Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Måling av tidsutviklingen av nanoskalamaterialer med stoppet strømning og småvinklet nøytronspredning

Published: August 6, 2021 doi: 10.3791/62873
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1, 1
1NIST Center for Neutron Research, National Institute of Standards and Technology, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of Windsor, 3Department of Physics, University of Windsor

Summary

Denne protokollen presenterer bruken av et prøvemiljø med stoppet strømning for raskt å blande flere flytende løsninger in situ under en liten vinkel nøytronspredningsmåling og for å studere kinetiske prosesser på nanometerlengdeskalaer og andre tidsskalaer.

Abstract

Denne artikkelen presenterer bruken av et prøvemiljø med stoppet flyt av liten vinkel nøytronspredning (SANS) for raskt å blande væskeprøver og studere nanoskala kinetiske prosesser på tidsskalaer fra sekunder til minutter. Prøvemiljøet med stoppet strømning bruker kommersielt tilgjengelige sprøytepumper for å blande de ønskede volumene av væskeprøver som deretter injiseres gjennom en dynamisk mikser i en kvartsglasscelle i ca. 1 s. Tidsløst SANS-datainnsamling synkroniseres med prøveblandingen for å følge utviklingen av nanostrukturen i oppløsning etter blanding.

For å utnytte nøytronstråletiden mest mulig effektivt, bruker vi en serie strømningsvelgerventiler for automatisk å laste, skylle og tørke cellen mellom målingene, noe som muliggjør gjentatt datainnsamling gjennom flere prøveinjeksjoner. Prøveinjeksjoner gjentas til tilstrekkelig nøytronspredningsstatistikk er samlet. Blandingsoppsettet kan programmeres til systematisk å variere forholdene for å måle kinetikken ved forskjellige blandingsforhold, prøvekonsentrasjoner, additivkonsentrasjoner og temperaturer. Minste prøvevolum som kreves per injeksjon er ca. 150 μL, avhengig av kvartscellens banelengde.

Representative resultater ved bruk av dette stoppede strømningsprøvemiljøet presenteres for rask lipidutvekslingskinetikk i nærvær av et additiv, cyklodekstrin. Vesiklene utveksler ytre brosjyre (eksteriør) lipider i størrelsesorden sekunder og utveksler fullt ut både indre og ytre lipider i løpet av timer. Måling av lipidutvekslingskinetikk krever in situ-blanding for å fange opp de raskere (sekunder) og langsommere (minutter) prosessene og trekke ut de kinetiske hastighetskonstantene. Det samme prøvemiljøet kan også brukes til å undersøke molekylær utveksling i andre typer væskeprøver som lipid nanopartikler, proteiner, overflateaktive midler, polymerer, emulsjoner eller uorganiske nanopartikler. Måling av nanoskala strukturelle transformasjoner og kinetikk av utveksling eller reagerende systemer vil gi ny innsikt i prosesser som utvikler seg på nanoskala.

Introduction

Småvinklet nøytronspredning (SANS) gir en unik måte å måle størrelser, former, interaksjoner og organisering av ulike materialer på lengdeskalaer fra ≈1 nm til ≈100 nm 1,2,3. Nylige instrumenter, inkludert VSANS (very small-angle neutron scattering) instrumenter med fokuseringsspeil, skyver grensene mot å måle enda større lengdeskalaer opp til ≈1000 nm 4,5. Generelt gir den unike spredningskontrasten som er forbundet med nøytronspredningsmetoder flere fordeler ved måling av tidsutviklingen av nanoskalastrukturer, for eksempel aggregering av komponenter i farmasøytiske formuleringer6, tverrbinding og geleringsreaksjoner i polymersystemer 7,8, i mesokrystallisering av membranproteiner9,10, nedbrytning og utfolding av proteiner11,12 , og vekst av silikabaserte materialer13,14,15. Den unike spredningskontrasten gjør tidsoppløst SANS (TR-SANS) til et nyttig supplement til andre stoppede strømningsbaserte målinger.

Blandingsmetoder med stoppet strømning implementeres ofte i småvinklet røntgenspredning (SAXS)16,17,18,19,20,21, fluorescensspektroskopi 22,23,24,25,26 og lysspredning27,28,29,30, 31,32 eksperimenter for å studere kinetiske prosesser på millisekund tidsskalaer. En viktig forskjell mellom SANS og SAXS er at nøytronspredning er en ikke-destruktiv karakteriseringsteknikk, og som sådan kan SANS brukes til å måle den samme prøven i timer eller dager uten ioniserende strålingsskade på prøven, noe som kan skje under røntgenspredningseksperimenter med høyere fluks33. Siden gjentatte SANS-målinger ikke vil endre den kjemiske strukturen til sondemolekylet eller prøven, kan tidsutviklingen studeres uten effekter av fotobleking, for eksempel, noe som kan komplisere kinetikkmålinger som er avhengige av fluorescens23,24. Videre kan SANS brukes til å måle svært konsentrerte og optisk ugjennomsiktige prøver som ofte er vanskelige å karakterisere med lysbaserte teknikker som dynamisk lysspredning.

I tillegg til å gi strukturell informasjon på nanoskala, kan SANS brukes til å undersøke den lokale sammensetningen av disse strukturene gjennom variasjonen i nøytronspredningslengdetetthetskontrast. Spredningslengdetettheten (SLD) av forskjellige elementer varierer tilfeldig over det periodiske systemet og varierer med forskjellige isotoper av samme element. Et vanlig utnyttet eksempel er hydrogen (1H eller H) og deuterium (2H eller D), som har svært forskjellige nøytronspredningslengder. Derfor kan hydrogenrike materialer, som overflateaktive midler, lipider, proteiner, RNA, DNA og andre polymerer, skilles fra deutererte løsningsmidler ved bruk av SANS uten å endre systemets fysiske egenskaper betydelig. Det er imidlertid viktig å merke seg at H/D-utveksling kan påvirke tettheten, hydrogenbindingen og faseovergangstemperaturene i prøven. Likevel er den unike følsomheten til SANS for hydrogenrike materialer spesielt nyttig i myk materieforskning hvor prøvene av interesse har lavere spredningskontrast og signal i røntgenbaserte teknikker som SAXS. Isotopisk substitusjon gjør også SANS til et kraftig verktøy for å studere molekylær utvekslingskinetikk i hydrogenrike materialer ved ganske enkelt å blande H-merkede og D-merkede molekyler. Isotopisk substitusjon er spesielt nyttig i systemer der klumpete fluorescerende fargestoffer er større enn overflateaktive eller lipidmolekyler av interesse og kan påvirke utvekslingskinetikken34,35.

Tidsoppløste SANS-målinger er fordelaktige fordi den målte intensiteten er en funksjon av tid, lengdeskala og SLD-kontrast. Som sådan kan TR-SANS-eksperimenter utformes for å undersøke de tidsavhengige endringene i de romlige fordelingene og komposisjonene til prøvene. Disse unike fordelene med SANS har ført til viktig innsikt i kinetiske prosesser i mange myke materialsystemer som overflateaktive stoffer 36,37,38, emulsjoner 39,40,41, lipider 34,42,43,44,45,46,47,48,49 ,50 og polymerene 51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62. De fleste TR-SANS-studier har fokusert på tidsskalaer fra minutter til timer. Imidlertid forekommer mange kinetiske prosesser av interesse på den andre tidsskalaen og er avgjørende for å forstå de underliggende mekanismene. Fangst av disse tidlige tidspunktene krever at løsningene raskt blandes og måles in situ, hvor blandingen synkroniseres med datainnsamling under stoppet strømningslysspredning 27,28,29,30,31,32, fluorescens 22,23,24,25,26 og røntgen 16,17,18,19,20,21 eksperimenter. Dette arbeidet beskriver bruken av et prøvemiljø designet for raskt å blande flere væskeprøver og injisere blandingen i en kvartsglasscelle for TR-SANS-målinger. Blandeanordningen er en tilpasning av den nylig utviklede kapillære rheoSANS-enheten63 og bruker flere sprøytepumper og ventiler for å kontrollere prøveblandingen og for å automatisere cellerengjøring. Ved å koble sprøytepumper til en serie strømningsvelgerventiler, kan flere innløpsstrømmer blandes, måles, skylles og tørkes gjentatte ganger for å lette TR-SANS-målinger på sekundets tidsskala.

Dagens prosedyre forutsetter at interesseprøvene er identifisert og utarbeidet. Vi fokuserer på in situ mikseoppsett og metoder for å samle inn TR-SANS-data. Data om nøytronspredning ble samlet inn på VSANS-instrumentet ved NIST Center for Neutron Research (NCNR); Framgangsmåten bør imidlertid få anvendelse på andre SANS-instrumenter. Lesere som er interessert i å implementere lignende protokoller på andre SANS-instrumenter, bør konsultere de lokale instrumentforskerne for å bestemme den optimale instrumentkonfigurasjonen for å maksimere nøytronfluks ved ønsket lengdeskala og tidsskala som er mest relevant for de kinetiske prosessene av interesse. Dataene som presenteres her ble samlet inn ved hjelp av den høye flukskonfigurasjonen "hvit stråle" på VSANS for å maksimere nøytronantallet ved tap av romlig oppløsning5. Detektorvognene ble plassert for å dekke en rekke spredningsvektorer (q), 0,005 Å-1 < q < 0,5 Å-1, tilsvarende lengdeskalaer fra ≈130 nm til ≈13 nm. Spredningsvektoren er definert som q = 4π/λ sin (θ/2) der λ er nøytronbølgelengden, og θ er spredningsvinkelen.

