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Engineering

Stopped-flow and Small-angle Neutron Scattering을 이용한 나노스케일 물질의 시간 진화 측정

Published: August 6, 2021 doi: 10.3791/62873
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1, 1
1NIST Center for Neutron Research, National Institute of Standards and Technology, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of Windsor, 3Department of Physics, University of Windsor

Summary

이 프로토콜은 소각 중성자 산란 측정 중에 여러 액체 용액을 현장에서 신속하게 혼합하고 나노미터 길이 스케일 및 두 번째 시간 스케일에서 동역학 과정을 연구하기 위해 정지 흐름 샘플 환경을 사용합니다.

Abstract

이 논문은 정지 흐름 소각 중성자 산란(SANS) 샘플 환경을 사용하여 액체 샘플을 빠르게 혼합하고 몇 초에서 몇 분의 시간 규모로 나노 스케일 운동 과정을 연구하는 방법을 제시합니다. 흐름이 멈춘 시료 환경에서는 시중에서 판매되는 주사기 펌프를 사용하여 원하는 부피의 액체 시료를 혼합한 다음 동적 믹서를 통해 약 1초 내에 석영 유리 셀에 주입합니다. 시간 분해 SANS 데이터 수집은 혼합 후 용액에서 나노 구조의 진화를 따르기 위해 샘플 혼합과 동기화됩니다.

중성자 빔 시간을 가장 효율적으로 사용하기 위해 일련의 유량 선택 밸브를 사용하여 측정 사이에 셀을 자동으로 로드, 헹굼 및 건조하여 여러 샘플 주입을 통해 반복적인 데이터 수집이 가능합니다. 충분한 중성자 산란 통계가 수집될 때까지 샘플 주입을 반복합니다. 혼합 설정은 다양한 혼합 비율, 시료 농도, 첨가제 농도 및 온도에서 동역학을 측정하기 위해 조건을 체계적으로 변경하도록 프로그래밍할 수 있습니다. 주입당 필요한 최소 시료 부피는 석영 셀의 경로 길이에 따라 약 150μL입니다.

이 정지 흐름 샘플 환경을 사용한 대표적인 결과는 첨가제인 사이클로덱스트린의 존재 하에서 빠른 지질 교환 역학에 대해 제시됩니다. 소포는 몇 초 안에 외부 전엽(외부) 지질을 교환하고 몇 시간 내에 내부 및 외부 지질을 완전히 교환합니다. 지질 교환 동역학을 측정하려면 더 빠른(초) 공정과 느린(분) 공정을 캡처하고 동역학 속도 상수를 추출하기 위해 현장 혼합이 필요합니다. 동일한 샘플 환경을 사용하여 지질 나노입자, 단백질, 계면활성제, 폴리머, 에멀젼 또는 무기 나노입자와 같은 다른 유형의 액체 샘플에서 분자 교환을 조사할 수도 있습니다. 나노 스케일의 구조 변형과 교환 또는 반응 시스템의 동역학을 측정하면 나노 스케일에서 진화하는 프로세스에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다.

Introduction

소각 중성자 산란(SANS)은 ≈1 nm에서 ≈100 nm까지의 길이 척도에서 다양한 물질의 크기, 모양, 상호 작용 및 조직을 측정하는 고유한 방법을 제공합니다 1,2,3. 포커싱 미러가 있는 VSANS(Very Small-Angle Neutron Scattering) 기기를 포함한 최신 기기는 최대 ≈1000nm까지 더 큰 길이의 스케일을 측정하는 데 한계를 뛰어 넘었습니다 4,5. 일반적으로, 중성자 산란 방법에 내재된 독특한 산란 대비는 제약 제형6의 성분 응집,폴리머 시스템에서의 가교 및 겔화 반응7,8, 막 단백질의 메조 결정화(meso crystallization)9,10, 단백질의 분해 및 풀림(11,12)과 같은 나노스케일 구조의 시간 진화를 측정하는 데 있어 몇 가지 이점을 제공한다 및 실리카계 물질의 성장13,14,15. 고유한 산란 대비는 시간 분해 SANS(TR-SANS)를 다른 정지 흐름 기반 측정에 대한 유용한 보완책으로 만듭니다.

정지 흐름 혼합 방법은 종종 소각 X선 산란(SAXS)16,17,18,19,20,21, 형광 분광법 22,23,24,25,26 및 광 산란27,28,29,30, 밀리초 시간 척도에서 운동 과정을 연구하기 위한 31,32개의 실험. SANS와 SAXS의 중요한 차이점은 중성자 산란은 비파괴 특성화 기술이며, 따라서 SANS는 고플럭스 X선 산란 실험 중에 발생할 수 있는 샘플에 대한 이온화 방사선 손상 없이 몇 시간 또는 며칠 동안 동일한 샘플을 측정하는 데 사용할 수 있다는 것입니다(33). 반복적인 SANS 측정은 프로브 분자 또는 샘플의 화학 구조를 변경하지 않기 때문에, 예를 들어 형광에 의존하는 동역학 측정을 복잡하게 만들 수 있는 광표백의 영향 없이 시간 진화를 연구할 수 있습니다23,24. 또한 SANS는 동적 광 산란과 같은 광 기반 기술로 특성화하기 어려운 고농축 및 광학적으로 불투명한 샘플을 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

나노 스케일에 대한 구조 정보를 제공하는 것 외에도 SANS는 중성자 산란 길이 밀도 대비의 변화를 통해 이러한 구조의 국소 구성을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 서로 다른 원소의 산란 길이 밀도(SLD)는 주기율표에서 무작위로 변하며 동일한 원소의 동위원소에 따라 다릅니다. 일반적으로 이용되는 예는 수소 (1H 또는 H)와 중수소 (2H 또는 D)이며, 이들은 중성자 산란 길이가 크게 다릅니다. 따라서 계면활성제, 지질, 단백질, RNA, DNA 및 기타 폴리머와 같은 수소가 풍부한 물질은 시스템의 물리적 특성을 크게 변경하지 않고 SANS를 사용하여 중수소화 용매와 구별할 수 있습니다. 그러나 H/D 교환은 시료의 밀도, 수소 결합 및 상전이 온도에 영향을 미칠 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 그럼에도 불구하고 수소가 풍부한 물질에 대한 SANS의 고유한 감도는 SAXS와 같은 X선 기반 기술에서 관심 샘플의 산란 대비와 신호가 낮은 연질 물질 연구에 특히 유용합니다. 동위원소 치환은 또한 SANS를 단순히 H-표지 및 D-표지 분자를 혼합함으로써 수소가 풍부한 물질의 분자 교환 역학을 연구하기 위한 강력한 도구로 만듭니다. 동위원소 치환은 부피가 큰 형광 염료가 관심 있는 계면활성제 또는 지질 분자보다 크고 교환 동역학에 영향을 미칠 수 있는 시스템에서 특히 유용합니다34,35.

시간 분해 SANS 측정은 측정된 강도가 시간, 길이 스케일 및 SLD 대비의 함수이기 때문에 유리합니다. 따라서 TR-SANS 실험은 공간 분포 및 샘플 구성의 시간 의존적 변화를 조사하도록 설계할 수 있습니다. SANS의 이러한 고유한 장점은 계면활성제 36,37,38, 에멀 젼39,40,41, 지질 34,42,43,44,45,46,47,48,49와 같은 많은 연질 재료 시스템에서 운동 과정에 대한 중요한 통찰력을 이끌어 냈습니다 , 50, 및 중합체 51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62. 대부분의 TR-SANS 연구는 몇 분에서 몇 시간의 시간 척도에 초점을 맞추었습니다. 그러나 관심 있는 많은 운동 과정은 두 번째 시간 척도에서 발생하며 기본 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다. 이러한 초기 시점을 포착하려면 용액을 신속하게 혼합하고 현장에서 측정해야 하며, 여기서 혼합은 정지 흐름 광 산란 27,28,29,30,31,32, 형광 22,23,24,25,26 및 X선 동안 데이터 수집과 동기화됩니다 16,17,18,19,20,21 실험. 이 작업은 여러 액체 샘플을 신속하게 혼합하고 TR-SANS 측정을 위해 혼합물을 석영 유리 셀에 주입하도록 설계된 샘플 환경의 사용에 대해 설명합니다. 혼합 장치는 최근에 개발된 모세관 rheoSANS 장치(63)를 개량한 것으로, 샘플 혼합을 제어하고 세포 세척을 자동화하기 위해 다중 주사기 펌프 및 밸브를 사용한다. 시린지 펌프를 일련의 유량 선택 밸브에 연결하면 여러 흡입구 스트림을 반복적으로 혼합, 측정, 헹굼 및 건조하여 초 단위의 TR-SANS 측정을 용이하게 할 수 있습니다.

현재 절차에서는 관심 샘플이 식별되고 준비되었다고 가정합니다. 현장 믹싱 설정 및 TR-SANS 데이터 수집 방법에 중점을 둡니다. 중성자 산란 데이터는 NIST 중성자 연구 센터(NCNR)의 VSANS 장비에서 수집되었습니다. 그러나 이 절차는 다른 SANS 기기에도 적용할 수 있어야 합니다. 다른 SANS 장비에서 유사한 프로토콜을 구현하는 데 관심이 있는 독자는 현지 장비 과학자와 상의하여 관심 있는 운동 과정과 가장 관련이 있는 원하는 길이 척도 및 시간 척도에서 중성자 플럭스를 최대화하기 위한 최적의 기기 구성을 결정해야 합니다. 여기에 제시된 데이터는 공간 분해능5의 손실에서 중성자 수를 최대화하기 위해 VSANS에서 높은 플럭스 '백색 빔' 구성을 사용하여 수집되었습니다. 검출기 캐리지는 ≈130 nm에서 ≈13 nm의 길이 스케일에 해당하는 0.005 Å-1 < q < 0.5 Å-1 범위의 산란 벡터(q)를 포함하도록 배치되었습니다. 산란 벡터는 q = 4π/λ sin(θ/2)으로 정의되며, 여기서 λ는 중성자 파장이고 θ는 산란 각도입니다.

