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Engineering

Messung der zeitlichen Entwicklung von nanoskaligen Materialien mit gestopptem Fluss und Kleinwinkel-Neutronenstreuung

Published: August 6, 2021 doi: 10.3791/62873
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1, 1
1NIST Center for Neutron Research, National Institute of Standards and Technology, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of Windsor, 3Department of Physics, University of Windsor

Summary

Dieses Protokoll stellt die Verwendung einer Probenumgebung mit gestopptem Durchfluss dar, um während einer Neutronenstreumessung mit kleinem Winkel schnell mehrere flüssige Lösungen in situ zu mischen und kinetische Prozesse auf Nanometer-Längenskalen und Zweitzeitskalen zu untersuchen.

Abstract

In diesem Artikel wird die Verwendung einer SANS-Probenumgebung (Stoped-Flow-Kleinwinkel-Neutronenstreuung) vorgestellt, um flüssige Proben schnell zu mischen und kinetische Prozesse im Nanobereich auf Zeitskalen von Sekunden bis Minuten zu untersuchen. In der Probenumgebung mit gestopptem Durchfluss werden handelsübliche Spritzenpumpen verwendet, um die gewünschten Mengen an flüssigen Proben zu mischen, die dann in ca. 1 s durch einen dynamischen Mischer in eine Quarzglaszelle injiziert werden. Die zeitaufgelöste SANS-Datenerfassung wird mit dem Mischen der Probe synchronisiert, um die Entwicklung der Nanostruktur in Lösung nach dem Mischen zu verfolgen.

Um die Zeit des Neutronenstrahls so effizient wie möglich zu nutzen, verwenden wir eine Reihe von Durchflusswahlventilen, um die Zelle zwischen den Messungen automatisch zu laden, zu spülen und zu trocknen, was eine wiederholte Datenerfassung während mehrerer Probeninjektionen ermöglicht. Die Probeninjektionen werden so lange wiederholt, bis eine ausreichende Neutronenstreustatistik erfasst ist. Der Mischaufbau kann so programmiert werden, dass die Bedingungen systematisch variiert werden, um die Kinetik bei verschiedenen Mischungsverhältnissen, Probenkonzentrationen, Additivkonzentrationen und Temperaturen zu messen. Das minimale Probenvolumen, das pro Injektion benötigt wird, beträgt ca. 150 μl, abhängig von der Weglänge der Quarzzelle.

Repräsentative Ergebnisse unter Verwendung dieser Stoped-Flow-Probenumgebung werden für die Kinetik des schnellen Lipidaustauschs in Gegenwart eines Additivs, Cyclodextrin, präsentiert. Die Vesikel tauschen äußere (äußere) Lipide in der Größenordnung von Sekunden aus und tauschen sowohl innere als auch äußere Lipide innerhalb von Stunden vollständig aus. Die Messung der Lipidaustauschkinetik erfordert In-situ-Mischungen , um die schnelleren (Sekunden) und langsameren (Minuten) Prozesse zu erfassen und die kinetischen Geschwindigkeitskonstanten zu extrahieren. Die gleiche Probenumgebung kann auch verwendet werden, um den molekularen Austausch in anderen Arten von flüssigen Proben wie Lipid-Nanopartikeln, Proteinen, Tensiden, Polymeren, Emulsionen oder anorganischen Nanopartikeln zu untersuchen. Die Messung der nanoskaligen strukturellen Umwandlungen und der Kinetik von austauschenden oder reagierenden Systemen wird neue Einblicke in Prozesse liefern, die sich auf der Nanoskala entwickeln.

Introduction

Die Kleinwinkel-Neutronenstreuung (SANS) bietet eine einzigartige Möglichkeit, die Größe, Form, Wechselwirkung und Organisation verschiedener Materialien auf Längenskalen von ≈1 nm bis ≈100 nm 1,2,3 zu messen. Neuere Instrumente, darunter VSANS-Instrumente (Very Small-Angle Neutron Scattering) mit fokussierenden Spiegeln, verschieben die Grenzen für die Messung noch größerer Längenskalen bis ≈1000 nm 4,5. Im Allgemeinen bietet der einzigartige Streukontrast, der Neutronenstreumethoden innewohnt, mehrere Vorteile bei der Messung der zeitlichen Entwicklung von nanoskaligen Strukturen, wie z.B. der Aggregation von Komponenten in pharmazeutischen Formulierungen6, Vernetzungs- und Gelierungsreaktionen in Polymersystemen 7,8, bei der Mesokristallisation von Membranproteinen9,10, dem Abbau und der Entfaltung von Proteinen11,12 und das Wachstum von Materialien auf Kieselsäurebasis13,14,15. Der einzigartige Streukontrast macht zeitaufgelöste SANS (TR-SANS) zu einer nützlichen Ergänzung zu anderen Stopped-Flow-basierten Messungen.

Stopped-Flow-Mischmethoden werden häufig in der Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS)16,17,18,19,20,21, der Fluoreszenzspektroskopie 22,23,24,25,26 und der Lichtstreuung 27,28,29,30 eingesetzt. 31,32 Experimente zur Untersuchung kinetischer Prozesse auf Millisekunden-Zeitskalen. Ein wichtiger Unterschied zwischen SANS und SAXS besteht darin, dass die Neutronenstreuung eine zerstörungsfreie Charakterisierungstechnik ist und SANS als solche verwendet werden kann, um dieselbe Probe stunden- oder sogar tagelang zu messen, ohne dass ionisierende Strahlung die Probe schädigt, was bei Röntgenstreuexperimenten mit höherem Fluss auftreten kann33. Da wiederholte SANS-Messungen die chemische Struktur des Sondenmoleküls oder der Probe nicht verändern, kann die Zeitentwicklung ohne Effekte von z. B. Photobleichung untersucht werden, die kinetische Messungen erschweren können, die auf Fluoreszenz basieren23,24. Darüber hinaus können mit SANS hochkonzentrierte und optisch undurchsichtige Proben gemessen werden, die mit lichtbasierten Techniken wie dynamischer Lichtstreuung oft nur schwer zu charakterisieren sind.

SANS liefert nicht nur strukturelle Informationen auf der Nanoskala, sondern kann auch verwendet werden, um die lokale Zusammensetzung dieser Strukturen durch die Variation des Längendichtekontrasts der Neutronenstreuung zu untersuchen. Die Streulängendichte (SLD) verschiedener Elemente variiert zufällig über das Periodensystem und variiert mit verschiedenen Isotopen desselben Elements. Ein häufig genutztes Beispiel sind Wasserstoff (1H oder H) und Deuterium (2H oder D), die sehr unterschiedliche Neutronenstreulängen haben. Daher können wasserstoffreiche Materialien wie Tenside, Lipide, Proteine, RNA, DNA und andere Polymere mit SANS von deuterierten Lösungsmitteln unterschieden werden, ohne die physikalischen Eigenschaften des Systems wesentlich zu verändern. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass der H/D-Austausch die Dichte, die Wasserstoffbrückenbindung und die Phasenübergangstemperaturen in der Probe beeinflussen kann. Nichtsdestotrotz ist die einzigartige Empfindlichkeit von SANS gegenüber wasserstoffreichen Materialien besonders nützlich in der Forschung an weicher Materie, wo die interessierenden Proben in röntgenbasierten Techniken wie SAXS einen geringeren Streukontrast und ein geringeres Signal aufweisen. Die Isotopensubstitution macht SANS auch zu einem leistungsstarken Werkzeug für die Untersuchung der molekularen Austauschkinetik in wasserstoffreichen Materialien, indem einfach H-markierte und D-markierte Moleküle gemischt werden. Die Isotopensubstitution ist besonders nützlich in Systemen, in denen voluminöse Fluoreszenzfarbstoffe größer sind als die interessierenden Tensid- oder Lipidmoleküle und die Austauschkinetik beeinflussen können34,35.

Zeitaufgelöste SANS-Messungen sind von Vorteil, da die gemessene Intensität eine Funktion von Zeit, Längenskala und SLD-Kontrast ist. Daher können TR-SANS-Experimente so konzipiert werden, dass sie die zeitabhängigen Änderungen der räumlichen Verteilungen und der Zusammensetzung der Proben untersuchen. Diese einzigartigen Vorteile von SANS haben zu wichtigen Erkenntnissen über kinetische Prozesse in vielen weichen Materialsystemen geführt, wie z.B. Tenside 36,37,38, Emulsionen 39,40,41, Lipide 34,42,43,44,45,46,47,48,49 50 und Polymere 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60,61, 62. Die meisten TR-SANS-Studien haben sich auf Zeitskalen von Minuten bis Stunden konzentriert. Viele kinetische Prozesse, die von Interesse sind, finden jedoch auf der zweiten Zeitskala statt und sind essentiell für das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen. Um diese frühen Zeitpunkte zu erfassen, müssen die Lösungen schnell gemischt und in situ gemessen werden, wobei die Durchmischung mit der Datenerfassung während der gestoppten Lichtstreuung 27,28,29,30,31,32, Fluoreszenz 22,23,24,25,26 und Röntgenstrahlung synchronisiert wird 16,17,18,19,20,21 Experimente. Diese Arbeit beschreibt die Verwendung einer Probenumgebung, die darauf ausgelegt ist, mehrere flüssige Proben schnell zu mischen und die Mischung für TR-SANS-Messungen in eine Quarzglaszelle zu injizieren. Die Mischvorrichtung ist eine Adaption der kürzlich entwickelten KapillarrheoSANS-Vorrichtung63 und verwendet mehrere Spritzenpumpen und Ventile, um die Probenmischung zu steuern und die Zellreinigung zu automatisieren. Durch den Anschluss von Spritzenpumpen an eine Reihe von Durchflusswahlventilen können mehrere Einlassströme wiederholt gemischt, gemessen, gespült und getrocknet werden, um TR-SANS-Messungen auf der Sekunden-Zeitskala zu erleichtern.