Blandeanordningen for stoppet strømning som brukes til TR-SANS-målingene, består av flere pumper, skyllesprøyter, prøvesprøyter, strømningsvelgere, samt adynamisk mikser, prøvecelle og blandet prøvebeholder, som vist i figur 1. Alle forseglede væskebaner er plassert inne i et luftkondisjonert kabinett, som inkluderer sprøyter, ventiler, tilkoblingsrør, dynamisk mikser og prøveceller. Et programmerbart termoelektrisk klimaanlegg brukes til å kontrollere kapslingstemperaturen i området fra 10 ° C til 50 ° C innen ± 1 ° C. Merk at noe av kabinettisolasjonen ble fjernet for å vise arbeidsdelene av enheten. Hovedblandeanordningskabinettet er plassert på et translasjonstrinn på NG3 VSANS-strålelinjen ved NCNR. Kaslingsposisjonen justeres ved hjelp av oversettelsestrinnet for å plassere prøvecellen i banen til nøytronstrålen (gul stiplet linje).

Figure 1
Figur 1: Et eksempeloppsett for å kombinere stopped-flow mixing og småvinklede nøytronspredningsmålinger ved VSANS-strålelinjen ved NIST Center for Neutron Research. Oppsettet inneholder fire sprøytepumper, to sprøyter for løsemiddelskylling og to sprøyter for prøveinjeksjon, fire pumpevelgerventiler, to mikservelgerventiler, en dynamisk mikser, en gjennomstrømningskvartscelle og en blandet prøvebeholder. Innfallende nøytroner sprer seg fra den blandede prøven som befinner seg inne i prøvecellen. Et isolert kabinett med kvartsvinduer og en termoelektrisk klimaanlegg brukes til å kontrollere prøven og alt utstyr ved konstant temperatur. Den gule stiplede linjen viser nøytronstrålebanen. Skala bar = 10 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Apparatet som er avbildet i figur 1 , er konfigurert med to prøvesprøyter, to skyllesprøyter og én prøvecelle. Tilsvarende flytskjemaer for de ulike trinnene i protokollen er illustrert i figur 2. De ønskede volumene av de to forskjellige prøvene injiseres i mikseren og prøvecellen (figur 2A). Når prøvecellen er fylt, lukkes innløpsbryterventilen (ISV) og utløpsbryterventilen (OSV) for å isolere prøvecellen fra den dynamiske mikseren og for å forhindre spredning av prøven tilbake i cellen under TR-SANS-datainnsamling (figur 2B). Før den dynamiske mikseren varierer tilkoblingsslangen i lengde fra 10 cm til 1 m og påvirker ikke blandeforsinkelsestiden. Rørforbindelser mellom den dynamiske mikseren og prøvecellen vil imidlertid påvirke blandeforsinkelsestiden og det nødvendige injeksjonsvolumet for prøven. Precut rustfritt stål rør med 0,04 tommer (1 mm) indre diameter og 100 mm lengde brukes til å koble den dynamiske mikseren, Mixer Selector Valves (MSV1 og MSV2), og ISV og OSV. Fluorerte slanger med en indre diameter på 1 mm og en lengde på 115 mm brukes til å koble ISV og OSV (eller det dynamiske mikseruttaket) til prøvecellen. Det totale tomromsvolumet som påvirker blandeforsinkelsestiden inkluderer blanderens tomromsvolum (0,15 ml), slangen mellom mikserutløpet og prøvecelleinntaket (0,09 ml) og prøvecellevolumet (0,16 ml). I dette eksemplet er det totale voidvolumet 0,4 ml. De interne tomromsvolumene til ventiler er ubetydelige sammenlignet med slange-, mikser- og prøvecelletomromsvolumene. For eksempel inneholder de anvendte lavtrykksvelgerventilene (0,75 mm borediameter) omtrentlige tomromsvolumer på 4 μL, mens høytrykksvelgerventilene og bryterventilene (0,25 mm borediameter) inneholder omtrentlige tomromsvolumer på 0,5 μL.

Etter at TR-SANS-målingen er fullført, skyves prøven ut av cellen med løsemiddel, og skyllevæske pumpes gjentatte ganger gjennom cellen for å fjerne restprøven og rengjøre prøvecellen (figur 2C). Merk at skyllesprøytene er koblet til større løsemiddelbeholdere (f.eks. vann og etanol) via pumpevelgerverdier for å sikre at tilstrekkelig løsemiddelvolum er tilgjengelig for å rengjøre prøvecellen mellom målekjøringene. Løsemiddelkilder, prøvekilder og blandede prøvebeholdere som inneholder brennbare væsker, er plassert i et separat kabinett uten elektrisk utstyr for å eliminere alle mulige tennkilder. I tillegg brukes damplåsende flaskekorker for å minimere brannfarlige damper og løsningsmiddelfordampning. Til slutt tørkes prøvecellen med en nitrogengasstrøm for å fjerne det gjenværende skylleløsningsmidlet (figur 2D). Innløpsnitrogengasstrykket til mikservelgerventilen reguleres til ca. 2 bar (0,2 MPa, målertrykk) ved hjelp av en manuell trykkregulator plassert på nitrogengassflasken. Når prøvecellen er tilstrekkelig rengjort og tørket, injiseres en nylig blandet prøve i prøvecellen for neste målesyklus (gjentar blandingen og injeksjonen illustrert i flytskjemaet i figur 2A).

Figure 2
Figur 2: Eksempel på flytskjema ved bruk av én prøvecelle, blanding av to prøver og to skylleløsningsmidler for rengjøring . (A) Blanding av prøve A (blå) og prøve B (rød), og deretter strømmer den blandede prøven (lilla) inn i prøvecellen. (B) Under datainnsamling angir stoppstrømningsanordningen der ISV- og OSV-bryterventilene er lukket for å isolere prøvecellen og forhindre tilbakediffusjon av prøven under datainnsamling. (C) Rengjøringstrinnene der prøvecellen skylles med skyllevæske fra SS1 (grønn) etter datainnsamling. (D) Tørketrinn der prøvecellen tørkes med nitrogengass (oransje). Forkortelser: PSV = pumpevelgerventil; MSV = mikservelgerventil; OSV = utløpsbryterventil; ISV = innløpsbryter ventil; SS1 = løsningsmiddelkilde 1; SSA = prøvekilde A; N2 = nitrogengasskilde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3 viser flytdiagrammer for en litt annen versjon der blandeoppsettet er konfigurert med to separate prøveceller koblet til de samme bryterventilene (figur 3A). Mens TR-SANS-data samles inn i prøvecelle 1, skylles prøvecelle 2 (figur 3B) og tørkes (figur 3C). Når datainnsamlingen er fullført for prøvecelle 1, dirigerer innløpsbryterventilen en nylig blandet prøve til prøvecelle 2 for datainnsamling (figur 3D). Mens TR-SANS-data samles inn i prøvecelle 2, skylles prøvecelle 1 og tørkes (figur 3E). Denne vekslende, parallelle prosessen mellom to prøveceller minimerer tiden mellom påfølgende prøveinjeksjoner og maksimerer bruken av nøytronstråletid.

Figure 3
Figur 3: Eksempel på flytskjema ved bruk av celler med to prøver, blanding av to prøver og to skylleløsningsmidler for rengjøring. (A) Blande prøve A (blå) og prøve B (rød) og deretter flyte den blandede prøven (lilla) inn i prøvecelle 1. (B) Tilstanden til enheten med stoppet strømning under datainnsamling på prøvecelle 1 mens prøvecelle 2 skylles med løsningsmiddel fra SS1 (grønn). (C) Tilstanden til enheten med stoppet strømning under datainnsamling på prøvecelle 1 mens prøvecelle 2 tørkes med nitrogengass (oransje). (D) Når datainnsamlingen av prøvecelle 1 er fullført, blandes en ny prøve (lilla) umiddelbart og strømmer inn i prøvecelle 2. (E) Tilstanden til enheten med stoppet strømning under datainnsamling på prøvecelle 2 mens prøvecelle 1 skylles med løsningsmiddel fra SS1 (grønn). Mens en prøvecelle måles, blir den andre prøvecellen rengjort og tørket. Måleprosessen for stoppet strømning veksler mellom to prøveceller for å minimere tiden mellom påfølgende injeksjoner for prøveblanding. Forkortelser: PSV = pumpevelgerventil; MSV = mikservelgerventil; OSV = utløpsbryterventil; ISV = innløpsbryter ventil; SS1 = løsningsmiddelkilde 1; SSA = prøvekilde A; N2 = nitrogengasskilde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

En trinnvis protokoll er beskrevet nedenfor for tilkobling av pumper og slanger, priming av systemet, skylling og tørking av prøvecellen og injisering av blandet prøve. Selv om enkeltcellekonfigurasjonen er demonstrert for enkelhet (figur 2), kan det fleksible modulære oppsettet, protokollen og skriptene enkelt endres for å implementere flere sprøytepumper, ventiler, miksere eller prøvecellekonfigurasjoner, for eksempel cellekonfigurasjonen med to prøver vist i figur 3. Representative data om rå nøytrontall samlet inn gjennom blandings- og rengjøringsinjeksjonssykluser er vist i figur 4, mens lipidutvekslingskinetikk målt ved 3 forskjellige temperaturer og den ekstraherte normaliserte spredte intensiteten tilsvarende fraksjonen av lipider utvekslet er vist i henholdsvis figur 5 og figur 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sett opp og start stopp-flow-systemet.