TR-SANS 측정에 사용되는 정지 흐름 혼합 장치는 그림 1과 같이 여러 펌프, 헹굼 주사기, 샘플 주사기, 유량 선택기, 비동적 믹서, 샘플 셀 및 혼합 샘플 용기로 구성됩니다. 모든 밀봉된 유체 경로는 주사기, 밸브, 연결 튜브, 다이나믹 믹서 및 샘플 셀을 포함하는 에어컨이 설치된 인클로저 내부에 있습니다. 풀그릴 열전 에어 컨디셔너는 ±1 °C 내의 10 °C에서 50 °C에 범위에 있는 울안 온도를 통제하기 위하여 이용됩니다. 장치의 작동 부분을 표시하기 위해 인클로저 단열재 중 일부가 제거되었습니다. 메인 믹싱 장치 인클로저는 NCNR의 NG3 VSANS 빔 라인의 병진 스테이지에 위치합니다. 인클로저 위치는 중성자 빔의 경로(노란색 점선)에 샘플 셀을 배치하기 위해 변환 단계를 사용하여 조정됩니다.

Figure 1
그림 1: NIST Center for Neutron Research의 VSANS 빔라인에서 정지 흐름 혼합 및 소각 중성자 산란 측정을 결합하기 위한 설정 예. 이 설정에는 4개의 주사기 펌프, 용매 헹굼용 주사기 2개, 시료 주입용 주사기 2개, 펌프 선택 밸브 4개, 믹서 선택 밸브 2개, 다이내믹 믹서, 플로우 스루 석영 셀 및 혼합 시료 용기가 포함되어 있습니다. 입사 중성자는 샘플 셀 내부에 위치한 혼합 샘플에서 산란됩니다. 석영 창과 열전 냉방 장치가 있는 절연 인클로저를 사용하여 샘플과 모든 장비를 일정한 온도로 제어합니다. 노란색 점선은 중성자 빔 경로를 나타냅니다. 스케일 바 = 10cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 1에 표시된 장치는 2개의 샘플 주사기, 2개의 헹굼 주사기 및 1 개의 샘플 셀로 구성됩니다. 프로토콜의 여러 단계에 해당하는 흐름도는 그림 2에 나와 있습니다. 두 개의 서로 다른 샘플의 원하는 부피가 믹서와 샘플 셀에 주입됩니다(그림 2A). 시료 셀이 채워지면 입구 스위치 밸브(ISV)와 출구 스위치 밸브(OSV)가 닫혀 동적 혼합기에서 시료 셀을 분리하고 TR-SANS 데이터 수집 중에 시료가 셀로 역확산되는 것을 방지합니다(그림 2B). 다이나믹 믹서 전에 연결 튜브의 길이는 10cm에서 1m까지 다양하며 혼합 지연 시간에 영향을 미치지 않습니다. 그러나 동적 혼합기와 시료 셀 사이의 튜브 연결은 혼합 지연 시간과 필요한 시료 주입량에 영향을 미칩니다. 내경이 0.04인치(1mm)이고 길이가 100mm인 프리컷 스테인리스강 튜빙은 다이내믹 믹서, 믹서 선택 밸브(MSV1 및 MSV2), ISV 및 OSV를 연결하는 데 사용됩니다. 내경 1mm, 길이 115mm의 불소화 튜브를 사용하여 ISV 및 OSV(또는 동적 혼합기 배출구)를 시료 셀에 연결합니다. 혼합 지연 시간에 영향을 미치는 총 공극 부피에는 혼합기 공극 부피(0.15mL), 혼합기 출구와 시료 셀 주입구 사이의 튜브(0.09mL) 및 시료 셀 부피(0.16mL)가 포함됩니다. 이 예에서 총 공극 부피는 0.4mL입니다. 밸브의 내부 공극 부피는 튜브, 믹서 및 시료 셀 공극 부피에 비해 무시할 수 있습니다. 예를 들어, 사용된 저압 선택 밸브(내경 직경 0.75mm)는 약 4μL의 공극 부피를 포함하는 반면, 고압 선택 밸브 및 스위치 밸브(내경 직경 0.25mm)는 약 0.5μL의 공극 부피를 포함합니다.

TR-SANS 측정이 완료된 후, 시료는 용매와 함께 셀 밖으로 밀려나고, 헹굼 용매는 잔류 시료를 제거하고 시료 셀을 세척하기 위해 셀을 통해 반복적으로 펌핑됩니다(그림 2C). 헹굼 주사기는 펌프 선택기 값을 통해 더 큰 용매 저장소(예: 물 및 에탄올)에 연결되어 측정 실행 사이에 샘플 셀을 세척하는 데 적절한 용매 부피를 사용할 수 있도록 합니다. 용매 공급원, 시료 공급원 및 가연성 액체가 들어 있는 혼합 시료 용기는 가능한 모든 점화원을 제거하기 위해 전기 장비가 없는 별도의 인클로저에 배치됩니다. 또한 증기 잠금 병 뚜껑은 가연성 증기 및 용매 증발을 최소화하는 데 사용됩니다. 마지막으로, 샘플 셀은 질소 가스 스트림으로 건조되어 잔류 헹굼 용매를 제거합니다(그림 2D). 믹서 선택 밸브로의 유입 질소 가스 압력은 질소 가스 실린더에 있는 수동 압력 조절기를 사용하여 약 2bar(0.2MPa, 게이지 압력)로 조절됩니다. 샘플 셀이 충분히 세척되고 건조되면 새로 혼합된 샘플이 다음 측정 주기를 위해 샘플 셀에 주입됩니다( 그림 2A의 흐름도에 설명된 혼합 및 주입 반복).

Figure 2
그림 2: 세척을 위해 샘플 셀 1개, 샘플 혼합 2개, 헹굼 용매 2개를 사용한 예시 흐름도. (A) 샘플 A(파란색)와 샘플 B(빨간색)를 혼합한 다음 혼합된 샘플을 샘플 셀에 흘립니다. (B) 데이터 수집 중에 ISV 및 OSV 스위치 밸브가 닫혀 샘플 셀을 분리하고 데이터 수집 중에 샘플의 역확산을 방지하는 정지 흐름 장치 상태. (C) 데이터 수집 후 샘플 셀을 SS1(녹색)의 헹굼 용매로 헹구는 세척 단계. (D) 시료셀을 질소가스(주황색)로 건조시키는 건조단계. 약어: PSV = 펌프 선택 밸브; MSV = 믹서 선택 밸브; OSV = 출구 스위치 밸브; ISV = 입구 스위치 밸브; SS1 = 용매 공급원 1; SSA = 샘플 소스 A; N2 = 질소 가스 공급원. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3은 혼합 설정이 동일한 스위치 밸브에 연결된 두 개의 개별 샘플 셀로 구성된 약간 다른 버전의 흐름도를 보여줍니다(그림 3A). TR-SANS 데이터가 샘플 셀 1에서 수집되는 동안 샘플 셀 2는 헹구어지고(그림 3B) 건조됩니다(그림 3C). 샘플 셀 1에 대한 데이터 수집이 완료되면 입구 스위치 밸브가 새로 혼합된 샘플을 데이터 수집을 위해 샘플 셀 2로 보냅니다(그림 3D). TR-SANS 데이터가 샘플 셀 2에서 수집되는 동안 샘플 셀 1은 헹구고 건조됩니다(그림 3E). 두 샘플 셀 간의 이러한 교대 병렬 프로세스는 후속 샘플 주입 사이의 시간을 최소화하고 중성자 빔 시간의 사용을 최대화합니다.

Figure 3
그림 3: 세척을 위해 2개의 시료 셀, 2개의 시료 혼합 및 2개의 헹굼 용매를 사용한 예시 흐름도. (A) 샘플 A(파란색)와 샘플 B(빨간색)를 혼합한 다음 혼합된 샘플을 샘플 셀 1에 흘려보냅니다. (B) 샘플 셀 2가 SS1(녹색)의 용매로 헹구는 동안 샘플 셀 1에서 데이터를 수집하는 동안 흐름이 중지된 장치 상태. (C) 샘플 셀 2가 질소 가스(주황색)로 건조되는 동안 샘플 셀 1에서 데이터를 수집하는 동안 흐름이 중지된 장치 상태. (D) 샘플 셀 1의 데이터 수집이 완료되면 새 샘플(보라색)이 즉시 혼합되어 샘플 셀 2로 유입됩니다. (E) 샘플 셀 1이 SS1(녹색)의 용매로 헹구는 동안 샘플 셀 2에서 데이터를 수집하는 동안 흐름이 중지된 장치 상태. 하나의 샘플 셀을 측정하는 동안 다른 샘플 셀은 세척 및 건조됩니다. 정지된 유량 측정 프로세스는 두 개의 시료 셀을 번갈아 가며 진행되어 후속 시료 혼합 주입 사이의 시간을 최소화합니다. 약어: PSV = 펌프 선택 밸브; MSV = 믹서 선택 밸브; OSV = 출구 스위치 밸브; ISV = 입구 스위치 밸브; SS1 = 용매 공급원 1; SSA = 샘플 소스 A; N2 = 질소 가스 공급원. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

펌프와 튜빙 라인을 연결하고, 시스템을 프라이밍하고, 샘플 셀을 헹구고 건조하고, 혼합된 샘플을 주입하기 위한 단계별 프로토콜이 아래에 설명되어 있습니다. 단일 셀 구성은 단순성을 위해 시연되었지만(그림 2), 유연한 모듈식 설정, 프로토콜 및 스크립트를 쉽게 수정하여 더 많은 시린지 펌프, 밸브, 믹서 또는 샘플 셀 구성(예: 그림 3에 표시된 2개 샘플 셀 구성)을 구현할 수 있습니다. 혼합 및 세척 주입 주기 전반에 걸쳐 수집된 대표적인 원시 중성자 계수율 데이터는 그림 4에 나와 있으며, 3가지 다른 온도에서 측정된 지질 교환 역학과 교환된 지질 분율에 해당하는 추출된 정규화된 산란 강도는 각각 그림 5 및 그림 6에 나와 있습니다.

