e le tubazioni, adescare il sistema, risciacquare e asciugare la cella del campione e iniettare il campione misto. Sebbene la configurazione a cella singola sia dimostrata per semplicità (Figura 2), la configurazione modulare flessibile, il protocollo e gli script possono essere facilmente modificati per implementare più pompe a siringa, valvole, miscelatori o configurazioni di celle campione, come la configurazione a due celle campione mostrata nella Figura 3. I dati rappresentativi della velocità di conteggio dei neutroni grezzi raccolti durante i cicli di iniezione di miscelazione e pulizia sono mostrati nella Figura 4, mentre la cinetica di scambio lipidico misurata a 3 diverse temperature e l'intensità diffusa normalizzata estratta corrispondente alla frazione di lipidi scambiati sono mostrati rispettivamente nella Figura 5 e nella Figura 6.

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Protocol

1. Impostare e avviare il sistema a flusso interrotto.

  1. Accendere tutti gli alimentatori della pompa e i miscelatori dinamici utilizzando l'interruttore di alimentazione.
  2. Avviare tutte le pompe e le valvole nell'interfaccia utente grafica (GUI) di controllo del sistema a flusso interrotto inserendo il percorso di configurazione del dispositivo e utilizzando i comandi bus=qmixbus. Bus(), bus.open(), bus.start(), pump=qmixpump. Pump(), pump.enable() e valve=ViciMultiposSelector() (vedere il codice di avvio di esempio disponibile in un repository open source online64).
  3. Calibrare le pompe prima di collegare le siringhe utilizzando il comando pump.calibrate().
  4. Verificare che le valvole siano avviate e passare alla porta di selezione corretta al comando utilizzando il comando valve.setPort() e valve.getPort().
  5. Assegnare il tipo di siringa da utilizzare per ciascuna pompa utilizzando il comando pump.set_syringe_param(A , B), in cui A è il diametro interno del cilindro della siringa (mm) e B è la distanza massima della corsa del pistone della siringa (mm).
  6. Collegare le siringhe campione alle pompe a siringa.
    1. Dopo essersi assicurati che le pompe siano state calibrate, avvitare i cilindri della siringa puliti alla connessione nella parte superiore della pompa (testa di montaggio della siringa).
    2. Quando si utilizzano siringhe di vetro, assicurarsi che la testa di montaggio della siringa sia allentata prima di erogare il volume di riempimento, in modo che la siringa di vetro non si rompa a causa di una forza eccessiva dal pistone della siringa.
    3. Avvitare il pistone della siringa alla connessione nella parte inferiore della pompa (coda di montaggio della siringa).
    4. Dopo aver collegato il cilindro della siringa e il pistone della siringa alla pompa, erogare il volume di riempimento del tipo di siringa utilizzando il comando pump.empty(), che sposta il pistone della siringa verso la parte superiore del cilindro della siringa.
    5. Quando si utilizzano siringhe di vetro, serrare la testa di montaggio della siringa dopo l'arresto del movimento del pistone.
  7. Collegare il tubo alle fonti di campioni e solventi, siringhe, valvole, miscelatori, celle di campionamento e contenitore di campioni misti.
    1. Collegare il tubo della pompa a siringa alle valvole selettrici della pompa.
    2. Collegare il tubo della valvola selettrice della pompa alle sorgenti di campionamento.
    3. Collegare il tubo della valvola selettrice della pompa alle fonti di solvente di risciacquo.
    4. Collegare il tubo della valvola selettore della pompa al tubo della valvola selettore del miscelatore.
    5. Collegare il tubo della valvola selettrice del miscelatore alla fonte di gas azoto.
    6. Collegare il tubo della valvola selettore del miscelatore agli ingressi del miscelatore.
    7. Collegare l'uscita del miscelatore alla valvola dell'interruttore di ingresso.
    8. Collegare la valvola dell'interruttore di ingresso all'ingresso della cella di campionamento.
    9. Collegare l'uscita della cella di campionamento alla valvola dell'interruttore di uscita.
    10. Collegare la valvola dell'interruttore di uscita al contenitore del campione misto.
  8. Definire tutti i collegamenti di tubi e valvole effettuati (Passo 1.7) nella GUI di controllo del sistema a flusso interrotto digitando i corrispondenti collegamenti del numero di porta effettuati a ciascuna valvola (vedere il codice di controllo di esempio nel repository open source online64).
  9. Calcolare il volume vuoto del tubo tra l'ingresso del miscelatore e l'uscita della cella di campionamento, che definisce la quantità minima di campione necessaria per riempire la cella campione per ogni misurazione.

2. Caricare il campione.

  1. Impostare il volume di riempimento del campione desiderato e il volume di riempimento del solvente nella GUI di controllo del sistema a flusso interrotto digitando i numeri desiderati (vedere il codice di controllo di esempio nel repository open source online64).
  2. Utilizzare il comando pump.aspirate() per aspirare ( aspirare) i volumi desiderati di campione e solvente dalle loro fonti nelle siringhe del campione attraverso le valvole di selezione della pompa.
    NOTA: Quando si carica per la prima volta una siringa vuota, nella parte superiore della siringa sarà presente aria che deve essere spurgata per adescare il sistema con campione e solvente nella fase 3.