Das derzeitige Verfahren geht davon aus, dass die interessierenden Proben identifiziert und aufbereitet wurden. Wir konzentrieren uns auf den in situ Mischaufbau und Methoden zur Erfassung von TR-SANS-Daten. Neutronenstreudaten wurden mit dem VSANS-Instrument am NIST Center for Neutron Research (NCNR) gesammelt; Das Verfahren sollte jedoch auch auf andere SANS-Instrumente anwendbar sein. Leser, die daran interessiert sind, ähnliche Protokolle auf anderen SANS-Instrumenten zu implementieren, sollten sich mit den lokalen Instrumentenwissenschaftlern beraten, um die optimale Instrumentenkonfiguration zu bestimmen, um den Neutronenfluss auf der gewünschten Längenskala und Zeitskala zu maximieren, die für die interessierenden kinetischen Prozesse am relevantesten ist. Die hier vorgestellten Daten wurden unter Verwendung der Hochfluss-"Weißstrahl"-Konfiguration auf VSANS gesammelt, um die Neutronenzahl bei Verlust der räumlichen Auflösungzu maximieren 5. Die Detektorschlitten wurden so positioniert, dass sie einen Bereich von Streuvektoren (q) von 0,005 Å-1 < q < 0,5 Å-1 abdecken, was Längenskalen von ≈130 nm bis ≈13 nm entspricht. Der Streuvektor ist definiert als q = 4π/λ sin (θ/2), wobei λ die Neutronenwellenlänge und θ der Streuwinkel ist.

Das für die TR-SANS-Messungen verwendete Mischgerät mit gestopptem Durchfluss besteht aus mehreren Pumpen, Spülspritzen, Probenspritzen, Durchflussselektoren sowie einem dynamischen Mischer, einer Probenzelle und einem Mischprobenbehälter, wie in Abbildung 1 dargestellt. Alle abgedichteten Flüssigkeitswege befinden sich in einem klimatisierten Gehäuse, das die Spritzen, Ventile, Verbindungsschläuche, den dynamischen Mischer und die Probenzellen umfasst. Ein programmierbares thermoelektrisches Klimagerät wird verwendet, um die Gehäusetemperatur im Bereich von 10 °C bis 50 °C innerhalb von ±1 °C zu regeln. Beachten Sie, dass ein Teil der Gehäuseisolierung entfernt wurde, um die funktionierenden Teile des Geräts zu zeigen. Das Hauptgehäuse des Mischgeräts befindet sich auf einem Translationstisch an der NG3 VSANS-Strahllinie am NCNR. Die Position des Gehäuses wird mit dem Translationstisch eingestellt, um die Probenzelle im Pfad des Neutronenstrahls zu positionieren (gelbe gestrichelte Linie).

Figure 1
Abbildung 1: Ein Beispielaufbau für die Kombination von Stopped-Flow-Mixing und Kleinwinkel-Neutronenstreumessungen an der VSANS-Beamline am NIST Center for Neutron Research. Der Aufbau besteht aus vier Spritzenpumpen, zwei Spritzen zum Spülen von Lösungsmitteln und zwei Spritzen zur Probeninjektion, vier Pumpenwahlventilen, zwei Mischerwahlventilen, einem dynamischen Mischer, einer Durchfluss-Quarzzelle und einem Mischprobenbehälter. Einfallende Neutronen werden an der gemischten Probe gestreut, die sich in der Probenzelle befindet. Ein isoliertes Gehäuse mit Quarzfenstern und einer thermoelektrischen Klimaanlage dient zur Steuerung der Probe und aller Geräte bei konstanter Temperatur. Die gelbe gestrichelte Linie zeigt den Strahlengang der Neutronen. Maßstabsleiste = 10 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Das in Abbildung 1 dargestellte Gerät ist mit zwei Probenspritzen, zwei Spülspritzen und einer Probenzelle konfiguriert. Entsprechende Flussdiagramme für die verschiedenen Schritte des Protokolls sind in Abbildung 2 dargestellt. Die gewünschten Volumina der beiden unterschiedlichen Proben werden in den Mischer und die Probenzelle injiziert (Abbildung 2A). Sobald die Probenzelle gefüllt ist, werden das Einlassschaltventil (ISV) und das Auslassschaltventil (OSV) geschlossen, um die Probenzelle vom dynamischen Mischer zu isolieren und eine Rückdiffusion der Probe in die Zelle während der TR-SANS-Datenerfassung zu verhindern (Abbildung 2B). Vor dem dynamischen Mischer variiert der Verbindungsschlauch in der Länge von 10 cm bis 1 m und hat keinen Einfluss auf die Mischverzögerungszeit. Schlauchverbindungen zwischen dem dynamischen Mischer und der Probenzelle wirken sich jedoch auf die Mischverzögerungszeit und das erforderliche Probeninjektionsvolumen aus. Vorgeschnittene Edelstahlrohre mit einem Innendurchmesser von 1 mm (0,04 Zoll) und einer Länge von 100 mm werden verwendet, um den dynamischen Mischer, die Mischerwahlventile (MSV1 und MSV2) sowie den ISV und OSV zu verbinden. Fluorierte Schläuche mit 1 mm Innendurchmesser und 115 mm Länge werden verwendet, um den ISV und OSV (oder den dynamischen Mischerausgang) mit der Probenzelle zu verbinden. Das gesamte Hohlraumvolumen, das die Mischverzögerungszeit beeinflusst, umfasst das Hohlraumvolumen des Mischers (0,15 ml), den Schlauch zwischen dem Mischerauslass und dem Probenzelleneinlass (0,09 ml) und das Probenzellenvolumen (0,16 ml). In diesem Beispiel beträgt das gesamte Hohlraumvolumen 0,4 ml. Die internen Hohlraumvolumina der Ventile sind im Vergleich zu den Hohlraumvolumina der Schläuche, des Mischers und der Probenzelle vernachlässigbar. So enthalten beispielsweise die eingesetzten Niederdruck-Wahlventile (0,75 mm Bohrungsdurchmesser) ein ungefähres Hohlraumvolumen von 4 μl, während die Hochdruck-Wahlventile und Umschaltventile (0,25 mm Bohrungsdurchmesser) ein ungefähres Hohlraumvolumen von 0,5 μl aufweisen.

Nach Abschluss der TR-SANS-Messung wird die Probe mit Lösungsmittel aus der Zelle gedrückt und wiederholt Spüllösungsmittel durch die Zelle gepumpt, um die Restprobe zu entfernen und die Probenzelle zu reinigen (Abbildung 2C). Beachten Sie, dass die Spülspritzen über Pumpenwahlwerte mit größeren Lösungsmittelbehältern (z. B. Wasser und Ethanol) verbunden sind, um sicherzustellen, dass zwischen den Messläufen ausreichende Lösungsmittelmengen zur Reinigung der Probenzelle zur Verfügung stehen. Lösungsmittelquellen, Probenquellen und gemischte Probenbehälter, die brennbare Flüssigkeiten enthalten, werden in einem separaten Gehäuse ohne elektrische Ausrüstung positioniert, um alle möglichen Zündquellen auszuschließen. Darüber hinaus werden dampfverschließende Flaschenverschlüsse verwendet, um brennbare Dämpfe und die Verdunstung von Lösungsmitteln zu minimieren. Schließlich wird die Probenzelle mit einem Stickstoffgasstrom getrocknet, um das restliche Spüllösungsmittel zu entfernen (Abbildung 2D). Der Stickstoffgasdruck am Eingang des Mischerwahlventils wird mit einem manuellen Druckregler an der Stickstoffgasflasche auf ca. 2 bar (0,2 MPa, Überdruck) geregelt. Sobald die Probenzelle ausreichend gereinigt und getrocknet ist, wird eine neu gemischte Probe für den nächsten Messzyklus in die Probenzelle injiziert (Wiederholung des Mischens und der Injektion, dargestellt im Flussdiagramm in Abbildung 2A).