  1. Slå på alle pumpestrømforsyninger og dynamiske miksere ved hjelp av strømbryteren.
  2. Start alle pumper og ventiler i det grafiske brukergrensesnittet for systemkontroll med stoppet strømning (GUI) ved å angi enhetskonfigurasjonsbanen og bruke kommandoene bus=qmixbus. Buss(), bus.open(), bus.start(), pumpe=qmixpump. Pump(), pump.enable() og valve=ViciMultiposSelector() (se eksempel på startkode tilgjengelig i et online open source-depot64).
  3. Kalibrer pumpene før du fester sprøyter ved hjelp av kommandoen pump.calibrate().
  4. Bekreft at ventilene er startet og flytt til riktig velgerport på kommando ved hjelp av kommandoen valve.setPort() og valve.getPort().
  5. Tilordne sprøytetypen som skal brukes for hver pumpe ved hjelp av kommandoen pump.set_syringe_param(A, B), der A er sprøytesylinderens indre diameter (mm), og B er sprøytens maksimale stempelslagavstand (mm).
  6. Koble prøvesprøytene til sprøytepumpene.
    1. Etter å ha forsikret deg om at pumpene er kalibrert, skru inn rene sprøytefat til tilkoblingen på toppen av pumpen (sprøytemonteringshode).
    2. Når du bruker sprøyter av glass, må du sørge for at sprøytemonteringshodet løsnes før fyllvolumet dispenseres, slik at glasssprøyten ikke går i stykker på grunn av overdreven kraft fra sprøytestempelet.
    3. Skru inn sprøytestempelet til tilkoblingen i bunnen av pumpen (sprøytemonteringshale).
    4. Etter at sprøytesylinderen og sprøytestempelet er koblet til pumpen, dispenserer fyllvolumet av sprøytetypen ved hjelp av kommandoen pump.empty(), som flytter sprøytestempelet til toppen av sprøytesylinderen.
    5. Når du bruker glasssprøyter, stram sprøytemonteringshodet etter at stempelbevegelsen stopper.
  7. Koble slangen til prøve- og løsningsmiddelkilder, sprøyter, ventiler, miksere, prøveceller og blandet prøvebeholder.
    1. Koble sprøytepumpeslangen til pumpevelgerventilene.
    2. Koble ventilslangen for pumpevelgeren til prøvekildene.
    3. Koble ventilslangen for pumpevelgeren til kildene for skylleløsningsmiddel.
    4. Koble pumpevelgerventilslangen til blanderens ventilslange.
    5. Koble blandervelgerens ventilrør til nitrogengasskilden.
    6. Koble ventilslangen til mikservelgeren til blanderens innløp.
    7. Koble mikserutløpet til innløpsbryterventilen.
    8. Koble innløpsbryterventilen til prøvecelleinnløpet.
    9. Koble prøvecelleuttaket til utløpsbryterventilen.
    10. Koble utløpsbryterventilen til den blandede prøvebeholderen.
  8. Definer alle slange- og ventiltilkoblinger som er gjort (trinn 1.7) i kontroll-GUI-en for stoppet strømningssystem ved å skrive inn de tilsvarende portnummertilkoblingene som er gjort til hver ventil (se eksempelkontrollkode i det elektroniske depotet med åpen kildekode64).
  9. Beregn tomromsvolumet til slangen mellom mikserinnløpet og prøvecelleutløpet, som definerer den minste mengden prøve som trengs for å fylle prøvecellen for hver måling.

2. Legg i prøven.

  1. Still inn ønsket prøvefyllvolum og løsemiddelfyllvolum i det stoppede strømningssystemkontroll-GUIet ved å skrive inn de ønskede tallene (se eksempelkontrollkode i det elektroniske open source-depotet64).
  2. Bruk kommandoen pump.aspirate () til å trekke inn (aspirere) ønsket prøve- og løsningsmiddelvolum fra kildene inn i prøvesprøytene gjennom pumpevelgerventilene.
    MERK: Når en tom sprøyte settes i første gang, vil det være luft på toppen av sprøyten som må renses for å fylle systemet med prøve og oppløsningsmiddel i trinn 3.

3. Prime systemet.

  1. Bruk kommandoen pump.dispense() til å skyve ut (dispensere) all luft fra sprøyter, slangerør og ventiler. Sørg for at nok væskevolum dispenseres fra hver sprøyte for å fjerne all luft helt fra sprøytene, slangen og ventilene. Hvis luftbobler er synlige inne i en slange, fortsett å dispensere oppløsningsvæske eller prøve til boblene er fjernet.
  2. Når luften er renset fra systemet, utfør minst én injeksjons- og skylleprosedyre (uten at nøytronspredningsdata er samlet inn).
    1. Klikk for å merke cellen merket Start blandingseksperimentet i kontroll-GUI-en.
    2. Når denne cellen er aktivt valgt, klikker du på Kjør-knappen (høyre trekant) øverst på kontroll-GUI-en, eller trykker på Skift- og Enter-tastene sammen på tastaturet.
    3. Inspiser prøvecellen visuelt for å bekrefte at luftbobler ikke er tilstede.
      1. Hvis det er luftbobler, gjenta protokolltrinn 3.1 og 3.2 for å rense eventuell luft fra slangeledningene ytterligere.
      2. Hvis det ikke finnes luftbobler i prøvecellen, går du videre til trinn 4 for å definere de gjenværende trinnene i eksperimentprotokollen.

4. Definer mixing-protokollen for stoppet flyt i programskriptet (se kodeeksempel i det elektroniske open source-depotet64).

  1. Angi temperatursettpunktet til det programmerbare klimaanlegget (AC) som styrer temperaturen på det isolerte kabinettet som omgir stoppstrømningsanordningen.
    1. Mens du holder stjerneknappen på AC-kontrollenheten, trykker du på opp - og nedpilene for å endre settpunkttemperaturen. Alternativt kan du skrive inn ønsket temperatursettpunkt i kontroll-GUI-en og klikke på Kjør.
    2. Vent i 15-30 minutter for å la kabinettet balansere ved ønsket temperatur før du starter de kinetiske eksperimentene.
      MERK: Det tilgjengelige temperaturområdet er for tiden mellom 10 °C og 50 °C, og temperaturstabiliteten er ± 1 °C.
  2. Angi alle trinn for skyllesekvens ved å skrive inn riktige volumer, strømningshastigheter, tider og antall repetisjoner i kontroll-GUI-en.
    1. Definer volumet av hver prøve som skal injiseres, som definerer den totale strømningshastigheten (Q).
    2. Definer volumet av hver oppløsningsvæske som skal injiseres under skylleprosedyren.
    3. Definer tørketiden mellom hvert undertrinn for skylling (t tørt).
    4. Definer antall undertrinn for skylling.
    5. Definer de forskjellige løsningsmidlene for de påfølgende skylletrinnene.
    6. Definer antall skyllingsrepetisjoner som skal utføres etter hver måling (nskyll).
    7. Definer tidspunktet for å tørke prøvecellen og mikseren helt, og gi en ren prøvecelle for den påfølgende prøveinjeksjonen (tdry_final).
  3. Definer alle trinn i prøveinjeksjonssekvensen ved å skrive inn riktige volumer, strømningshastigheter og tider i det kontrollerende GUI-et for stoppet flytsystemkontroll.
    1. Definer volumet av hver prøve som skal injiseres og strømningshastigheten.
    2. Beregn forsinkelsestiden (tforsinkelse) fra voidvolumet (Vvoid) og den totale strømningshastigheten (tdelay = Vvoid / Q).
      MERK: Forsinkelsestiden er tiden det tar å fylle prøvecellen med den blandede prøven.
    3. Definer ønsket innsamlingstid for TR-SANS-dataene slik at hele den kinetiske prosessen av interesse har skjedd (tscatt).
    4. Angi ventetiden mellom slutten av spredningseksperimentet og begynnelsen av skyllesyklusene (tvent).
      MERK: Denne ventetiden bør være minst 100 s hvis nøytronoverføringen skal måles før den skylles fra cellen. Prøveoverføringen er nødvendig under databehandling for å redusere dataene til absolutt intensitet.
    5. Definer antall injeksjonssykluser som skal utføres med skyllesekvenser mellom hver injeksjon som er definert i trinn 4.2 (nsyklus).
  4. Beregn den totale tiden for en enkelt stoppet strømningsdatainnsamlingssyklus (t-syklus) ved hjelp av ligning (1).
    tsyklus = nskyll × (t forsinkelse + ttørr) + tdry_final + tforsinkelse + tscatt (1)
    der nskyll = antall skyllende repetisjoner (trinn 4.2.6); tforsinkelse = forsinkelsestid for den stoppede strømningsenheten (trinn 4.3.2); ttørr = tørketid mellom hvert skylletrinn (trinn 4.2.3); tdry_final = tid til å tørke prøvecellen og mikseren helt (trinn 4.2.7); tscatt = ønsket TR-SANS datainnsamlingstid (trinn 4.3.3)

5. Definer de småvinklede nøytronspredningsparametrene i SANS-instrumentkontroll-GUI.

  1. Bestem lengdeskalaene og q-området av interesse for hver prøve.
  2. Definer instrumentkonfigurasjonen for å dekke ønsket q-område av interesse, samtidig som du maksimerer nøytronfluksen ved prøven.
  3. Sett den totale VSANS-datainnsamlingstiden i SANS-instrumentkontroll-GUI til den beregnede syklustiden i trinn 4.4 (nøytronspredning, datainnsamlingstid =t-syklus).
  4. Sett måletiden for prøveoverføring til 100 s i GUI-en for SANS-instrumentkontroll.
  5. Bruk GUI-en for SANS-instrumentkontroll til å slå på datainnsamling i hendelsesmodus ved å skrive GenerateEventModeData true på kommandolinjen.