3. Prepara il sistema.

  1. Utilizzare il comando pump.dispense () per spingere fuori (erogare) tutta l'aria da siringhe, tubazioni e valvole. Assicurarsi che da ogni siringa venga erogato un volume di liquido sufficiente per rimuovere completamente tutta l'aria dalle siringhe, dai tubi e dalle valvole. Se le bolle d'aria sono visibili all'interno di qualsiasi tubo, continuare a erogare solvente o campione fino a quando le bolle non vengono rimosse.
  2. Una volta che l'aria è stata eliminata dal sistema, eseguire almeno una procedura di iniezione e risciacquo del campione (senza raccogliere dati di diffusione neutronica).
    1. Fare clic per selezionare la cella denominata Avvia esperimento di miscelazione nella GUI dei controlli.
    2. Con questa cella selezionata attivamente, fare clic sul pulsante Esegui (triangolo rettangolo) situato nella parte superiore della GUI di controllo oppure premere contemporaneamente i tasti Maiusc e Invio sulla tastiera.
    3. Ispezionare visivamente la cella del campione per verificare che non siano presenti bolle d'aria.
      1. Se sono presenti bolle d'aria, ripetere i passaggi 3.1 e 3.2 del protocollo per eliminare ulteriormente l'aria dalle tubazioni.
      2. Se nella cella campione non sono presenti bolle d'aria, procedere al passaggio 4 per definire i passaggi rimanenti del protocollo dell'esperimento.

4. Definire il protocollo di mixaggio a flusso interrotto nello script del programma (vedere l'esempio di codice nel repository open source online64).

  1. Immettere il set point di temperatura dell'unità di condizionamento d'aria programmabile (CA) che controlla la temperatura dell'involucro isolato che circonda il dispositivo di flusso interrotto.
    1. Tenendo premuto il pulsante a forma di stella sull'unità di controllo CA, premere le frecce su e giù per modificare la temperatura impostata. In alternativa, digitare il setpoint di temperatura desiderato nella GUI di controllo e fare clic su Esegui.
    2. Attendere 15-30 minuti per consentire all'interno dell'involucro di equilibrarsi alla temperatura desiderata prima di iniziare gli esperimenti cinetici.
      NOTA: l'intervallo di temperatura accessibile è attualmente compreso tra 10 °C e 50 °C e la stabilità della temperatura è ± 1 °C.
  2. Immettere tutte le fasi della sequenza di risciacquo digitando i volumi, le portate, i tempi e il numero di ripetizioni appropriati nella GUI di controllo.
    1. Definire il volume di ciascun campione da iniettare, che definisce la portata totale (Q).
    2. Definire il volume di ciascun solvente da iniettare durante la procedura di risciacquo.
    3. Definire il tempo di asciugatura tra ogni sottofase di risciacquo (tasciutto).
    4. Definire il numero di sottopassaggi di risciacquo.
    5. Definire i diversi solventi per le successive fasi di risciacquo.
    6. Definire il numero di ripetizioni di risciacquo da eseguire dopo ogni misurazione (nrisciacquo).
    7. Definire il tempo necessario per asciugare completamente la cella del campione e il miscelatore, fornendo una cella di campionamento pulita per la successiva iniezione del campione (tdry_final).
  3. Definire tutte le fasi della sequenza di iniezione del campione digitando i volumi, le portate e i tempi appropriati nella GUI di controllo del sistema a flusso interrotto.
    1. Definire il volume di ciascun campione da iniettare e la portata.
    2. Calcolare il tempo di ritardo (tritardo) dal volume di vuoto (V vuoto) e la portata totale(ritardo t = Vvuoto/Q).
      NOTA: il tempo di ritardo è il tempo necessario per riempire la cella del campione con il campione misto.
    3. Definire il tempo di acquisizione desiderato per i dati TR-SANS in modo tale che si sia verificato l'intero processo cinetico di interesse (tscatt).
    4. Impostare il tempo di attesa tra la fine dell'esperimento di scattering e l'inizio dei cicli di risciacquo (twait).
      NOTA: Questo tempo di attesa deve essere di almeno 100 s se la trasmissione di neutroni del campione deve essere misurata prima di essere risciacquata dalla cella. La trasmissione del campione è necessaria durante l'elaborazione dei dati per ridurre i dati a intensità assoluta.
    5. Definire il numero di cicli di iniezione da eseguire con le sequenze di risciacquo eseguite tra ciascuna iniezione definite nella fase 4.2 (nciclo).
  4. Calcolare il tempo totale di un singolo ciclo di raccolta dati a flusso interrotto (ciclo t) utilizzando l'equazione (1).
    ciclo t = n× di risciacquo (t ritardo + tasciugatura) + tdry_final + tritardo + tscatt (1)
    in cui n risciacquo = numero di ripetizioni dirisciacquo (fase 4.2.6); t ritardo = tempo diritardo del dispositivo di flusso arrestato (fase 4.3.2); tasciutto = tempo di asciugatura tra ciascuna sottofase di risciacquo (fase 4.2.3); tdry_final = tempo necessario per asciugare completamente la cella del campione e il miscelatore (fase 4.2.7); tscatt = tempo di acquisizione dati TR-SANS desiderato (passo 4.3.3)

5. Definire i parametri di scattering neutronico a piccolo angolo nella GUI di controllo dello strumento SANS.

  1. Determinare le scale di lunghezza e l'intervallo q di interesse per ciascun campione.
  2. Definire la configurazione dello strumento per coprire il q-range di interesse desiderato, massimizzando il flusso di neutroni sul campione.
  3. Impostare il tempo totale di acquisizione dati VSANS nella GUI di controllo dello strumento SANS sul tempo di ciclo calcolato nel passaggio 4.4 (tempo di acquisizione dei dati di scattering neutronico =ciclo t).
  4. Impostare il tempo di misurazione della trasmissione del campione su 100 s nella GUI di controllo dello strumento SANS.
  5. Utilizzando la GUI del controllo dello strumento SANS, attivare la raccolta dei dati in modalità evento digitando GenerateEventModeData true nella riga di comando.