Figure 2
Abbildung 2: Beispiel für ein Flussdiagramm mit einer Probenzelle, zwei Probenmischungen und zwei Spüllösungsmitteln zur Reinigung . (A) Mischen von Probe A (blau) und Probe B (rot) und anschließendes Einfließen der gemischten Probe (violett) in die Probenzelle. (B) Während der Datenerfassung befindet sich das Gerät mit gestopptem Durchfluss, in dem die ISV- und OSV-Umschaltventile geschlossen sind, um die Probenzelle zu isolieren und eine Rückdiffusion der Probe während der Datenerfassung zu verhindern. (C) Die Reinigungsschritte, bei denen die Probenzelle nach der Datenerfassung mit dem Spüllösungsmittel von SS1 (grün) gespült wird. (D) Trocknungsschritt, bei dem die Probenzelle mit Stickstoffgas (orange) getrocknet wird. Abkürzungen: PSV = Pumpenwahlventil; MSV = Mischer-Wahlventil; OSV = Auslassschalterventil; ISV = Einlassschalterventil; SS1 = Lösungsmittelquelle 1; SSA = Probenquelle A; N2 = Stickstoffgasquelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3 zeigt Flussdiagramme für eine etwas andere Version, bei der der Mischaufbau mit zwei separaten Probenzellen konfiguriert ist, die an dieselben Umschaltventile angeschlossen sind (Abbildung 3A). Während die TR-SANS-Daten in Probenzelle 1 erfasst werden, wird Probenzelle 2 gespült (Abbildung 3B) und getrocknet (Abbildung 3C). Wenn die Datenerfassung für Probenzelle 1 abgeschlossen ist, leitet das Einlassschaltventil eine neu gemischte Probe zur Datenerfassung in Probenzelle 2 (Abbildung 3D). Während die TR-SANS-Daten in Probenzelle 2 erfasst werden, wird Probenzelle 1 gespült und getrocknet (Abbildung 3E). Dieser alternierende, parallele Prozess zwischen zwei Probenzellen minimiert die Zeit zwischen nachfolgenden Probeninjektionen und maximiert die Nutzung der Neutronenstrahlzeit.

Figure 3
Abbildung 3: Beispiel für ein Flussdiagramm mit einer Zwei-Proben-Zellen, zwei Proben, die gemischt werden, und zwei Spüllösungsmitteln zur Reinigung. (A) Mischen von Probe A (blau) und Probe B (rot) und anschließendes Einfließen der gemischten Probe (violett) in Probenzelle 1. (B) Der Zustand des Geräts mit gestopptem Durchfluss während der Datenerfassung an Probenzelle 1, während Probenzelle 2 mit Lösungsmittel aus SS1 (grün) gespült wird. (C) Der Zustand des Geräts mit gestopptem Durchfluss während der Datenerfassung an der Probenzelle 1, während die Probenzelle 2 mit Stickstoffgas (orange) getrocknet wird. (D) Sobald die Datenerfassung der Probenzelle 1 abgeschlossen ist, wird sofort eine neue Probe (violett) gemischt und in die Probenzelle 2 eingebracht. (E) Der Zustand der Stoped-Flow-Vorrichtung während der Datenerfassung an Probenzelle 2, während Probenzelle 1 mit Lösungsmittel aus SS1 (grün) gespült wird. Während eine Probenzelle gemessen wird, wird die andere Probenzelle gereinigt und getrocknet. Der Stopped-Flow-Messprozess wechselt zwischen zwei Probenzellen, um die Zeit zwischen nachfolgenden Probenmischinjektionen zu minimieren. Abkürzungen: PSV = Pumpenwahlventil; MSV = Mischer-Wahlventil; OSV = Auslassschalterventil; ISV = Einlassschalterventil; SS1 = Lösungsmittelquelle 1; SSA = Probenquelle A; N2 = Stickstoffgasquelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Im Folgenden wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für das Anschließen der Pumpen und Schlauchleitungen, das Ansaugen des Systems, das Spülen und Trocknen der Probenzelle und das Einspritzen der gemischten Probe beschrieben. Obwohl die Einzelzellenkonfiguration der Einfachheit halber demonstriert wird (Abbildung 2), können der flexible modulare Aufbau, das Protokoll und die Skripte leicht geändert werden, um mehr Spritzenpumpen, Ventile, Mischer oder Probenzellenkonfigurationen zu implementieren, wie z. B. die in Abbildung 3 gezeigte Konfiguration mit zwei Probenzellen. Repräsentative Rohdaten der Neutronenzählrate, die während der Misch- und Reinigungsinjektionszyklen gesammelt wurden, sind in Abbildung 4 dargestellt, während die bei 3 verschiedenen Temperaturen gemessene Lipidaustauschkinetik und die extrahierte normalisierte Streuintensität, die dem Anteil der ausgetauschten Lipide entspricht, in Abbildung 5 bzw. Abbildung 6 dargestellt sind.

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Protocol

1. Einrichten und Einschalten des Stopped-Flow-Systems.

  1. Schalten Sie alle Pumpennetzteile und dynamischen Mischer mit dem Netzschalter ein.
  2. Starten Sie alle Pumpen und Ventile in der grafischen Benutzeroberfläche (GUI) der Steuerung des gestoppten Durchflusssystems, indem Sie den Gerätekonfigurationspfad eingeben und die Befehle bus=qmixbus verwenden. Bus(), bus.open(), bus.start(), pump=qmixpump. Pump(), pump.enable() und valve=ViciMultiposSelector() (siehe Beispiel-Initiierungscode, der in einem Online-Open-Source-Repository64 verfügbar ist).
  3. Kalibrieren Sie die Pumpen vor dem Anbringen von Spritzen mit dem Befehl pump.calibrate().
  4. Vergewissern Sie sich, dass die Ventile initiiert wurden, und bewegen Sie sich auf Befehl mit den Befehlen valve.setPort() und valve.getPort() zum richtigen Selektorport.
  5. Weisen Sie den Spritzentyp zu, der für jede Pumpe verwendet werden soll, indem Sie den Befehl pump.set_syringe_param(A, B) verwenden, wobei A der Innendurchmesser des Spritzenzylinders (mm) und B der maximale Kolbenhub der Spritze (mm) ist.
  6. Schließen Sie die Probenspritzen an die Spritzenpumpen an.
    1. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die Pumpen kalibriert sind, schrauben Sie saubere Spritzenzylinder an den Anschluss an der Oberseite der Pumpe (Spritzenmontagekopf) ein.
    2. Stellen Sie bei der Verwendung von Glasspritzen sicher, dass der Spritzenhalterungskopf vor der Abgabe des Füllvolumens gelöst ist, damit die Glasspritze nicht durch übermäßige Kraft des Spritzenkolbens bricht.
    3. Schrauben Sie den Spritzenkolben in den Anschluss an der Unterseite der Pumpe (Spritzenhalterungsende).
    4. Nachdem der Spritzenzylinder und der Spritzenkolben mit der Pumpe verbunden sind, geben Sie das Füllvolumen des Spritzentyps mit dem Befehl pump.empty() ab, der den Spritzenkolben an die Oberseite des Spritzenzylinders bewegt.
    5. Wenn Sie Glasspritzen verwenden, ziehen Sie den Spritzenhalterungskopf fest, nachdem die Kolbenbewegung gestoppt wurde.
  7. Schließen Sie den Schlauch an die Proben- und Lösungsmittelquellen, Spritzen, Ventile, Mischer, Probenzellen und den gemischten Probenbehälter an.
    1. Verbinden Sie den Schlauch der Spritzenpumpe mit den Pumpenwahlventilen.
    2. Schließen Sie den Schlauch des Pumpenwahlventils an die Probenquellen an.
    3. Schließen Sie den Schlauch des Pumpenwahlventils an die Spüllösungsmittelquellen an.
    4. Verbinden Sie den Schlauch des Pumpenwählventils mit dem Schlauch des Mischerwahlventils.
    5. Schließen Sie den Schlauch des Mischerwahlventils an die Stickstoffgasquelle an.
    6. Verbinden Sie den Schlauch des Mischerwahlventils mit den Mischereinlässen.
    7. Verbinden Sie den Mischerausgang mit dem Einlassschalterventil.
    8. Verbinden Sie das Einlassschalterventil mit dem Probenzelleneinlass.
    9. Verbinden Sie den Ausgang der Probenzelle mit dem Auslassschalterventil.
    10. Schließen Sie das Auslassschalterventil an den Mischprobenbehälter an.
  8. Definieren Sie alle Schlauch- und Ventilverbindungen (Schritt 1.7) in der GUI für die Steuerung des Systems mit gestopptem Durchfluss, indem Sie die entsprechenden Anschlussnummern eingeben, die zu jedem Ventil hergestellt wurden (siehe Beispiel-Steuercode im Online-Open-Source-Repository64).
  9. Berechnen Sie das Hohlraumvolumen des Schlauchs zwischen dem Mischereinlass und dem Auslass der Probenzelle, das die Mindestmenge an Probe definiert, die zum Füllen der Probenzelle für jede Messung erforderlich ist.