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Protocol

1. 흐름 중지 시스템을 설정하고 시작합니다.

  1. 전원 스위치를 사용하여 모든 펌프 전원 공급 장치와 동적 믹서를 켭니다.
  2. 장치 구성 경로를 입력하고 bus=qmixbus 명령을 사용하여 흐름 정지 시스템 제어 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)에서 모든 펌프 및 밸브를 시작합니다. Bus(), bus.open(), bus.start(), pump=qmixpump. Pump(), pump.enable() 및 valve=ViciMultiposSelector() (온라인 오픈 소스 저장소64에서 사용할 수 있는 예제 시작 코드 참조).
  3. pump.calibrate() 명령을 사용하여 주사기를 부착하기 전에 펌프를 보정합니다.
  4. 밸브가 시작되었는지 확인하고 valve.setPort() 및 valve.getPort() 명령을 사용하여 명령에서 올바른 선택기 포트로 이동합니다.
  5. 명령 pump.set_syringe_param(A, B)를 사용하여 각 펌프에 사용할 주사기 유형을 지정합니다. 여기서 A는 주사기 배럴 내경(mm)이고 B는 주사기 최대 피스톤 스트로크 거리(mm)입니다.
  6. 샘플 주사기를 주사기 펌프에 연결합니다.
    1. 펌프가 보정되었는지 확인한 후 깨끗한 실린지 배럴을 펌프 상단의 연결부(실린지 마운트 헤드)에 나사로 고정합니다.
    2. 유리 주사기를 사용할 때 주사기 피스톤의 과도한 힘으로 인해 유리 주사기가 파손되지 않도록 충전량을 분배하기 전에 주사기 마운트 헤드가 느슨해졌는지 확인하십시오.
    3. 주사기 피스톤을 펌프 바닥의 연결부(주사기 장착 꼬리)에 나사로 고정합니다.
    4. 주사기 배럴과 주사기 피스톤을 펌프에 연결한 후 주사기 피스톤을 주사기 배럴의 상단으로 이동시키는 pump.empty() 명령을 사용하여 주사기 유형의 채우기 부피를 분배합니다.
    5. 유리 주사기를 사용할 때는 피스톤 움직임이 멈춘 후 주사기 마운트 헤드를 조입니다.
  7. 튜브를 시료 및 용매 공급원, 주사기, 밸브, 믹서, 시료 셀 및 혼합 시료 용기에 연결합니다.
    1. 주사기 펌프 튜브를 펌프 선택 밸브에 연결합니다.
    2. 펌프 선택 밸브 튜브를 샘플 소스에 연결합니다.
    3. 펌프 선택기 밸브 튜브를 헹굼 용매 공급원에 연결합니다.
    4. 펌프 선택 밸브 튜브를 믹서 선택 밸브 튜브에 연결합니다.
    5. 믹서 선택 밸브 튜브를 질소 가스 공급원에 연결합니다.
    6. 믹서 선택 밸브 튜브를 믹서 입구에 연결합니다.
    7. 믹서 배출구를 입구 스위치 밸브에 연결합니다.
    8. 입구 스위치 밸브를 샘플 셀 입구에 연결합니다.
    9. 연결 sample 셀 출구를 출구 스위치 밸브에 연결합니다.
    10. 출구 스위치 밸브를 혼합 샘플 용기에 연결합니다.
  8. 각 밸브에 대한 해당 포트 번호 연결을 입력하여 정지 흐름 시스템 제어 GUI에서 만들어진 모든 튜빙 및 밸브 연결(단계1.7)을 정의하십시오(온라인 오픈 소스 저장소(64)의 예제 제어 코드 참조).
  9. 믹서 입구와 샘플 셀 출구 사이의 튜브의 공극 부피를 계산하여 각 측정을 위해 샘플 셀을 채우는 데 필요한 샘플의 최소량을 정의합니다.

2. 샘플을 로드합니다.

  1. 원하는 숫자를 입력하여 정지 흐름 시스템 제어 GUI에서 원하는 샘플 충전 부피 및 용매 충전 부피를 설정합니다(온라인 오픈 소스 리포지토리64의 예제 제어 코드 참조).
  2. pump.aspirate() 명령을 사용하여 원하는 샘플 및 용매 볼륨을 소스에서 펌프 선택기 밸브를 통해 샘플 주사기로 끌어들입니다(흡인).
    알림: 빈 주사기를 처음 로드할 때 3단계에서 샘플과 용매로 시스템을 프라이밍하기 위해 퍼지해야 하는 주사기 상단에 공기가 존재합니다.

3. 시스템을 프라이밍합니다.

  1. pump.dispense() 명령을 사용하여 주사기, 튜빙 라인 및 밸브에서 모든 공기를 밀어냅니다(디스펜스). 주사기, 튜브 및 밸브에서 모든 공기를 완전히 제거할 수 있도록 각 주사기에서 충분한 양의 액체가 분배되었는지 확인하십시오. 튜브 내부에 기포가 보이면 기포가 제거될 때까지 용매 또는 샘플을 계속 분배합니다.
  2. 시스템에서 공기가 제거되면 하나 이상의 샘플 주입 및 헹굼 절차를 수행합니다(중성자 산란 데이터를 수집하지 않음).
    1. 제어 GUI에서 혼합 실험 시작 이라는 셀을 클릭하여 선택합니다.
    2. 이 셀을 선택한 상태에서 제어 GUI의 맨 위에 있는 실행 버튼(오른쪽 삼각형)을 클릭하거나 키보드에서 Shift 키와 Enter 키를 함께 누릅니다.
    3. 샘플 셀을 육안으로 검사하여 기포가 없는지 확인합니다.
      1. 기포가 있는 경우 프로토콜 단계 3.1 및 3.2를 반복하여 튜브 라인에서 공기를 추가로 제거합니다.
      2. 샘플 셀에 기포가 없는 경우 4단계로 진행하여 나머지 실험 프로토콜 단계를 정의합니다.

4. 프로그램 스크립트에서 정지 된 흐름 혼합 프로토콜을 정의하십시오 (온라인 오픈 소스 저장소64의 코드 예제 참조).

  1. 흐름 정지 장치를 둘러싼 절연 인클로저의 온도를 제어하는 프로그래밍 가능한 에어컨(AC) 장치의 온도 설정값을 입력합니다.
    1. AC 제어 장치의 별 버튼을 누른 상태에서 위쪽 및 아래쪽 화살표를 눌러 설정 온도를 변경합니다. 또는 제어 GUI에 원하는 온도 설정값을 입력하고 실행을 클릭합니다.
    2. 동역학 실험을 시작하기 전에 인클로저 내부가 원하는 온도에서 평형을 이룰 수 있도록 15-30분 동안 기다리십시오.
      알림: 접근 가능한 온도 범위는 현재 10°C에서 50°C 사이이며 온도 안정성은 ± 1°C입니다.
  2. 제어 GUI에 적절한 부피, 유속, 시간 및 반복 횟수를 입력하여 모든 헹굼 순서를 입력합니다.
    1. 주입할 각 샘플의 부피를 정의하여 총 유량(Q)을 정의합니다.
    2. 헹굼 절차 중에 주입 할 각 용매의 부피를 정의하십시오.
    3. 각 헹굼 하위 단계(tdry) 사이의 건조 시간을 정의합니다.
    4. 헹굼 하위 단계의 수를 정의합니다.
    5. 후속 헹굼 단계를 위해 다른 용매를 정의합니다.
    6. 각 측정 후 수행할 헹굼 반복 횟수를 정의합니다(n 헹굼).
    7. 샘플 셀과 믹서를 완전히 건조하는 시간을 정의하여 후속 샘플 주입을 위한 깨끗한 샘플 셀을 제공합니다(tdry_final).
  3. 모든 시료 주입 시퀀스 단계를 적절한 부피, 유량 및 시간을 중지된 흐름 시스템 제어 GUI에 입력하여 정의합니다.
    1. 주입할 각 샘플의 부피와 유속을 정의합니다.
    2. 공극 부피(V void)와 총 유량(t 지연 = Vvoid/Q)에서 지연 시간(t지연)을 계산합니다.
      알림: 지연 시간은 s를 채우는 데 필요한 시간입니다.amp혼합된 s로 셀 셀amp르.
    3. TR-SANS 데이터에 대해 원하는 획득 시간을 정의하여 관심 있는 전체 운동 프로세스가 발생하도록 합니다(tscatt).
    4. 산란 실험의 끝과 헹굼 주기의 시작 사이의 대기 시간을 설정합니다(twait).
      알림: 이 대기 시간은 s의 경우 최소 100초여야 합니다.amp셀에서 헹구기 전에 중성자 투과율을 측정해야 합니다. 데이터를 절대 강도로 줄이기 위해 데이터 처리 중에 샘플 전송이 필요합니다.
    5. 4.2단계(n 주기)에 정의된 각 주입 사이에 실행되는 헹굼 시퀀스로 수행할 주입주기 수를 정의합니다.
  4. 방정식 (1)을 사용하여 단일 정지 흐름 데이터 수집 주기(t주기)의 총 시간을 계산합니다.
    T사이클 = N헹굼 × (T지연 + T건조) + Tdry_final + T지연 + T스캣 (1)
    여기서 n 헹굼 = 헹굼 반복 횟수 (단계 4.2.6); tdelay = 정지된 유동 장치의 지연 시간 (단계 4.3.2); t 건조 = 각 헹굼 서브 단계 사이의건조 시간 (단계 4.2.3); tdry_final = 셀 및 혼합기 샘플을 완전히 건조시키는 시간 (단계 4.2.7); tscatt = 원하는 TR-SANS 데이터 획득 시간 (단계 4.3.3)

5. SANS 기기 제어 GUI에서 소각 중성자 산란 파라미터를 정의합니다.

  1. 각 표본에 대한 길이 척도와 관심 있는 q-범위를 결정합니다.
  2. 원하는 q-range of interest를 커버하는 동시에 샘플에서 중성자 플럭스를 최대화하도록 기기 구성을 정의합니다.
  3. SANS 계측기 제어 GUI에서 총 VSANS 데이터 수집 시간을 4.4단계에서 계산된 사이클 시간으로 설정합니다(중성자 산란 데이터 수집 시간 = t사이클).
  4. SANS 기기 제어 GUI에서 샘플 전송 측정 시간을 100초로 설정합니다.
  5. SANS 계측기 제어 GUI를 사용하여 명령줄에 GenerateEventModeData true 를 입력하여 이벤트 모드 데이터 수집을 켭니다.