6. Raccogliere misurazioni di scattering standard per la riduzione dei dati prima di iniziare l'esperimento di flusso interrotto per elaborare i dati TR-SANS.

  1. Misurare la dispersione in background.
    1. Assicurarsi che l'otturatore dello strumento locale sia chiuso.
    2. Fissare il campione del fascio bloccato sul retro dell'apertura del campione, proteggere l'ambiente dello strumento locale e aprire l'otturatore dello strumento locale.
    3. Definire il tempo di acquisizione dei dati di scattering del fascio bloccato nel software e raccogliere i dati di diffusione del fascio bloccato, contando per la stessa durata del tempo di acquisizione dei dati di scattering più lungo (tscatt).
    4. Una volta completata la raccolta dei dati, chiudere l'otturatore dello strumento e rimuovere il campione di fascio bloccato dall'apertura del campione.
  2. Misurare la dispersione delle celle vuote.
    1. Assicurarsi che la cella campione sia stata accuratamente risciacquata e asciugata.
    2. Aprire l'otturatore dello strumento locale.
    3. Raccogliere la misura della trasmissione a celle vuote per 100 s.
    4. Raccogliere la misura di dispersione delle celle vuote, contando almeno per il tempo di acquisizione più lungo (tscatt).

7. Iniziare l'esperimento del flusso interrotto.

  1. Avviare la raccolta dei dati di scattering VSANS in modalità evento .
    1. Assicurarsi che l'area locale dello strumento sia sicura e quindi aprire l'otturatore del fascio dello strumento locale.
    2. Avviare la raccolta dei dati SANS utilizzando il software di controllo dello strumento SANS sul computer dello strumento trascinando e rilasciando le corse desiderate nella coda degli strumenti.
      NOTA: per assicurarsi che vengano misurati i primi punti temporali, iniziare la raccolta dei dati prima di iniziare l'esperimento di miscelazione del flusso interrotto. I dati saranno post-elaborati in una fase successiva per tenere conto del tempo di ritardo (tritardo).
  2. Avviare l'esperimento di mixaggio a flusso interrotto nella GUI di controllo.
    1. Selezionare la cella del notebook denominata Avvia esperimento di mixaggio nella GUI di controllo del sistema a flusso interrotto.
    2. Con questa cella selezionata attivamente, fare clic sul pulsante Esegui (triangolo rettangolo) situato nella parte superiore del programma di controllo del dispositivo a flusso interrotto oppure premere contemporaneamente i tasti Maiusc e Invio sulla tastiera.
    3. Verificare che il protocollo di miscelazione a flusso interrotto definito nella sezione 4 abbia iniziato a funzionare.
    4. Aggiungere la misurazione della trasmissione di 100 s alla coda degli strumenti VSANS dopo l'esecuzione di scattering utilizzando la GUI di controllo dello strumento SANS.
    5. Aggiungere una corsa di misurazione dello scattering e una di misurazione della trasmissione alla coda degli strumenti per ogni ciclo di miscelazione del flusso interrotto rimanente(ciclo n - 1, passo 4.3.5) nella GUI di controllo dello strumento SANS.

8. Elaborare e ridurre i dati per rimuovere tutti gli sfondi, correggere la sensibilità del rilevatore e correggere la trasmissione del campione.

  1. Scaricare i file di dati di dispersione e i file di eventi associati dal server.
    NOTA: dopo ogni misurazione VSANS verranno generati file di eventi del rilevatore separati, un file di eventi per ciascun carrello del rilevatore attivo (ad esempio, rilevatore anteriore, centrale e/o posteriore).
  2. Trasferisci i dati di scattering ai time bins desiderati usando il comando events=Rebin(filename ) seguito dal comando events.do_rebinning(timebins), in cui il nome del file di input corrisponde al nome del file di dati SANS desiderato e timebins è un elenco dei limiti del time bin desiderati in secondi.
    NOTA: se i timebins di input vengono inseriti come un singolo numero anziché come elenco, i dati verranno binned in N numero di contenitori con uguali larghezze temporali, dove N è il timebins di input (vedere gli script software forniti dalla beamline e disponibile online open-source repository64).
  3. Ridurre i dati di scattering binned utilizzando il software fornito dalla beamline65.

9. Analizzare i dati TR-SANS.

  1. Calcolare il tempo di processo di interesse(processo t) dai tempi di misurazione utilizzando l'equazione (2).
    tprocesso = ti - tstop + tritardo (2)
    Dove ti è il tempo di misurazione che inizia dopo l'arresto del flusso, tstop è il tempo di misurazione immediatamente quando il flusso viene arrestato e tritardo è il tempo di ritardo.
  2. Tracciare l'intensità q-dipendente I(q) in funzione del tempo di processo utilizzando i contenitori temporali definiti al punto 8.2 e ilprocesso t calcolato nel punto 9.1.
    NOTA: il primo tempo di processo accessibile è limitato dalritardo t. Per misurare i punti temporali di processo precedenti, aumentare la portata totale (Q) o diminuire il volume totale di vuoto (Vvuoto).
  3. Estrarre i parametri cinetici di interesse dalla variazione in I(q) in funzione del tempo di processo.