2. Legen Sie die Probe ein.

  1. Stellen Sie das gewünschte Probenfüllvolumen und das Lösungsmittelfüllvolumen in der Steueroberfläche des Stopped-Flow-Systems ein, indem Sie die gewünschten Zahlen eingeben (siehe Beispiel-Steuercode im Online-Open-Source-Repository64).
  2. Verwenden Sie den Befehl pump.aspirate(), um die gewünschten Proben- und Lösungsmittelvolumina aus ihren Quellen durch die Pumpenwahlventile in die Probenspritzen zu ziehen (anzusaugen).
    Anmerkungen: Beim ersten Laden einer leeren Spritze befindet sich oben in der Spritze Luft, die gespült werden muss, um das System in Schritt 3 mit Probe und Lösungsmittel zu befüllen.

3. Bereiten Sie das System vor.

  1. Verwenden Sie den Befehl pump.dispense(), um die gesamte Luft aus Spritzen, Schlauchleitungen und Ventilen herauszudrücken (abzugeben). Stellen Sie sicher, dass aus jeder Spritze genügend Flüssigkeitsvolumen abgegeben wird, um die gesamte Luft vollständig aus den Spritzen, Schläuchen und Ventilen zu entfernen. Wenn Luftblasen in einem Schlauch sichtbar sind, setzen Sie die Abgabe des Lösungsmittels oder der Probe fort, bis die Blasen entfernt sind.
  2. Sobald die Luft aus dem System gespült wurde, führen Sie mindestens einen Probeninjektions- und Spülvorgang durch (ohne Neutronenstreuung).
    1. Klicken Sie auf die Zelle mit der Bezeichnung Mischexperiment starten in der Steuerungs-GUI, um sie auszuwählen.
    2. Wenn diese Zelle aktiv ausgewählt ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen (rechtes Dreieck) oben in der GUI des Steuerelements oder drücken Sie gleichzeitig die Umschalt - und Eingabetaste auf der Tastatur.
    3. Untersuchen Sie die Probenzelle visuell, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
      1. Wenn Luftblasen vorhanden sind, wiederholen Sie die Protokollschritte 3.1 und 3.2, um die Luft weiter aus den Schlauchleitungen zu spülen.
      2. Wenn in der Probenzelle keine Luftblasen vorhanden sind, fahren Sie mit Schritt 4 fort, um die verbleibenden Schritte des Experimentprotokolls zu definieren.

4. Definieren Sie das Stopped-Flow-Mixing-Protokoll im Programmskript (siehe Codebeispiel im Online-Open-Source-Repository64).

  1. Geben Sie den Temperatursollwert des programmierbaren Klimageräts (AC) ein, das die Temperatur des isolierten Gehäuses steuert, das das Gerät mit gestopptem Durchfluss umgibt.
    1. Halten Sie die Sterntaste am AC-Steuergerät gedrückt und drücken Sie die Aufwärts- und Abwärtspfeile, um die Solltemperatur zu ändern. Alternativ können Sie den gewünschten Temperatursollwert in der Steuerungsoberfläche eingeben und auf Ausführen klicken.
    2. Warten Sie 15-30 Minuten, damit sich das Innere des Gehäuses bei der gewünschten Temperatur ausgleichen kann, bevor Sie mit den kinetischen Experimenten beginnen.
      HINWEIS: Der zugängliche Temperaturbereich liegt derzeit zwischen 10 °C und 50 °C, die Temperaturstabilität liegt ± 1 °C.
  2. Geben Sie alle Schritte der Spülsequenz ein, indem Sie die entsprechenden Volumina, Durchflussraten, Zeiten und die Anzahl der Wiederholungen in die Steuerungs-GUI eingeben.
    1. Definieren Sie das Volumen jeder zu injizierenden Probe, das die Gesamtflussrate (Q) definiert.
    2. Definieren Sie das Volumen jedes Lösungsmittels, das während des Spülvorgangs injiziert werden soll.
    3. Definieren Sie die Trocknungszeit zwischen den einzelnen Spülteilschritten (tdry).
    4. Legen Sie die Anzahl der Spülteilschritte fest.
    5. Definieren Sie die verschiedenen Lösemittel für die nachfolgenden Spülschritte.
    6. Definieren Sie die Anzahl der Spülwiederholungen, die nach jeder Messung durchgeführt werden sollen (nSpülen).
    7. Definieren Sie die Zeit für die vollständige Trocknung der Probenzelle und des Mischers, um eine saubere Probenzelle für die anschließende Probeninjektion bereitzustellen (tdry_final).
  3. Definieren Sie alle Sequenzschritte der Probeninjektion, indem Sie die entsprechenden Volumina, Durchflussraten und Zeiten in die GUI des Stopped-Flow-Systems eingeben.
    1. Definieren Sie das Volumen jeder zu injizierenden Probe und die Durchflussrate.
    2. Berechnen Sie die Verzögerungszeit (t-Verzögerung) aus dem Hohlraumvolumen (V-Verzögerung) und der Gesamtdurchflussrate (t-Verzögerung = V-Verzögerung/Q).
      Anmerkungen: Die Verzögerungszeit ist die Zeit, die benötigt wird, um die Probenzelle mit der gemischten Probe zu füllen.
    3. Definieren Sie den gewünschten Erfassungszeitpunkt für die TR-SANS-Daten so, dass der gesamte kinetische Prozess von Interesse stattgefunden hat (tscatt).
    4. Stellen Sie die Wartezeit zwischen dem Ende des Streuexperiments und dem Beginn der Spülzyklen ein (twait).
      Anmerkungen: Diese Wartezeit sollte mindestens 100 s betragen, wenn die Neutronentransmission der Probe gemessen werden soll, bevor sie aus der Zelle gespült wird. Die Probenübertragung wird während der Datenverarbeitung benötigt, um die Daten auf absolute Intensität zu reduzieren.
    5. Definieren Sie die Anzahl der Einspritzzyklen, die mit den in Schritt 4.2 (n Zyklus) definierten Spülsequenzen zwischen den einzelnen Injektionen durchgeführt werden sollen.
  4. Berechnen Sie die Gesamtzeit eines einzelnen gestoppten Datenerfassungszyklus (t-Zyklus) mit Gleichung (1).
    tZyklus = nSpülen × (t Verzögerung + ttrocken) + tdry_final + tVerzögerung + t scatt (1)
    wobei nSpülen = Anzahl der Spülwiederholungen (Schritt 4.2.6); tVerzögerung = Verzögerungszeit der gestoppten Durchflussvorrichtung (Schritt 4.3.2); tdry = Trocknungszeit zwischen den einzelnen Spülschritten (Schritt 4.2.3); tdry_final = Zeit für die vollständige Trocknung der Probenzelle und des Mischers (Schritt 4.2.7); tscatt = gewünschte TR-SANS-Datenerfassungszeit (Schritt 4.3.3)

5. Definieren Sie die Parameter für die Kleinwinkel-Neutronenstreuung in der SANS-Gerätesteuerungs-GUI.

  1. Bestimmen Sie die Längenskalen und den Q-Bereich, die für jede Probe von Interesse sind.
  2. Definieren Sie die Gerätekonfiguration, um den gewünschten Q-Bereich von Interesse abzudecken und gleichzeitig den Neutronenfluss an der Probe zu maximieren.
  3. Stellen Sie die gesamte VSANS-Datenerfassungszeit in der SANS-Gerätesteuerungs-GUI auf die berechnete Zykluszeit in Schritt 4.4 ein (Neutronenstreuungs-Datenerfassungszeit =t-Zyklus).
  4. Stellen Sie die Messzeit für die Probenübertragung in der SANS-Gerätesteuerungs-GUI auf 100 s ein.
  5. Aktivieren Sie mithilfe der SANS-Gerätesteuerungs-GUI die Datenerfassung im Ereignismodus, indem Sie GenerateEventModeData true in die Befehlszeile eingeben.

6. Sammeln Sie Standardstreuungsmessungen zur Datenreduktion, bevor Sie mit dem Stopped-Flow-Experiment beginnen, um die TR-SANS-Daten zu verarbeiten.