6. Samle standard spredningsmålinger for datareduksjon før du begynner stoppet strømningseksperimentet for å behandle TR-SANS-dataene.

  1. Mål bakgrunnsspredningen.
    1. Kontroller at lukkeren for det lokale instrumentet er lukket.
    2. Fest den blokkerte stråleprøven på baksiden av prøveåpningen, fest det lokale instrumentmiljøet og åpne den lokale instrumentlukkeren.
    3. Definer den blokkerte strålespredningsdatainnsamlingstiden i programvaren, og samle blokkerte strålespredningsdata, regnet med samme varighet som den lengste spredningsdatainnsamlingstiden (t scatt).
    4. Når datainnsamlingen er fullført, lukker du instrumentlukkeren og fjerner den blokkerte stråleprøven fra prøveåpningen.
  2. Mål spredningen av tomme celler.
    1. Forsikre deg om at prøvecellen er grundig skyllet og tørket.
    2. Åpne lukkeren for det lokale instrumentet.
    3. Samle måling av tom celleoverføring i 100 s.
    4. Samle måling av spredning av tomme celler, som teller minst den lengste anskaffelsestiden (tscatt).

7. Start eksperimentet med stoppet flyt.

  1. Start datainnsamling av VSANS-spredning i hendelsesmodus .
    1. Kontroller at det lokale instrumentområdet er sikkert, og åpne deretter den lokale instrumentstrålelukkeren.
    2. Start innsamlingen av SANS-data ved hjelp av SANS-instrumentstyringsprogramvaren på instrumentdatamaskinen ved å dra og slippe de ønskede kjøringene i instrumentkøen.
      MERK: For å sikre at de tidligste tidspunktene måles, må du starte datainnsamlingen før du starter eksperimentet med blanding med stoppet flyt. Dataene vil bli etterbehandlet på et senere trinn for å ta hensyn til forsinkelsestiden (tforsinkelse).
  2. Start eksperimentet med blanding med stoppet flyt i kontroll-GUI-en.
    1. Velg notatblokkcellen merket Start blandingseksperimentet i det systemkontrollerende GUI-et for stoppet flyt.
    2. Når denne cellen er aktivt valgt, klikker du på Kjør-knappen (høyre trekant) øverst i kontrollprogrammet for stoppet flyt, eller trykker på Skift - og Enter-tastene sammen på tastaturet.
    3. Bekreft at blandeprotokollen for stoppet flyt som er definert i avsnitt 4, har begynt å fungere.
    4. Legg til 100 s overføringsmåling i VSANS-instrumentkøen etter spredningskjøringen ved hjelp av SANS-instrumentkontroll-GUI.
    5. Legg til én spredningsmålingskjøring og én transmisjonsmålingskjøring i instrumentkøen for hver gjenværende blandesyklus med stoppet strømning (nsyklus - 1, trinn 4.3.5) i SANS-instrumentkontroll-GUI.

8. Behandle og redusere data for å fjerne alle bakgrunner, korrigere for detektorfølsomhet og korrigere for prøveoverføring.

  1. Last ned spredningsdatafilene og tilhørende hendelsesfiler fra serveren.
    MERK: Separate detektorhendelsesfiler genereres etter hver VSANS-måling, én hendelsesfil for hver aktive detektorvogn (f.eks. foran, midtre og/eller bakre detektor).
  2. Bin spredningsdataene til ønskede tidskasser ved hjelp av kommandoen hendelser = Rebin (filnavn) etterfulgt av kommandoen events.do_rebinning (tidsbinger), der inngangsfilnavnet tilsvarer navnet på ønsket SANS-datafil, og tidsbinker er en liste over ønskede tidskassegrenser i sekunder.
    MERK: Hvis inngangstidskassene er angitt som et enkelt nummer i stedet for en liste, blir dataene binned i N antall hyller med like tidsbredder, hvor N er inngangstidsbingene (se programvareskript levert av strålelinjen og tilgjengelig online åpen kildekode-depot64).
  3. Reduser de binned spredningsdataene ved hjelp av programvaren som følger med strålelinjen65.

9. Analyser TR-SANS-dataene.

  1. Beregn prosesstiden av interesse (tprosess) fra måletidspunktene ved hjelp av ligning (2).
    tprosess = ti - tstopp + tforsinkelse (2)
    Hvor ti er måletidsintervallene som starter etter at strømmen er stoppet, tstopp er måletiden umiddelbart når strømmen stoppes, og tforsinkelse er forsinkelsestiden.
  2. Plott den q-avhengige intensiteten I (q) som en funksjon av prosesstiden ved hjelp av tidskassene som er definert i trinn 8.2 ogt-prosessen beregnet i trinn 9.1.
    MERK: Den tidligste tilgjengelige behandlingstiden er begrenset av tforsinkelse. For å måle tidligere prosesstider, øk den totale strømningshastigheten (Q) eller reduser det totale tomromsvolumet (V-tomrom).
  3. Trekk ut de kinetiske parametrene av interesse fra endringen i I (q) som en funksjon av prosesstid.

10. Avslutt eksperimentet.

  1. Slå av nøytronstrålen ved å lukke den lokale instrumentlukkeren.
  2. Utfør en strålingskontroll ved hjelp av en strålingsmonitor levert av strålelinjen før du kobler fra deler, slanger eller losser prøver eller blandede prøvebeholdere.
  3. Overfør sprøytene, slangen og blandede prøvebeholderen til helsefysikkavdelingen.
  4. Fyll ut helsefysikkskjemaer og vent på evaluering av helsefysikkpersonell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De representative nøytrondataene vist her måler lipidutvekslingskinetikk i nærvær av metyl-β-cyklodekstrin (mβCD), et additiv som katalyserer lipidutvekslingen mellom vesikler med valutakursen (ke) 66,67. Tidligere fluorescensstudier har vistat k e avhenger av mβCD-konsentrasjonen, og halveringstiden til utvekslingsprosessen er i størrelsesorden minutter68. De nåværende forsøkene bruker stoppet flyt TR-SANS for å måle mβCD-katalysert lipidutveksling mellom vesikler på sekunders tidsskala. To isotopisk distinkte lipidvesikkelpopulasjoner ble fremstilt; den ene vesikkelpopulasjonen ble fremstilt med halehydrogenerte dimyristoylfosfatidylkolinlipider (DMPC) lipider (H-lipidvesikler i figur 5), og den andre vesikkelpopulasjonen ble fremstilt med haledeutererte DMPC (DMPC-d54)-lipider (D-lipidvesikler i figur 5). En molfraksjon på 0,05 (5 mol%) ladet dimyrisotylfosfatidylglyerkol (DMPG) lipid ble tilsatt til både DMPC og DMPC-d54 tørr lipidpulver for å fremme unilamellar vesikkeldannelse69.

Separate H-vesikkel- og D-vesikkelløsninger ble fremstilt ved å hydrere de respektive lipidfilmene i et løsningsmiddel inneholdende 45 volumprosent tungtvann (D2O) og 55 volumprosent vann (H2O). D 2 O/H2O løsningsmiddelsammensetningen ble beregnet slik at nøytronspredningslengdetettheten (p) av løsningsmidlet matchet en tilfeldig blanding av H-lipidene og D-lipidene (Δρ = ρlipid- ρløsningsmiddel = 0). Med andre ord vil en tilfeldig blandet H / D-vesikkel være "usynlig" for nøytronene og generere null sammenhengende nøytronspredning. Unilamellare vesikkelløsninger ble fremstilt ved frysetining av løsningene fem ganger og deretter ekstrudering av de enkelte løsningene gjennom et polykarbonatfilter med 100 nm diameter porer. Vesikkeloppløsningene ble ekstrudert frem og tilbake mellom to sprøyter og filteret totalt 31 ganger ved 30 °C. Deretter ble et lite volum av en konsentrert mβCD-stamløsning fremstilt i samme D2O/H2O-løsningsmiddelblandingtilsatt til vesikkelløsningene. Den endelige lipidkonsentrasjonen var 14 mmol/l (mM) og mβCD-konsentrasjonen var 30 mM. De individuelle vesikkeloppløsningene ble likevektet i minst 30 minutter med tilsatt mβCD før oppløsningene ble lagt inn i prøvesprøytene i blandeanordningen for stoppet strømning.