10. Termina l'esperimento.

  1. Spegnere il fascio di neutroni chiudendo l'otturatore locale dello strumento.
  2. Eseguire un controllo delle radiazioni utilizzando un monitor di radiazione fornito dalla beamline prima di scollegare qualsiasi parte, tubo o scaricare campioni o contenitori di campioni misti.
  3. Trasferire le siringhe, i tubi e il contenitore del campione misto al dipartimento di fisica sanitaria.
  4. Compila i moduli di fisica sanitaria e attendi la valutazione da parte del personale di fisica sanitaria.

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Representative Results

I dati rappresentativi dei neutroni qui mostrati misurano la cinetica di scambio lipidico in presenza di metil-β-ciclodestrina (mβCD), un additivo che catalizza lo scambio lipidico tra vescicole con il tasso di cambio (ke)66,67. Precedenti studi di fluorescenza hanno dimostrato che k e dipende dalla concentrazione di mβCDe l'emivita del processo di scambio è dell'ordine diminuti 68. I presenti esperimenti utilizzano TR-SANS a flusso interrotto per misurare lo scambio lipidico catalizzato da mβCD tra vescicole sulla scala temporale dei secondi. Sono state preparate due popolazioni di vescicole lipidiche isotopicamente distinte; una popolazione di vescicole è stata preparata con lipidi dimiristoilfosfatidilcolina idrogenati della coda (DMPC) (vescicole H-lipidiche nella Figura 5), e l'altra popolazione di vescicole è stata preparata con lipidi DMPC deuterati dalla coda (DMPC-d54) (vescicole D-lipidiche in Figura 5). Una frazione molare di 0,05 (5 mol%) di lipidi carichi di dimirisotilfosfatidilglyercol (DMPG) è stata aggiunta alle polveri lipidiche secche DMPC e DMPC-d54 per promuovere la formazione di vescicole unilamellari69.

Sono state preparate soluzioni separate di vescicola H e vescicola D idratando i rispettivi film lipidici in un solvente contenente il 45% in volume di acqua pesante (D 2 O) e il 55% in volumedi acqua (H2O). La composizionedel solvente D 2 O/H2O è stata calcolata in modo tale che la densità della lunghezza di diffusione dei neutroni (ρ) del solvente corrispondesse a una miscela casuale di H-lipidi e D-lipidi (Δρ = ρlipid- ρsolvente = 0). In altre parole, una vescicola H/D miscelata casualmente sarebbe "invisibile" ai neutroni e genererebbe zero diffusione coerente di neutroni. Le soluzioni di vescicole unilamellari sono state preparate congelando le soluzioni cinque volte e quindi estrudendo le singole soluzioni attraverso un filtro in policarbonato con pori di diametro 100 nm. Le soluzioni di vescicole sono state estruse avanti e indietro tra due siringhe e il filtro per un totale di 31 volte a 30 °C. Successivamente, un piccolo volume di una soluzione madre concentrata di mβCD preparata nella stessa miscela di solvente D2 O/H2O è stata aggiunta alle soluzioni di vescicola. La concentrazione lipidica finale era di 14 mmol/L (mM) e la concentrazione di mβCD era di 30 mM. Le singole soluzioni di vescicole sono state equilibrate per almeno 30 minuti con l'aggiunta di mβCD prima che le soluzioni venissero caricate nelle siringhe campione nel dispositivo di miscelazione a flusso interrotto.

Un esempio dei tassi di conta dei neutroni misurati su più cicli di iniezione è mostrato nella Figura 4A. Ogni ciclo consisteva in 9 fasi di risciacquo, 1 fase di asciugatura e 1 fase di iniezione del campione. Solo le velocità di conteggio misurate sul carrello centrale del rivelatore nello strumento VSANS sono presentate per chiarezza. Tendenze simili sono state trovate sul carrello del rivelatore anteriore, che corrispondeva ai dati raccolti ad angoli di diffusione più grandi o valori q più elevati. La velocità di conteggio aumentava con ogni iniezione di solvente di risciacquo (solvente S1 e solvente S2) e tornava alla conta basale delle cellule vuote quando il solvente veniva espulso dalla cella con azoto gassoso e asciugato. Il risciacquo finale della cella è stato con S2, che era etanolo in questo esempio, e la cella è stata asciugata un'ultima volta con azoto gassoso per 3 minuti prima dell'iniezione del campione. Poco dopo che il campione è stato iniettato nella cellula, la velocità di conteggio dei neutroni è aumentata e i dati sono stati raccolti continuamente per 5 minuti. Il campione rappresentativo iniettato nei dati di esempio nella Figura 4A era uno sfondo del buffer salino. Le fluttuazioni dell'intensità misurata nel tempo riflettono le variazioni della velocità di conta dei neutroni di fondo e non riflettono un cambiamento nella composizione media del campione. Il ciclo completo di risciacquo, asciugatura, miscelazione e iniezione del campione è stato ripetuto un'ulteriore volta nell'esempio in Figura 4A, dove ogni ciclo è durato per un totale di 15 minuti.

Le singole soluzioni di vescicole lipidiche marcate H e D marcate sono state miscelate al tempo tmix e immediatamente fluite nella cellula campione. La velocità di conteggio dei neutroni misurata è aumentata e poi ha raggiunto un valore massimo quando la cella campione è stata riempita a tfill, come mostrato nella Figura 4B. Il tempo trascorso necessario per riempire la cella del campione è chiamato tempo di ritardo t ritardo ed è dato da tritardo = tmiscela di riempimento-t. Se il volume di vuoto (V vuoto) tra il miscelatore e la cella di campionamento è noto e la portata totale (Q) è nota, allora ilritardo t può anche essere calcolato comeritardo t = Vvuoto/Q (vedere il passaggio del protocollo 4.3.2), che è anche il tempo medio di permanenza del campione liquido per entrare nel miscelatore e uscire dalla cella del campione. Dopo aver raggiunto ilriempimento t, il flusso è stato continuato a una portata costante per garantire che la cella si fosse riempita e avesse raggiunto lo stato stazionario. Il flusso è stato quindi immediatamente interrotto allafermata t. La velocità media della conta neutronica è rimasta costante in funzione del tempo di misurazione tra tfill e tstop perché la portata attraverso la cella del campione era costante e, pertanto, il campione all'interno del percorso del fascio di neutroni era allo stato stazionario. In altre parole, i dati misurati a tstop corrispondono al campione che è stato miscelato ed evoluto da tritardo = tfill- tmix = Vvuoto/Q. I tempi di misuraraccolti immediatamente dopo tstop sono i principali dati cinetici di interesse.