  1. Messen Sie die Hintergrundstreuung.
    1. Stellen Sie sicher, dass der lokale Instrumentenverschluss geschlossen ist.
    2. Befestigen Sie die Probe mit blockiertem Strahl an der Rückseite der Probenöffnung, sichern Sie die lokale Geräteumgebung und öffnen Sie den lokalen Geräteverschluss.
    3. Definieren Sie die Datenerfassungszeit für die Streuung des blockierten Strahls in der Software und erfassen Sie die Daten zur Streuung des blockierten Strahls, wobei die gleiche Dauer wie die längste Datenerfassungszeit für die Streuung des Strahls (tscatt) gezählt wird.
    4. Sobald die Datenerfassung abgeschlossen ist, schließen Sie den Geräteverschluss und entfernen Sie die Probe mit blockiertem Strahl aus der Probenöffnung.
  2. Messen Sie die Streuung leerer Zellen.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Probenzelle gründlich gespült und getrocknet wurde.
    2. Öffnen Sie den lokalen Instrumentenverschluss.
    3. Erfassen Sie die Transmissionsmessung der leeren Zelle für 100 s.
    4. Erfassen Sie die Messung der Leerzellenstreuung, wobei mindestens die längste Erfassungszeit (tscatt) gezählt wird.

7. Beginnen Sie mit dem Stopped-Flow-Experiment.

    8. Verarbeiten und reduzieren Sie die Daten, um alle Hintergründe zu entfernen, die Empfindlichkeit des Detektors zu korrigieren und die Probenübertragung zu korrigieren.

    1. Laden Sie die Streudatendateien und die zugehörigen Ereignisdateien vom Server herunter.
      HINWEIS: Nach jeder VSANS-Messung werden separate Detektor-Ereignisdateien generiert, eine Ereignisdatei für jeden aktiven Detektorträger (z. B. vorderer, mittlerer und/oder hinterer Detektor).
    2. Binden Sie die Streudaten in die gewünschten Zeitabschnitte mit dem Befehl events=Rebin(filename ) gefolgt vom Befehle vents.do_rebinning(timebins), wobei der eingegebene Dateiname dem Namen der gewünschten SANS-Datendatei entspricht und timebins eine Liste der gewünschten Zeitabschnittsgrenzen in Sekunden ist.
      HINWEIS: Wenn die Eingabe-Timebins als einzelne Zahl anstelle einer Liste eingegeben werden, werden die Daten in N Bins mit gleicher Zeitbreite eingeteilt, wobei N die Eingabe-Timebins sind (siehe Software-Skripte, die von der Beamline bereitgestellt werden, und das verfügbare Online-Open-Source-Repository64).
    3. Reduzieren Sie die Bind-Streudaten mit der Software, die mit der Beamline65 geliefert wird.

    9. Analysieren Sie die TR-SANS-Daten.

    1. Berechnen Sie die interessierende Prozesszeit (t-Prozess) aus den Messzeiten mit Gleichung (2).
      t-Prozess = ti -t Stopp + tVerzögerung (2)
      Dabei ist ti die Messzeitklassen, die nach dem Stoppen des Durchflusses beginnen, tstop ist die Messzeit, die unmittelbar nach dem Stoppen des Durchflusses beginnt, und tdelay ist die Verzögerungszeit.
    2. Zeichnen Sie die q-abhängige Intensität I(q) als Funktion der Prozesszeit unter Verwendung der in Schritt 8.2 definierten Zeitklassen und des in Schritt 9.1 berechnetent-Prozesses.
      HINWEIS: Die früheste zugängliche Prozesszeit ist durch tVerzögerung begrenzt. Um frühere Prozesszeitpunkte zu messen, erhöhen Sie den Gesamtdurchfluss (Q) oder verringern Sie das Gesamtvolumen des Hohlraums (V-Hohlraum).
    3. Extrahieren Sie die interessierenden kinetischen Parameter aus der Änderung von I(q) als Funktion der Prozesszeit.

    10. Beenden Sie das Experiment.

    1. Schalten Sie den Neutronenstrahl aus, indem Sie den lokalen Instrumentenverschluss schließen.
    2. Führen Sie eine Strahlungsprüfung mit einem vom Strahlrohr bereitgestellten Strahlungsmonitor durch, bevor Sie Teile, Rohre oder Proben oder gemischte Probenbehälter entladen.
    3. Übergeben Sie die Spritzen, den Schlauch und den Mischprobenbehälter an die Abteilung für Gesundheitsphysik.
    4. Füllen Sie die Formulare für Gesundheitsphysik aus und warten Sie auf die Bewertung durch das Personal der Gesundheitsphysik.

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    Representative Results

    Die hier gezeigten repräsentativen Neutronendaten messen die Lipidaustauschkinetik in Gegenwart von Methyl-β-Cyclodextrin (mβCD), einem Additiv, das den Lipidaustausch zwischen Vesikeln mit der Austauschrate (ke)66,67 katalysiert. Frühere Fluoreszenzstudien haben gezeigt, dass ke von der mβCD-Konzentration abhängt und die Halbwertszeit des Austauschprozesses in der Größenordnung von68 Minuten liegt. Die vorliegenden Experimente verwenden Stoped-Flow-TR-SANS, um den mβCD-katalysierten Lipidaustausch zwischen Vesikeln auf der Sekunden-Zeitskala zu messen. Es wurden zwei isotopisch unterschiedliche Lipidvesikelpopulationen präpariert; Eine Vesikelpopulation wurde mit schwanzhydrierten Dimyristoylphosphatidylcholin-Lipiden (DMPC) präpariert (H-Lipid-Vesikel in Abbildung 5), und die andere Vesikelpopulation wurde mit schwanzdeuterierten DMPC-Lipiden (DMPC-d54) (D-Lipid-Vesikel in Abbildung 5) präpariert. Eine Molfraktion von 0,05 (5 mol%) geladenem Dimyrisotylphosphatidylglyercol (DMPG)-Lipid wurde sowohl den DMPC- als auch den DMPC-d54-Trockenlipidpulvern zugesetzt, um die Bildung unilamellarer Vesikel zu fördern69.

    Getrennte H-Vesikel- und D-Vesikellösungen wurden hergestellt, indem die jeweiligen Lipidfilme in einem Lösungsmittel hydratisiert wurden, das 45 Vol.-% schweres Wasser (D2O) und 55 Vol.-% Wasser (H2O) enthielt. Die LösungsmittelzusammensetzungD2O/H2Owurde so berechnet, dass die Neutronenstreulängendichte (ρ) des Lösungsmittels mit einer zufälligen Mischung der H-Lipide und D-Lipide übereinstimmte (Δρ = ρLipid- ρLösungsmittel = 0). Mit anderen Worten, ein zufällig gemischtes H/D-Vesikel wäre für die Neutronen "unsichtbar" und würde keine kohärente Neutronenstreuung erzeugen. Unilamellare Vesikellösungen wurden hergestellt, indem die Lösungen fünfmal gefroren und dann durch einen Polycarbonatfilter mit Poren mit 100 nm Durchmesser extrudiert wurden. Die Vesikellösungen wurden insgesamt 31 Mal bei 30 °C zwischen zwei Spritzen und dem Filter hin und her extrudiert. Anschließend wurde ein kleines Volumen einer konzentrierten mβCD-Stammlösung, die in der gleichen D2O/H2O-Lösungsmittelmischunghergestellt wurde, zu den Vesikellösungen gegeben. Die endgültige Lipidkonzentration betrug 14 mmol/L (mM) und die mβCD-Konzentration 30 mM. Die einzelnen Vesikellösungen wurden für mindestens 30 min mit der zugesetzten mβCD äquilibriert, bevor die Lösungen in die Probenspritzen in der Stopped-Flow-Mischvorrichtung geladen wurden.

    Ein Beispiel für die gemessenen Neutronenzählraten über mehrere Injektionszyklen ist in Abbildung 4A dargestellt. Jeder Zyklus bestand aus 9 Spülschritten, 1 Trocknungsschritt und 1 Probeninjektionsschritt. Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden nur die Zählraten angezeigt, die auf dem mittleren Detektorschlitten des VSANS-Geräts gemessen wurden. Ähnliche Trends zeigten sich auf dem vorderen Detektorschlitten, die mit Daten korrespondierten, die bei größeren Streuwinkeln oder höheren q-Werten erhoben wurden. Die Zählrate stieg mit jeder Injektion des Spüllösungsmittels (Lösungsmittel S1 und Lösungsmittel S2) an und kehrte zu den Ausgangswerten der leeren Zellen zurück, wenn das Lösungsmittel mit Stickstoffgas aus der Zelle gedrückt und getrocknet wurde. Die letzte Zellspülung erfolgte mit S2, in diesem Beispiel Ethanol, und die Zelle wurde ein letztes Mal mit Stickstoffgas getrocknet, bevor die Probe injiziert wurde. Kurz nachdem die Probe in die Zelle injiziert worden war, stieg die Neutronenzählrate sprunghaft an, und die Daten wurden 5 Minuten lang kontinuierlich gesammelt. Bei der repräsentativen Stichprobe, die in die Beispieldaten in Abbildung 4A injiziert wurde, handelte es sich um einen Salzpufferhintergrund. Die Fluktuationen der gemessenen Intensität über die Zeit spiegeln die Variationen der Neutronenzählrate im Hintergrund wider und spiegeln keine Änderung der durchschnittlichen Probenzusammensetzung wider. Der gesamte Zyklus des Spülens, Trocknens, Mischens und Einspritzens der Probe wurde im Beispiel in Abbildung 4A ein weiteres Mal wiederholt, wobei jeder Zyklus insgesamt 15 Minuten dauerte.

