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Medición de la evolución temporal de materiales a nanoescala con flujo detenido y dispersión de neutrones de ángulo pequeño

Published: August 6, 2021 doi: 10.3791/62873
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1, 1
1NIST Center for Neutron Research, National Institute of Standards and Technology, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of Windsor, 3Department of Physics, University of Windsor

Summary

Este protocolo presenta el uso de un entorno de muestra de flujo detenido para mezclar rápidamente múltiples soluciones líquidas in situ durante una medición de dispersión de neutrones de ángulo pequeño y para estudiar procesos cinéticos en escalas de longitud nanométrica y escalas de segundo tiempo.

Abstract

Este documento presenta el uso de un entorno de muestra de dispersión de neutrones de ángulo pequeño (SANS) de flujo detenido para mezclar rápidamente muestras líquidas y estudiar procesos cinéticos a nanoescala en escalas de tiempo de segundos a minutos. El entorno de muestra de flujo detenido utiliza bombas de jeringa disponibles comercialmente para mezclar los volúmenes deseados de muestras líquidas que luego se inyectan a través de un mezclador dinámico en una celda de vidrio de cuarzo en aproximadamente 1 s. La adquisición de datos SANS con resolución temporal se sincroniza con la mezcla de muestras para seguir la evolución de la nanoestructura en solución después de la mezcla.

Para hacer el uso más eficiente del tiempo de haz de neutrones, utilizamos una serie de válvulas selectoras de flujo para cargar, enjuagar y secar automáticamente la celda entre mediciones, lo que permite la recopilación repetida de datos a través de múltiples inyecciones de muestras. Las inyecciones de muestras se repiten hasta que se recopilan suficientes estadísticas de dispersión de neutrones. La configuración de mezcla se puede programar para variar sistemáticamente las condiciones para medir la cinética en diferentes proporciones de mezcla, concentraciones de muestra, concentraciones de aditivos y temperaturas. El volumen mínimo de muestra requerido por inyección es de aproximadamente 150 μL, dependiendo de la longitud de la trayectoria de la celda de cuarzo.

Se presentan resultados representativos utilizando este entorno de muestra de flujo detenido para una cinética rápida de intercambio lipídico en presencia de un aditivo, ciclodextrina. Las vesículas intercambian lípidos externos (exteriores) en el orden de segundos e intercambian completamente los lípidos interiores y exteriores en cuestión de horas. La medición de la cinética de intercambio lipídico requiere una mezcla in situ para capturar los procesos más rápidos (segundos) y más lentos (minutos) y extraer las constantes de velocidad cinética. El mismo entorno de muestra también se puede utilizar para sondear el intercambio molecular en otros tipos de muestras líquidas como nanopartículas lipídicas, proteínas, surfactantes, polímeros, emulsiones o nanopartículas inorgánicas. La medición de las transformaciones estructurales a nanoescala y la cinética de los sistemas de intercambio o reacción proporcionará nuevos conocimientos sobre los procesos que evolucionan a nanoescala.

Introduction

La dispersión de neutrones de ángulo pequeño (SANS) proporciona una forma única de medir los tamaños, formas, interacciones y organización de varios materiales en escalas de longitud de ≈1 nm a ≈100 nm 1,2,3. Los instrumentos recientes, incluidos los instrumentos VSANS (dispersión de neutrones de ángulo muy pequeño) con espejos de enfoque, empujan los límites hacia la medición de escalas de longitud aún mayores hasta ≈1000 nm 4,5. En general, el contraste de dispersión único inherente a los métodos de dispersión de neutrones ofrece varias ventajas en la medición de la evolución temporal de estructuras a nanoescala, como la agregación de componentes en formulaciones farmacéuticas6, reacciones de reticulación y gelificación en sistemas poliméricos 7,8, en mesocristalización de proteínas de membrana9,10, degradación y despliegue de proteínas11,12 , y crecimiento de materiales a base de sílice13,14,15. El contraste de dispersión único hace que el SANS (TR-SANS) resuelto en el tiempo sea un complemento útil para otras mediciones basadas en flujo detenido.

Los métodos de mezcla de flujo detenido a menudo se implementan en la dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS)16,17,18,19,20,21, espectroscopia de fluorescencia 22,23,24,25,26 y dispersión de luz27,28,29,30, 31,32 experimentos para estudiar procesos cinéticos en escalas de tiempo de milisegundos. Una diferencia importante entre SANS y SAXS es que la dispersión de neutrones es una técnica de caracterización no destructiva, y como tal, SANS se puede utilizar para medir la misma muestra durante horas o incluso días sin daño por radiación ionizante a la muestra, lo que puede ocurrir durante experimentos de dispersión de rayos X de mayor flujo33. Como las mediciones repetidas de SANS no alterarán la estructura química de la molécula o muestra de la sonda, la evolución del tiempo puede estudiarse sin efectos de fotoblanqueo, por ejemplo, lo que puede complicar las mediciones cinéticas que dependen de la fluorescencia23,24. Además, SANS se puede utilizar para medir muestras altamente concentradas y ópticamente opacas que a menudo son difíciles de caracterizar con técnicas basadas en la luz, como la dispersión dinámica de la luz.

Además de proporcionar información estructural en la nanoescala, SANS se puede utilizar para sondear la composición local de estas estructuras a través de la variación en el contraste de densidad de longitud de dispersión de neutrones. La densidad de longitud de dispersión (SLD) de diferentes elementos varía aleatoriamente a través de la tabla periódica y varía con diferentes isótopos del mismo elemento. Un ejemplo comúnmente explotado es el hidrógeno (1H o H) y el deuterio (2H o D), que tienen longitudes de dispersión de neutrones muy diferentes. Por lo tanto, los materiales ricos en hidrógeno, como surfactantes, lípidos, proteínas, ARN, ADN y otros polímeros, se pueden distinguir de los disolventes deuterados que utilizan SANS sin cambiar significativamente las propiedades físicas del sistema. Sin embargo, es importante tener en cuenta que el intercambio H/D puede afectar la densidad, el enlace de hidrógeno y las temperaturas de transición de fase en la muestra. Sin embargo, la sensibilidad única de SANS a los materiales ricos en hidrógeno es especialmente útil en la investigación de materia blanda donde las muestras de interés tienen un menor contraste de dispersión y señal en técnicas basadas en rayos X como SAXS. La sustitución isotópica también hace que SANS sea una herramienta poderosa para estudiar la cinética de intercambio molecular en materiales ricos en hidrógeno simplemente mezclando moléculas marcadas con H y D. La sustitución isotópica es particularmente útil en sistemas donde los colorantes fluorescentes voluminosos son más grandes que las moléculas de surfactante o lípidos de interés y pueden influir en la cinética de intercambio34,35.

Las mediciones SANS resueltas en el tiempo son ventajosas porque la intensidad medida es una función del tiempo, la escala de longitud y el contraste SLD. Como tal, los experimentos TR-SANS pueden diseñarse para sondear los cambios dependientes del tiempo en las distribuciones espaciales y las composiciones de las muestras. Estas ventajas únicas de SANS han llevado a importantes conocimientos sobre los procesos cinéticos en muchos sistemas de materiales blandos, como tensioactivos 36,37,38, emulsiones 39,40,41, lípidos 34,42,43,44,45,46,47,48,49 ,50, y polímeros 51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62. La mayoría de los estudios TR-SANS se han centrado en escalas de tiempo de minutos a horas. Sin embargo, muchos procesos cinéticos de interés ocurren en la segunda escala de tiempo y son esenciales para comprender los mecanismos subyacentes. La captura de estos primeros puntos de tiempo requiere que las soluciones se mezclen rápidamente y se midan in situ, en las que la mezcla se sincroniza con la recopilación de datos durante la dispersión de luz de flujo detenido 27,28,29,30,31,32, fluorescencia 22,23,24,25,26 y rayos X 16,17,18,19,20,21 experimentos. Este trabajo describe el uso de un entorno de muestra diseñado para mezclar rápidamente múltiples muestras líquidas e inyectar la mezcla en una celda de vidrio de cuarzo para mediciones TR-SANS. El dispositivo de mezcla es una adaptación del dispositivo capilar rheoSANS63 recientemente desarrollado y utiliza múltiples bombas de jeringa y válvulas para controlar la mezcla de muestras y automatizar la limpieza celular. Al conectar las bombas de jeringa a una serie de válvulas selectoras de flujo, se pueden mezclar, medir, enjuagar y secar repetidamente múltiples flujos de entrada para facilitar las mediciones de TR-SANS en la escala de tiempo de segundos.