Nella Figura 4C, i conteggi dei neutroni dal campione di vescicole lipidiche miste a tre diverse temperature sono tracciati in funzione della scala temporale di processo corretta (processo t), che è il tempo diprocesso di interesse che è stato corretto per il periodo di flusso stazionario e il tempo di ritardo. La scala temporale del processo è stata calcolata da t process = t i- t stop + tdelay, o equivalentemente, tprocess = t i- tstop + tfill- tmix. I dati SANS sono stati raccolti continuamente nella Figura 4 nella cosiddetta modalità evento. Durante la raccolta dei dati in modalità evento, ogni evento neutronico rilevato viene registrato con un timestamp univoco e la sua posizione x e y sul rivelatore di neutroni bidimensionale. I dati della modalità evento vengono quindi post-elaborati nei time bins desiderati (ti) nella Figura 4B.

I dati della modalità evento all'interno della finestra temporale di processo accessibile di interesse (cioè lo scattering neutronico raccolto ad ogni ti dopo tstop nella Figura 4B) sono stati ricostruiti in un'immagine del rivelatore bidimensionale (2D) per quel contenitore temporale utilizzando protocolli e script disponibili nel repository open source online64. Ogni immagine del rilevatore 2D è stata quindi elaborata utilizzando routine di riduzione dei dati per sottrarre le diverse fonti di background, correggere la trasmissione del campione e l'efficienza del rilevatore e integrare azimutalmente i dati del rilevatore 2D nei grafici di intensità (I) rispetto al vettore di diffusione (q)65. I dati nella Figura 5 sono stati raggruppati in contenitori temporali uguali (3 s) e sono rappresentativi delle informazioni dipendenti dalla scala di tempo e lunghezza che possono essere ottenute da una misurazione TR-SANS. Analogamente al tasso totale di conteggio grezzo mostrato nella Figura 4B, l'intensità q-dipendente I(q) diminuisce nel tempo man mano che i lipidi nel foglietto esterno si scambiano e si mescolano casualmente tra diverse vescicole.

I dati sono presentati in Figura 5 per la cinetica di scambio lipidico misurata a 3 diverse temperature. Ogni grafico mostra i dati raccolti per i primi 110 minuti dopo la miscelazione. L'intensità misurata diminuisce di un ordine di grandezza ai valori q più bassi a 36 °C e 30 °C, che corrispondono alla fase del fluido lipidico. Nel frattempo, i dati di intensità sparsi cambiano significativamente più lentamente con il tempo a 20 °C, indicando che la cinetica di scambio del foglietto esterno è molto più lenta nella fase del gel lipidico.

L'intensità di scattering misurata, I(q), è correlata al contrasto SLD come Equation 1, in cui Δρ è la differenza SLD tra la vescicola e il solvente circostante. Questo contrasto medio SLD è direttamente correlato al numero relativo di H-lipidi e D-lipidi in una vescicola in un dato momento. Pertanto, l'intensità di scattering misurata in un dato momento può essere normalizzata per determinare la frazione della popolazione lipidica che ha scambiato. Questa normalizzazione si ottiene raccogliendo due misurazioni aggiuntive, tra cui: (1) l'intensità misurata I(0) al tempo t = 0, quando non c'è scambio lipidico tra vescicole, e (2) l'intensità misurata I(∞) al tempo t = ∞, quando tutti i lipidi si sono scambiati e le popolazioni si sono equilibrate. La velocità di conteggio normalizzata, 42, Equation 2 è rappresentata in funzione del tempo di processo per le diverse temperature nella Figura 6. In questo esempio, I(t) è l'intensità q-integrata al momento del processo t (intensità sottratta dallo sfondo integrata in funzione di q), I(∞) è l'intensità q-integrata a tempo infinito dopo che tutti i lipidi si sono scambiati (che dovrebbe essere simile allo scattering di fondo del solvente), e I(0) è il q-integrato intensità al tempo t = 0 (senza scambio lipidico). I(0) è stato misurato per un campione misto al di sotto della temperatura di transizione di fase a 20 °C in cui lo scambio era lento, e I(∞) è stato misurato in un campione separato che si era equilibrato per più di 36 ore a 40 °C e aveva e completamente scambiato H-lipidi e D-lipidi.