    Die einzelnen H-markierten und D-markierten Lipidvesikellösungen wurden zum Zeitpunkt dert-Mischung gemischt und flossen sofort in die Probenzelle. Die gemessene Neutronenzählrate stieg sprunghaft an und erreichte dann einen Maximalwert, wenn die Probenzelle beit-Füllung gefüllt wurde, wie in Abbildung 4B dargestellt. Die verstrichene Zeit, die zum Füllen der Probenzelle benötigt wird, wird alsVerzögerungszeit t Verzögerung bezeichnet und ist gegeben durch tVerzögerung = tFüllung -t Mischung. Wenn das Hohlraumvolumen (V-Hohlraum) zwischen dem Mischer und der Probenzelle bekannt ist und die Gesamtflussrate (Q) bekannt ist, kann die t-Verzögerung auch alst-Verzögerung =V-Hohlraum/Q berechnet werden (siehe Protokollschritt 4.3.2), was auch die durchschnittliche Verweilzeit ist, die die flüssige Probe benötigt, um in den Mischer einzutreten und die Probenzelle zu verlassen. Nach Erreichen dert-Füllung wurde der Fluss mit einer konstanten Flussrate fortgesetzt, um sicherzustellen, dass sich die Zelle gefüllt hatte und den stationären Zustand erreichte. Der Durchfluss wurde dann sofort bei tStopp gestoppt. Die gemittelte Neutronenzählrate blieb als Funktion der Messzeit zwischen tFüllung undt Stopp konstant, da die Flussrate durch die Probenzelle konstant war und sich daher die Probe innerhalb des Neutronenstrahlengangs im stationären Zustand befand. Mit anderen Worten, die beit-Stopp gemessenen Daten entsprechen der Probe, die gemischt und entwickelt wurde durch tdelay = tfill- tmix = Vvoid/Q. Die binnierten Messzeiten ti, die unmittelbar nach demt-Stopp erfasst wurden, sind die wichtigsten kinetischen Daten von Interesse.

    In Abbildung 4C sind die Neutronenzahlen aus der gemischten Lipidvesikelprobe bei drei verschiedenen Temperaturen als Funktion der korrigierten Prozesszeitskala (t-Prozess) aufgetragen, d. h. der interessierenden Prozesszeit, die für die stationäre Flussperiode und die Verzögerungszeit korrigiert wurde. Die Prozesszeitskala wurde mit t process = t i- t stop + tdelay oder äquivalent tprocess = t i-t stop + tfill- tmix berechnet. SANS-Daten wurden in Abbildung 4 kontinuierlich im sogenannten Ereignismodus erfasst. Während der Datenerfassung im Ereignismodus wird jedes detektierte Neutronenereignis mit einem eindeutigen Zeitstempel und seiner x- und y-Position auf dem zweidimensionalen Neutronendetektor aufgezeichnet. Die Daten aus dem Ereignismodus werden dann in die gewünschten Zeitabschnitte (ti) in Abbildung 4B nachverarbeitet.

    Ereignismodusdaten innerhalb des zugänglichen Prozesszeitfensters von Interesse (d. h. Neutronenstreuung, die bei jedemt i nach t Stopp in 4B gesammelt wurde) wurden unter Verwendung von Protokollen und Skripten, die in dem Online-Open-Source-Repository64 verfügbar sind, in ein zweidimensionales (2D) Detektorbild für diesen Zeitabschnitt rekonstruiert. Jedes 2D-Detektorbild wurde dann unter Verwendung von Datenreduktionsroutinen verarbeitet, um die verschiedenen Hintergrundquellen zu subtrahieren, die Probentransmission und die Detektoreffizienz zu korrigieren und die 2D-Detektordaten azimutal in Intensitäts- (I) vs. Streuvektordiagramme (q)65 zu integrieren. Die Daten in Abbildung 5 wurden in gleiche (3 s) Zeitabschnitte unterteilt und sind repräsentativ für die zeit- und längenskalenabhängigen Informationen, die aus einer TR-SANS-Messung gewonnen werden können. Ähnlich wie bei der in Abbildung 4B gezeigten Gesamtrohzählrate nimmt die q-abhängige Intensität I(q) mit der Zeit ab, wenn die Lipide in den äußeren Blättchen zufällig zwischen verschiedenen Vesikeln ausgetauscht und gemischt werden.

    Die Daten sind in Abbildung 5 für die Lipidaustauschkinetik dargestellt, die bei 3 verschiedenen Temperaturen gemessen wurde. Jedes Diagramm zeigt die Daten, die in den ersten 110 Minuten nach dem Mischen gesammelt wurden. Die gemessene Intensität nimmt bei den niedrigsten q-Werten bei 36 °C und 30 °C, die der Lipidflüssigkeitsphase entsprechen, um eine Größenordnung ab. Währenddessen ändern sich die gestreuten Intensitätsdaten mit der Zeit bei 20 °C signifikant langsamer, was darauf hindeutet, dass die Kinetik des äußeren Blattaustauschs in der Lipidgelphase viel langsamer ist.

    Die gemessene Streuintensität I(q) bezieht sich auf den SLD-Kontrast als Equation 1, wobei Δρ die SLD-Differenz zwischen dem Vesikel und dem umgebenden Lösungsmittel ist. Dieser durchschnittliche SLD-Kontrast steht in direktem Zusammenhang mit der relativen Anzahl von H-Lipiden und D-Lipiden in einem Vesikel zu einem bestimmten Zeitpunkt. Auf diese Weise kann die gemessene Streuintensität zu einem bestimmten Zeitpunkt normalisiert werden, um den Anteil der Lipidpopulation zu bestimmen, der ausgetauscht wurde. Diese Normalisierung wird durch das Sammeln von zwei zusätzlichen Messungen erreicht, darunter: (1) die gemessene Intensität I(0) zum Zeitpunkt t = 0, wenn kein Lipidaustausch zwischen den Vesikeln stattfindet, und (2) die gemessene Intensität I(∞) zum Zeitpunkt t = ∞, wenn alle Lipide ausgetauscht wurden und die Populationen ausgeglichen sind. Die normierte Zählrate Equation 242 ist als Funktion der Prozesszeit für die verschiedenen Temperaturen in Abbildung 6 dargestellt. In diesem Beispiel ist I(t) die q-integrierte Intensität zum Prozesszeitpunkt t (hintergrundsubtrahierte Intensität, die als Funktion von q integriert ist), I(∞) ist die q-integrierte Intensität in unendlicher Zeit, nachdem alle Lipide ausgetauscht wurden (was der Lösungsmittelhintergrundstreuung ähnlich sein sollte), und I(0) ist die q-integrierte Intensität Intensität zum Zeitpunkt t = 0 (ohne Lipidaustausch). I(0) wurde für eine gemischte Probe unterhalb der Phasenübergangstemperatur bei 20 °C gemessen, wo der Austausch langsam war, und I(∞) wurde in einer separaten Probe gemessen, die mehr als 36 h bei 40 °C gleichgewichtet hatte und H-Lipide und D-Lipide vollständig ausgetauscht hatte.

    Die normierte Zählrate sollte von R(t) = 1 zur Prozesszeit t = 0 auf R(t) = 0 bei t = ∞ abfallen und steht in direktem Zusammenhang mit dem SLD-Kontrast in der Probe und damit dem Ausmaß des Lipidaustauschs 27,28,29,30,31,32,33,34,35 . Es ist zu beachten, dass die frühesten gemessenen R(t)-Daten nicht bei R(t)=1 bei 30 °C und 36 °C beginnen, was darauf hindeutet, dass während der ersten 3 s nach dem Mischen ein signifikanter Lipidaustausch stattfand, der aufgrund der Verzögerungszeit (tdelay = 2,4 s) des verwendeten Stoped-Flow-Mischprotokolls experimentell nicht zugänglich war. Währenddessen blieb das gemessene R(t) bei 20 °C für die ersten (2-3) Minuten annähernd konstant. Für die Lipidaustauschkinetik, die bei 30 °C und 36 °C gemessen wurde, zerfiel R(t) innerhalb von 100 s schnell auf ≈0,5, was darauf hindeutet, dass die äußeren Leaflet-Lipide innerhalb von Minuten vollständig ausgetauscht und ausgeglichen wurden. Dementsprechend wurde die Erfassung des mβCD-katalysierten Lipidaustauschs mit Hilfe von Stoped-Flow-SANS ermöglicht und wäre mit manuellem Pipettenmischen nur schwer zu erfassen. Um noch frühere Prozesszeitpunkte (t < 3 s) zu erfassen, ist ein anderer Mischertyp mit kleinerem Hohlraumvolumen, kleineren Hohlraumvolumina und höheren Gesamtdurchflussraten erforderlich, um die Verzögerungszeit zu verkürzen.

    Das R(t) zerfiel über längere Zeiträume weiter, da die Lipide zwischen den inneren und äußeren Segeln hin- und herwechselten. TR-SANS-Daten für den langsameren Flip-Flop-Prozess (t > 5 min) können mit diskreten Proben erfasst werden, die von Hand gemischt und in Standard-SANS-Probenzellen geladen werden, da die manuelle Pipettenmischmethode ca. 5 min dauert. In ähnlicher Weise war der Lipidaustausch bei 20 °C in der Lipidgelphase langsam genug, um gemischt und diskret gemessen zu werden, und diese Messung musste nicht unbedingt mit der Stoped-Flow-Mischmethode untersucht werden. Messungen von kinetischen Prozessen auf Zeitskalen von einigen Minuten bis Stunden sind effizienter, wenn die Proben durch manuelles Pipettenmischen gemischt werden. Kinetische Prozesse auf Zeitskalen von weniger als Minuten erfordern jedoch dieses Stoped-Flow-Misch- und TR-SANS-Messverfahren.

    Figure 4
    Abbildung 4: Repräsentative Rohdaten der Neutronenzählrate, die während der Misch- und Reinigungsinjektionszyklen gesammelt wurden . (A) Beispiel für die Neutronenzählrate (mittlerer Detektor) als Funktion der Zeit während wiederholter Spülsequenzen, Trocknungssequenz und Injektionssequenz für gemischte Proben über mehrere Zyklen. Bei der Probe in (A) handelte es sich um einen Salzpufferhintergrund, und die Intensitätsänderungen im Laufe der Zeit spiegeln die Variationen der Hintergrundzählrate wider, nicht eine Änderung der Probe. (B) Monitornormalisierte Neutronenzählrate in Abhängigkeit von der Versuchszeit nach der Injektion von gemischten H-Lipid- und D-Lipid-Vesikeln bei 30 °C. Die vertikalen gestrichelten Linien geben die Startzeit des Mischens (tMix), die Füllzeit (tFüllung), die Stoppzeit des Durchflusses (tstop) und den Zeit-Binning-Bereich (ti) an. Der Abfall der Zählrate nacht-Stopp ist auf den Verlust des Kontrastmittels in der Probe als Lipidaustausch zwischen den Vesikeln zurückzuführen. (C) Überwachen Sie die normalisierten Neutronenzählraten als Funktion der Austauschprozesszeit für die ersten 100 s des Experiments bei (blau) 20 °C, (grün) 30 °C und (rot) 36 °C. Die Daten des Ereignismodus werden in 1-Sekunden-Bins verarbeitet. Abkürzungen: S1 = Lösungsmittel 1; S2 = Lösungsmittel 2; tmix = Versuchszeitpunkt, zu dem die Probenlösungen gemischt werden; tfill = Experimentzeitpunkt, zu dem die Probenzelle gefüllt wird; tstop = Versuchszeit, bei der der Durchfluss gestoppt wird; t-Prozess = berechnete kinetische Prozesszeit von Interesse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

    Figure 5
    Abbildung 5: Darstellung des katalysierten Austauschs der äußeren Schicht der Lipidvesikel und der entsprechenden Änderungen der Streuintensität (I) in Abhängigkeit vom Streuvektor (q) bei verschiedenen Temperaturen. Schematische Darstellung des Lipidaustausches zwischen H-Lipid- und D-Lipidvesikeln nach (A) anfänglicher Durchmischung bei t = 0 und (B) Austausch der äußeren Schicht, katalysiert durch Methyl-β-Cyclodextrin (mβCD). Reduzierte Neutronenstreuintensität in Abhängigkeit vom Streuwellenvektor q. Stopped-Flow-Mischexperimente und VSANS-Messungen wurden bei (C) 36 °C, (D) 30 °C und (E) 20 °C wiederholt. Die präsentierten Daten wurden in 3-s-Intervalle über die ersten 10 Minuten nach dem Mischen bei jeder angegebenen Temperatur eingeteilt. Fehlerbalken sind die propagierte Unsicherheit aus der Zählstatistik und stellen eine Standardabweichung dar. Abkürzungen: ke = Geschwindigkeitskonstante für den Lipidaustausch zwischen den Vesikel; mβCD = Methyl-β-cyclodextrin; kf = Geschwindigkeitskonstante für den Lipidaustausch zwischen den Blättchen, auch als Lipid-Flipflop bezeichnet; l(q) = gemessene SANS-Intensität mit Einheiten von cm-1 ; q = Streuvektor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

    Figure 6
    Abbildung 6: Normalisierte Streuintensität, die dem Anteil der ausgetauschten Lipide entspricht, die modelliert werden können, um Geschwindigkeitskonstanten für die interessierenden kinetischen Prozesse zu extrahieren . (A) Lipidaustausch zwischen den äußeren Segeln der Vesikel auf Zeitskalen zwischen 3 s und 600 s, gemessen bei (blau) 20 °C, (schwarz) 30 °C und (rot) 36 °C. Der Einschub in der Abbildung zoomt auf die ersten 60 s des kinetischen Prozesses. Fehlerbalken sind die propagierte Unsicherheit aus der numerischen Integration der Streuintensitäten und stellen eine Standardabweichung dar. Abkürzungen: R(t) = normalisierte Streuintensität; t process = korrigierte Prozesszeit von Interesse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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    Discussion

    Das aktuelle Verfahren beschreibt das Mischgerät und die Schritte zur Durchführung von TR-SANS-Messungen mit gestopptem Durchfluss. Das Gerät und das Protokoll sind für flüssige Proben mit niedriger Viskosität optimiert, bei denen die interessierenden Zeitskalen ≈1 s bis 5 min betragen. Bei Zeitskalen von mehr als 5 Minuten kann es einfacher und wünschenswerter sein, die Proben manuell zu mischen und in Standard-Streuzellen zu laden, insbesondere bei hochviskosen Proben, Gelen oder Pasten. Der Zugriff auf Zeitskalen von weniger als 1 s erfordert eine andere Mischapparatur, geringere Gesamthohlraumvolumina und höhere Gesamtdurchflussraten, um die Verzögerungszeit zu verringern. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Untersuchung kinetischer Prozesse auf diesen kurzen Zeitskalen wahrscheinlich wiederholte Probeninjektionen erfordert, um mit TR-SANS ausreichende Streuzählstatistiken auf der Millisekunden-Zeitskala zu sammeln. Wenn das Gesamtprobenvolumen begrenzt ist, kann es wünschenswert sein, eine Technik mit höherem Fluss zu verwenden, wie z. B. Lichtstreuung oder Röntgenstreuung, die weniger Probeninjektionen oder weniger Probenvolumen pro Injektion erfordert, vorausgesetzt, dass ein ausreichender Streukontrast mit Licht- oder Röntgenstreuung vorhanden ist.

    Dieser modulare Stopped-Flow-SANS-Ansatz bietet mehrere wichtige Vor- und Nachteile im Vergleich zu kommerziell erhältlichen Stopped-Flow-Instrumenten, die für Neutronenstreuexperimente optimiert wurden. Zu den wichtigsten Vorteilen gehören (1) abwechselnde TR-SANS-Messungen zwischen verschiedenen Probenzellen während der Spülperioden, um die Nutzung der Neutronenstrahlzeit zu maximieren, (2) die Anpassung der Anzahl der Spritzen, Spritzenvolumina und Mischertypen für das ternäre Mischen von Proben oder andere komplexere Probenmischanforderungen und (3) die Ermöglichung längerer Messzeiträume durch Isolierung der Probenzelle und Eliminierung der Rückdiffusion auf längeren Zeitskalen (>10 Minuten). Obwohl hier nicht implementiert, würde die Modularität des Mischzellendesigns auch eine gleichzeitige Datenerfassung mit mehreren Messmethoden, wie z. B. der Kombination von SANS-, UV-Vis- und Fluoreszenzmessungen70, ermöglichen. Zwei Hauptnachteile dieses modularen Aufbaus sind (1) relativ längere Mischverzögerungszeiten (1 s bis 3 s) im Vergleich zu anderen Systemen, die Verzögerungszeiten von 1 ms bis 100 ms bieten können, und (2) ein kleinerer Betriebstemperaturbereich (10 °C bis 50 °C) im Vergleich zu anderen verfügbaren Systemen, die Betriebstemperaturen von -20 °C bis über 80 °C erreichen können.

    Das Sammeln vorläufiger SANS-Daten über die interessierenden Proben vor der Durchführung von In-situ-Mischexperimenten ist wichtig, um die besten TR-SANS-Daten zu sammeln, insbesondere bei Experimenten zur Überwachung der molekularen Austauschkinetik, wie das hier vorgestellte Beispiel. Die Bestimmung genauer Werte von I(0) und I(∞) ist entscheidend für die Berechnung genauer Werte der normierten Intensität R(t), die modelliert wird, um die gewünschten kinetischen Parameter zu extrahieren. Der Wert von I(0) kann direkt aus den gemessenen Streuintensitäten der getrennten H-Vesikel- und D-Vesikelstämme berechnet werden, und I(∞) kann durch die Herstellung einer separaten Vesikelprobe bestimmt werden, die aus einem 50/50-Gemisch von H-Lipiden/D-Lipiden hergestellt wurde. Die Streudaten dieser Kontrollproben können auch verwendet werden, um den optimalen Q-Bereich und die optimale SANS-Gerätekonfiguration für die TR-SANS-Messung zu bestimmen, um das Signal zu maximieren und den Verlauf der Austauschkinetik während der TR-SANS-Experimente zu überprüfen. Wenn die gemessene Intensität zum ersten Zeitpunkt nach dem Mischen nicht mit dem berechneten I(0) übereinstimmt, sind möglicherweise schnellere Mischzeiten erforderlich, um alle interessierenden Prozesse zu erfassen. Sobald die gemessene Intensität I(∞ erreicht hat, ist der Austauschvorgang abgeschlossen und die Zelle kann entleert und gereinigt werden, um die nächste Injektion vorzubereiten.

    Um die flüssige Probe für TR-SANS erfolgreich zu mischen, muss unbedingt sichergestellt werden, dass alle Spritzen, Ventile und Schlauchleitungen angesaugt und luftfrei sind und dass alle Schlauchverbindungen sicher sind, um ein Auslaufen zu verhindern. Wenn diese kritischen Schritte nicht korrekt ausgeführt werden, kann dies zu ungenauen Mischvolumina oder ungenauen absoluten Streuintensitäten führen. Zum Beispiel verringern Luftblasen, die in der Probenzelle eingeschlossen sind, die gemessene SANS-Intensität aufgrund des reduzierten Probenvolumens im Neutronenstrahlengang. Alternativ können Luftblasen aufgrund der Strahlbrechung an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche "Streifen" oder "Flares" von hoher Intensität auf dem Detektor erzeugen. Unerwartete Änderungen der gemessenen Streuintensität im Laufe der Zeit können auf eine schlechte Probenmischung, Ventilleckage, Luftblasen in der Probenzelle oder eine Rückdiffusion der Probe hinweisen.

    Die Erfassung einer Transmissionsmessung für jede Probe während eines TR-SANS-Experiments ist entscheidend, um die gesammelten Daten auf eine absolute Intensität zu reduzieren. Es ist möglich, auf einigen SANS-Geräten gleichzeitig Streu- und Übertragungsdaten zu sammeln, was die gesamte TR-SANS-Datenerfassungsprogrammierung vereinfacht. Dies ist jedoch nicht auf allen Geräten möglich, einschließlich des in diesem Protokoll verwendeten VSANS-Geräts. Da die Messungen der Probentransmission und der Probenstreuung unterschiedliche Gerätekonfigurationen erforderten, wurden die Transmissionsmessungen am Ende der Streumessungen (Protokollschritt 7.2.4) erfasst, um sicherzustellen, dass die Streudaten zu den frühesten Zeitpunkten nach der Injektion der Probe in die Zelle gemessen wurden. Die Transmission hängt nur von der gesamten Elementzusammensetzung, der Probenweglänge und der Neutronenwellenlänge ab. Daher sollte sich die Transmission nicht ändern, wenn die gesamte Elementzusammensetzung während des zeitaufgelösten Experiments konstant bleibt. Große Unterschiede in den Transmissionswerten zwischen wiederholten Durchläufen derselben Probe deuten auf ein Problem hin, das entweder durch ungleichmäßiges Mischen der Probenvolumina, unvollständige Füllung der Probenzelle, Luftblasen oder Ventilleckagen und Probenrückfluss während des Experiments verursacht wird.

    Ein einzigartiger Vorteil von TR-SANS ist, dass die gemessene Intensität vom Streuvektor (q) abhängig ist und zur Untersuchung räumlicher Veränderungen auf der Nanoskala verwendet werden kann. In Kombination mit dem Stopped-Flow-Mischgerät kann TR-SANS diese nanoskaligen Veränderungen auf Zeitskalen von zwei bis Minuten untersuchen und so Einblicke in die Selbstorganisation und den Austausch von Tensiden und Lipiden, die Polymer- und Proteinaggregation bei Zugabe von Hilfsstoffen, das Wachstum und den Zerfall von Nanopartikeln oder den Austausch von verkapselten Produkten in Emulsionen liefern. Das Stopped-Flow-Gerät kann mit mehreren Probenspritzenpumpen und Spritzen konfiguriert werden, um das Mischen von zwei oder mehr flüssigen Proben zu erleichtern. Diese Flexibilität ermöglicht die systematische Untersuchung von Additiven auf die interessierende Kinetik. Beispielsweise könnten verschiedene Volumina einer konzentrierten antimikrobiellen Peptidlösung mit H-Vesikel- und D-Vesikellösungen gemischt werden, um die Auswirkungen der Peptidkonzentration auf die Lipidaustauschkinetik zu untersuchen45,46. Da alle abgedichteten Flüssigkeitswege in einem temperaturgesteuerten Gehäuse untergebracht sind, das die Probenspritzen, Ventile, Mischer und Schläuche umfasst, kann die Temperatur des Systems außerdem geändert werden, um die thermodynamischen Parameter zu extrahieren, die sich auf die interessierenden kinetischen Prozesse beziehen.

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    Disclosures

    Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

    Acknowledgments

    Der Zugang zum NG3 VSANS wurde vom Center for High-Resolution Neutron Scattering bereitgestellt, einer Partnerschaft zwischen dem National Institute of Standards and Technology und der National Science Foundation im Rahmen der Vereinbarung Nr. DMR-2010792. M.H.L.N bedankt sich für die Finanzierung durch Mitacs Globalink (Kanada). Die Identifizierung kommerzieller Produkte oder Handelsnamen dient der Förderung des Verständnisses und impliziert keine Befürwortung oder Empfehlung durch das National Institute of Standards and Technology.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Dynamic mixer Analytical Scientific Instruments 462-0150A Magnetically coupled rotor, binary dynamic mixer assembly (ternary type available), 0.15 mL dead volume (larger dead volume available)
    Fluoropolymer tubing IDEX Health & Science 1507L PFA Tubing Natural 1/16 inch OD x 0.040 inch ID x 50 ft
    Fluoropolymer 1/4-28 flangeless fittings IDEX Health & Science XP-245 PFA flangeless fitting with ferrules, 1/4-28 threading, 1/16 inch OD tubing
    Glass syringes Hamilton Company 81660 Hamilton 1000 series syringes, 10 mL (81660), model 1010 C syr, 1/4"-28 thread termination, other volumes available
    High-pressure flow selector valves Vici Valco C85X-1570EUTB Vici 10 position selector valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
    High-pressure switch valves Vici Valco C82X-1574EUHB Vici 4 port switch valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
    High-pressure syringes Cetoni A2019000358 3 mL stainless steel syringe, 510 bar max, 21 mL/min flow rate max
    Low-pressure flow selector valves Vici Valco C25-3180EUHB Vici 10 position selector valves, max 250 psi liquid, 0.75 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 1/4-28 threaded ports, USB universal actuator
    neMESYS high-pressure syringe pumps Cetoni A3921000103 Max force 2600 N
    neMESYS mid-pressure syringe pumps Cetoni A3921000131 Max force 1000 N
    Power supply Cetoni A3921000127 Base 600, supplies power for up to 4 high pressure pumps
    Quartz flow-through sample cell Starna Scientific 3-2.30-Q-1/TC Quartz micro flow cells, 2 mm path length (1 mm available), 2 mm by 2 mm by 30 mm internal dimension
    Quartz windows Technical Glass Products NA GE 124 Clear fused quartz ground and polished plates, 11.75 inch by 23.75 inch by 0.375 inch thick
    Stainless steel 10-32 coned compression fittings IDEX Health & Science U-321X, U-320X 316 stainless steel ferrule (U-321X) and nut (U-320X) -Valco type, 10-32 coned, for 1/16 inch OD stainless steel tubing
    Stainless steel tubing IDEX Health & Science U-102 Stainless Steel Tubing 1/16 inch OD x 0.020 inch ID, 10 cm, various precut lengths available
    Syringe pump control software Cetoni T6000000004 QmixElements software for nemesys pumps, QmixSDK software development kit
    Thermoelectric air conditioner EIC Solutions AAC-140C-4XT-HC Thermoelectric air conditioner mounted on insulated enclosure to control the pump, valve, mixer, and sample temperature
    T-slot railing McMaster-Carr 47065T103 Aluminum t-slotted railing (1.5 inch by 1.5 inch) cut to various lengths
    Vapor locking bottle caps  Cole-Parmer EW-12018-02 Four 304 SS port inserts, 1/4"-28 threads, GL45 bottle cap size, PTFE body, SS threads, PP collar

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    References

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