Et eksempel på de målte nøytrontallene over flere injeksjonssykluser er vist i figur 4A. Hver syklus besto av 9 skylletrinn, 1 tørketrinn og 1 injeksjonsprøvetrinn. Bare tellehastigheter målt på den midtre detektorvognen i VSANS-instrumentet presenteres for klarhet. Lignende trender ble funnet på den fremre detektorvognen, som korresponderte med data samlet inn ved større spredningsvinkler eller høyere q-verdier. Tellehastigheten økte med hver injeksjon av skyllevæske (oppløsningsmiddel S1 og oppløsningsmiddel S2) og gikk tilbake til baseline-tellingen av tomme celler når løsningsmidlet ble presset ut av cellen med nitrogengass og tørket. Den endelige celleskyllingen var med S2, som var etanol i dette eksemplet, og cellen ble tørket en siste gang med nitrogengass i 3 min før prøveinjeksjon. Kort tid etter at prøven ble injisert i cellen, økte nøytrontallet, og data ble samlet kontinuerlig i 5 minutter. Den representative prøven injisert i eksempeldataene i figur 4A var en saltbufferbakgrunn. Svingningene i målt intensitet over tid reflekterer variasjonene i bakgrunnsantallet nøytroner og reflekterer ikke en endring i gjennomsnittlig prøvesammensetning. Den komplette syklusen med skylling, tørking, blanding og injeksjon av prøver ble gjentatt en ekstra gang i eksemplet i figur 4A, hvor hver syklus varte i totalt 15 minutter.

De individuelle H-merkede og D-merkede lipidvesikkelløsningene ble blandet på tidspunktett-blanding og strømmet umiddelbart inn i prøvecellen. Den målte nøytrontellingshastigheten økte og nådde deretter en maksimumsverdi når prøvecellen ble fylt vedt-fylling, som vist i figur 4B. Tiden som kreves for å fylle prøvecellen kalles forsinkelsestiden tforsinkelse og er gitt ved tdelay = tfill- tmix. Hvis voidvolumet (V void) mellom mikseren og prøvecellen er kjent og den totale strømningshastigheten (Q) er kjent, kan t delay også beregnes som tdelay = Vvoid / Q (se protokoll trinn 4.3.2), som også er gjennomsnittlig oppholdstid for væskeprøven å komme inn i mikseren og forlate prøvecellen. Etter å ha nådd tfylling, ble strømmen fortsatt med en konstant strømningshastighet for å sikre at cellen hadde fylt og nådd steady-state. Strømmen ble da umiddelbart stoppetved stopp. Den gjennomsnittlige nøytrontellingshastigheten forble konstant som en funksjon av måletiden mellom t-fylling ogt-stopp fordi strømningshastigheten gjennom prøvecellen var konstant, og derfor var prøven i nøytronstrålebanen i steady-state. Dataene målt vedt-stopp tilsvarer med andre ord prøven som har blitt blandet og utviklet av tdelay = tfill- tmix = Vvoid/Q. De binned måletidene ti samlet umiddelbart etter tstopp er de viktigste kinetiske dataene av interesse.

I figur 4C er nøytronantallet fra den blandede lipidvesiklerprøven ved tre forskjellige temperaturer plottet som en funksjon av den korrigerte prosesstidsskalaen (t-prosessen), som er prosesstiden av interesse som er korrigert for steady-state strømningsperiode og forsinkelsestid. Prosesstidsskalaen ble beregnet ved t prosess = ti- t stopp + tforsinkelse, eller tilsvarende, tprosess = t i- tstopp + tfill- tmix. SANS-data ble samlet inn fortløpende i figur 4 i såkalt hendelsesmodus. Under datainnsamling i hendelsesmodus registreres hver oppdagede nøytronhendelse med et unikt tidsstempel og dets x- og y-plassering på den todimensjonale nøytrondetektoren. Data fra hendelsesmodus blir deretter etterbehandlet til de ønskede tidsintervallene (t i)i figur 4B.

Hendelsesmodusdata innenfor det tilgjengelige prosesstidsvinduet av interesse (dvs. nøytronspredning samlet inn ved hver t i ettert-stopp i figur 4B) ble rekonstruert til et todimensjonalt (2D) detektorbilde for den tiden ved hjelp av protokoller og skript tilgjengeligi det elektroniske open source-depotet64. Hvert 2D-detektorbilde ble deretter behandlet ved hjelp av datareduksjonsrutiner for å trekke fra de forskjellige bakgrunnskildene, korrigere for prøveoverførings- og detektoreffektiviteten, og azimuthally integrere 2D-detektordataene i intensitetsplott (I) vs. spredningsvektor (q)65. Dataene i figur 5 ble delt inn i like (3 s) tidsintervaller og er representative for tids- og lengdeskalaavhengig informasjon som kan oppnås fra en TR-SANS-måling. I likhet med den totale råtellingshastigheten vist i figur 4B, reduseres den q-avhengige intensiteten I (q) i tid når lipidene i den ytre brosjyren utveksles og blandes tilfeldig mellom forskjellige vesikler.

Data er presentert i figur 5 for lipidbyttekinetikken målt ved 3 forskjellige temperaturer. Hvert plott viser dataene som er samlet inn de første 110 minuttene etter blanding. Den målte intensiteten avtar med en størrelsesorden ved de laveste q-verdiene ved 36 °C og 30 °C, som tilsvarer lipidvæskefasen. I mellomtiden endres de spredte intensitetsdataene betydelig langsommere med tiden ved 20 ° C, noe som indikerer at den ytre brosjyreutvekslingskinetikken er mye langsommere i lipidgelfasen.

Den målte spredningsintensiteten, I (q), er relatert til SLD-kontrasten som Equation 1, hvor Δρ er SLD-forskjellen mellom vesikkelen og det omkringliggende løsningsmidlet. Denne gjennomsnittlige SLD-kontrasten er direkte relatert til det relative antallet H-lipider og D-lipider i en vesikkel til enhver tid. Som sådan kan den målte spredningsintensiteten på et gitt tidspunkt normaliseres for å bestemme brøkdelen av lipidpopulasjonen som har utvekslet. Denne normaliseringen oppnås ved å samle to tilleggsmålinger, inkludert: (1) den målte intensiteten I (0) på tidspunktet t = 0, når det ikke er lipidutveksling mellom vesikler, og (2) den målte intensiteten I (∞) på tidspunktet t = ∞, når alle lipidene har utvekslet og populasjonene har likevektet. Den normaliserte tellehastigheten, 42, Equation 2 er plottet som en funksjon av prosesstiden for de forskjellige temperaturene i figur 6. I dette eksemplet er I (t) den q-integrerte intensiteten ved prosesstid t (bakgrunnsfratrukket intensitet integrert som en funksjon av q), I (∞) er q-integrert intensitet på uendelig tid etter at alle lipider har utvekslet (som skal være lik løsningsmiddelbakgrunnsspredningen), og I (0) er q-integrert intensitet på tidspunktet t = 0 (uten lipidutveksling). I(0) ble målt for en blandet prøve under faseovergangstemperaturen ved 20 °C der utvekslingen var langsom, og I(∞) ble målt i en separat prøve som hadde likevektet i mer enn 36 timer ved 40 °C og hadde og fullt utvekslet H-lipider og D-lipider.

Den normaliserte tellingsraten skal henfalle fra R(t) = 1 ved prosesstidspunktet t = 0, til R(t) = 0 ved t = ∞, og er direkte relatert til SLD-kontrast i prøven og dermed omfanget av lipidutveksling 27,28,29,30,31,32,33,34,35 . Legg merke til at de tidligste målte R (t) -dataene ikke begynner ved R (t) = 1 ved 30 ° C og 36 ° C, noe som indikerer at en signifikant mengde lipidutveksling skjedde i løpet av de første 3 s etter blanding, som ikke var eksperimentelt tilgjengelig på grunn av forsinkelsestiden (tforsinkelse = 2,4 s) av den anvendte stopp-flow blandingsprotokollen. Samtidig holdt den målte R(t) ved 20 °C seg omtrent konstant de første (2-3) minuttene. For lipidutvekslingskinetikken målt ved 30 ° C og 36 ° C, falt R (t) raskt til ≈0,5 innen 100 s, noe som tyder på at lipidene i ytre brosjyren har fullstendig utvekslet og likevektet i løpet av minutter. Følgelig ble fangst av mβCD-katalysert lipidutveksling gjort mulig ved bruk av stopp-flow SANS og ville være vanskelig å fange med manuell pipetteblanding. Registrering av enda tidligere prosesstidspunkter (t < 3 s) vil kreve en annen miksertype med mindre tomromsvolum, mindre rørtomromsvolumer og høyere totale strømningshastigheter for å redusere forsinkelsestiden.

R (t) fortsatte å forfalle på lengre tider som lipidene flip-flop mellom indre og ytre brosjyrer. TR-SANS-data for den langsommere flip-flop-prosessen (t > 5 min) kan samles inn med diskrete prøver blandet for hånd og lastes inn i standard SANS-prøveceller, da den manuelle pipetteblandingsmetoden tar ca. 5 minutter. På samme måte var lipidutvekslingen ved 20 °C i lipidgelfasen langsom nok til å blandes og måles diskret, og denne målingen trengte ikke nødvendigvis å studeres med stoppet strømningsblandingsmetode. Målinger av kinetikkprosesser på tidsskalaer fra flere minutter til timer er mer effektive når prøvene blandes ved manuell pipetteblanding. Kinetiske prosesser på tidsskalaer mindre enn minutter vil imidlertid kreve denne måleprosedyren for stoppet strømning og TR-SANS.