6. TR-SANS 데이터를 처리하기 위해 흐름 중지 실험을 시작하기 전에 데이터 감소를 위한 표준 산란 측정값을 수집합니다.

  1. 배경 산란을 측정합니다.
    1. 로컬 계기판 셔터가 닫혀 있는지 확인하십시오.
    2. 차단된 빔 샘플을 샘플 조리개 뒤쪽에 부착하고, 로컬 기기 환경을 보호하고, 로컬 기기 셔터를 엽니다.
    3. 소프트웨어에서 차단된 빔 산란 데이터 수집 시간을 정의하고, 차단된 빔 산란 데이터를 수집하여 가장 긴 산란 데이터 수집 시간(tscatt)과 동일한 기간 동안 계산합니다.
    4. 데이터 수집이 완료되면 기기 셔터를 닫고 샘플 조리개에서 차단된 빔 샘플을 제거합니다.
  2. 빈 세포 산란을 측정합니다.
    1. 샘플 셀이 완전히 헹구고 건조되었는지 확인하십시오.
    2. 로컬 측량기 셔터를 엽니다.
    3. 100초 동안 빈 셀 전송 측정값을 수집합니다.
    4. 빈 세포 산란 측정값을 수집하고, 적어도 가장 긴 획득 시간(tscatt)을 계수합니다.

7. 흐름 중지 실험을 시작합니다.

  1. 이벤트 모드에서 VSANS 산란 데이터 수집을 시작합니다.
    1. 로컬 계기 영역이 안전한지 확인한 다음 로컬 계기 빔 셔터를 엽니다.
    2. 원하는 실행을 기기 대기열로 끌어다 놓아 기기 컴퓨터의 SANS 기기 제어 소프트웨어를 사용하여 SANS 데이터 수집을 시작합니다.
      알림: 가장 빠른 시점을 측정하려면 흐름 중지 혼합 실험을 시작하기 전에 데이터 수집을 시작하십시오. 데이터는 지연 시간(tdelay)을 설명하기 위해 이후 단계에서 사후 처리됩니다.
  2. 제어 GUI에서 중지된 흐름 혼합 실험을 시작합니다.
    1. 흐름 중지 시스템 제어 GUI에서 혼합 실험 시작 이라는 레이블이 지정된 Notebook 셀을 선택합니다.
    2. 이 셀을 능동적으로 선택한 상태에서 흐름 중지 장치 제어 프로그램의 맨 위에 있는 실행 버튼(오른쪽 삼각형)을 클릭하거나 키보드에서 Shift 키와 Enter 키를 함께 누릅니다.
    3. 섹션 4에 정의된 정지 흐름 혼합 프로토콜이 작동하기 시작했는지 확인합니다.
    4. SANS 계측기 제어 GUI를 사용하여 산란 실행 후 VSANS 계측기 대기열에 100초 전송 측정값을 추가합니다.
    5. SANS 기기 제어 GUI에서 남은 각 정지 흐름 혼합 주기(n주기 - 1, 단계 4.3.5)에 대해 하나의 산란 측정 실행과 하나의 전송 측정 실행을 기기 대기열에 추가합니다.

8. 데이터를 처리하고 줄여 모든 배경을 제거하고, 검출기 감도를 수정하고, 샘플 전송을 수정합니다.

  1. 서버에서 산란 데이터 파일 및 관련 이벤트 파일을 다운로드합니다.
    참고: 각 VSANS 측정 후 각 활성 감지기 캐리지(예: 전면, 중간 및/또는 후면 감지기)에 대해 하나의 이벤트 파일인 별도의 감지기 이벤트 파일이 생성됩니다.
  2. 입력 파일 이름이 원하는 SANS 데이터 파일의 이름에 해당하고 timebins는 초 단위로 원하는 시간 빈 경계 목록인 명령 events=Rebin(filename)과 명령 events.do_rebinning(timebins)를 사용하여 산란 데이터를 원하는 시간 빈에 Bin 합니다 .
    참고: 입력 타임빈이 목록 대신 단일 숫자로 입력되면 데이터는 동일한 시간 너비를 가진 N개의 빈으로 비닝되며, 여기서 N은 입력 타임빈 입니다(빔라인에서 제공하는 소프트웨어 스크립트 및 사용 가능한 온라인 오픈 소스 리포지토리64 참조).
  3. 빔라인(65)에 제공된 소프트웨어를 사용하여 빈화된 산란 데이터를 감소시킨다.

9. TR-SANS 데이터를 분석합니다.

  1. 식 (2)를 사용하여 측정 시간으로부터 관심 있는 공정 시간(t공정)을 계산한다.
    t프로세스 = ti - tstop + t지연 (2)
    여기서, ti는 흐름이 정지된 후에 시작되는 측정 시간인 빈이고,tstop 은 흐름이 정지된 직후의 측정 시간이며,tdelay 는 지연 시간이다.
  2. 8.2단계에서 정의된 시간 빈과 9.1단계에서 계산된 t프로세스를 사용하여 q-종속 강도 I(q)를 공정 시간의 함수로 플로팅합니다.
    참고: 가장 빠른 액세스 가능한 프로세스 시간은 t지연에 의해 제한됩니다. 초기 공정 시점을 측정하려면 총 유량(Q)을 늘리거나 총 공극 부피(V공극)를 줄입니다.
  3. I(q)의 변화에서 관심 있는 운동 파라미터를 공정 시간의 함수로 추출합니다.

10. 실험을 종료합니다.

  1. 로컬 계기 셔터를 닫아 중성자 빔을 끕니다.
  2. 부품, 튜브를 분리하거나 샘플 또는 혼합 샘플 용기를 내리기 전에 빔라인에서 제공하는 방사선 모니터를 사용하여 방사선 검사를 수행합니다.
  3. 주사기, 튜브 및 혼합 샘플 용기를 건강 물리학 부서로 옮깁니다.
  4. 건강 물리학 양식을 작성하고 건강 물리학 담당자의 평가를 기다립니다.

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Representative Results

여기에 표시된 대표적인 중성자 데이터는 교환률(ke)66,67로 소포 사이의 지질 교환을 촉매하는 첨가제인 메틸-β-시클로덱스트린(mβCD)의 존재 하에서 지질 교환 동역학을 측정합니다. 이전의 형광연구는 ke가 mβCD 농도에 의존하고, 교환 과정의 반감기가68분 정도라는 것을 보여주었다. 본 실험은 정지 흐름 TR-SANS를 사용하여 초 시간 척도에서 소포 간의 mβCD 촉매 지질 교환을 측정합니다. 2개의 동위원소적으로 구별되는 지질 소포 집단이 준비되었습니다. 한 소포 집단은 꼬리 수소화 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC) 지질(그림 5의 H-지질 소포)로 준비되었고, 다른 소포 집단은 꼬리 중수소화 DMPC(DMPC-d54) 지질(그림 5의 D-지질 소포)로 준비되었습니다. 0.05(5몰%)의 몰분율로 하전된 디미리조틸포스파티딜글리에르콜(DMPG) 지질을 DMPC 및 DMPC-d54 건조 지질 분말 모두에 첨가하여 단층형 소포 형성을 촉진하였다69.

분리된 H-vesicle과 D-vesicle 용액은 45 부피% 중수(D2O)와 55 부피%의 물(H2O)을 포함하는 용매에서 각각의 지질 필름을 수화하여제조하였다. D2O/H2O용매 조성은 용매의 중성자 산란 길이 밀도(ρ)가 H-지질 및 D-지질의 무작위 혼합물과 일치하도록 계산하였다(Δρ = ρ지질-ρ용매 = 0). 즉, 무작위로 혼합된 H/D-소포는 중성자에 '보이지 않게' 되고 제로 간섭성 중성자 산란을 생성합니다. Unilamellar 소포 용액은 용액을 5회 동결-해동한 다음 직경 100nm 기공을 갖는 폴리카보네이트 필터를 통해 개별 용액을 압출하여 제조되었습니다. 소포 용액을 30°C에서 총 31회 동안 2개의 주사기와 필터 사이에서 앞뒤로 압출하였다. 이어서, 동일한 D2O/H2O용매 혼합물에서 제조된 소량의 농축된 mβCD 원액을 소포 용액에 첨가하였다. 최종 지질 농도는 14mmol/L(mM)이고 mβCD 농도는 30mM이었다. 개별 소포 용액은 용액이 정지 흐름 혼합 장치의 샘플 주사기에 로드되기 전에 추가된 mβCD로 최소 30분 동안 평형화되었습니다.