La velocità di conteggio normalizzata dovrebbe decadere da R(t) = 1 al momento del processo t = 0, a R(t) = 0 a t = ∞, ed è direttamente correlata al contrasto SLD nel campione e quindi all'entità dello scambio lipidico 27,28,29,30,31,32,33,34,35 . Si noti che i primi dati R(t) misurati non iniziano a R(t)=1 a 30 °C e 36 °C, indicando che una quantità significativa di scambio lipidico si è verificata durante i primi 3 s dopo la miscelazione, che non era accessibile sperimentalmente a causa del tempo di ritardo(ritardo t = 2,4 s) del protocollo di miscelazione a flusso interrotto impiegato. Nel frattempo, la R(t) misurata a 20 °C è rimasta approssimativamente costante per i primi (2-3) minuti. Per la cinetica di scambio lipidico misurata a 30 °C e 36 °C, R(t) è rapidamente decaduto a ≈0,5 entro 100 s, suggerendo che i lipidi del foglietto esterno si sono completamente scambiati ed equilibrati in pochi minuti. Di conseguenza, l'acquisizione dello scambio lipidico catalizzato da mβCD è stata resa possibile utilizzando SANS a flusso interrotto e sarebbe difficile da acquisire con la miscelazione manuale delle pipette. L'acquisizione di punti di tempo di processo ancora più precedenti (t < 3 s) richiederà un tipo di miscelatore diverso con un volume di vuoto inferiore, volumi di vuoto dei tubi più piccoli e portate totali più elevate per ridurre il tempo di ritardo.

L'R(t) ha continuato a decadere in tempi più lunghi mentre i lipidi si capovolgono tra i foglietti interni ed esterni. I dati TR-SANS per il processo flip-flop più lento (t > 5 min) possono essere raccolti con campioni discreti miscelati a mano e caricati in celle di campionamento SANS standard, poiché il metodo di miscelazione manuale delle pipette richiede circa 5 minuti. Allo stesso modo, lo scambio lipidico a 20 °C nella fase gel lipidico era abbastanza lento da poter essere miscelato e misurato discretamente, e questa misurazione non doveva necessariamente essere studiata con il metodo di miscelazione a flusso interrotto. Le misurazioni dei processi cinetici su scale temporali da diversi minuti a ore sono più efficienti quando i campioni vengono miscelati mediante miscelazione manuale delle pipette. Tuttavia, i processi cinetici su scale temporali inferiori a minuti richiederanno questa miscelazione a flusso interrotto e la procedura di misurazione TR-SANS.

Figure 4
Figura 4: Dati rappresentativi della velocità di conteggio dei neutroni grezzi raccolti durante i cicli di iniezione di miscelazione e pulizia. (A) Esempio della velocità di conteggio dei neutroni (rivelatore centrale) in funzione del tempo durante le sequenze di risciacquo ripetute, la sequenza di essiccazione e la sequenza di iniezione del campione misto su più cicli. Il campione in (A) era uno sfondo di tampone salino e le variazioni di intensità nel tempo riflettono le variazioni nel tasso di conteggio dello sfondo, non un cambiamento nel campione. (B) Velocità di conta dei neutroni normalizzata dal monitor in funzione del tempo sperimentale dopo l'iniezione di vescicole miste di lipidi H e D-lipidi a 30 °C. Le linee tratteggiate verticali indicano l'ora di inizio della miscelazione (tmix), il tempo di riempimento (tfill), il tempo di arresto del flusso (tstop) e la regione di binning del tempo (ti). Il decadimento della velocità di conteggio dopo tstop è dovuto alla perdita di contrasto nel campione come scambio lipidico tra vescicole. (C) Monitorare i tassi di conta neutronica normalizzati in funzione del tempo del processo di scambio per i primi 100 s dell'esperimento a (blu) 20 °C, (verde) 30 °C e (rosso) 36 °C. I dati della modalità evento vengono elaborati in contenitori da 1 s. Abbreviazioni: S1 = solvente 1; S2 = solvente 2; tmix = tempo dell'esperimento in cui le soluzioni campione sono miscelate; tfill = tempo dell'esperimento in cui viene riempita la cella campione; tstop = tempo dell'esperimento in cui il flusso viene arrestato; Processo T = Tempo di interesse del processo cinetico calcolato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Illustrazione dello scambio catalizzato dello strato esterno di vescicole lipidiche e corrispondenti variazioni dell'intensità diffusa (I) in funzione del vettore di scattering (q) a varie temperature. Schema che mostra lo scambio lipidico tra vescicole H-lipid e D-lipidiche dopo (A) miscelazione iniziale a t = 0 e (B) scambio dello strato esterno catalizzato da metil-β-ciclodestrina (mβCD). Ridotta intensità di scattering neutronico in funzione del vettore d'onda di scattering q. Gli esperimenti di miscelazione a flusso interrotto e le misurazioni VSANS sono stati ripetuti a (C) 36 °C, (D) 30 °C e (E) 20 °C. I dati presentati sono stati raggruppati in intervalli di 3 s nei primi 10 minuti dopo la miscelazione ad ogni temperatura specificata. Le barre di errore sono l'incertezza propagata dalle statistiche di conteggio e rappresentano una deviazione standard. Abbreviazioni: ke = costante di velocità per lo scambio lipidico intervescicolare; mβCD = metil-β-ciclodestrina; kf = costante di velocità per lo scambio lipidico tra lembini, noto anche come flip-flop lipidico; l(q) = intensità SANS misurata con unità di cm-1 ; q = vettore di scattering. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Intensità diffusa normalizzata corrispondente alla frazione di lipidi scambiati che può essere modellata per estrarre costanti di velocità per i processi cinetici di interesse . (A) Scambio lipidico tra il foglietto esterno delle vescicole che si verifica su scale temporali comprese tra 3 s e 600 s misurate a (blu) 20 °C, (nero) 30 °C e (rosso) 36 °C. L'inserto nella figura ingrandisce i primi 60 s del processo cinetico. Le barre di errore sono l'incertezza propagata dall'integrazione numerica delle intensità di diffusione e rappresentano una deviazione standard. Abbreviazioni: R(t) = intensità diffusa normalizzata; t processo = tempo di interesse delprocesso corretto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