El procedimiento actual supone que las muestras de interés han sido identificadas y preparadas. Nos centramos en la configuración de mezcla in situ y los métodos para recopilar datos TR-SANS. Los datos de dispersión de neutrones se recopilaron en el instrumento VSANS en el Centro de Investigación de Neutrones (NCNR) del NIST; sin embargo, el procedimiento debe ser aplicable a otros instrumentos SANS. Los lectores interesados en implementar protocolos similares en otros instrumentos SANS deben consultar con los científicos locales del instrumento para determinar la configuración óptima del instrumento para maximizar el flujo de neutrones en la escala de longitud deseada y la escala de tiempo más relevante para los procesos cinéticos de interés. Los datos presentados aquí se recopilaron utilizando la configuración de "haz blanco" de alto flujo en VSANS para maximizar el recuento de neutrones en la pérdida de resolución espacial5. Los carros detectores se colocaron para cubrir un rango de vectores de dispersión (q), 0.005 Å-1 < q < 0.5 Å-1, correspondientes a escalas de longitud de ≈130 nm a ≈13 nm. El vector de dispersión se define como q = 4π/λ sin (θ/2) en el que λ es la longitud de onda del neutrón y θ es el ángulo de dispersión.

El dispositivo de mezcla de flujo detenido utilizado para las mediciones de TR-SANS consta de múltiples bombas, jeringas de enjuague, jeringas de muestra, selectores de flujo, así como un mezclador dinámico, celda de muestra y recipiente de muestra mixta, como se muestra en la Figura 1. Todas las rutas de fluidos sellados están ubicadas dentro de un recinto con aire acondicionado, que incluye las jeringas, válvulas, tubos de conexión, mezclador dinámico y celdas de muestra. Se utiliza un acondicionador de aire termoeléctrico programable para controlar la temperatura de la carcasa en el rango de 10 °C a 50 °C dentro de ±1 °C. Tenga en cuenta que parte del aislamiento de la carcasa se eliminó para mostrar las partes de trabajo del dispositivo. El gabinete del dispositivo de mezcla principal se coloca en una etapa de traslación en la línea de haz NG3 VSANS en el NCNR. La posición de la carcasa se ajusta utilizando la etapa de traslación para colocar la celda de muestra en la trayectoria del haz de neutrones (línea discontinua amarilla).

Figure 1
Figura 1: Un ejemplo de configuración para combinar la mezcla de flujo detenido y las mediciones de dispersión de neutrones de ángulo pequeño en la línea de luz VSANS en el Centro de Investigación de Neutrones del NIST. La configuración contiene cuatro bombas de jeringa, dos jeringas para enjuague con disolvente y dos jeringas para inyección de muestras, cuatro válvulas selectoras de bombas, dos válvulas selectoras mezcladoras, un mezclador dinámico, una celda de cuarzo de flujo continuo y un recipiente de muestra mixta. Los neutrones incidentes se dispersan de la muestra mezclada ubicada dentro de la celda de muestra. Se utiliza un recinto aislado con ventanas de cuarzo y una unidad termoeléctrica con aire acondicionado para controlar la muestra y todos los equipos a una temperatura constante. La línea discontinua amarilla muestra la trayectoria del haz de neutrones. Barra de escala = 10 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El dispositivo representado en la Figura 1 se configura con dos jeringas de muestra, dos jeringas de enjuague y una celda de muestra. Los diagramas de flujo correspondientes para los diferentes pasos del protocolo se ilustran en la Figura 2. Los volúmenes deseados de las dos muestras diferentes se inyectan en el mezclador y en la celda de muestra (Figura 2A). Una vez que se llena la celda de muestra, la válvula de interruptor de entrada (ISV) y la válvula de interruptor de salida (OSV) se cierran para aislar la celda de muestra del mezclador dinámico y evitar la difusión posterior de la muestra en la celda durante la recopilación de datos TR-SANS (Figura 2B). Antes del mezclador dinámico, el tubo de conexión varía en longitud de 10 cm a 1 m y no afecta el tiempo de retardo de mezcla. Sin embargo, las conexiones de tubería entre el mezclador dinámico y la celda de muestra afectarán el tiempo de retardo de mezcla y el volumen de inyección de muestra requerido. Los tubos de acero inoxidable precortados con 0,04 pulgadas (1 mm) de diámetro interior y 100 mm de longitud se utilizan para conectar el mezclador dinámico, las válvulas selectoras del mezclador (MSV1 y MSV2), y el ISV y OSV. El tubo fluorado con 1 mm de diámetro interior y 115 mm de longitud se utiliza para conectar el ISV y el OSV (o la salida del mezclador dinámico) a la celda de muestra. El volumen vacío total que influye en el tiempo de retardo de mezcla incluye el volumen vacío del mezclador (0,15 ml), el tubo entre la salida del mezclador y la entrada de la celda de muestra (0,09 ml) y el volumen de la celda de muestra (0,16 ml). En este ejemplo, el volumen total de vacío es de 0,4 ml. Los volúmenes de vacío interno de las válvulas son insignificantes en comparación con los volúmenes de vacío de tubos, mezcladores y celdas de muestra. Por ejemplo, las válvulas selectoras de baja presión empleadas (diámetro interior de 0,75 mm) contienen volúmenes vacíos aproximados de 4 μL, mientras que las válvulas selectoras de alta presión y las válvulas de conmutación (diámetro interior de 0,25 mm) contienen volúmenes vacíos aproximados de 0,5 μL.

Una vez completada la medición TR-SANS, la muestra se empuja fuera de la celda con disolvente, y el disolvente de enjuague se bombea repetidamente a través de la celda para extraer la muestra residual y limpiar la celda de muestra (Figura 2C). Tenga en cuenta que las jeringas de enjuague están conectadas a depósitos de disolventes más grandes (por ejemplo, agua y etanol) a través de valores de selector de bomba para garantizar que se disponga de volúmenes de disolvente adecuados para limpiar la celda de muestra entre series de medición. Las fuentes de solventes, las fuentes de muestras y los recipientes de muestras mixtas que contienen líquidos inflamables se colocan en un recinto separado sin equipo eléctrico para eliminar todas las fuentes de ignición posibles. Además, las tapas de botellas con bloqueo de vapor se utilizan para minimizar los vapores inflamables y la evaporación del solvente. Finalmente, la celda de muestra se seca con una corriente de gas nitrógeno para eliminar el disolvente de enjuague residual (Figura 2D). La presión de entrada de gas nitrógeno a la válvula selectora del mezclador se regula a aproximadamente 2 bar (0,2 MPa, presión manométrica) utilizando un regulador de presión manual ubicado en el cilindro de gas nitrógeno. Una vez que la celda de muestra está suficientemente limpia y seca, se inyecta una muestra recién mezclada en la celda de muestra para el siguiente ciclo de medición (repitiendo la mezcla e inyección ilustradas en el diagrama de flujo en la Figura 2A).