다중 주입 사이클에 걸쳐 측정된 중성자 계수율의 예가 그림 4A에 나와 있습니다. 각 사이클은 9개의 헹굼 단계, 1개의 건조 단계 및 1개의 샘플 주입 단계로 구성되었습니다. 명확성을 위해 VSANS 장비의 중간 검출기 캐리지에서 측정된 계수율만 표시됩니다. 전방 검출기 캐리지에서도 유사한 경향이 발견되었으며, 이는 더 큰 산란 각도 또는 더 높은 q 값에서 수집된 데이터에 해당합니다. 계수율은 각 헹굼 용매 주입(용매 S1 및 용매 S2)으로 급증하고 용매가 질소 가스로 셀 밖으로 밀려나고 건조될 때 빈 셀 기준선 계수로 돌아갔습니다. 최종 세포 헹굼은 S2(이 예에서는 에탄올)로 이루어졌으며, 셀은 샘플 주입 전에 3분 동안 질소 가스로 최종 건조되었습니다. 샘플을 세포에 주입한 직후 중성자 계수율이 급증하고 데이터를 5분 동안 지속적으로 수집했습니다. 도 4A 의 예시 데이터에서 주입된 대표적인 샘플은 염 완충액 배경이었다. 시간 경과에 따른 측정된 강도의 변동은 배경 중성자 계수율의 변화를 반영하며 평균 샘플 구성의 변화를 반영하지 않습니다. 샘플 헹굼, 건조, 혼합 및 주입의 전체 사이클은 도 4A의 예에서 추가 시간 반복되었고, 여기서 각 사이클은 총 15분 동안 지속되었다.

개별적인 H-표지된 지질 소포 용액을 t-시간 혼합에서혼합하고 즉시 샘플 세포로 흘렀다. 측정된 중성자 계수율은 도 4B에 도시된 바와 같이, 샘플 셀이 t충전에서 채워졌을 때 급증한 다음 최대값에 도달하였다. 샘플 셀을 채우는 데 필요한 경과 시간을 지연 시간 t 지연이라고 하며 t지연 = t채우기-t 혼합으로 제공됩니다. 혼합기와 샘플 셀 사이의 공극 부피(V void)가 알려져 있고 총 유량(Q)이 알려진 경우, t 지연은 또한 t지연 = V void/Q로 계산될 수 있으며(프로토콜 단계 4.3.2 참조), 이는 또한 액체 샘플이 믹서에 들어가고 샘플 셀을 떠나는 평균 체류 시간이다. t 충전에 도달한 후, 유동은 일정한 유속으로 계속되어 셀이충전되고 정상 상태에 도달하는 것을 보장하였다. 이어서, 흐름은 t 정지에서 즉시정지되었다. 평균 중성자 계수율은 샘플 셀을 통과하는 유속이 일정했기 때문에 t충전과 t정지 사이의 측정 시간의 함수로서 일정하게 유지되었고, 따라서 중성자 빔 경로 내의 샘플은 정상 상태에 있었다. 즉, tstop에서 측정된 데이터는 tdelay = tfill-t mix = Vvoid/Q에 의해 혼합 및 진화된 샘플에 해당합니다. t정지 직후에 수집된 빈화된 측정 시간 ti는 관심의 주요 동역학 데이터입니다.

도 4C에서, 3개의 상이한 온도에서 혼합된 지질 소포 샘플로부터의 중성자 계수는 정정된 공정 시간 척도(t 공정)의 함수로서 플롯되며, 이는 정상 상태 유동 기간 및 지연 시간 동안 보정된 관심 있는공정 시간이다. 공정 시간 척도는 t 프로세스 = t i- t stop + t지연, 또는 동등하게, t프로세스 = t i-t stop + t fill-t 혼합에 의해 계산되었다. SANS 데이터는 소위 이벤트 모드에서 그림 4에서 지속적으로 수집되었습니다. 이벤트 모드 데이터 수집 중에 감지된 각 중성자 이벤트는 고유한 타임스탬프와 2차원 중성자 검출기 상의 x 및 y 위치와 함께 기록됩니다. 그 후, 이벤트 모드 데이터는 도 4B에서 원하는 시간 빈들(ti)로 후처리된다.

관심있는 액세스 가능한 프로세스 시간 윈도우 내의 이벤트 모드 데이터(즉, 도 4B에서 t정지 후 각 ti에서 수집된 중성자 산란)는 온라인 오픈 소스 저장소(64)에서 이용가능한 프로토콜 및 스크립트를 사용하여 그 시간 빈에 대한 2차원(2D) 검출기 이미지로 재구성되었다. 이어서, 각각의 2D 검출기 이미지는 데이터 감소 루틴을 사용하여 처리되어 상이한 배경 소스를 빼고, 샘플 전송 및 검출기 효율을 보정하고, 2D 검출기 데이터를 강도(I) 대 산란 벡터(q) 플롯(65)에 방위각적으로 통합한다. 그림 5의 데이터는 동일한(3초) 시간 빈으로 비닝되었으며 TR-SANS 측정에서 얻을 수 있는 시간 및 길이 척도 종속 정보를 나타냅니다. 그림 4B에 표시된 총 원시 계수율과 유사하게, q-의존적 강도 I(q)는 외부 소엽의 지질이 서로 다른 소포 사이에서 교환되고 무작위로 혼합됨에 따라 시간이 지남에 따라 감소합니다.

데이터는 3가지 다른 온도에서 측정된 지질 교환 동역학에 대해 그림 5 에 제시되어 있습니다. 각 플롯은 혼합 후 처음 110분 동안 수집된 데이터를 보여줍니다. 측정된 강도는 지질 유체 상에 해당하는 36°C 및 30°C에서 가장 낮은 q-값에서 한 자릿수만큼 감소합니다. 한편, 산란 강도 데이터는 20°C에서 시간에 따라 상당히 느리게 변화하며, 이는 외부 소엽 교환 동역학이 지질 겔 상에서 훨씬 더 느리다는 것을 나타낸다.

측정된 산란 강도 I(q)는 다음과 같이 Equation 1SLD 대비와 관련이 있으며, 여기서 Δρ는 소포와 주변 용매 간의 SLD 차이입니다. 이 평균 SLD 대비는 주어진 시간에 소포에 있는 H-지질 및 D-지질의 상대적 수와 직접적인 관련이 있습니다. 이와 같이, 주어진 시간에 측정된 산란 강도는 교환된 지질 집단의 비율을 결정하기 위해 정규화될 수 있다. 이 정규화는 (1) 소포 사이에 지질 교환이 없을 때 시간 t = 0에서 측정된 강도 I(0) 및 (2) 모든 지질이 교환되고 집단이 평형을 이루었을 때 시간 t = ∞에서 측정된 강도 I(∞)를 포함하여 두 가지 추가 측정값을 수집하여 달성됩니다. 정규화된 계수율(Equation 242)은 그림 6에서 다양한 온도에 대한 공정 시간의 함수로 표시됩니다. 이 예에서 I(t)는 공정 시간 t에서의 q-적분 강도(q의 함수로서 적분된 배경 빼기 강도)이고, I(∞)는 모든 지질이 교환된 후 무한 시간에서의 q-적분 강도(용매 배경 산란과 유사해야 함)이고, I(0)은 q-적분입니다 시간 t = 0에서의 강도(지질 교환 없음). I(0)은 교환이 느린 20°C에서 상전이 온도 이하의 혼합 샘플에 대해 측정되었고, I(∞)는 40°C에서 36시간 이상 평형을 이루고 H-지질과 D-지질을 완전히 교환한 별도의 샘플에서 측정되었습니다.

정규화된 계수율은 공정 시간 t = 0에서 R(t) = 1에서 t = ∞에서 R(t) = 0으로 감소해야 하며, 이는 샘플의 SLD 대비와 직접적인 관련이 있으므로 지질 교환 범위 27,28,29,30,31,32,33,34,35 . 가장 초기에 측정된 R(t) 데이터는 30°C 및 36°C에서 R(t)=1에서 시작하지 않으며, 이는 혼합 후 처음 3초 동안 상당한 양의 지질 교환이 발생했음을 나타내며, 이는 사용된 정지 흐름 혼합 프로토콜의 지연 시간(t지연 = 2.4초)으로 인해 실험적으로 액세스할 수 없었습니다. 한편, 20°C에서 측정된 R(t)는 처음 (2-3) 분 동안 거의 일정하게 유지되었습니다. 30°C 및 36°C에서 측정된 지질 교환 동역학의 경우, R(t)는 100초 이내에 ≈0.5로 급격히 감소했으며, 이는 외부 소엽 지질이 몇 분 이내에 완전히 교환되고 평형화되었음을 시사합니다. 따라서, mβCD-촉매 지질 교환을 포획하는 것은 정지된 흐름 SANS를 사용하여 가능했으며 수동 피펫 혼합으로는 포획하기 어려웠습니다. 더 이른 공정 시점(t < 3초)을 캡처하려면 지연 시간을 줄이기 위해 더 작은 공극 부피, 더 작은 튜빙 공극 부피 및 더 높은 총 유량을 가진 다른 믹서 유형이 필요합니다.

R(t)는 지질이 내부 및 외부 소엽 사이에서 플립플롭됨에 따라 더 오랜 시간 동안 계속 붕괴되었습니다. 수동 피펫 혼합 방법은 약 5분이 소요되므로, 느린 플립플롭 공정(t > 5분)에 대한 TR-SANS 데이터는 손으로 혼합한 개별 샘플로 수집하여 표준 SANS 샘플 셀에 로드할 수 있습니다. 유사하게, 지질 겔 상에서의 20°C에서의 지질 교환은 이산적으로 혼합 및 측정될 수 있을 만큼 충분히 느렸고, 이 측정은 반드시 정지 유동 혼합 방법으로 연구될 필요가 없었다. 몇 분에서 몇 시간의 시간 척도로 kinetics 공정을 측정하는 것은 수동 피펫 혼합으로 샘플을 혼합할 때 더 효율적입니다. 그러나 몇 분 미만의 시간 규모의 운동 프로세스에는 이러한 정지 흐름 혼합 및 TR-SANS 측정 절차가 필요합니다.

Figure 4
그림 4: 혼합 및 세척 주입 주기 전반에 걸쳐 수집된 대표적인 원시 중성자 계수율 데이터. (A) 중성자 계수율(중간 검출기)의 예는 여러 사이클에 걸쳐 반복되는 헹굼 시퀀스, 건조 시퀀스 및 혼합된 샘플 주입 시퀀스 동안 시간의 함수입니다. (A)의 샘플은 염 완충액 배경이었고, 시간 경과에 따른 강도의 변화는 샘플의 변화가 아니라 배경 계수율의 변화를 반영합니다. (B) 30°C에서 H-lipid와 D-lipid가 혼합된 소포를 주입한 후 실험 시간의 함수로 정규화된 중성자 계수율을 모니터링합니다. 수직 점선은 혼합 시작 시간(tmix), 충전 시간(tfill), 유동 정지 시간(tstop) 및 시간 비닝 영역(tii)을 나타낸다. tstop 후 카운트 속도의 감소는 소포 사이의 지질 교환으로서 샘플의 대비 손실에 기인합니다. (C) (파란색) 20 °C, (녹색) 30 °C 및 (빨간색) 36 °C에서 실험의 처음 100초 동안 교환 공정 시간의 함수로 정규화된 중성자 계수율을 모니터링합니다. 이벤트 모드 데이터는 1초 단위로 처리됩니다. 약어: S1 = 용매 1; S2 = 용매 2; tmix = 샘플 용액이 혼합되는 실험 시간; t채우기 = 샘플 셀이 채워지는 실험 시간; tstop = 흐름이 정지되는 실험 시간; t 프로세스 = 계산된 관심 있는 운동프로세스 시간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 다양한 온도에서 산란 벡터(q)의 함수로서 지질 소포 외부 층의 촉매 교환 및 산란 강도(I)의 해당 변화를 보여줍니다. (A) t = 0에서의 초기 혼합 및 (B) 메틸-β-시클로덱스트린(mβCD)에 의해 촉매된 외층의 교환 후 H-지질과 D-지질 소포 사이의 지질 교환을 보여주는 개략도. 산란 파동 벡터 q의 함수로서 감소된 중성자 산란 강도. 정지 유동 혼합 실험 및 VSANS 측정은 (C) 36°C, (D) 30°C, 및 (E) 20°C에서 반복되었습니다. 제시된 데이터는 각 지정된 온도에서 혼합한 후 처음 10분 동안 3초 간격으로 비닝되었습니다. 오차 막대는 계수 통계량에서 전파된 불확실성이며 하나의 표준 편차를 나타냅니다. 약어: ke = 소포간 지질 교환을 위한 속도 상수; mβCD = 메틸-β-시클로덱스트린; KF = 지질 플립플롭으로도 지칭되는 전단 간 지질 교환을 위한 속도 상수; l(q) = cm-1 단위로 측정된 SANS 강도 ; q = 산란 벡터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 교환된 지질의 분율에 해당하는 정규화된 산란 강도로, 관심 있는 운동 과정에 대한 속도 상수를 추출하기 위해 모델링할 수 있습니다. (A) (파란색) 20°C, (검은색) 30°C 및 (빨간색) 36°C에서 측정된 3초에서 600초 사이의 시간 척도에서 발생하는 소포의 외부 소엽 사이의 지질 교환. 그림의 삽입물은 운동 과정의 처음 60초를 확대합니다. 오차 막대는 산란 강도의 수치 적분에서 전파된 불확도이며 하나의 표준 편차를 나타냅니다. 약어: R(t) = 정규화된 산란 강도; t 프로세스 = 관심 있는 수정된프로세스 시간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

현재 절차에서는 혼합 장치 및 정지 흐름 TR-SANS 측정을 수행하는 단계에 대해 설명합니다. 이 장치 및 프로토콜은 관심 시간 척도가 ≈1초에서 5분인 저점도 액체 샘플에 최적화되어 있습니다. 5분 이상의 시간 척도의 경우, 특히 고점도 샘플, 젤 또는 페이스트의 경우 샘플을 수동으로 혼합하고 표준 산란 셀에 로드하는 것이 더 쉽고 바람직할 수 있습니다. 1초 미만의 시간 척도에 액세스하려면 지연 시간을 낮추기 위해 다른 혼합 장치, 더 낮은 총 공극 부피 및 더 높은 총 유량이 필요합니다. 또한 이러한 짧은 시간 척도에서 동역학 과정을 연구하려면 TR-SANS를 사용하여 밀리초 시간 척도에서 충분한 산란 계수 통계를 축적하기 위해 반복적인 샘플 주입이 필요할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 총 샘플 부피가 제한되는 경우, 광 또는 X선 산란과 함께 충분한 산란 대비가 존재한다고 가정할 때, 주입당 더 적은 샘플 주입 또는 더 적은 샘플 부피를 필요로 하는 광 산란 또는 X선 산란과 같은 더 높은 플럭스 기술을 사용하는 것이 바람직할 수 있습니다.

이 모듈식 정지 흐름 SANS 접근 방식은 중성자 산란 실험에 최적화된 상업적으로 이용 가능한 정지 흐름 기기와 비교할 때 몇 가지 주요 장점과 단점을 만듭니다. 주요 이점으로는 (1) 중성자 빔 시간의 사용을 극대화하기 위해 헹굼 기간 동안 서로 다른 샘플 셀 간에 TR-SANS 측정을 번갈아 가며, (2) 삼원 샘플 혼합 또는 기타 더 복잡한 샘플 혼합 요구 사항에 맞게 주사기, 주사기 부피 및 믹서 유형을 조정하고, (3) 샘플 셀을 분리하고 더 긴 시간 규모(>10분)에서 역확산을 제거하여 더 긴 측정 기간을 허용합니다. 여기에서 구현되지는 않았지만, 혼합 셀 설계의 모듈성은 또한 SANS, UV-Vis 및 형광 측정치(70)를 결합하는 것과 같은 여러 측정 방법을 사용하여 동시 데이터 수집을 허용할 것이다. 이 모듈식 설정의 두 가지 주요 단점은 (1) 1ms에서 100ms의 지연 시간을 제공할 수 있는 다른 시스템에 비해 상대적으로 더 긴 혼합 지연 시간(1초에서 3초)과 (2) -20°C에서 80°C 이상의 작동 온도에 액세스할 수 있는 다른 사용 가능한 시스템에 비해 작동 온도 범위(10°C에서 50°C)가 더 작다는 것입니다.

현장 혼합 실험을 수행하기 전에 관심 샘플에 대한 예비 SANS 데이터를 수집하는 것은 특히 여기에 제시된 예와 같이 분자 교환 동역학을 모니터링하도록 설계된 실험에서 최상의 TR-SANS 데이터를 수집하는 데 중요합니다. I(0) 및 I(∞)의 정확한 값을 결정하는 것은 원하는 운동 매개변수를 추출하기 위해 모델링된 정규화된 강도 R(t)의 정확한 값을 계산하는 데 중요합니다. I(0)의 값은 별도의 H-소포 및 D-소포 스톡의 측정된 산란 강도로부터 직접 계산할 수 있으며, I(∞)는 H-지질/D-지질의 50/50 혼합물로부터 제조된 별도의 소포 샘플을 준비하여 결정할 수 있습니다. 이러한 제어 샘플의 산란 데이터는 TR-SANS 측정을 위한 최적의 q-범위 및 SANS 기기 구성을 결정하는 데에도 사용할 수 있으며, 이를 통해 신호를 최대화하고 TR-SANS 실험 중에 교환 동역학의 진행을 검증할 수 있습니다. 혼합 후 첫 번째 시점에서 측정된 강도가 계산된 I(0)과 같지 않으면 관심 있는 모든 프로세스를 캡처하기 위해 더 빠른 혼합 시간이 필요할 수 있습니다. 측정된 강도가 I(∞)에 도달하면 교환 과정이 완료되고 다음 주입을 준비하기 위해 셀을 비우고 세척할 수 있습니다.

TR-SANS용 액체 시료를 성공적으로 혼합하려면 모든 주사기, 밸브 및 튜빙 라인에 프라이밍이 되어 있고 공기가 없는지 확인하고 누출을 방지하기 위해 모든 튜빙 연결부를 안전하게 고정하는 것이 중요합니다. 이러한 중요한 단계를 올바르게 수행하지 못하면 혼합 부피가 부정확하거나 절대 산란 강도가 부정확해질 수 있습니다. 예를 들어, 샘플 셀 내에 갇힌 기포는 중성자 빔 경로에서 샘플 부피가 감소하기 때문에 측정된 SANS 강도를 감소시킵니다. 대안적으로, 기포는 공기-액체 계면에서의 빔 굴절로 인해 검출기에서 고강도의 '줄무늬' 또는 '플레어'를 생성할 수 있습니다. 시간 경과에 따라 측정된 산란 강도의 예기치 않은 변화는 샘플 혼합 불량, 밸브 누출, 샘플 셀의 기포 또는 샘플 역확산을 나타낼 수 있습니다.