La procedura attuale descrive il dispositivo di miscelazione e le fasi per eseguire misure TR-SANS a flusso interrotto. Il dispositivo e il protocollo sono ottimizzati per campioni liquidi a bassa viscosità in cui le scale temporali di interesse sono ≈1 s a 5 min. Per scale temporali superiori a 5 minuti, mescolare manualmente i campioni e caricarli in celle di dispersione standard può essere più facile e desiderabile, specialmente per campioni ad alta viscosità, gel o paste. L'accesso a scale temporali inferiori a 1 s richiede un apparato di miscelazione diverso, volumi di vuoto totali inferiori e portate totali più elevate per ridurre il tempo di ritardo. È anche importante notare che lo studio dei processi cinetici su queste brevi scale temporali richiederà probabilmente iniezioni ripetute di campioni per accumulare sufficienti statistiche di conteggio dello scattering sulla scala temporale del millisecondo con TR-SANS. Se i volumi totali del campione sono limitati, può essere opportuno utilizzare una tecnica di flusso più elevata, come la diffusione della luce o la diffusione dei raggi X, che richiede meno iniezioni di campione o meno volume di campione per iniezione, supponendo che esista un contrasto di diffusione sufficiente con la diffusione della luce o dei raggi X.

Questo approccio SANS modulare a flusso interrotto crea diversi vantaggi e svantaggi chiave rispetto agli strumenti a flusso interrotto disponibili in commercio che sono stati ottimizzati per esperimenti di diffusione di neutroni. I vantaggi principali includono (1) misurazioni TR-SANS alternate tra diverse celle campione durante i periodi di risciacquo per massimizzare l'uso del tempo del fascio di neutroni, (2) adattamento del numero di siringhe, volumi di siringhe e tipi di miscelatori per la miscelazione ternaria del campione o altri requisiti di miscelazione del campione più complessi e (3) consentendo periodi di misurazione più lunghi isolando la cella del campione ed eliminando la retrodiffusione su scale temporali più lunghe (>10 min). Sebbene non implementata qui, la modularità del design della cella di miscelazione consentirebbe anche la raccolta simultanea dei dati con più metodi di misurazione, come la combinazione di SANS, UV-Vis e misure di fluorescenza70. Due svantaggi chiave di questa configurazione modulare includono (1) tempi di ritardo di miscelazione relativamente più lunghi (da 1 s a 3 s) rispetto ad altri sistemi in grado di fornire tempi di ritardo da 1 ms a 100 ms e (2) un intervallo di temperatura operativa inferiore (da 10 °C a 50 °C) rispetto ad altri sistemi disponibili che possono accedere a temperature operative da -20 °C a oltre 80 °C.

La raccolta di dati preliminari SANS sui campioni di interesse prima di eseguire esperimenti di miscelazione in situ è importante per raccogliere i migliori dati TR-SANS, in particolare negli esperimenti progettati per monitorare la cinetica di scambio molecolare, come l'esempio presentato qui. La determinazione dei valori accurati di I(0) e I(∞) è fondamentale per calcolare valori accurati dell'intensità normalizzata, R(t), che viene modellata per estrarre i parametri cinetici desiderati. Il valore di I(0) può essere calcolato direttamente dalle intensità di scattering misurate delle scorte separate di vescicole H e D-vescicole, e I(∞) può essere determinato preparando un campione di vescicola separato preparato da una miscela 50/50 di H-lipidi/D-lipidi. I dati di scattering di questi campioni di controllo possono anche essere utilizzati per determinare la gamma q ottimale e la configurazione dello strumento SANS per la misurazione TR-SANS per massimizzare il segnale e verificare la progressione della cinetica di scambio durante gli esperimenti TR-SANS. Se l'intensità misurata al primo punto temporale dopo la miscelazione non è uguale al calcolato I(0), potrebbero essere necessari tempi di miscelazione più rapidi per catturare tutti i processi di interesse. Una volta che l'intensità misurata ha raggiunto I(∞), il processo di scambio è completo e la cella può essere svuotata e pulita in preparazione per l'iniezione successiva.

Per miscelare con successo il campione liquido per TR-SANS, è fondamentale garantire che tutte le siringhe, le valvole e le tubazioni siano innescate e prive di aria e che tutte le connessioni dei tubi siano sicure per evitare perdite. La mancata esecuzione corretta di questi passaggi critici potrebbe causare volumi di miscelazione imprecisi o intensità di dispersione assolute imprecise. Ad esempio, le bolle d'aria intrappolate all'interno della cella del campione diminuiranno l'intensità SANS misurata a causa del ridotto volume del campione nel percorso del fascio di neutroni. In alternativa, le bolle d'aria possono produrre "strisce" o "brillamenti" di alta intensità sul rivelatore a causa della rifrazione del fascio all'interfaccia aria-liquido. Cambiamenti imprevisti nell'intensità di diffusione misurata nel tempo possono indicare una scarsa miscelazione del campione, perdite della valvola, bolle d'aria nella cella del campione o retrodiffusione del campione.

La raccolta di una misura di trasmissione per ciascun campione durante un esperimento TR-SANS è fondamentale per ridurre i dati raccolti a un'intensità assoluta. È possibile raccogliere simultaneamente dati di scattering e trasmissione su alcuni strumenti SANS, il che semplifica la programmazione complessiva dell'acquisizione dati TR-SANS; tuttavia, ciò non è possibile su tutti gli strumenti, incluso lo strumento VSANS utilizzato in questo protocollo. Poiché la trasmissione del campione e le misurazioni della diffusione del campione richiedevano diverse configurazioni dello strumento, le misurazioni della trasmissione sono state raccolte alla fine delle misurazioni di scattering (fase di protocollo 7.2.4) per garantire che i dati di scattering fossero misurati nei primi punti temporali dopo che il campione è stato iniettato nella cella. La trasmissione dipende solo dalla composizione elementare totale, dalla lunghezza del percorso del campione e dalla lunghezza d'onda dei neutroni. Pertanto, la trasmissione non dovrebbe cambiare se la composizione elementare totale rimane costante durante l'esperimento risolto nel tempo. Grandi differenze nei valori di trasmissione tra cicli ripetuti dello stesso campione indicano un problema dovuto a volumi di campionamento di miscelazione incoerenti, riempimento incompleto della cella del campione, bolle d'aria o perdite di valvole e riflusso del campione durante l'esperimento.

Un vantaggio unico di TR-SANS è che l'intensità misurata dipende dal vettore di scattering (q) e può essere utilizzata per sondare i cambiamenti spaziali su scala nanometrica. In combinazione con il dispositivo di miscelazione a flusso interrotto, TR-SANS può sondare questi cambiamenti su scala nanometrica su scale temporali dal secondo al minuto, fornendo approfondimenti sull'autoassemblaggio e lo scambio di tensioattivi e lipidi, sull'aggregazione di polimeri e proteine in seguito all'aggiunta di eccipienti, alla crescita e al decadimento delle nanoparticelle o allo scambio di prodotti incapsulati in emulsioni. Il dispositivo a flusso interrotto può essere configurato con più pompe per siringhe e siringhe per campioni per facilitare la miscelazione di due o più campioni liquidi. Questa flessibilità consente lo studio sistematico degli additivi sulla cinetica di interesse. Ad esempio, diversi volumi di una soluzione peptidica antimicrobica concentrata potrebbero essere miscelati con soluzioni di vescicole H e vescicole D per studiare gli effetti della concentrazione di peptidi sulla cinetica di scambio lipidico45,46. Inoltre, poiché tutti i percorsi sigillati del fluido sono racchiusi in un involucro a temperatura controllata, che include le siringhe di campionamento, le valvole, i miscelatori e i tubi, la temperatura del sistema può essere modificata per estrarre i parametri termodinamici relativi ai processi cinetici di interesse.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgments

L'accesso al VSANS NG3 è stato fornito dal Center for High-Resolution Neutron Scattering, una partnership tra il National Institute of Standards and Technology e la National Science Foundation ai sensi dell'accordo n. DMR-2010792. M.H.L.N riconosce il finanziamento fornito da Mitacs Globalink (Canada). L'identificazione di qualsiasi prodotto commerciale o nome commerciale è per favorire la comprensione e non implica l'approvazione o la raccomandazione da parte del National Institute of Standards and Technology.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynamic mixer Analytical Scientific Instruments 462-0150A Magnetically coupled rotor, binary dynamic mixer assembly (ternary type available), 0.15 mL dead volume (larger dead volume available)
Fluoropolymer tubing IDEX Health & Science 1507L PFA Tubing Natural 1/16 inch OD x 0.040 inch ID x 50 ft
Fluoropolymer 1/4-28 flangeless fittings IDEX Health & Science XP-245 PFA flangeless fitting with ferrules, 1/4-28 threading, 1/16 inch OD tubing
Glass syringes Hamilton Company 81660 Hamilton 1000 series syringes, 10 mL (81660), model 1010 C syr, 1/4"-28 thread termination, other volumes available
High-pressure flow selector valves Vici Valco C85X-1570EUTB Vici 10 position selector valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure switch valves Vici Valco C82X-1574EUHB Vici 4 port switch valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure syringes Cetoni A2019000358 3 mL stainless steel syringe, 510 bar max, 21 mL/min flow rate max
Low-pressure flow selector valves Vici Valco C25-3180EUHB Vici 10 position selector valves, max 250 psi liquid, 0.75 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 1/4-28 threaded ports, USB universal actuator
neMESYS high-pressure syringe pumps Cetoni A3921000103 Max force 2600 N
neMESYS mid-pressure syringe pumps Cetoni A3921000131 Max force 1000 N
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Quartz windows Technical Glass Products NA GE 124 Clear fused quartz ground and polished plates, 11.75 inch by 23.75 inch by 0.375 inch thick
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Syringe pump control software Cetoni T6000000004 QmixElements software for nemesys pumps, QmixSDK software development kit
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T-slot railing McMaster-Carr 47065T103 Aluminum t-slotted railing (1.5 inch by 1.5 inch) cut to various lengths
Vapor locking bottle caps  Cole-Parmer EW-12018-02 Four 304 SS port inserts, 1/4"-28 threads, GL45 bottle cap size, PTFE body, SS threads, PP collar

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Questo mese in JoVE Numero 174 Scattering neutronico a piccolo angolo (SANS) scattering risolto nel tempo miscelazione a flusso interrotto cinetica di scambio molecolare nanoparticelle lipidiche membrane lipidiche vescicole evoluzione strutturale
Misurare l'evoluzione temporale di materiali su scala nanometrica con scattering neutronico a flusso interrotto e a piccolo angolo
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Kelley, E. G., Nguyen, M. H. L., Marquardt, D., Maranville, B. B., Murphy, R. P. Measuring the Time-Evolution of Nanoscale Materials with Stopped-Flow and Small-Angle Neutron Scattering. J. Vis. Exp. (174), e62873, doi:10.3791/62873 (2021).

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