Figure 2
Figura 2: Ejemplo de diagrama de flujo utilizando una celda de muestra, dos muestras mezclando y dos solventes de enjuague para limpieza . (A) Mezcla de la muestra A (azul) y la muestra B (roja), y luego fluye la muestra mezclada (púrpura) en la celda de muestra. (B) Durante la recopilación de datos, el estado del dispositivo de flujo detenido donde las válvulas de conmutación ISV y OSV están cerradas para aislar la celda de muestra y evitar la difusión posterior de la muestra durante la recopilación de datos. (C) Los pasos de limpieza donde la celda de muestra se enjuaga con disolvente de enjuague de SS1 (verde) después de la recopilación de datos. (D) Etapa de secado donde la celda de muestra se seca con gas nitrógeno (naranja). Abreviaturas: PSV = válvula selectora de bomba; MSV = válvula selectora del mezclador; OSV = válvula de interruptor de salida; ISV = válvula de interruptor de entrada; SS1 = fuente de disolvente 1; SSA = fuente de muestra A; N2 = fuente de gas nitrógeno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Figura 3 muestra diagramas de flujo para una versión ligeramente diferente en la que la configuración de mezcla se configura con dos celdas de muestra separadas conectadas a las mismas válvulas de conmutación (Figura 3A). Mientras que los datos de TR-SANS se recopilan en la celda de muestra 1, la celda de muestra 2 se enjuaga (Figura 3B) y se seca (Figura 3C). Cuando se completa la recopilación de datos para la celda de muestra 1, la válvula de interruptor de entrada dirige una muestra recién mezclada a la celda de muestra 2 para la recopilación de datos (Figura 3D). Mientras que los datos de TR-SANS se recopilan en la celda de muestra 2, la celda de muestra 1 se enjuaga y se seca (Figura 3E). Este proceso paralelo y alterno entre dos celdas de muestra minimiza el tiempo entre las inyecciones de muestra posteriores y maximiza el uso del tiempo de haz de neutrones.

Figure 3
Figura 3: Ejemplo de diagrama de flujo utilizando dos celdas de muestra, dos muestras de mezcla y dos solventes de enjuague para la limpieza. (A) Mezclar la muestra A (azul) y la muestra B (roja) y luego hacer fluir la muestra mezclada (púrpura) en la celda de muestra 1. (B) El estado del dispositivo de flujo detenido durante la recopilación de datos en la celda de muestra 1 mientras la celda de muestra 2 se enjuaga con disolvente de SS1 (verde). (C) El estado del dispositivo de flujo detenido durante la recopilación de datos en la celda de muestra 1 mientras la celda de muestra 2 se seca con gas nitrógeno (naranja). (D) Una vez que se completa la recolección de datos de la celda de muestra 1, una nueva muestra (púrpura) se mezcla inmediatamente y fluye hacia la celda de muestra 2. (E) El estado del dispositivo de flujo detenido durante la recopilación de datos en la celda de muestra 2 mientras la celda de muestra 1 se enjuaga con disolvente de SS1 (verde). Mientras se mide una celda de muestra, la otra celda de muestra se limpia y se seca. El proceso de medición de flujo detenido alterna entre dos celdas de muestra para minimizar el tiempo entre las inyecciones posteriores de mezcla de muestras. Abreviaturas: PSV = válvula selectora de bomba; MSV = válvula selectora del mezclador; OSV = válvula de interruptor de salida; ISV = válvula de interruptor de entrada; SS1 = fuente de disolvente 1; SSA = fuente de muestra A; N2 = fuente de gas nitrógeno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

A continuación se describe un protocolo paso a paso para conectar las bombas y las líneas de tubería, cebar el sistema, enjuagar y secar la celda de muestra e inyectar la muestra mezclada. Aunque la configuración de una sola celda se demuestra por simplicidad (Figura 2), la configuración modular flexible, el protocolo y los scripts se pueden modificar fácilmente para implementar más bombas de jeringa, válvulas, mezcladores o configuraciones de celdas de muestra, como la configuración de celda de dos muestras que se muestra en la Figura 3. Los datos representativos de la tasa de recuento de neutrones brutos recopilados a lo largo de los ciclos de inyección de mezcla y limpieza se muestran en la Figura 4, mientras que la cinética de intercambio lipídico medida a 3 temperaturas diferentes y la intensidad dispersa normalizada extraída correspondiente a la fracción de lípidos intercambiados se muestran en la Figura 5 y la Figura 6, respectivamente.

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Protocol

1. Configure e inicie el sistema de flujo detenido.

  1. Encienda todas las fuentes de alimentación de la bomba y mezcladores dinámicos con el interruptor de encendido.
  2. Inicie todas las bombas y válvulas en la interfaz gráfica de usuario (GUI) de control del sistema de flujo detenido introduciendo la ruta de configuración del dispositivo y utilizando los comandos bus=qmixbus. Bus(), bus.open(), bus.start(), pump=qmixpump. Pump(), pump.enable(), y valve=ViciMultiposSelector() (véase el ejemplo de código de iniciación disponible en un repositorio de código abiertoen línea 64).
  3. Calibre las bombas antes de colocar las jeringas con el comando pump.calibrate().
  4. Confirme que las válvulas están iniciadas y muévase al puerto selector correcto en el comando usando el comando valve.setPort() y valve.getPort().
  5. Asigne el tipo de jeringa que se utilizará para cada bomba utilizando el comando pump.set_syringe_param(A, B), en el que A es el diámetro interior del cilindro de la jeringa (mm) y B es la distancia máxima de carrera del pistón de la jeringa (mm).
  6. Conecte las jeringas de muestra a las bombas de jeringa.
    1. Después de asegurarse de que las bombas han sido calibradas, atornille los barriles de jeringa limpios a la conexión en la parte superior de la bomba (cabezal de montaje de jeringa).
    2. Cuando utilice jeringas de vidrio, asegúrese de que el cabezal de montaje de la jeringa esté aflojado antes de dispensar el volumen de llenado, de modo que la jeringa de vidrio no se rompa debido a la fuerza excesiva del pistón de la jeringa.
    3. Atornille el pistón de la jeringa a la conexión en la parte inferior de la bomba (cola de montaje en jeringa).
    4. Después de conectar el cilindro de la jeringa y el pistón de la jeringa a la bomba, dispense el volumen de llenado del tipo de jeringa utilizando la bomba de comando.empty(), que mueve el pistón de la jeringa a la parte superior del cilindro de la jeringa.
    5. Cuando utilice jeringas de vidrio, apriete el cabezal de montaje de la jeringa después de que se detenga el movimiento del pistón.
  7. Conecte el tubo a las fuentes de muestras y solventes, jeringas, válvulas, mezcladores, celdas de muestra y recipiente de muestras mixtas.
    1. Conecte el tubo de la bomba de jeringa a las válvulas selectoras de la bomba.
    2. Conecte el tubo de la válvula selectora de la bomba a las fuentes de muestra.
    3. Conecte el tubo de la válvula selectora de la bomba a las fuentes de disolvente de enjuague.
    4. Conecte el tubo de la válvula selectora de la bomba al tubo de la válvula selectora del mezclador.
    5. Conecte el tubo de la válvula selectora del mezclador a la fuente de gas nitrógeno.
    6. Conecte el tubo de la válvula selectora del mezclador a las entradas del mezclador.
    7. Conecte la salida del mezclador a la válvula del interruptor de entrada.
    8. Conecte la válvula del interruptor de entrada a la entrada de la celda de muestra.
    9. Conecte la salida de la celda de muestra a la válvula del interruptor de salida.
    10. Conecte la válvula del interruptor de salida al recipiente de muestras mixtas.
  8. Defina todas las conexiones de tuberías y válvulas realizadas (Paso 1.7) en la GUI de control del sistema de flujo detenido escribiendo las conexiones correspondientes del número de puerto realizadas a cada válvula (consulte el código de control de ejemplo en el repositorio de código abiertoen línea 64).
  9. Calcule el volumen vacío del tubo entre la entrada del mezclador y la salida de la celda de muestra, que define la cantidad mínima de muestra necesaria para llenar la celda de muestra para cada medición.