TR-SANS 실험 중에 각 샘플에 대한 투과 측정값을 수집하는 것은 수집된 데이터를 절대 강도로 줄이는 데 중요합니다. 일부 SANS 장비에서 산란 및 전송 데이터를 동시에 수집할 수 있어 전체 TR-SANS 데이터 수집 프로그래밍이 간소화됩니다. 그러나 이 프로토콜에 사용되는 VSANS 계측기를 포함한 모든 계측기에서 이 작업을 수행할 수 있는 것은 아닙니다. 시료 투과 및 시료 산란 측정에는 서로 다른 기기 구성이 필요했기 때문에 산란 측정이 끝날 때 투과 측정이 수집되었습니다(프로토콜 단계 7.2.4) 시료가 셀에 주입된 후 가장 빠른 시점에 산란 데이터가 측정되도록 했습니다. 투과율은 전체 원소 조성, 샘플 경로 길이 및 중성자 파장에만 의존합니다. 따라서 전체 원소 조성이 시간 분해 실험 내내 일정하게 유지되는 경우 투과율이 변경되어서는 안 됩니다. 동일한 샘플의 반복 실행 간에 전송 값의 큰 차이는 일관되지 않은 혼합 샘플 볼륨, 샘플 셀의 불완전한 충전, 기포 또는 실험 중 밸브 누출 및 샘플 역류로 인한 문제를 나타냅니다.

TR-SANS의 고유한 장점은 측정된 강도가 산란 벡터(q)에 따라 달라지며 나노 스케일에서 공간 변화를 조사하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. TR-SANS는 정지 흐름 혼합 장치와 결합하여 이러한 나노 스케일 변화를 2분에서 분 단위로 조사하여 계면활성제와 지질의 자가 조립 및 교환, 부형제 첨가 시 고분자 및 단백질 응집, 나노 입자 성장 및 붕괴 또는 에멀젼 캡슐화된 제품의 교환에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 정지 흐름 장치는 두 개 이상의 액체 샘플의 혼합을 용이하게 하기 위해 여러 샘플 주사기 펌프 및 주사기로 구성할 수 있습니다. 이러한 유연성 덕분에 관심 동역학에 대한 첨가제를 체계적으로 조사할 수 있습니다. 예를 들어, 농축된 항균 펩타이드 용액의 다른 부피를 H-소포 및 D-소포 용액과 혼합하여 지질 교환 동역학에 대한 펩타이드 농도의 영향을 연구할 수 있습니다45,46. 또한 모든 밀봉된 유체 경로가 시료 주사기, 밸브, 믹서 및 튜브를 포함하는 온도 제어 인클로저에 둘러싸여 있기 때문에 시스템의 온도를 변경하여 관심 있는 운동 프로세스와 관련된 열역학적 파라미터를 추출할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

NG3 VSANS에 대한 액세스는 계약 번호 DMR-2010792에 따라 미국 국립표준기술연구소(National Institute of Standards and Technology)와 국립과학재단(National Science Foundation) 간의 파트너십인 고분해능 중성자 산란 센터(Center for High-Resolution Neutron Scattering)에서 제공했습니다. M.H.L.N은 Mitacs Globalink(캐나다)가 제공한 자금을 인정합니다. 상업용 제품 또는 상호의 식별은 이해를 돕기 위한 것이며 미국 국립표준기술연구소(NIST)의 보증 또는 추천을 의미하지 않습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynamic mixer Analytical Scientific Instruments 462-0150A Magnetically coupled rotor, binary dynamic mixer assembly (ternary type available), 0.15 mL dead volume (larger dead volume available)
Fluoropolymer tubing IDEX Health & Science 1507L PFA Tubing Natural 1/16 inch OD x 0.040 inch ID x 50 ft
Fluoropolymer 1/4-28 flangeless fittings IDEX Health & Science XP-245 PFA flangeless fitting with ferrules, 1/4-28 threading, 1/16 inch OD tubing
Glass syringes Hamilton Company 81660 Hamilton 1000 series syringes, 10 mL (81660), model 1010 C syr, 1/4"-28 thread termination, other volumes available
High-pressure flow selector valves Vici Valco C85X-1570EUTB Vici 10 position selector valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure switch valves Vici Valco C82X-1574EUHB Vici 4 port switch valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure syringes Cetoni A2019000358 3 mL stainless steel syringe, 510 bar max, 21 mL/min flow rate max
Low-pressure flow selector valves Vici Valco C25-3180EUHB Vici 10 position selector valves, max 250 psi liquid, 0.75 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 1/4-28 threaded ports, USB universal actuator
neMESYS high-pressure syringe pumps Cetoni A3921000103 Max force 2600 N
neMESYS mid-pressure syringe pumps Cetoni A3921000131 Max force 1000 N
Power supply Cetoni A3921000127 Base 600, supplies power for up to 4 high pressure pumps
Quartz flow-through sample cell Starna Scientific 3-2.30-Q-1/TC Quartz micro flow cells, 2 mm path length (1 mm available), 2 mm by 2 mm by 30 mm internal dimension
Quartz windows Technical Glass Products NA GE 124 Clear fused quartz ground and polished plates, 11.75 inch by 23.75 inch by 0.375 inch thick
Stainless steel 10-32 coned compression fittings IDEX Health & Science U-321X, U-320X 316 stainless steel ferrule (U-321X) and nut (U-320X) -Valco type, 10-32 coned, for 1/16 inch OD stainless steel tubing
Stainless steel tubing IDEX Health & Science U-102 Stainless Steel Tubing 1/16 inch OD x 0.020 inch ID, 10 cm, various precut lengths available
Syringe pump control software Cetoni T6000000004 QmixElements software for nemesys pumps, QmixSDK software development kit
Thermoelectric air conditioner EIC Solutions AAC-140C-4XT-HC Thermoelectric air conditioner mounted on insulated enclosure to control the pump, valve, mixer, and sample temperature
T-slot railing McMaster-Carr 47065T103 Aluminum t-slotted railing (1.5 inch by 1.5 inch) cut to various lengths
Vapor locking bottle caps  Cole-Parmer EW-12018-02 Four 304 SS port inserts, 1/4"-28 threads, GL45 bottle cap size, PTFE body, SS threads, PP collar