Figure 4
Figur 4: Representative data om rå nøytrontall samlet inn gjennom blande- og rengjøringsinjeksjonssykluser. (A) Eksempel på nøytrontellingshastigheten (midtdetektoren) som en funksjon av tid under gjentatte skyllesekvenser, tørkesekvens og blandet prøveinjeksjonssekvens over flere sykluser. Utvalget i (A) var en saltbufferbakgrunn, og endringene i intensitet over tid gjenspeiler variasjonene i bakgrunnstellingsraten, ikke en endring i utvalget. (B) Monitor-normalisert nøytrontellingshastighet som en funksjon av eksperimentet tid etter injeksjon av blandede H-lipid og D-lipidvesikler ved 30 ° C. De loddrette stiplede linjene angir blandingens starttid (t-blanding), fylletid (t-fyll), flytstopptid (t-stopp) og tidsbinningsområde (ti). Forfallet i tellehastighet ettert-stopp skyldes tap av kontrast i prøven som lipidutveksling mellom vesikler. (C) Overvåk normaliserte nøytrontellingshastigheter som en funksjon av utvekslingsprosesstid for de første 100 s av eksperimentet ved (blå) 20 °C, (grønn) 30 °C og (rød) 36 °C. Hendelsesmodusdataene behandles i 1 s bins. Forkortelser: S1 = løsemiddel 1; S2 = løsningsmiddel 2; t-blanding = eksperimenttidspunkt hvor prøveløsningene blandes; tfill = eksperimenttidspunktet da prøvecellen fylles ut; tstop = eksperimenttid hvor strømmen stoppes; tprosess = beregnet kinetisk prosesstid av interesse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Illustrasjon av katalysert utveksling av det ytre laget av lipidvesikler og tilsvarende endringer i den spredte intensiteten (I) som funksjon av spredningsvektoren (q) ved forskjellige temperaturer. Skjematisk fremstilling av lipidutveksling mellom H-lipid og D-lipidvesikler etter (A) initial blanding ved t = 0 og (B) utveksling av det ytre laget katalysert av metyl-β-cyklodekstrin (mβCD). Redusert nøytronspredningsintensitet som funksjon av spredningsbølgevektor q. Eksperimenter med blanding av stoppede strømninger og VSANS-målinger ble gjentatt ved (C) 36 °C, (D) 30 °C og (E) 20 °C. De presenterte dataene ble binned i 3s intervaller i løpet av de første 10 minuttene etter blanding ved hver spesifisert temperatur. Feilfelt er den forplantede usikkerheten fra tellestatistikken og representerer ett standardavvik. Forkortelser: ke = hastighetskonstant for intervesikkellipidutveksling; mβCD = metyl-β-cyklodekstrin; kf = hastighetskonstant for lipidutveksling mellom brosjyrer, også referert til som lipid flip-flop; l (q) = målt SANS-intensitet med enheter av cm-1 ; q = spredningsvektor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Normalisert spredt intensitet tilsvarende fraksjonen av lipider utvekslet som kan modelleres for å trekke ut hastighetskonstanter for de kinetiske prosessene av interesse . (A) Lipidutveksling mellom vesiklens ytre pakning som forekommer i tidsskalaer mellom 3 s og 600 s målt ved (blå) 20 °C, (svart) 30 °C og (rød) 36 °C. Innfellingen i figuren zoomer inn på de første 60 årene av den kinetiske prosessen. Feilfelt er den forplantede usikkerheten fra den numeriske integrasjonen av spredningsintensitetene og representerer ett standardavvik. Forkortelser: R(t) = normalisert spredt intensitet; tprosess = korrigert prosesstid av interesse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den gjeldende prosedyren beskriver blandeanordningen og trinnene for å utføre TR-SANS-målinger med stoppet strømning. Enheten og protokollen er optimalisert for væskeprøver med lav viskositet der tidsskalaene av interesse er ≈1 s til 5 minutter. For tidsskalaer større enn 5 minutter kan det være enklere og ønskelig å blande prøvene manuelt og legge dem inn i standard spredningsceller, spesielt for prøver med høy viskositet, geler eller pastaer. Tilgang til tidsskalaer mindre enn 1 s krever et annet blandeapparat, lavere totale tomromsvolumer og høyere totale strømningshastigheter for å redusere forsinkelsestiden. Det er også viktig å merke seg at studier av kinetiske prosesser på disse korte tidsskalaene sannsynligvis vil kreve gjentatte prøveinjeksjoner for å akkumulere tilstrekkelig spredningstellingsstatistikk på millisekundtidsskalaen med TR-SANS. Hvis det totale prøvevolumet er begrenset, kan det være ønskelig å bruke en høyere fluksteknikk, for eksempel lysspredning eller røntgenspredning, som krever færre prøveinjeksjoner eller mindre prøvevolum per injeksjon, forutsatt at tilstrekkelig spredningskontrast eksisterer med lys eller røntgenspredning.

Denne modulære stopped-flow SANS-tilnærmingen skaper flere viktige fordeler og ulemper sammenlignet med kommersielt tilgjengelige stoppede strømningsinstrumenter som er optimalisert for nøytronspredningseksperimenter. Viktige fordeler inkluderer (1) alternerende TR-SANS-målinger mellom forskjellige prøveceller i skylleperioder for å maksimere bruken av nøytronstråletid, (2) tilpasning av antall sprøyter, sprøytevolumer og miksertyper for ternær prøveblanding eller andre mer komplekse prøveblandingskrav, og (3) å tillate lengre måleperioder ved å isolere prøvecellen og eliminere tilbakediffusjon på lengre tidsskalaer (>10 min). Selv om det ikke er implementert her, vil modulariteten til blandecelledesignet også tillate samtidig datainnsamling med flere målemetoder, for eksempel kaming av SANS, UV-Vis og fluorescensmålinger70. To viktige ulemper med dette modulære oppsettet inkluderer (1) relativt lengre blandeforsinkelsestider (1 s til 3 s) sammenlignet med andre systemer som kan gi forsinkelsestider på 1 ms til 100 ms, og (2) et mindre driftstemperaturområde (10 °C til 50 °C) sammenlignet med andre tilgjengelige systemer som kan få tilgang til driftstemperaturer fra -20 °C til større enn 80 °C.

Innsamling av foreløpige SANS-data om prøvene av interesse før utførelse in situ blandingseksperimenter er viktig for å samle de beste TR-SANS-dataene, spesielt i eksperimenter designet for å overvåke molekylær utvekslingskinetikk, som eksemplet presentert her. Bestemmelse av nøyaktige verdier av I (0) og I (∞) er avgjørende for å beregne nøyaktige verdier for normalisert intensitet, R (t), som er modellert for å trekke ut de ønskede kinetiske parametrene. Verdien av I (0) kan beregnes direkte fra de målte spredningsintensitetene til de separate H-vesikkel- og D-vesikelbestandene, og I (∞) kan bestemmes ved å fremstille en separat vesikkelprøve fremstilt fra en 50/50 blanding av H-lipider / D-lipider. Spredningsdataene fra disse kontrollprøvene kan også brukes til å bestemme den optimale q-range- og SANS-instrumentkonfigurasjonen for TR-SANS-målingen for å maksimere signalet og verifisere utviklingen av utvekslingskinetikk under TR-SANS-eksperimentene. Hvis den målte intensiteten ved første tidspunkt etter blanding ikke er lik den beregnede I (0), kan det være nødvendig med raskere blandingstider for å fange opp alle prosessene av interesse. Når den målte intensiteten har nådd I (∞), er utvekslingsprosessen fullført, og cellen kan tømmes og rengjøres som forberedelse til neste injeksjon.

For å kunne blande væskeprøver for TR-SANS, er det avgjørende å sikre at alle sprøyter, ventiler og slangelinjer er primet og luftfrie, og at alle slangetilkoblingene er sikre for å forhindre lekkasje. Hvis du ikke utfører disse kritiske trinnene riktig, kan det føre til unøyaktige blandingsvolumer eller unøyaktige absolutte spredningsintensiteter. For eksempel vil luftbobler fanget i prøvecellen redusere den målte SANS-intensiteten på grunn av redusert prøvevolum i nøytronstrålebanen. Alternativt kan luftbobler produsere "striper" eller "bluss" med høy intensitet på detektoren på grunn av strålebrytning ved luft-væske-grensesnittet. Uventede endringer i den målte spredningsintensiteten over tid kan indikere dårlig prøveblanding, ventillekkasje, luftbobler i prøvecellen eller tilbakediffusjonsprøve.

Innsamling av en overføringsmåling for hver prøve under et TR-SANS-eksperiment er avgjørende for å redusere de innsamlede dataene til en absolutt intensitet. Det er mulig å samle inn sprednings- og overføringsdata samtidig på noen SANS-instrumenter, noe som forenkler den generelle TR-SANS-datainnsamlingsprogrammeringen; Dette er imidlertid ikke mulig på alle instrumenter, inkludert VSANS-instrumentet som brukes i denne protokollen. Fordi målingene av prøveoverføring og prøvespredning krevde forskjellige instrumentkonfigurasjoner, ble overføringsmålinger samlet inn på slutten av spredningsmålingene (protokolltrinn 7.2.4) for å sikre at spredningsdata ble målt tidligst etter at prøven ble injisert i cellen. Overføringen avhenger bare av den totale elementære sammensetningen, prøvebanelengden og nøytronbølgelengden. Derfor bør overføringen ikke endres dersom den totale elementære sammensetningen forblir konstant gjennom det tidsoppløste eksperimentet. Store forskjeller i overføringsverdiene mellom gjentatte kjøringer av samme prøve indikerer et problem fra enten inkonsekvente blandeprøvevolumer, ufullstendig fylling av prøvecellen, luftbobler eller ventillekkasje og tilbakestrømning av prøver under eksperimentet.