2. Cargue la muestra.

  1. Defina el volumen de llenado de muestra y el volumen de llenado de disolvente deseados en la GUI de control del sistema de flujo detenido escribiendo los números deseados (consulte el código de control de ejemplo en el repositorio de código abiertoen línea 64).
  2. Utilice el comando pump.aspirate () para extraer (aspirar) la muestra deseada y los volúmenes de disolvente de sus fuentes a las jeringas de muestra a través de las válvulas selectoras de la bomba.
    NOTA: Al cargar por primera vez una jeringa vacía, habrá aire en la parte superior de la jeringa que debe purgarse para preparar el sistema con muestra y disolvente en el paso 3.

3. Prepara el sistema.

  1. Utilice el comando pump.dispense () para expulsar (dispensar) todo el aire de las jeringas, tuberías y válvulas. Asegúrese de que se dispense suficiente volumen de líquido de cada jeringa para eliminar completamente todo el aire de las jeringas, tubos y válvulas. Si las burbujas de aire son visibles dentro de cualquier tubo, continúe dispensando disolvente o muestra hasta que se retiren las burbujas.
  2. Una vez que se haya purgado el aire del sistema, realice al menos un procedimiento de inyección y enjuague de la muestra (sin recopilar datos de dispersión de neutrones).
    1. Haga clic para seleccionar la celda etiquetada Iniciar experimento de mezcla en la GUI de control.
    2. Con esta celda seleccionada activamente, haga clic en el botón Ejecutar (triángulo recto) ubicado en la parte superior de la GUI de control, o presione las teclas Mayús y Enter juntas en el teclado.
    3. Inspeccione visualmente la celda de muestra para confirmar que no hay burbujas de aire presentes.
      1. Si hay burbujas de aire, repita los pasos del protocolo 3.1 y 3.2 para purgar aún más el aire de las líneas de tubería.
      2. Si no hay burbujas de aire en la celda de muestra, continúe con el paso 4 para definir los pasos restantes del protocolo de experimento.

4. Defina el protocolo de mezcla de flujo detenido en el script del programa (consulte el ejemplo de código en el repositorio de código abiertoen línea 64).

  1. Introduzca el punto de ajuste de temperatura de la unidad de aire acondicionado programable (CA) que controla la temperatura de la carcasa aislada que rodea el dispositivo de flujo detenido.
    1. Mientras mantiene pulsado el botón de estrella de la unidad de control de CA, pulse las flechas hacia arriba y hacia abajo para cambiar la temperatura del punto de consigna. Alternativamente, escriba el punto de ajuste de temperatura deseado en la GUI de control y haga clic en Ejecutar.
    2. Espere 15-30 minutos para permitir que el interior del recinto se equilibre a la temperatura deseada antes de comenzar los experimentos cinéticos.
      NOTA: El rango de temperatura accesible está actualmente entre 10 °C y 50 °C, y la estabilidad de temperatura es ± 1 °C.
  2. Introduzca todos los pasos de la secuencia de enjuague escribiendo los volúmenes, caudales, tiempos y número de repeticiones apropiados en la GUI de control.
    1. Defina el volumen de cada muestra a inyectar, que define el caudal total (Q).
    2. Defina el volumen de cada disolvente a inyectar durante el procedimiento de enjuague.
    3. Defina el tiempo de secado entre cada subpaso de enjuague (tseco).
    4. Defina el número de subpasos de enjuague.
    5. Definir los diferentes disolventes para los pasos de aclarado posteriores.
    6. Defina el número de repeticiones de enjuague a realizar después de cada medición (nenjuague).
    7. Defina el tiempo para secar completamente la celda de muestra y el mezclador, proporcionando una celda de muestra limpia para la posterior inyección de muestra (tdry_final).
  3. Defina todos los pasos de la secuencia de inyección de muestras escribiendo los volúmenes, caudales y tiempos apropiados en la GUI de control del sistema de flujo detenido.
    1. Definir el volumen de cada muestra a inyectar y el caudal.
    2. Calcule el tiempo de retardo (t retardo) a partir del volumen vacío (V vacío) y el caudal total (tretardo = V vacío/Q).
      NOTA: El tiempo de retardo es el tiempo necesario para llenar la celda de muestra con la muestra mezclada.
    3. Defina el tiempo de adquisición deseado para los datos TR-SANS de modo que se haya producido todo el proceso cinético de interés (tscatt).
    4. Establezca el tiempo de espera entre el final del experimento de dispersión y el comienzo de los ciclos de enjuague (tespera).
      NOTA: Este tiempo de espera debe ser de al menos 100 s si se va a medir la transmisión de neutrones de la muestra antes de que se enjuague de la celda. La transmisión de la muestra es necesaria durante el procesamiento de datos para reducir los datos a intensidad absoluta.
    5. Defina el número de ciclos de inyección a realizar con las secuencias de enjuague ejecutadas entre cada inyección que se definen en el paso 4.2 (nciclo).
  4. Calcule el tiempo total de un solo ciclo de recolección de datos de flujo detenido (ciclo t) utilizando la ecuación (1).
    ciclo t = n× de enjuague (t retardo + tseco) + tdry_final +t retardo + tdispersión (1)
    en el que nenjuague = número de repeticiones de aclarado (paso 4.2.6); t retardo = tiempo deretardo del dispositivo de flujo detenido (paso 4.3.2); tseco = tiempo de secado entre cada subpaso de enjuague (paso 4.2.3); tdry_final = tiempo para secar completamente la célula de muestra y el mezclador (paso 4.2.7); tscatt = tiempo de adquisición de datos TR-SANS deseado (paso 4.3.3)

5. Defina los parámetros de dispersión de neutrones de ángulo pequeño en la GUI de control del instrumento SANS.

  1. Determine las escalas de longitud y el rango q de interés para cada muestra.
  2. Defina la configuración del instrumento para cubrir el rango q de interés deseado, mientras maximiza el flujo de neutrones en la muestra.
  3. Establezca el tiempo total de adquisición de datos VSANS en la GUI de control del instrumento SANS en el tiempo de ciclo calculado en el paso 4.4 (tiempo de adquisición de datos de dispersión de neutrones =ciclo t).
  4. Ajuste el tiempo de medición de la transmisión de la muestra a 100 s en la GUI de control del instrumento SANS.
  5. Con la GUI de control de instrumentos SANS, active la recopilación de datos en modo de evento escribiendo GenerateEventModeData true en la línea de comandos.

6. Recopile mediciones de dispersión estándar para la reducción de datos antes de comenzar el experimento de flujo detenido para procesar los datos TR-SANS.

  1. Mide la dispersión de fondo.
    1. Asegúrese de que el obturador del instrumento local esté cerrado.
    2. Acople la muestra de haz bloqueada a la parte posterior de la abertura de la muestra, asegure el entorno del instrumento local y abra el obturador del instrumento local.
    3. Defina el tiempo de adquisición de datos de dispersión de haz bloqueado en el software y recopile datos de dispersión de haz bloqueado, contando durante la misma duración que el tiempo de adquisición de datos de dispersión más largo (tscatt).
    4. Una vez completada la recopilación de datos, cierre el obturador del instrumento y retire la muestra de haz bloqueada de la abertura de la muestra.
  2. Mida la dispersión de celdas vacías.
    1. Asegúrese de que la celda de muestra se haya enjuagado y secado completamente.
    2. Abra el obturador del instrumento local.
    3. Recopile la medición de transmisión de celda vacía durante 100 s.
    4. Recopile la medición de dispersión de celdas vacías, contando al menos el tiempo de adquisición más largo (tscatt).

7. Comience el experimento de flujo detenido.

  1. Inicie la recopilación de datos de dispersión de VSANS en modo de evento .
    1. Asegúrese de que el área del instrumento local esté segura y, a continuación, abra el obturador del haz de instrumentos local.
    2. Comience la recopilación de datos SANS utilizando el software de control de instrumentos SANS en la computadora del instrumento arrastrando y soltando las carreras deseadas en la cola de instrumentos.
      NOTA: Para asegurarse de que se miden los primeros puntos de tiempo, comience la recopilación de datos antes de comenzar el experimento de mezcla de flujo detenido. Los datos se procesarán posteriormente en un paso posterior para tener en cuenta el tiempo de retraso (tdelay).
  2. Inicie el experimento de mezcla de flujo detenido en la GUI de control.
    1. Seleccione la celda del bloc de notas con la etiqueta Iniciar experimento de mezcla en la GUI de control del sistema de flujo detenido.
    2. Con esta celda seleccionada activamente, haga clic en el botón Ejecutar (triángulo recto) ubicado en la parte superior del programa de control del dispositivo de flujo detenido, o presione las teclas Mayús y Enter juntas en el teclado.
    3. Confirme que el protocolo de mezcla de flujo detenido definido en la sección 4 ha comenzado a funcionar.
    4. Agregue la medición de transmisión de 100 s a la cola de instrumentos VSANS después de la ejecución de dispersión utilizando la GUI de control de instrumentos SANS.
    5. Agregue una ejecución de medición de dispersión y una ejecución de medición de transmisión a la cola de instrumentos para cada ciclo de mezcla de flujo detenido restante(ciclo n - 1, paso 4.3.5) en la GUI de control de instrumentos SANS.

8. Procese y reduzca los datos para eliminar todos los fondos, corregir la sensibilidad del detector y corregir la transmisión de muestras.

  1. Descargue los archivos de datos de dispersión y los archivos de eventos asociados desde el servidor.
    NOTA: Se generarán archivos de eventos de detector separados después de cada medición de VSANS, un archivo de eventos para cada carro de detector activo (por ejemplo, detector frontal, central y/o posterior).
  2. Agrupe los datos de dispersión en las bandejas de tiempo deseadas mediante el comando events=Rebin(filename) seguido del comando e vents.do_rebinning(timebins), en el que el nombre de archivo de entrada corresponde al nombre del archivo de datos SANS deseado, ytimebins es una lista de los límites de la bandeja de tiempo deseada en segundos.
    NOTA: Si los intervalos de tiempo de entrada se introducen como un solo número en lugar de una lista, los datos se agruparán en N número de contenedores con anchos de tiempo iguales, donde N son los intervalos de tiempo de entrada (consulte los scripts de software proporcionados por la línea de luz y el repositorio de código abierto en líneadisponible 64).
  3. Reduzca los datos de dispersión agrupados utilizando el software proporcionado por la línea de luz65.

9. Analice los datos de TR-SANS.

  1. Calcule el tiempo de proceso de interés (tproceso) a partir de los tiempos de medición utilizando la ecuación (2).
    tproceso = ti - tstop + tretardo (2)
    Donde ti son los intervalos de tiempo de medición que comienzan después de que se detiene el flujo, tstop es el tiempo de medición inmediatamente cuando se detiene el flujo, y tdelay es el tiempo de retardo.
  2. Trazar la intensidad dependiente de q I(q) en función del tiempo de proceso utilizando las bandejas de tiempo definidas en el paso 8.2 y elproceso t calculado en el paso 9.1.
    NOTA: El tiempo de proceso accesible más temprano está restringido por elretraso t. Para medir puntos de tiempo de proceso anteriores, aumente el caudal total (Q) o disminuya el volumen de vacío total (vacío V).
  3. Extraer los parámetros cinéticos de interés del cambio en I(q) en función del tiempo de proceso.

10. Finaliza el experimento.

  1. Apague el haz de neutrones cerrando el obturador del instrumento local.
  2. Realice una verificación de radiación utilizando un monitor de radiación proporcionado por la línea de luz antes de desconectar cualquier pieza, tubo o descargar cualquier muestra o recipiente de muestras mixtas.
  3. Transfiera las jeringas, el tubo y el recipiente de muestra mixta al departamento de física de la salud.
  4. Complete formularios de física de la salud y espere la evaluación por parte del personal de física de la salud.

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Representative Results

Los datos representativos de neutrones que se muestran aquí miden la cinética de intercambio lipídico en presencia de metil-β-ciclodextrina (mβCD), un aditivo que cataliza el intercambio lipídico entre vesículas con la tasa de cambio (ke)66,67. Estudios previos de fluorescencia han demostrado que ke depende de la concentración de mβCD, y la vida media del proceso de intercambio es del orden de minutos68. Los experimentos actuales utilizan TR-SANS de flujo detenido para medir el intercambio lipídico catalizado por mβCD entre vesículas en la escala de tiempo de segundos. Se prepararon dos poblaciones de vesículas lipídicas isotópicamente distintas; una población de vesículas se preparó con lípidos de dimiristoilfosfatidilcolina hidrogenada de cola (DMPC) (vesículas de lípidos H en la Figura 5), y la otra población de vesículas se preparó con lípidos DMPC deuterados de cola (DMPC-d54) (vesículas de lípidos D en la Figura 5). Se añadió una fracción molar de 0,05 (5 mol%) de lípidos dimirrisotilifosfatidilglyercol cargados (DMPG) a los polvos lipídicos secos DMPC y DMPC-d54 para promover la formación de vesículas unilamelares69.

Se prepararon soluciones separadas de vesícula H y vesícula D hidratando las respectivas películas lipídicas en un disolvente que contenía 45% en volumen de agua pesada (D 2 O) y 55% en volumen de agua(H2O). La composición del disolvente D2O/H2Ose calculó de tal manera que la densidad de longitud de dispersión de neutrones (ρ) del disolvente coincidiera con una mezcla aleatoria de los lípidos H y los lípidos D (Δρ =ρ lípido- ρdisolvente = 0). En otras palabras, una vesícula H/D mezclada aleatoriamente sería "invisible" para los neutrones y generaría cero dispersión coherente de neutrones. Las soluciones de vesículas unilamelares se prepararon congelando y descongelando las soluciones cinco veces y luego extruyendo las soluciones individuales a través de un filtro de policarbonato con poros de 100 nm de diámetro. Las soluciones de vesículas se extruyeron de un lado a otro entre dos jeringas y el filtro durante un total de 31 veces a 30 °C. Posteriormente, se añadió a las soluciones vesiculares un pequeño volumen de una solución madre concentrada de mβCD preparada en la misma mezcla de disolvente D2O/H2O. La concentración lipídica final fue de 14 mmol/L (mM) y la concentración de mβCD fue de 30 mM. Las soluciones de vesículas individuales se equilibraron durante al menos 30 min con el mβCD añadido antes de que las soluciones se cargaran en las jeringas de muestra en el dispositivo de mezcla de flujo detenido.

Un ejemplo de las tasas de recuento de neutrones medidas durante múltiples ciclos de inyección se muestra en la Figura 4A. Cada ciclo consistió en 9 pasos de enjuague, 1 paso de secado y 1 paso de inyección de muestra. Solo se presentan las tasas de recuento medidas en el carro del detector medio en el instrumento VSANS para mayor claridad. Se encontraron tendencias similares en el carro del detector frontal, que correspondían a datos recopilados en ángulos de dispersión más grandes o valores q más altos. La tasa de recuento aumentó con cada inyección de solvente de enjuague (solvente S1 y solvente S2) y regresó a los recuentos de referencia de celdas vacías cuando el solvente fue expulsado de la celda con gas nitrógeno y secado. El enjuague celular final fue con S2, que era etanol en este ejemplo, y la celda se secó una última vez con gas nitrógeno durante 3 minutos antes de la inyección de la muestra. Poco después de que la muestra se inyectó en la célula, la tasa de recuento de neutrones se disparó y los datos se recopilaron continuamente durante 5 minutos. La muestra representativa inyectada en los datos de ejemplo de la Figura 4A fue un fondo de tampón salino. Las fluctuaciones en la intensidad medida a lo largo del tiempo reflejan las variaciones en la tasa de recuento de neutrones de fondo y no reflejan un cambio en la composición promedio de la muestra. El ciclo completo de enjuague, secado, mezcla e inyección de la muestra se repitió un tiempo adicional en el ejemplo de la Figura 4A, donde cada ciclo duró un total de 15 minutos.

Las soluciones individuales de vesículas lipídicas marcadas con H y D se mezclaron en el momento t de la mezcla e inmediatamente fluyeron haciala célula de muestra. La tasa de recuento de neutrones medida se disparó y luego alcanzó un valor máximo cuando la celda de muestra se llenó en tllenado, como se muestra en la Figura 4B. El tiempo transcurrido requerido para llenar la celda de muestra se denomina tiempo de retardo ty viene dado por tretardo = tfill-t mix. Si se conoce el volumen vacío (vacío V) entre el mezclador y la celda de muestra y se conoce el caudal total (Q), entonces el retardo t también se puede calcular comoretardo t =vacío V/Q (consulte el paso de protocolo 4.3.2), que también es el tiempo de residencia promedio para que la muestra líquida ingrese al mezclador y salga de la celda de muestra. Después de alcanzar el llenado, el flujo continuó a un caudal constante para garantizar que la celda se hubierallenado y alcanzado el estado estacionario. El flujo se detuvo inmediatamente en laparada. La tasa de recuento de neutrones promedio se mantuvo constante en función del tiempo de medición entre elllenado t y laparada t porque el caudal a través de la celda de muestra era constante y, por lo tanto, la muestra dentro de la trayectoria del haz de neutrones estaba en estado estacionario. En otras palabras, los datos medidos en tstop corresponden a la muestra que ha sido mezclada y evolucionada por tretardo = tfill- tmix = Vvoid/Q. Los tiempos de medición agrupados ti recogidos inmediatamente después de tstop son los principales datos cinéticos de interés.

En la Figura 4C, los recuentos de neutrones de la muestra de vesículas lipídicas mixtas a tres temperaturas diferentes se representan en función de la escala de tiempo de proceso corregida (proceso t), que es el tiempo de proceso de interés que se ha corregido para el período de flujo en estado estacionario y el tiempo de retardo. La escala de tiempo del proceso se calculó por tproceso = t i- t stop + tdelay, o equivalentemente, tprocess = ti- tstop + tfill- tmix. Los datos de SANS se recopilaron continuamente en la Figura 4 en el llamado modo de evento. Durante la recopilación de datos del modo de evento, cada evento de neutrones detectado se registra con una marca de tiempo única y su ubicación x e y en el detector de neutrones bidimensional. A continuación, los datos del modo de evento se procesan posteriormente en las bandejas de tiempo deseadas (ti) en la figura 4B.

Los datos del modo de evento dentro de la ventana de tiempo de proceso accesible de interés (es decir, la dispersión de neutrones recopilada en cada ti después de tstop en la Figura 4B) se reconstruyeron en una imagen de detector bidimensional (2D) para ese contenedor de tiempo utilizando protocolos y scripts disponibles en el repositorio de código abiertoen línea 64. Cada imagen del detector 2D se procesó utilizando rutinas de reducción de datos para restar las diferentes fuentes de fondo, corregir la transmisión de la muestra y la eficiencia del detector, e integrar azimutalmente los datos del detector 2D en gráficos de intensidad (I) frente a vectores de dispersión (q)65. Los datos de la Figura 5 se agruparon en contenedores de tiempo iguales (3 s) y son representativos de la información dependiente de la escala de tiempo y longitud que se puede obtener de una medición TR-SANS. Similar a la tasa total de recuento bruto que se muestra en la Figura 4B, la intensidad dependiente de q I (q) disminuye con el tiempo a medida que los lípidos en la valva externa intercambian y se mezclan aleatoriamente entre diferentes vesículas.

Los datos se presentan en la Figura 5 para la cinética de intercambio lipídico medida a 3 temperaturas diferentes. Cada gráfico muestra los datos recopilados durante los primeros 110 minutos después de la mezcla. La intensidad medida disminuye en un orden de magnitud a los valores q más bajos a 36 °C y 30 °C, que corresponden a la fase del líquido lipídico. Mientras tanto, los datos de intensidad dispersa cambian significativamente más lentamente con el tiempo a 20 ° C, lo que indica que la cinética de intercambio de valvas externas es mucho más lenta en la fase de gel lipídico.

La intensidad de dispersión medida, I(q), está relacionada con el contraste SLD como Equation 1, en el que Δρ es la diferencia SLD entre la vesícula y el disolvente circundante. Este contraste SLD promedio está directamente relacionado con el número relativo de lípidos H y lípidos D en una vesícula en un momento dado. Como tal, la intensidad de dispersión medida en un momento dado se puede normalizar para determinar la fracción de la población lipídica que se ha intercambiado. Esta normalización se logra mediante la recopilación de dos mediciones adicionales, que incluyen: (1) la intensidad medida I (0) en el tiempo t = 0, cuando no hay intercambio de lípidos entre vesículas, y (2) la intensidad medida I (∞) en el momento t = ∞, cuando todos los lípidos se han intercambiado y las poblaciones se han equilibrado. La tasa de conteo normalizada, 42, Equation 2 se representa en función del tiempo de proceso para las diferentes temperaturas en la Figura 6. En este ejemplo, I(t) es la intensidad q-integrada en el tiempo de proceso t (intensidad restada de fondo integrada en función de q), I(∞) es la intensidad q-integrada en un tiempo infinito después de que todos los lípidos se hayan intercambiado (que debería ser similar a la dispersión del fondo solvente), e I(0) es la q-integrada intensidad en el tiempo t = 0 (sin intercambio lipídico). I(0) se midió para una muestra mixta por debajo de la temperatura de transición de fase a 20 °C cuando el intercambio fue lento, y I(∞) se midió en una muestra separada que se había equilibrado durante más de 36 h a 40 °C y tenía e intercambió completamente lípidos H y lípidos D.

La tasa de recuento normalizada debe decaer de R(t) = 1 en el momento del proceso t = 0, a R(t) = 0 en t = ∞, y está directamente relacionada con el contraste SLD en la muestra y, por lo tanto, con el grado de intercambio lipídico 27,28,29,30,31,32,33,34,35 . Tenga en cuenta que los primeros datos medidos de R(t) no comienzan en R(t)=1 a 30 °C y 36 °C, lo que indica que se produjo una cantidad significativa de intercambio lipídico durante los primeros 3 s después de la mezcla, que no fue accesible experimentalmente debido al tiempo de retardo (tretardo = 2,4 s) del protocolo de mezcla de flujo detenido empleado. Mientras tanto, el R(t) medido a 20 °C permaneció aproximadamente constante durante los primeros (2-3) minutos. Para la cinética de intercambio lipídico medida a 30 °C y 36 °C, R(t) decayó rápidamente a ≈0,5 en 100 s, lo que sugiere que los lípidos de las valvas externas se han intercambiado y equilibrado completamente en cuestión de minutos. En consecuencia, la captura del intercambio lipídico catalizado por mβCD fue posible utilizando SANS de flujo detenido y sería difícil de capturar con la mezcla manual de pipetas. La captura de puntos de tiempo de proceso aún más tempranos (t < 3 s) requerirá un tipo de mezclador diferente con un volumen de vacío más pequeño, volúmenes de vacío de tubería más pequeños y caudales totales más altos para disminuir el tiempo de retardo.

El R(t) continuó decayendo en momentos más largos a medida que los lípidos cambian entre las valvas internas y externas. Los datos TR-SANS para el proceso flip-flop más lento (t > 5 min) se pueden recolectar con muestras discretas mezcladas a mano y cargarse en celdas de muestra SANS estándar, ya que el método de mezcla manual de pipetas tarda aproximadamente 5 min. Del mismo modo, el intercambio lipídico a 20 °C en la fase de gel lipídico fue lo suficientemente lento como para mezclarse y medirse discretamente, y esta medición no necesariamente tuvo que estudiarse con el método de mezcla de flujo detenido. Las mediciones de los procesos cinéticos en escalas de tiempo de varios minutos a horas son más eficientes cuando las muestras se mezclan mediante mezcla manual de pipetas. Sin embargo, los procesos cinéticos en escalas de tiempo inferiores a minutos requerirán este procedimiento de mezcla de flujo detenido y medición TR-SANS.

Figure 4
Figura 4: Datos representativos de la tasa de recuento de neutrones brutos recopilados a lo largo de los ciclos de inyección de mezcla y limpieza. (A) Ejemplo de la tasa de recuento de neutrones (detector medio) en función del tiempo durante secuencias de enjuague repetidas, secuencia de secado y secuencia de inyección de muestras mixtas durante múltiples ciclos. La muestra en (A) fue un fondo de amortiguación de sal, y los cambios en la intensidad a lo largo del tiempo reflejan las variaciones en la tasa de recuento de fondo, no un cambio en la muestra. (B) Tasa de recuento de neutrones normalizada por monitor en función del tiempo de experimento después de la inyección de vesículas mixtas de lípidos H y lípidos D a 30 °C. Las líneas discontinuas verticales indican el tiempo de inicio de la mezcla (mezcla t), el tiempo de llenado (relleno t), el tiempo de parada del flujo (tstop) y la región de agrupación de tiempo (ti). La disminución en la tasa de conteo después de tstop se debe a la pérdida de contraste en la muestra como el intercambio de lípidos entre vesículas. (C) Monitorear las tasas normalizadas de recuento de neutrones en función del tiempo del proceso de intercambio durante los primeros 100 s del experimento a (azul) 20 °C, (verde) 30 °C y (rojo) 36 °C. Los datos del modo de evento se procesan en bandejas de 1 s. Abreviaturas: S1 = disolvente 1; S2 = disolvente 2; tmix = tiempo de experimento en el que se mezclan las soluciones de muestra; tfill = tiempo de experimento en el que se llena la celda de muestra; tstop = tiempo de experimento en el que se detiene el flujo; t proceso = tiempo de interés delproceso cinético calculado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Ilustración del intercambio catalizado de la capa externa de vesículas lipídicas y los cambios correspondientes en la intensidad dispersa (I) en función del vector de dispersión (q) a varias temperaturas. Esquema que muestra el intercambio lipídico entre las vesículas H-lípido y D-lípido después de (A) la mezcla inicial a t = 0 y (B) el intercambio de la capa externa catalizada por metil-β-ciclodextrina (mβCD). Reducción de la intensidad de dispersión de neutrones en función de la dispersión del vector de onda q. Los experimentos de mezcla de flujo detenido y las mediciones de VSANS se repitieron a (C) 36 °C, (D) 30 °C y (E) 20 °C. Los datos presentados se agruparon en intervalos de 3 s durante los primeros 10 minutos después de mezclar a cada temperatura especificada. Las barras de error son la incertidumbre propagada de las estadísticas de recuento y representan una desviación estándar. Abreviaturas: ke = constante de velocidad para el intercambio lipídico entre vesículas; mβCD = metil-β-ciclodextrina; kf = constante de velocidad para el intercambio lipídico entre valvas, también conocido como flip-flop lipídico; l(q) = intensidad SANS medida con unidades de cm-1 ; q = vector de dispersión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Intensidad dispersa normalizada correspondiente a la fracción de lípidos intercambiados que se puede modelar para extraer constantes de velocidad para los procesos cinéticos de interés . (A) Intercambio lipídico entre la valva externa de las vesículas que ocurre en escalas de tiempo entre 3 s y 600 s medidas a (azul) 20 °C, (negro) 30 °C y (rojo) 36 °C. El recuadro en la figura se acerca a los primeros 60 s del proceso cinético. Las barras de error son la incertidumbre propagada a partir de la integración numérica de las intensidades de dispersión y representan una desviación estándar. Abreviaturas: R(t) = intensidad dispersa normalizada; tproceso = tiempo de proceso corregido de interés. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El procedimiento actual describe el dispositivo de mezcla y los pasos para realizar mediciones TR-SANS de flujo detenido. El dispositivo y el protocolo están optimizados para muestras líquidas de baja viscosidad donde las escalas de tiempo de interés son de ≈1 s a 5 min. Para escalas de tiempo superiores a 5 minutos, mezclar manualmente las muestras y cargarlas en celdas de dispersión estándar puede ser más fácil y deseable, especialmente para muestras, geles o pastas de alta viscosidad. El acceso a escalas de tiempo inferiores a 1 s requiere un aparato de mezcla diferente, volúmenes de vacío total más bajos y caudales totales más altos para reducir el tiempo de retardo. También es importante tener en cuenta que el estudio de los procesos cinéticos en estas escalas de tiempo cortas probablemente requerirá inyecciones repetidas de muestras para acumular suficientes estadísticas de conteo de dispersión en la escala de tiempo de milisegundos con TR-SANS. Si los volúmenes totales de muestra son limitados, puede ser deseable utilizar una técnica de flujo más alto, como la dispersión de luz o la dispersión de rayos X, que requiere menos inyecciones de muestra o menos volumen de muestra por inyección, suponiendo que exista suficiente contraste de dispersión con luz o dispersión de rayos X.

Este enfoque modular SANS de flujo detenido crea varias ventajas y desventajas clave en comparación con los instrumentos de flujo detenido disponibles comercialmente que han sido optimizados para experimentos de dispersión de neutrones. Las ventajas clave incluyen (1) alternar mediciones TR-SANS entre diferentes celdas de muestra durante los períodos de enjuague para maximizar el uso del tiempo de haz de neutrones, (2) adaptar el número de jeringas, volúmenes de jeringas y tipos de mezcladores para la mezcla ternaria de muestras u otros requisitos de mezcla de muestras más complejos, y (3) permitir períodos de medición más largos aislando la celda de muestra y eliminando la difusión posterior a escalas de tiempo más largas (>10 min). Aunque no se implementó aquí, la modularidad del diseño de la celda de mezcla también permitiría la recopilación simultánea de datos con múltiples métodos de medición, como el peinado de SANS, UV-Vis y mediciones de fluorescencia70. Dos desventajas clave de esta configuración modular incluyen (1) tiempos de retardo de mezcla relativamente más largos (1 s a 3 s) en comparación con otros sistemas que pueden proporcionar tiempos de retardo de 1 ms a 100 ms, y (2) un rango de temperatura de funcionamiento más pequeño (10 °C a 50 °C) en comparación con otros sistemas disponibles que pueden acceder a temperaturas de funcionamiento de -20 °C a más de 80 °C.

La recopilación de datos preliminares de SANS sobre las muestras de interés antes de realizar experimentos de mezcla in situ es importante para recopilar los mejores datos TR-SANS, particularmente en experimentos diseñados para monitorear la cinética de intercambio molecular, como el ejemplo presentado aquí. La determinación de valores exactos de I(0) e I(∞) es fundamental para calcular valores precisos de la intensidad normalizada, R(t), que se modela para extraer los parámetros cinéticos deseados. El valor de I(0) puede calcularse directamente a partir de las intensidades de dispersión medidas de las cepas separadas de vesículas H y D, e I(∞) puede determinarse preparando una muestra de vesícula separada preparada a partir de una mezcla 50/50 de lípidos H/D lípidos. Los datos de dispersión de estas muestras de control también se pueden utilizar para determinar el rango q óptimo y la configuración del instrumento SANS para la medición TR-SANS para maximizar la señal y verificar la progresión de la cinética de intercambio durante los experimentos TR-SANS. Si la intensidad medida en el primer punto de tiempo después de la mezcla no es igual al I (0) calculado, entonces se pueden necesitar tiempos de mezcla más rápidos para capturar todos los procesos de interés. Una vez que la intensidad medida ha alcanzado I(∞), el proceso de intercambio se completa y la celda se puede vaciar y limpiar en preparación para la siguiente inyección.

Para mezclar con éxito la muestra líquida para TR-SANS, es fundamental asegurarse de que todas las jeringas, válvulas y líneas de tuberías estén cebadas y libres de aire, y que todas las conexiones de tubería sean seguras para evitar fugas. No realizar estos pasos críticos correctamente podría resultar en volúmenes de mezcla inexactos o intensidades de dispersión absolutas inexactas. Por ejemplo, las burbujas de aire atrapadas dentro de la celda de muestra disminuirán la intensidad SANS medida debido al volumen de muestra reducido en la trayectoria del haz de neutrones. Alternativamente, las burbujas de aire pueden producir "rayas" o "llamaradas" de alta intensidad en el detector debido a la refracción del haz en la interfaz aire-líquido. Los cambios inesperados en la intensidad de dispersión medida a lo largo del tiempo pueden indicar una mezcla deficiente de la muestra, fugas de la válvula, burbujas de aire en la celda de muestra o retrodifusión de la muestra.

La recopilación de una medición de transmisión para cada muestra durante un experimento TR-SANS es fundamental para reducir los datos recopilados a una intensidad absoluta. Es posible recopilar simultáneamente datos de dispersión y transmisión en algunos instrumentos SANS, lo que simplifica la programación general de adquisición de datos TR-SANS; sin embargo, esto no es posible en todos los instrumentos, incluido el instrumento VSANS utilizado en este protocolo. Debido a que las mediciones de transmisión y dispersión de muestras requerían diferentes configuraciones de instrumentos, las mediciones de transmisión se recolectaron al final de las mediciones de dispersión (paso de protocolo 7.2.4) para garantizar que los datos de dispersión se midieran en los primeros puntos de tiempo después de que la muestra se inyectó en la celda. La transmisión solo depende de la composición elemental total, la longitud de la trayectoria de la muestra y la longitud de onda de los neutrones. Por lo tanto, la transmisión no debe cambiar si la composición elemental total permanece constante durante todo el experimento resuelto en el tiempo. Las grandes diferencias en los valores de transmisión entre series repetidas de la misma muestra indican un problema debido a volúmenes de muestra de mezcla inconsistentes, llenado incompleto de la celda de muestra, burbujas de aire o fugas de válvulas y reflujo de muestras durante el experimento.

Una ventaja única de TR-SANS es que la intensidad medida depende del vector de dispersión (q) y se puede utilizar para sondear cambios espaciales a nanoescala. Cuando se combina con el dispositivo de mezcla de flujo detenido, TR-SANS puede sondear estos cambios a nanoescala en escalas de tiempo de segundo a minuto, proporcionando información sobre el autoensamblaje y el intercambio de surfactantes y lípidos, la agregación de polímeros y proteínas tras la adición de excipientes, el crecimiento y la descomposición de nanopartículas, o el intercambio de productos encapsulados en emulsiones. El dispositivo de flujo detenido se puede configurar con múltiples bombas de jeringa y jeringas de muestra para facilitar la mezcla de dos o más muestras líquidas. Esta flexibilidad permite la investigación sistemática de aditivos en la cinética de interés. Por ejemplo, diferentes volúmenes de una solución peptídica antimicrobiana concentrada podrían mezclarse con soluciones de vesículas H y vesículas D para estudiar los efectos de la concentración de péptidos en la cinética de intercambio lipídico45,46. Además, debido a que todas las rutas de fluido selladas están encerradas en un recinto de temperatura controlada, que incluye las jeringas de muestra, válvulas, mezcladores y tubos, la temperatura del sistema se puede cambiar para extraer los parámetros termodinámicos relacionados con los procesos cinéticos de interés.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Acknowledgments

El acceso al NG3 VSANS fue proporcionado por el Centro de Dispersión de Neutrones de Alta Resolución, una asociación entre el Instituto Nacional de Estándares y Tecnología y la Fundación Nacional de Ciencias bajo el Acuerdo NO. DMR-2010792. M.H.L.N reconoce la financiación proporcionada por Mitacs Globalink (Canadá). La identificación de cualquier producto comercial o nombre comercial es para fomentar la comprensión y no implica el respaldo o la recomendación por parte del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynamic mixer Analytical Scientific Instruments 462-0150A Magnetically coupled rotor, binary dynamic mixer assembly (ternary type available), 0.15 mL dead volume (larger dead volume available)
Fluoropolymer tubing IDEX Health & Science 1507L PFA Tubing Natural 1/16 inch OD x 0.040 inch ID x 50 ft
Fluoropolymer 1/4-28 flangeless fittings IDEX Health & Science XP-245 PFA flangeless fitting with ferrules, 1/4-28 threading, 1/16 inch OD tubing
Glass syringes Hamilton Company 81660 Hamilton 1000 series syringes, 10 mL (81660), model 1010 C syr, 1/4"-28 thread termination, other volumes available
High-pressure flow selector valves Vici Valco C85X-1570EUTB Vici 10 position selector valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure switch valves Vici Valco C82X-1574EUHB Vici 4 port switch valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure syringes Cetoni A2019000358 3 mL stainless steel syringe, 510 bar max, 21 mL/min flow rate max
Low-pressure flow selector valves Vici Valco C25-3180EUHB Vici 10 position selector valves, max 250 psi liquid, 0.75 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 1/4-28 threaded ports, USB universal actuator
neMESYS high-pressure syringe pumps Cetoni A3921000103 Max force 2600 N
neMESYS mid-pressure syringe pumps Cetoni A3921000131 Max force 1000 N
Power supply Cetoni A3921000127 Base 600, supplies power for up to 4 high pressure pumps
Quartz flow-through sample cell Starna Scientific 3-2.30-Q-1/TC Quartz micro flow cells, 2 mm path length (1 mm available), 2 mm by 2 mm by 30 mm internal dimension
Quartz windows Technical Glass Products NA GE 124 Clear fused quartz ground and polished plates, 11.75 inch by 23.75 inch by 0.375 inch thick
Stainless steel 10-32 coned compression fittings IDEX Health & Science U-321X, U-320X 316 stainless steel ferrule (U-321X) and nut (U-320X) -Valco type, 10-32 coned, for 1/16 inch OD stainless steel tubing
Stainless steel tubing IDEX Health & Science U-102 Stainless Steel Tubing 1/16 inch OD x 0.020 inch ID, 10 cm, various precut lengths available
Syringe pump control software Cetoni T6000000004 QmixElements software for nemesys pumps, QmixSDK software development kit
Thermoelectric air conditioner EIC Solutions AAC-140C-4XT-HC Thermoelectric air conditioner mounted on insulated enclosure to control the pump, valve, mixer, and sample temperature
T-slot railing McMaster-Carr 47065T103 Aluminum t-slotted railing (1.5 inch by 1.5 inch) cut to various lengths
Vapor locking bottle caps  Cole-Parmer EW-12018-02 Four 304 SS port inserts, 1/4"-28 threads, GL45 bottle cap size, PTFE body, SS threads, PP collar

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