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References

  1. Melnichenko, Y. B., Wignall, G. D. Small-angle neutron scattering in materials science: Recent practical applications. Journal of Applied Physics. 102 (2), 021101 (2007).
  2. Grillo, I. Small-angle neutron scattering and applications in soft condensed matter. Soft Matter Characterization. Borsali, R., Pecora, R. , Springer. Dordrecht. (2008).
  3. Hollamby, M. J. Practical applications of small-angle neutron scattering. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (26), 10566-10579 (2013).
  4. Pipich, V., Fu, Z. KWS-3: Very small angle diffractor with focusing mirror. Journal of large-scale research. 1, 31 (2015).
  5. Kline, S. 2019 NCNR Annual Report, Special Publication (NIST SP). , National Institute of Standards and Technology. Gaithersburg, MD. (2019).
  6. Gilbert, P. H., et al. Preservative induced polysorbate 80 micelle aggregation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 10 (6), 2395-2404 (2021).
  7. Terashima, T., et al. In situ and time-resolved small-angle neutron scattering observation of star polymer formation via arm-linking reaction in ruthenium-catalyzed living radical polymerization. Macromolecules. 43 (19), 8218-8232 (2010).
  8. Hashimoto, K., Fujii, K., Nishi, K., Shibayama, M. Ion gel network formation in an ionic liquid studied by time-resolved small-angle neutron scattering. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (40), 9419-9424 (2018).
  9. Conn, C. E., et al. Membrane protein structures in lipid bilayers; small-Angle neutron scattering with contrast-matched bicontinuous cubic phases. Frontiers in Chemistry. 8, 619470 (2021).
  10. van't Hag, L., et al. Protein-eye view of the in meso crystallization mechanism. Langmuir. 35 (25), 8344-8356 (2019).
  11. Mahieu, E., et al. Observing protein degradation by the PAN-20S proteasome by time-resolved neutron scattering. Biophysical Journal. 119 (2), 375-388 (2020).
  12. Ibrahim, Z., et al. Time-resolved neutron scattering provides new insight into protein substrate processing by a AAA+ unfoldase. Scientific Reports. 7 (1), 40948 (2017).
  13. Hollamby, M. J., et al. Growth of mesoporous silica nanoparticles monitored by time-resolved small-angle neutron scattering. Langmuir. 28 (9), 4425-4433 (2012).
  14. Blin, J. L., Impéror-Clerc, M. Mechanism of self-assembly in the synthesis of silica mesoporous materials: in situ studies by X-ray and neutron scattering. Chemical Society Reviews. 42 (9), 4071-4082 (2013).
  15. Impéror-Clerc, M., Grillo, I., Khodakov, A. Y., Durand, D., Zholobenko, V. L. New insights into the initial steps of the formation of SBA-15 materials: an in situ small angle neutron scattering investigation. Chemical Communications. 8, 834-836 (2007).
  16. Narayanan, T., Rüter, A., Olsson, U. SAXS/WAXS investigation of amyloid-β(16-22) peptide nanotubes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 654349 (2021).
  17. Angelov, B., et al. DNA/Fusogenic lipid nanocarrier assembly: millisecond structural dynamics. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (11), 1959-1964 (2013).
  18. Amann, M., et al. Kinetic pathways for polyelectrolyte coacervate micelle formation revealed by time-resolved synchrotron SAXS. Macromolecules. 52 (21), 8227 (2019).
  19. Varga, Z., Wacha, A., Bóta, A. Osmotic shrinkage of sterically stabilized liposomes as revealed by time-resolved small-angle X-ray scattering. Journal of Applied Crystallography. 47 (1), 35-40 (2014).
  20. Panine, P., Finet, S., Weiss, T. M., Narayanan, T. Probing fast kinetics in complex fluids by combined rapid mixing and small-angle X-ray scattering. Advances in Colloid and Interface Science. 127 (1), 9-18 (2006).
  21. Grillo, I. Applications of stopped-flow in SAXS and SANS. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 14 (6), 402-408 (2009).
  22. Gomez-Hens, A., Perez-Bendito, D. The stopped-flow technique in analytical chemistry. Analytica Chimica Acta. 242, 147-177 (1991).
  23. Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. Use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the ATP turnover cycle of kinesins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52142 (2014).
  24. Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of stopped-flow kinetics methods to investigate the mechanism of action of a DNA repair protein. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1874 (2010).
  25. Raney, K. D., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. A fluorescence-based assay for monitoring helicase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6644-6648 (1994).
  26. Roder, H., Maki, K., Cheng, H. Early events in protein folding explored by rapid mixing methods. Chemical reviews. 106 (5), 1836-1861 (2006).
  27. Milon, A., et al. Osmotic swelling of unilamellar vesicles by the stopped-flow light scattering method. Influence of vesicle size, solute, temperature, cholesterol and three α,ω-dihydroxycarotenoids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 859 (1), 1-9 (1986).
  28. Gast, K., Nöppert, A., Müller-Frohne, M., Zirwer, D., Damaschun, G. Stopped-flow dynamic light scattering as a method to monitor compaction during protein folding. European Biophysics Journal. 25 (3), 211-219 (1997).
  29. Antoun, A., Pavlov, M. Y., Tenson, T., Ehrenberg, M. M. Ribosome formation from subunits studied by stopped-flow and Rayleigh light scattering. Biological Procedures Online. 6, 35-54 (2004).
  30. Zhu, Z., Armes, S. P., Liu, S. pH-Induced micellization kinetics of ABC triblock copolymers measured by stopped-flow light scattering. Macromolecules. 38 (23), 9803-9812 (2005).
  31. Ye, J., et al. Comparative study of temperature-induced association of cyclic and linear poly(N-isopropylacrylamide) chains in dilute solutions by laser light scattering and stopped-flow temperature jump. Macromolecules. 41 (12), 4416-4422 (2008).
  32. Liu, X., et al. Early stage kinetics of polyelectrolyte complex coacervation monitored through stopped-flow light scattering. Soft Matter. 12 (44), 9030-9038 (2016).
  33. Garman, E. F., Weik, M. X-ray radiation damage to biological samples: recent progress. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (4), 907-911 (2019).
  34. Garg, S., Porcar, L., Woodka, A. C., Butler, P. D., Perez-Salas, U. Noninvasive neutron scattering measurements reveal slower cholesterol transport in model lipid membranes. Biophysical Journal. 101 (2), 370-377 (2011).
  35. Marquardt, D., et al. 1H NMR shows slow phospholipid flip-flop in gel and fluid bilayers. Langmuir. 33 (15), 3731-3741 (2017).
  36. Egelhaaf, S. U., Olsson, U., Schurtenberger, P. Time-resolved SANS for surfactant phase transitions. Physica B: Condensed Matter. 276-278, 326-329 (2000).
  37. Tabor, R. F., Eastoe, J., Grillo, I. Time-resolved small-angle neutron scattering as a lamellar phase evolves into a microemulsion. Soft Matter. 5 (10), 2125-2129 (2009).
  38. Gradzielski, M., Bergmeier, M., Hoffmann, H., Müller, M., Grillo, I. Vesicle gel formed by a self-organization process. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (49), 11594-11597 (2000).
  39. Lee, Y. -T., Li, D. S., Pozzo, L. D. Kinetic analysis of ultrasound-induced oil exchange in oil-in-water emulsions through contrast variation time-resolved small-sngle neutron scattering. Langmuir. 35 (47), 15204-15213 (2019).
  40. Lee, Y. -T., Pozzo, L. D. Contrast-variation time-resolved small-angle neutron scattering analysis of oil-exchange kinetics between oil-in-water emulsions stabilized by anionic surfactants. Langmuir. 35 (47), 15192-15203 (2019).
  41. Roger, K., Olsson, U., Schweins, R., Cabane, B. Emulsion ripening through molecular exchange at droplet contacts. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1452-1455 (2015).
  42. Nakano, M., Fukuda, M., Kudo, T., Endo, H., Handa, T. Determination of Interbilayer and Transbilayer Lipid Transfers by Time-Resolved Small-Angle Neutron Scattering. Physical Review Letters. 98 (23), 238101 (2007).
  43. Nakano, M., et al. Flip-flop of phospholipids in vesicles: kinetic analysis with time-resolved small-angle neutron scattering. The Journal of Physical Chemistry B. 113 (19), 6745-6748 (2009).
  44. Nguyen, M. H. L., et al. Methanol accelerates DMPC flip-flop and transfer: A SANS study on lipid dynamics. Biophysical Journal. 116 (5), 755-759 (2019).
  45. Nguyen, M. H. L., et al. Peptide-induced Lipid flip-flop in asymmetric liposomes measured by small angle neutron scattering. Langmuir. 35 (36), 11735-11744 (2019).
  46. Nguyen, M. H. L., et al. Time-resolved SANS reveals pore-forming peptides cause rapid lipid reorganization. New Journal of Chemistry. 45 (1), 447-456 (2021).
  47. Xia, Y., et al. Effects of nanoparticle morphology and acyl chain length on spontaneous lipid transfer rates. Langmuir. 31 (47), 12920-12928 (2015).
  48. Xia, Y., et al. Morphology-induced defects enhance lipid transfer rates. Langmuir. 32 (38), 9757-9764 (2016).
  49. Maric, S., et al. Time-resolved small-angle neutron scattering as a probe for the dynamics of lipid exchange between human lipoproteins and naturally derived membranes. Scientific Reports. 9 (1), 7591 (2019).
  50. Nielsen, J. E., Bjørnestad, V. A., Pipich, V., Jenssen, H., Lund, R. Beyond structural models for the mode of action: How natural antimicrobial peptides affect lipid transport. Journal of Colloid and Interface Science. 582, 793-802 (2021).
  51. Willner, L., Poppe, A., Allgaier, J., Mokenbusch, M., Richter, D. TIme-resolved SANS for the determintioan of unimer exchange kinetics in block copolymer micelles. Europhysics Letters. 55 (5), 667 (2001).
  52. Lund, R., Willner, L., Stellbrink, J., Lindner, P., Richter, D. Logarithmic chain-exchange kinetics of diblock copolymer micelles. Physical Review Letters. 96 (6), 068302 (2006).
  53. Lund, R., Willner, L., Richter, D., Dormidontova, E. E. Equilibrium chain exchange kinetics of diblock copolymer micelles: Tuning and logarithmic relaxation. Macromolecules. 39 (13), 4566-4575 (2006).
  54. Lund, R., Willner, L., Richter, D. Kinetics of block copolymer micelles studied by small-angle scattering methods. in Controlled Polymerization and Polymeric Structures. Advances in Polymer Science. Abe, A., Lee, K. S., Leibler, L., Kobayashi, S. , Springer. Cham. 51 (2013).
  55. Choi, S. -H., Lodge, T. P., Bates, F. S. Mechanism of molecular exchange in diblock copolymer micelles: hypersensitivity to core chain length. Physical Review Letters. 104 (4), 047802 (2010).
  56. Choi, S. -H., Bates, F. S., Lodge, T. P. Molecular exchange in ordered diblock copolymer micelles. Macromolecules. 44 (9), 3594-3604 (2011).
  57. Lu, J., Bates, F. S., Lodge, T. P. Chain exchange in binary copolymer micelles at equilibrium: confirmation of the independent chain hypothesis. ACS Macro Letters. 2 (5), 451-455 (2013).
  58. Lu, J., Bates, F. S., Lodge, T. P. Remarkable effect of molecular architecture on chain exchange in triblock copolymer micelles. Macromolecules. 48 (8), 2667-2676 (2015).
  59. Kelley, E. G., et al. Size evolution of highly amphiphilic macromolecular solution assemblies via a distinct bimodal pathway. Nature Communications. 5 (1), 3599 (2014).
  60. Murphy, R. P., Kelley, E. G., Rogers, S. A., Sullivan, M. O., Epps, T. H. Unlocking chain exchange in highly amphiphilic block polymer micellar systems: influence of agitation. ACS Macro Letters. 3 (11), 1106-1111 (2014).
  61. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50 (6), 2484-2494 (2017).
  62. Lantz, K. A., et al. Cavitation enables switchable and rapid block polymer exchange under high-χN conditions. Macromolecules. 51 (17), 6967-6975 (2018).
  63. Murphy, R. P., et al. Capillary RheoSANS: measuring the rheology and nanostructure of complex fluids at high shear rates. Soft Matter. 16 (27), 6285-6293 (2020).
  64. Stopped Flow Sans. usnistgov. , Available from: https://github.com/usnistgov/stopped-flow-sans (2021).
  65. Kline, S. Reduction and analysis of SANS and USANS data using IGOR Pro. Journal of Applied Crystallography. 39 (6), 895-900 (2006).
  66. Doktorova, M., et al. Preparation of asymmetric phospholipid vesicles for use as cell membrane models. Nature Protocols. 13 (9), 2086-2101 (2018).
  67. Huang, Z., London, E. Effect of cyclodextrin and membrane lipid structure upon cyclodextrin-lipid interaction. Langmuir. 29 (47), 14631-14638 (2013).
  68. Sugiura, T., Ikeda, K., Nakano, M. Kinetic analysis of the methyl-β-cyclodextrin-mediated intervesicular transfer of pyrene-labeled phospholipids. Langmuir. 32 (51), 13697-13705 (2016).
  69. Scott, H. L., et al. On the mechanism of bilayer separation by extrusion, or why your LUVs are not really unilamellar. Biophysical Journal. 117 (8), 1381-1386 (2019).
  70. Dicko, C., et al. NUrF-Optimization of in situ UV-vis and fluorescence and autonomous characterization techniques with small-angle neutron scattering instrumentation. Review of Scientific Instruments. 91 (7), 075111 (2020).

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