En unik fordel med TR-SANS er at den målte intensiteten er avhengig av spredningsvektoren (q) og kan brukes til å undersøke romlige endringer på nanoskala. Når det kombineres med blandeanordningen for stoppet strømning, kan TR-SANS undersøke disse nanoskalaendringene på sekund til minutt tidsskalaer, noe som gir innsikt i selvmontering og utveksling av overflateaktive midler og lipider, polymer og proteinaggregering ved hjelpestofftilsetning, nanopartikkelvekst og forfall, eller utveksling av innkapslede produkter i emulsjoner. Stopp-flow-enheten kan konfigureres med flere sprøytepumper og sprøyter for å lette blandingen av to eller flere væskeprøver. Denne fleksibiliteten muliggjør systematisk undersøkelse av tilsetningsstoffer på kinetikken av interesse. For eksempel kan forskjellige volumer av en konsentrert antimikrobiell peptidløsning blandes med H-vesikkel- og D-vesikkelløsninger for å studere effekten av peptidkonsentrasjon på lipidutvekslingskinetikk45,46. I tillegg, fordi alle forseglede væskebaner er innkapslet i et temperaturkontrollert kabinett, som inkluderer prøvesprøyter, ventiler, miksere og slanger, kan temperaturen i systemet endres for å trekke ut de termodynamiske parametrene relatert til de kinetiske prosessene av interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

Acknowledgments

Tilgang til NG3 VSANS ble gitt av Center for High-Resolution Neutron Scattering, et partnerskap mellom National Institute of Standards and Technology og National Science Foundation under avtale nr. DMR-2010792. M.H.L.N anerkjenner finansieringen fra Mitacs Globalink (Canada). Identifiseringen av kommersielle produkter eller handelsnavn er for å fremme forståelse og innebærer ikke godkjenning eller anbefaling fra National Institute of Standards and Technology.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynamic mixer Analytical Scientific Instruments 462-0150A Magnetically coupled rotor, binary dynamic mixer assembly (ternary type available), 0.15 mL dead volume (larger dead volume available)
Fluoropolymer tubing IDEX Health & Science 1507L PFA Tubing Natural 1/16 inch OD x 0.040 inch ID x 50 ft
Fluoropolymer 1/4-28 flangeless fittings IDEX Health & Science XP-245 PFA flangeless fitting with ferrules, 1/4-28 threading, 1/16 inch OD tubing
Glass syringes Hamilton Company 81660 Hamilton 1000 series syringes, 10 mL (81660), model 1010 C syr, 1/4"-28 thread termination, other volumes available
High-pressure flow selector valves Vici Valco C85X-1570EUTB Vici 10 position selector valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure switch valves Vici Valco C82X-1574EUHB Vici 4 port switch valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure syringes Cetoni A2019000358 3 mL stainless steel syringe, 510 bar max, 21 mL/min flow rate max
Low-pressure flow selector valves Vici Valco C25-3180EUHB Vici 10 position selector valves, max 250 psi liquid, 0.75 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 1/4-28 threaded ports, USB universal actuator
neMESYS high-pressure syringe pumps Cetoni A3921000103 Max force 2600 N
neMESYS mid-pressure syringe pumps Cetoni A3921000131 Max force 1000 N
Power supply Cetoni A3921000127 Base 600, supplies power for up to 4 high pressure pumps
Quartz flow-through sample cell Starna Scientific 3-2.30-Q-1/TC Quartz micro flow cells, 2 mm path length (1 mm available), 2 mm by 2 mm by 30 mm internal dimension
Quartz windows Technical Glass Products NA GE 124 Clear fused quartz ground and polished plates, 11.75 inch by 23.75 inch by 0.375 inch thick
Stainless steel 10-32 coned compression fittings IDEX Health & Science U-321X, U-320X 316 stainless steel ferrule (U-321X) and nut (U-320X) -Valco type, 10-32 coned, for 1/16 inch OD stainless steel tubing
Stainless steel tubing IDEX Health & Science U-102 Stainless Steel Tubing 1/16 inch OD x 0.020 inch ID, 10 cm, various precut lengths available
Syringe pump control software Cetoni T6000000004 QmixElements software for nemesys pumps, QmixSDK software development kit
Thermoelectric air conditioner EIC Solutions AAC-140C-4XT-HC Thermoelectric air conditioner mounted on insulated enclosure to control the pump, valve, mixer, and sample temperature
T-slot railing McMaster-Carr 47065T103 Aluminum t-slotted railing (1.5 inch by 1.5 inch) cut to various lengths
Vapor locking bottle caps  Cole-Parmer EW-12018-02 Four 304 SS port inserts, 1/4"-28 threads, GL45 bottle cap size, PTFE body, SS threads, PP collar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Melnichenko, Y. B., Wignall, G. D. Small-angle neutron scattering in materials science: Recent practical applications. Journal of Applied Physics. 102 (2), 021101 (2007).
  2. Grillo, I. Small-angle neutron scattering and applications in soft condensed matter. Soft Matter Characterization. Borsali, R., Pecora, R. , Springer. Dordrecht. (2008).
  3. Hollamby, M. J. Practical applications of small-angle neutron scattering. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (26), 10566-10579 (2013).
  4. Pipich, V., Fu, Z. KWS-3: Very small angle diffractor with focusing mirror. Journal of large-scale research. 1, 31 (2015).
  5. Kline, S. 2019 NCNR Annual Report, Special Publication (NIST SP). , National Institute of Standards and Technology. Gaithersburg, MD. (2019).
  6. Gilbert, P. H., et al. Preservative induced polysorbate 80 micelle aggregation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 10 (6), 2395-2404 (2021).
  7. Terashima, T., et al. In situ and time-resolved small-angle neutron scattering observation of star polymer formation via arm-linking reaction in ruthenium-catalyzed living radical polymerization. Macromolecules. 43 (19), 8218-8232 (2010).
  8. Hashimoto, K., Fujii, K., Nishi, K., Shibayama, M. Ion gel network formation in an ionic liquid studied by time-resolved small-angle neutron scattering. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (40), 9419-9424 (2018).
  9. Conn, C. E., et al. Membrane protein structures in lipid bilayers; small-Angle neutron scattering with contrast-matched bicontinuous cubic phases. Frontiers in Chemistry. 8, 619470 (2021).
  10. van't Hag, L., et al. Protein-eye view of the in meso crystallization mechanism. Langmuir. 35 (25), 8344-8356 (2019).
  11. Mahieu, E., et al. Observing protein degradation by the PAN-20S proteasome by time-resolved neutron scattering. Biophysical Journal. 119 (2), 375-388 (2020).
  12. Ibrahim, Z., et al. Time-resolved neutron scattering provides new insight into protein substrate processing by a AAA+ unfoldase. Scientific Reports. 7 (1), 40948 (2017).
  13. Hollamby, M. J., et al. Growth of mesoporous silica nanoparticles monitored by time-resolved small-angle neutron scattering. Langmuir. 28 (9), 4425-4433 (2012).
  14. Blin, J. L., Impéror-Clerc, M. Mechanism of self-assembly in the synthesis of silica mesoporous materials: in situ studies by X-ray and neutron scattering. Chemical Society Reviews. 42 (9), 4071-4082 (2013).
  15. Impéror-Clerc, M., Grillo, I., Khodakov, A. Y., Durand, D., Zholobenko, V. L. New insights into the initial steps of the formation of SBA-15 materials: an in situ small angle neutron scattering investigation. Chemical Communications. 8, 834-836 (2007).
  16. Narayanan, T., Rüter, A., Olsson, U. SAXS/WAXS investigation of amyloid-β(16-22) peptide nanotubes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 654349 (2021).
  17. Angelov, B., et al. DNA/Fusogenic lipid nanocarrier assembly: millisecond structural dynamics. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (11), 1959-1964 (2013).
  18. Amann, M., et al. Kinetic pathways for polyelectrolyte coacervate micelle formation revealed by time-resolved synchrotron SAXS. Macromolecules. 52 (21), 8227 (2019).
  19. Varga, Z., Wacha, A., Bóta, A. Osmotic shrinkage of sterically stabilized liposomes as revealed by time-resolved small-angle X-ray scattering. Journal of Applied Crystallography. 47 (1), 35-40 (2014).
  20. Panine, P., Finet, S., Weiss, T. M., Narayanan, T. Probing fast kinetics in complex fluids by combined rapid mixing and small-angle X-ray scattering. Advances in Colloid and Interface Science. 127 (1), 9-18 (2006).
  21. Grillo, I. Applications of stopped-flow in SAXS and SANS. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 14 (6), 402-408 (2009).
  22. Gomez-Hens, A., Perez-Bendito, D. The stopped-flow technique in analytical chemistry. Analytica Chimica Acta. 242, 147-177 (1991).
  23. Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. Use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the ATP turnover cycle of kinesins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52142 (2014).
  24. Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of stopped-flow kinetics methods to investigate the mechanism of action of a DNA repair protein. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1874 (2010).
  25. Raney, K. D., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. A fluorescence-based assay for monitoring helicase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6644-6648 (1994).
  26. Roder, H., Maki, K., Cheng, H. Early events in protein folding explored by rapid mixing methods. Chemical reviews. 106 (5), 1836-1861 (2006).
  27. Milon, A., et al. Osmotic swelling of unilamellar vesicles by the stopped-flow light scattering method. Influence of vesicle size, solute, temperature, cholesterol and three α,ω-dihydroxycarotenoids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 859 (1), 1-9 (1986).
  28. Gast, K., Nöppert, A., Müller-Frohne, M., Zirwer, D., Damaschun, G. Stopped-flow dynamic light scattering as a method to monitor compaction during protein folding. European Biophysics Journal. 25 (3), 211-219 (1997).
  29. Antoun, A., Pavlov, M. Y., Tenson, T., Ehrenberg, M. M. Ribosome formation from subunits studied by stopped-flow and Rayleigh light scattering. Biological Procedures Online. 6, 35-54 (2004).
  30. Zhu, Z., Armes, S. P., Liu, S. pH-Induced micellization kinetics of ABC triblock copolymers measured by stopped-flow light scattering. Macromolecules. 38 (23), 9803-9812 (2005).
  31. Ye, J., et al. Comparative study of temperature-induced association of cyclic and linear poly(N-isopropylacrylamide) chains in dilute solutions by laser light scattering and stopped-flow temperature jump. Macromolecules. 41 (12), 4416-4422 (2008).
  32. Liu, X., et al. Early stage kinetics of polyelectrolyte complex coacervation monitored through stopped-flow light scattering. Soft Matter. 12 (44), 9030-9038 (2016).
  33. Garman, E. F., Weik, M. X-ray radiation damage to biological samples: recent progress. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (4), 907-911 (2019).
  34. Garg, S., Porcar, L., Woodka, A. C., Butler, P. D., Perez-Salas, U. Noninvasive neutron scattering measurements reveal slower cholesterol transport in model lipid membranes. Biophysical Journal. 101 (2), 370-377 (2011).
  35. Marquardt, D., et al. 1H NMR shows slow phospholipid flip-flop in gel and fluid bilayers. Langmuir. 33 (15), 3731-3741 (2017).
  36. Egelhaaf, S. U., Olsson, U., Schurtenberger, P. Time-resolved SANS for surfactant phase transitions. Physica B: Condensed Matter. 276-278, 326-329 (2000).
  37. Tabor, R. F., Eastoe, J., Grillo, I. Time-resolved small-angle neutron scattering as a lamellar phase evolves into a microemulsion. Soft Matter. 5 (10), 2125-2129 (2009).
  38. Gradzielski, M., Bergmeier, M., Hoffmann, H., Müller, M., Grillo, I. Vesicle gel formed by a self-organization process. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (49), 11594-11597 (2000).
  39. Lee, Y. -T., Li, D. S., Pozzo, L. D. Kinetic analysis of ultrasound-induced oil exchange in oil-in-water emulsions through contrast variation time-resolved small-sngle neutron scattering. Langmuir. 35 (47), 15204-15213 (2019).
  40. Lee, Y. -T., Pozzo, L. D. Contrast-variation time-resolved small-angle neutron scattering analysis of oil-exchange kinetics between oil-in-water emulsions stabilized by anionic surfactants. Langmuir. 35 (47), 15192-15203 (2019).
  41. Roger, K., Olsson, U., Schweins, R., Cabane, B. Emulsion ripening through molecular exchange at droplet contacts. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1452-1455 (2015).
  42. Nakano, M., Fukuda, M., Kudo, T., Endo, H., Handa, T. Determination of Interbilayer and Transbilayer Lipid Transfers by Time-Resolved Small-Angle Neutron Scattering. Physical Review Letters. 98 (23), 238101 (2007).
  43. Nakano, M., et al. Flip-flop of phospholipids in vesicles: kinetic analysis with time-resolved small-angle neutron scattering. The Journal of Physical Chemistry B. 113 (19), 6745-6748 (2009).
  44. Nguyen, M. H. L., et al. Methanol accelerates DMPC flip-flop and transfer: A SANS study on lipid dynamics. Biophysical Journal. 116 (5), 755-759 (2019).
  45. Nguyen, M. H. L., et al. Peptide-induced Lipid flip-flop in asymmetric liposomes measured by small angle neutron scattering. Langmuir. 35 (36), 11735-11744 (2019).
  46. Nguyen, M. H. L., et al. Time-resolved SANS reveals pore-forming peptides cause rapid lipid reorganization. New Journal of Chemistry. 45 (1), 447-456 (2021).
  47. Xia, Y., et al. Effects of nanoparticle morphology and acyl chain length on spontaneous lipid transfer rates. Langmuir. 31 (47), 12920-12928 (2015).
  48. Xia, Y., et al. Morphology-induced defects enhance lipid transfer rates. Langmuir. 32 (38), 9757-9764 (2016).
  49. Maric, S., et al. Time-resolved small-angle neutron scattering as a probe for the dynamics of lipid exchange between human lipoproteins and naturally derived membranes. Scientific Reports. 9 (1), 7591 (2019).
  50. Nielsen, J. E., Bjørnestad, V. A., Pipich, V., Jenssen, H., Lund, R. Beyond structural models for the mode of action: How natural antimicrobial peptides affect lipid transport. Journal of Colloid and Interface Science. 582, 793-802 (2021).
  51. Willner, L., Poppe, A., Allgaier, J., Mokenbusch, M., Richter, D. TIme-resolved SANS for the determintioan of unimer exchange kinetics in block copolymer micelles. Europhysics Letters. 55 (5), 667 (2001).
  52. Lund, R., Willner, L., Stellbrink, J., Lindner, P., Richter, D. Logarithmic chain-exchange kinetics of diblock copolymer micelles. Physical Review Letters. 96 (6), 068302 (2006).
  53. Lund, R., Willner, L., Richter, D., Dormidontova, E. E. Equilibrium chain exchange kinetics of diblock copolymer micelles: Tuning and logarithmic relaxation. Macromolecules. 39 (13), 4566-4575 (2006).
  54. Lund, R., Willner, L., Richter, D. Kinetics of block copolymer micelles studied by small-angle scattering methods. in Controlled Polymerization and Polymeric Structures. Advances in Polymer Science. Abe, A., Lee, K. S., Leibler, L., Kobayashi, S. , Springer. Cham. 51 (2013).
  55. Choi, S. -H., Lodge, T. P., Bates, F. S. Mechanism of molecular exchange in diblock copolymer micelles: hypersensitivity to core chain length. Physical Review Letters. 104 (4), 047802 (2010).
  56. Choi, S. -H., Bates, F. S., Lodge, T. P. Molecular exchange in ordered diblock copolymer micelles. Macromolecules. 44 (9), 3594-3604 (2011).
  57. Lu, J., Bates, F. S., Lodge, T. P. Chain exchange in binary copolymer micelles at equilibrium: confirmation of the independent chain hypothesis. ACS Macro Letters. 2 (5), 451-455 (2013).
  58. Lu, J., Bates, F. S., Lodge, T. P. Remarkable effect of molecular architecture on chain exchange in triblock copolymer micelles. Macromolecules. 48 (8), 2667-2676 (2015).
  59. Kelley, E. G., et al. Size evolution of highly amphiphilic macromolecular solution assemblies via a distinct bimodal pathway. Nature Communications. 5 (1), 3599 (2014).
  60. Murphy, R. P., Kelley, E. G., Rogers, S. A., Sullivan, M. O., Epps, T. H. Unlocking chain exchange in highly amphiphilic block polymer micellar systems: influence of agitation. ACS Macro Letters. 3 (11), 1106-1111 (2014).
  61. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50 (6), 2484-2494 (2017).
  62. Lantz, K. A., et al. Cavitation enables switchable and rapid block polymer exchange under high-χN conditions. Macromolecules. 51 (17), 6967-6975 (2018).
  63. Murphy, R. P., et al. Capillary RheoSANS: measuring the rheology and nanostructure of complex fluids at high shear rates. Soft Matter. 16 (27), 6285-6293 (2020).
  64. Stopped Flow Sans. usnistgov. , Available from: https://github.com/usnistgov/stopped-flow-sans (2021).
  65. Kline, S. Reduction and analysis of SANS and USANS data using IGOR Pro. Journal of Applied Crystallography. 39 (6), 895-900 (2006).
  66. Doktorova, M., et al. Preparation of asymmetric phospholipid vesicles for use as cell membrane models. Nature Protocols. 13 (9), 2086-2101 (2018).
  67. Huang, Z., London, E. Effect of cyclodextrin and membrane lipid structure upon cyclodextrin-lipid interaction. Langmuir. 29 (47), 14631-14638 (2013).
  68. Sugiura, T., Ikeda, K., Nakano, M. Kinetic analysis of the methyl-β-cyclodextrin-mediated intervesicular transfer of pyrene-labeled phospholipids. Langmuir. 32 (51), 13697-13705 (2016).
  69. Scott, H. L., et al. On the mechanism of bilayer separation by extrusion, or why your LUVs are not really unilamellar. Biophysical Journal. 117 (8), 1381-1386 (2019).
  70. Dicko, C., et al. NUrF-Optimization of in situ UV-vis and fluorescence and autonomous characterization techniques with small-angle neutron scattering instrumentation. Review of Scientific Instruments. 91 (7), 075111 (2020).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 174 Småvinkel nøytronspredning (SANS) tidsoppløst spredning stoppet strømningsblanding molekylær utvekslingskinetikk lipid nanopartikler lipidmembraner vesikler strukturell evolusjon
Måling av tidsutviklingen av nanoskalamaterialer med stoppet strømning og småvinklet nøytronspredning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelley, E. G., Nguyen, M. H. L.,… More

Kelley, E. G., Nguyen, M. H. L., Marquardt, D., Maranville, B. B., Murphy, R. P. Measuring the Time-Evolution of Nanoscale Materials with Stopped-Flow and Small-Angle Neutron Scattering. J. Vis. Exp. (174), e62873, doi:10.3791/62873 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter