Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Mätning av tidsutvecklingen av nanoskala material med stoppat flöde och liten vinkel neutronspridning

Published: August 6, 2021 doi: 10.3791/62873
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1, 1
1NIST Center for Neutron Research, National Institute of Standards and Technology, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of Windsor, 3Department of Physics, University of Windsor

Summary

Detta protokoll presenterar användningen av en provmiljö med stoppat flöde för att snabbt blanda flera flytande lösningar in situ under en neutronspridningsmätning med liten vinkel och för att studera kinetiska processer på nanometerlängdskalor och andra tidsskalor.

Abstract

Detta dokument presenterar användningen av en SANS-provmiljö (Stoped-Flow-Small Angle Neutron-Scattering) för att snabbt blanda vätskeprover och studera kinetiska processer i nanoskala på tidsskalor från sekunder till minuter. Provmiljön med stoppat flöde använder kommersiellt tillgängliga sprutpumpar för att blanda de önskade volymerna av vätskeprover som sedan injiceras genom en dynamisk mixer i en kvartsglascell på cirka 1 s. Tidsupplöst SANS-datainsamling synkroniseras med provblandningen för att följa utvecklingen av nanostrukturen i lösning efter blandning.

För att utnyttja neutronstråletiden så effektivt som möjligt använder vi en serie flödesväljarventiler för att automatiskt ladda, skölja och torka cellen mellan mätningarna, vilket möjliggör upprepad datainsamling under flera provinjektioner. Provinjektionerna upprepas tills tillräcklig neutronspridningsstatistik har samlats in. Blandningsuppställningen kan programmeras för att systematiskt variera förhållandena för att mäta kinetiken vid olika blandningsförhållanden, provkoncentrationer, additiva koncentrationer och temperaturer. Den minsta provvolym som krävs per injektion är cirka 150 μl beroende på kvartscellens väglängd.

Representativa resultat med användning av denna stoppade flödesprovmiljö presenteras för snabb lipidutbyteskinetik i närvaro av en tillsats, cyklodextrin. Vesiklarna utbyter yttre (yttre) lipider i storleksordningen sekunder och utbyter fullständigt både inre och yttre lipider inom några timmar. Mätning av lipidutbyteskinetik kräver in situ-blandning för att fånga de snabbare (sekunder) och långsammare (minuter) processerna och extrahera de kinetiska hastighetskonstanterna. Samma provmiljö kan också användas för att undersöka molekylärt utbyte i andra typer av flytande prover såsom lipidnanopartiklar, proteiner, ytaktiva ämnen, polymerer, emulsioner eller oorganiska nanopartiklar. Mätning av strukturella omvandlingar och kinetik på nanonivå för utbyte eller reaktion av system kommer att ge nya insikter i processer som utvecklas på nanoskalan.

Introduction

Småvinkelneutronspridning (SANS) ger ett unikt sätt att mäta storlekar, former, interaktioner och organisation av olika material på längdskalor från ≈1 nm till ≈100 nm 1,2,3. Nya instrument, inklusive VSANS-instrument (mycket liten vinkel neutronspridning) med fokuseringsspeglar, tänjer på gränserna för att mäta ännu större längdskalor upp till ≈1000 nm 4,5. I allmänhet erbjuder den unika spridningskontrasten som är inneboende i neutronspridningsmetoder flera fördelar vid mätning av tidsutvecklingen av nanostrukturer, såsom aggregering av komponenter i farmaceutiska formuleringar6, tvärbindning och geleringsreaktioner i polymersystem7,8, i mesokristallisation av membranproteiner9,10, nedbrytning och utveckling av proteiner11,12 och tillväxt av kiseldioxidbaserade material13,14,15. Den unika spridningskontrasten gör tidsupplösta SANS (TR-SANS) till ett användbart komplement till andra stoppade flödesbaserade mätningar.

Stoppade flödesblandningsmetoder implementeras ofta i röntgenspridning med liten vinkel (SAXS)16,17,18,19,20,21, fluorescensspektroskopi 22,23,24,25,26 och ljusspridning27,28,29,30, 31,32 experiment för att studera kinetiska processer på millisekundskalorna. En viktig skillnad mellan SANS och SAXS är att neutronspridning är en icke-destruktiv karakteriseringsteknik, och som sådan kan SANS användas för att mäta samma prov i timmar eller till och med dagar utan joniserande strålningsskador på provet, vilket kan hända under röntgenspridningsexperiment med högre flöde33. Eftersom upprepade SANS-mätningar inte kommer att förändra den kemiska strukturen hos sondmolekylen eller provet, kan tidsutvecklingen studeras utan effekter av till exempel fotoblekning, vilket kan komplicera kinetiska mätningar som är beroende av fluorescens23,24. Dessutom kan SANS användas för att mäta högkoncentrerade och optiskt ogenomskinliga prover som ofta är svåra att karakterisera med ljusbaserade tekniker som dynamisk ljusspridning.

Förutom att tillhandahålla strukturell information om nanoskalan kan SANS användas för att undersöka den lokala sammansättningen av dessa strukturer genom variationen i neutronspridningslängdtäthetskontrast. Spridningslängdtätheten (SLD) för olika element varierar slumpmässigt över det periodiska systemet och varierar med olika isotoper av samma element. Ett vanligt utnyttjat exempel är väte (1H eller H) och deuterium (2H eller D), som har väldigt olika neutronspridningslängder. Därför kan väterika material, såsom ytaktiva ämnen, lipider, proteiner, RNA, DNA och andra polymerer, särskiljas från deutererade lösningsmedel med användning av SANS utan att väsentligt förändra systemets fysikaliska egenskaper. Det är dock viktigt att notera att H / D-utbyte kan påverka densiteten, vätebindningen och fasövergångstemperaturerna i provet. Ändå är SANS unika känslighet för väterika material särskilt användbar i forskning om mjuk materia där proverna av intresse har lägre spridningskontrast och signal i röntgenbaserade tekniker som SAXS. Isotopsubstitution gör också SANS till ett kraftfullt verktyg för att studera molekylär utbyteskinetik i väterika material genom att helt enkelt blanda H-märkta och D-märkta molekyler. Isotopsubstitution är särskilt användbar i system där skrymmande fluorescerande färgämnen är större än tensiden eller lipidmolekylerna av intresse och kan påverka utbyteskinetiken34,35.

Tidsupplösta SANS-mätningar är fördelaktiga eftersom den uppmätta intensiteten är en funktion av tid, längdskala och SLD-kontrast. Som sådan kan TR-SANS-experiment utformas för att undersöka de tidsberoende förändringarna i de rumsliga fördelningarna och provernas kompositioner. Dessa unika fördelar med SANS har lett till viktiga insikter i kinetiska processer i många mjuka materialsystem såsom ytaktiva ämnen 36,37,38, emulsioner 39,40,41, lipider 34,42,43,44,45,46,47,48,49 ,50 och polymerer 51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62. De flesta TR-SANS-studier har fokuserat på tidsskalor från minuter till timmar. Många kinetiska processer av intresse sker dock på den andra tidsskalan och är väsentliga för att förstå de underliggande mekanismerna. Att fånga dessa tidiga tidpunkter kräver att lösningarna snabbt blandas och mäts in situ, där blandningen synkroniseras med datainsamling under ljusspridning med stoppflöde 27,28,29,30,31,32, fluorescens 22,23,24,25,26 och röntgen 16,17,18,19,20,21 experiment. Detta arbete beskriver användningen av en provmiljö utformad för att snabbt blanda flera vätskeprover och injicera blandningen i en kvartsglascell för TR-SANS-mätningar. Blandningsanordningen är en anpassning av den nyligen utvecklade kapillär-reoSANS-enheten63 och använder flera sprutpumpar och ventiler för att styra provblandningen och för att automatisera cellrengöringen. Genom att ansluta sprutpumpar till en serie flödesväljarventiler kan flera inloppsströmmar blandas, mätas, sköljas och torkas upprepade gånger för att underlätta TR-SANS-mätningar på sekundens tidsskala.

Det nuvarande förfarandet förutsätter att proverna av intresse har identifierats och förberetts. Vi fokuserar på in situ-blandningsinställningen och metoder för att samla in TR-SANS-data. Neutronspridningsdata samlades in på VSANS-instrumentet vid NIST Center for Neutron Research (NCNR); Förfarandet bör dock vara tillämpligt på andra SANS-instrument. Läsare som är intresserade av att implementera liknande protokoll på andra SANS-instrument bör rådgöra med de lokala instrumentforskarna för att bestämma den optimala instrumentkonfigurationen för att maximera neutronflödet vid önskad längdskala och tidsskala som är mest relevant för de kinetiska processerna av intresse. Data som presenteras här samlades in med hjälp av högflödeskonfigurationen "vit stråle" på VSANS för att maximera neutronantalet vid förlust av rumslig upplösning5. Detektorvagnarna placerades för att täcka en rad spridningsvektorer (q), 0,005 Å-1 < q < 0,5 Å-1, motsvarande längdskalor från ≈130 nm till ≈13 nm. Spridningsvektorn definieras som q = 4π / λ sin (θ / 2) där λ är neutronvåglängden och θ är spridningsvinkeln.

Den stoppade flödesblandningsanordning som används för TR-SANS-mätningarna består av flera pumpar, sköljsprutor, provsprutor, flödesväljare samt adynamisk blandare, provcell och blandad provbehållare, såsom visas i figur 1. Alla förseglade vätskevägar är placerade inuti ett luftkonditionerat hölje, som inkluderar sprutor, ventiler, anslutningsslangar, dynamisk mixer och provceller. En programmerbar termoelektrisk luftkonditionering används för att styra kapslingstemperaturen i området från 10 °C till 50 °C inom ±1 °C. Observera att en del av höljesisoleringen togs bort för att visa enhetens arbetsdelar. Huvudblandningsanordningens hölje är placerat på ett translationellt steg på NG3 VSANS strållinje vid NCNR. Kapslingens position justeras med hjälp av translationssteget för att placera provcellen i neutronstrålens väg (gul streckad linje).

Figure 1
Figur 1: En exempeluppsättning för att kombinera mätningar av stoppad flödesblandning och neutronspridning med liten vinkel vid VSANS-strålröret vid NIST Center for Neutron Research. Uppställningen innehåller fyra sprutpumpar, två sprutor för sköljning av spädningsvätska och två sprutor för provinjektion, fyra pumpväljarventiler, två blandarväljarventiler, en dynamisk blandare, en genomströmningskvartscell och en blandad provbehållare. Infallande neutroner sprids från det blandade provet som finns inuti provcellen. Ett isolerat hölje med kvartsfönster och en termoelektrisk luftkonditionerad enhet används för att styra provet och all utrustning vid konstant temperatur. Den gula streckade linjen visar neutronstrålens väg. Skalstång = 10 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Enheten som visas i figur 1 är konfigurerad med två provsprutor, två sköljsprutor och en provcell. Motsvarande flödesscheman för de olika stegen i protokollet illustreras i figur 2. De önskade volymerna av de två olika proverna injiceras i blandaren och provcellen (figur 2A). När provcellen är fylld stängs inloppsomkopplarventilen (ISV) och utloppsomkopplarventilen (OSV) för att isolera provcellen från den dynamiska blandaren och för att förhindra att provet sprids tillbaka in i cellen under TR-SANS-datainsamlingen (figur 2B). Före den dynamiska blandaren varierar anslutningsslangen i längd från 10 cm till 1 m och påverkar inte blandningsfördröjningstiden. Slanganslutningar mellan den dynamiska blandaren och provcellen påverkar dock blandningsfördröjningstiden och den erforderliga provinjektionsvolymen. Förskurna rör av rostfritt stål med innerdiameter på 0,04 tum (1 mm) och längd på 100 mm används för att ansluta den dynamiska blandaren, blandarväljarventilerna (MSV1 och MSV2) och ISV och OSV. Fluorerade rör med 1 mm innerdiameter och 115 mm längd används för att ansluta ISV och OSV (eller det dynamiska blandarutloppet) till provcellen. Den totala hålrumsvolymen som påverkar blandningsfördröjningstiden inkluderar blandarens tomrumsvolym (0,15 ml), slangen mellan blandarens utlopp och provcellens inlopp (0,09 ml) och provcellens volym (0,16 ml). I det här exemplet är den totala tomrumsvolymen 0,4 ml. Ventilernas inre hålrumsvolymer är försumbara jämfört med hålrumsvolymerna för slangar, blandare och provceller. Till exempel innehåller de använda lågtrycksväljarventilerna (0,75 mm håldiameter) ungefärliga tomrumsvolymer på 4 μL, medan högtrycksväljarventilerna och omkopplingsventilerna (0,25 mm håldiameter) innehåller ungefärliga hålrumsvolymer på 0,5 μl.

När TR-SANS-mätningen är klar trycks provet ut ur cellen med lösningsmedel och sköljvätska pumpas upprepade gånger genom cellen för att avlägsna restprovet och rengöra provcellen (figur 2C). Observera att sköljsprutorna är anslutna till större lösningsmedelsbehållare (t.ex. vatten och etanol) via pumpväljarvärden för att säkerställa att tillräckliga lösningsmedelsvolymer finns tillgängliga för att rengöra provcellen mellan mätkörningarna. Lösningsmedelskällor, provkällor och blandade provbehållare som innehåller brandfarliga vätskor placeras i ett separat hölje utan elektrisk utrustning för att eliminera alla möjliga antändningskällor. Dessutom används ånglåsande flasklock för att minimera brandfarliga ångor och lösningsmedelsindunstning. Slutligen torkas provcellen med en kvävgasström för att avlägsna det kvarvarande sköljlösningsmedlet (figur 2D). Kvävgastrycket till blandarväljarventilen regleras till cirka 2 bar (0,2 MPa, övertryck) med hjälp av en manuell tryckregulator placerad på kvävgasflaskan. När provcellen har rengjorts och torkats tillräckligt injiceras ett nyblandat prov i provcellen för nästa mätcykel (blandning och injektion upprepas som illustreras i flödesschemat i figur 2A).

Figure 2
Figur 2: Exempel på flödesdiagram med en provcell, två provblandningar och två sköljmedel för rengöring . a) Blandning av prov A (blått) och prov B (rött) och sedan flöde av det blandade provet (lila) in i provcellen. (B) Under datainsamlingen, tillståndet för stoppflödesanordningen där ISV- och OSV-omkopplingsventilerna är stängda för att isolera provcellen och förhindra återspridning av provet under datainsamlingen. (C) Rengöringsstegen där provcellen sköljs med sköljvätska från SS1 (grön) efter datainsamling. d) Torkningssteg där provcellen torkas med kvävgas (orange). Förkortningar: PSV = pumpväljarventil; MSV = blandarväljarventil; OSV = utloppsbrytare; ISV = inloppsventil; SS1 = lösningsmedelskälla 1; SSA = provkälla A; N2 = kvävgaskälla. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3 visar flödesscheman för en något annorlunda version där blandningsinställningen konfigureras med två separata provceller anslutna till samma omkopplingsventiler (figur 3A). Medan TR-SANS-data samlas in i provcell 1 sköljs provcell 2 (figur 3B) och torkas (figur 3C). När datainsamlingen är klar för provcell 1 dirigerar inloppsbrytarventilen ett nyblandat prov till provcell 2 för datainsamling (figur 3D). Medan TR-SANS-data samlas in i provcell 2 sköljs och torkas provcell 1 (figur 3E). Denna alternerande, parallella process mellan två provceller minimerar tiden mellan efterföljande provinjektioner och maximerar användningen av neutronstråletid.

Figure 3
Figur 3: Exempel på flödesschema med två provceller, två provblandningar och två sköljmedel för rengöring. A) Blanda prov A (blått) och prov B (rött) och sedan flöda det blandade provet (lila) in i provcell 1. (B) Stoppflödesanordningens tillstånd under datainsamling på provcell 1 medan provcell 2 sköljs med lösningsmedel från SS1 (grön). (C) Stoppflödesanordningens tillstånd under datainsamlingen på provcell 1 medan provcell 2 torkas med kvävgas (orange). (D) När datainsamlingen av provcell 1 är klar blandas omedelbart ett nytt prov (lila) och flödas in i provcell 2. (E) Stoppflödesanordningens tillstånd under datainsamling på provcell 2 medan provcell 1 sköljs med lösningsmedel från SS1 (grön). Medan en provcell mäts rengörs och torkas den andra provcellen. Stoppflödesmätningsprocessen växlar mellan två provceller för att minimera tiden mellan efterföljande provblandningsinjektioner. Förkortningar: PSV = pumpväljarventil; MSV = blandarväljarventil; OSV = utloppsbrytare; ISV = inloppsventil; SS1 = lösningsmedelskälla 1; SSA = provkälla A; N2 = kvävgaskälla. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Ett steg-för-steg-protokoll beskrivs nedan för anslutning av pumpar och slangledningar, grundning av systemet, sköljning och torkning av provcellen och injektion av det blandade provet. Även om encellskonfigurationen demonstreras för enkelhetens skull (figur 2) kan den flexibla modulära installationen, protokollet och skripten enkelt modifieras för att implementera fler sprutpumpar, ventiler, blandare eller provcellkonfigurationer, såsom cellkonfigurationen med två prover som visas i figur 3. Representativa råa neutronräkningshastighetsdata som samlats in under blandnings- och rengöringsinjektionscyklerna visas i figur 4, medan lipidutbyteskinetiken mätt vid 3 olika temperaturer och den extraherade normaliserade spridda intensiteten motsvarande fraktionen av utbytta lipider visas i figur 5 respektive figur 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Ställ in och initiera stoppflödessystemet.

  1. Slå på alla pumpaggregat och dynamiska blandare med strömbrytaren.
  2. Starta alla pumpar och ventiler i det grafiska användargränssnittet (GUI) för systemkontroll med stoppat flöde genom att ange enhetens konfigurationssökväg och använda kommandona bus=qmixbus. Buss(), buss.open(), bus.start(), pump=qmixpump. Pump(), pump.enable()och valve=ViciMultiposSelector() (se exempel på initieringskod som finns i en onlinedatabas med öppen källkod64).
  3. Kalibrera pumparna innan du sätter på sprutorna med kommandot pump.calibrate().
  4. Bekräfta att ventilerna är initierade och flytta till rätt väljarport på kommando med kommandot valve.setPort() och valve.getPort().
  5. Tilldela spruttypen som ska användas för varje pump med kommandot pump.set_syringe_param(A, B), där A är sprutcylinderns innerdiameter (mm) och B är sprutans maximala kolvslagsavstånd (mm).
  6. Anslut provsprutorna till sprutpumparna.
    1. När du har säkerställt att pumparna har kalibrerats skruvar du fast rena spruttunnor i anslutningen längst upp på pumpen (sprutans monteringshuvud).
    2. När du använder glassprutor, se till att sprutans fäste är lossat innan påfyllningsvolymen doseras, så att glassprutan inte går sönder på grund av överdriven kraft från sprutkolven.
    3. Skruva fast sprutkolven i anslutningen längst ner på pumpen (sprutans monterade svans).
    4. När sprutcylindern och sprutkolven är anslutna till pumpen, fördela påfyllningsvolymen för spruttypen med kommandot pump.empty(), som flyttar sprutkolven till toppen av sprutcylindern.
    5. När du använder glassprutor, dra åt sprutans monteringshuvud efter att kolvrörelsen stannat.
  7. Anslut slangen till prov- och lösningsmedelskällorna, sprutorna, ventilerna, blandarna, provcellerna och den blandade provbehållaren.
    1. Anslut sprutpumpens slang till pumpväljarventilerna.
    2. Anslut pumpväljarventilslangen till provkällorna.
    3. Anslut pumpväljarventilslangen till sköljlösningsmedlet.
    4. Anslut pumpväljarventilslangen till blandarens väljarventilrör.
    5. Anslut blandarväljarventilslangen till kvävgaskällan.
    6. Anslut blandarens väljarventilslang till blandarens inlopp.
    7. Anslut blandarutloppet till inloppsventilen.
    8. Anslut inloppsomkopplarventilen till provcellens inlopp.
    9. Anslut provcelluttaget till utloppsomkopplarventilen.
    10. Anslut utloppsventilen till den blandade provbehållaren.
  8. Definiera alla slang- och ventilanslutningar som gjorts (steg 1.7) i det grafiska användargränssnittet för systemstyrning med stoppat flöde genom att skriva in motsvarande portnummeranslutningar som gjorts till varje ventil (se exempel på styrkod i onlineförvaret med öppen källkod64).
  9. Beräkna hålrumsvolymen på slangen mellan blandarens inlopp och provcellens utlopp, vilket definierar den minsta mängd prov som behövs för att fylla provcellen för varje mätning.

2. Ladda provet.

  1. Ställ in önskad provfyllningsvolym och lösningsmedelsfyllningsvolym i stoppat flöde systemkontroll-GUI genom att skriva önskade siffror (se exempel på kontrollkod i online-arkivet med öppen källkod64).
  2. Använd kommandot pump.aspirate () för att dra in (aspirera) de önskade prov- och lösningsmedelsvolymerna från deras källor till provsprutorna genom pumpväljarventilerna.
    OBS: När du först laddar en tom spruta kommer luft att finnas på toppen av sprutan som måste rensas för att fylla systemet med prov och vätska i steg 3.

3. Grunda systemet.

  1. Använd kommandot pump.dispense () för att trycka ut (dosera) all luft från sprutor, slangledningar och ventiler. Se till att tillräckligt med vätskevolym doseras från varje spruta för att helt avlägsna all luft från sprutorna, slangarna och ventilerna. Om luftbubblor är synliga inuti någon slang, fortsätt att dosera lösningsmedel eller prov tills bubblorna har tagits bort.
  2. När luft har rensats ut från systemet, utför minst en provinjektions- och sköljprocedur (utan insamlade neutronspridningsdata).
    1. Klicka för att välja cellen med etiketten Starta blandningsexperiment i kontrollgränssnittet.
    2. Med den här cellen aktivt vald klickar du på knappen Kör (höger triangel) längst upp i kontrollgränssnittet eller trycker på Skift- och Enter-tangenterna tillsammans på tangentbordet.
    3. Inspektera provcellen visuellt för att bekräfta att luftbubblor inte finns.
      1. Om det finns luftbubblor, upprepa protokollsteg 3.1 och 3.2 för att ytterligare rena luft från slangledningarna.
      2. Om det inte finns några luftbubblor i provcellen fortsätter du till steg 4 för att definiera de återstående experimentprotokollstegen.

4. Definiera blandningsprotokollet för stoppat flöde i programskriptet (se kodexempel i online-arkivet med öppen källkod64).

  1. Ange temperaturbörvärdet för den programmerbara luftkonditioneringsenheten (AC) som styr temperaturen på det isolerade höljet som omger den stoppade flödesanordningen.
    1. Håll stjärnknappen på AC-styrenheten intryckt och tryck på upp - och nedpilarna för att ändra börvärdestemperaturen. Alternativt kan du skriva önskat temperaturbörvärde i kontrollgränssnittet och klicka på Kör.
    2. Vänta i 15-30 minuter så att höljets inre kan balansera vid önskad temperatur innan du startar de kinetiska experimenten.
      OBS: Det tillgängliga temperaturområdet är för närvarande mellan 10 ° C och 50 ° C, och temperaturstabiliteten är ± 1 ° C.
  2. Ange alla sköljsekvenssteg genom att skriva in lämpliga volymer, flödeshastigheter, tider och antal repetitioner i kontrollgränssnittet.
    1. Definiera volymen för varje prov som ska injiceras, vilket definierar det totala flödet (Q).
    2. Definiera volymen av varje lösningsmedel som ska injiceras under sköljningen.
    3. Definiera torktiden mellan varje sköljsteg (ttorrt).
    4. Definiera antalet sköljningssteg.
    5. Definiera de olika lösningsmedlen för de efterföljande sköljstegen.
    6. Definiera antalet sköljrepetitioner som ska utföras efter varje mätning (nsköljning).
    7. Definiera tiden för fullständig torkning av provcellen och blandaren och tillhandahåll en ren provcell för efterföljande provinjektion (tdry_final).
  3. Definiera alla provinjektionssekvenssteg genom att skriva in lämpliga volymer, flödeshastigheter och tider i det stoppade flödessystemets kontrollgränssnitt.
    1. Definiera volymen för varje prov som ska injiceras och flödeshastigheten.
    2. Beräkna fördröjningstiden (t-fördröjning) från tomrumsvolymen (V void) och den totala flödeshastigheten (tdelay = Vvoid/Q).
      OBS: Fördröjningstiden är den tid som behövs för att fylla provcellen med det blandade provet.
    3. Definiera önskad förvärvstid för TR-SANS-data så att hela kinetiska processen av intresse har inträffat (tscatt).
    4. Ställ in väntetiden mellan slutet av spridningsexperimentet och början av sköljcyklerna (tvänta).
      OBS: Denna väntetid bör vara minst 100 s om provneutronöverföringen ska mätas innan den sköljs från cellen. Provöverföringen behövs under databehandlingen för att minska data till absolut intensitet.
    5. Definiera antalet injektionscykler som ska utföras med sköljsekvenser mellan varje injektion som definieras i steg 4.2 (ncykel).
  4. Beräkna den totala tiden för en enda datainsamlingscykel med stoppat flöde (t-cykel) med ekvation (1).
    tcykel = nsköljning × (t fördröjning + ttorr) + tdry_final + tfördröjning + tscatt (1)
    där nsköljning = antal sköljrepetitioner (steg 4.2.6), tfördröjning = fördröjningstiden för den stoppade flödesanordningen (steg 4.3.2), ttorr = torktiden mellan varje sköljsteg (steg 4.2.3), tdry_final = tid för fullständig torkning av provcellen och blandaren (steg 4.2.7), tscatt = önskad TR-SANS datainsamlingstid (steg 4.3.3)

5. Definiera neutronspridningsparametrarna med liten vinkel i SANS instrumentkontroll-GUI.

  1. Bestäm längdskalorna och q-intervallet av intresse för varje prov.
  2. Definiera instrumentkonfigurationen för att täcka önskat q-intervall av intresse, samtidigt som neutronflödet maximeras vid provet.
  3. Ställ in den totala VSANS-datainsamlingstiden i SANS instrumentkontrollgränssnitt till den beräknade cykeltiden i steg 4.4 (datainsamlingstid för neutronspridning =t-cykel).
  4. Ställ in mättiden för provöverföringen på 100 s i SANS instrumentkontroll-GUI.
  5. Använd SAR-instrumentkontrollgränssnittet och aktivera datainsamling i händelseläge genom att skriva GenerateEventModeData true på kommandoraden.

6. Samla in standardspridningsmätningar för datareduktion innan du påbörjar experimentet med stoppat flöde för att bearbeta TR-SANS-data.

  1. Mät bakgrundsspridningen.
    1. Se till att den lokala instrumentluckan är stängd.
    2. Fäst det blockerade strålprovet på baksidan av provöppningen, säkra den lokala instrumentmiljön och öppna den lokala instrumentluckan.
    3. Definiera datainsamlingstiden för blockerad strålspridning i programvaran och samla in blockerade strålspridningsdata, räkna med samma varaktighet som den längsta spridningsdatainsamlingstiden (tscatt).
    4. När datainsamlingen är klar stänger du instrumentslutaren och tar bort det blockerade strålprovet från provöppningen.
  2. Mät den tomma cellspridningen.
    1. Se till att provcellen har sköljts och torkats ordentligt.
    2. Öppna den lokala instrumentluckan.
    3. Samla in mätningen av tomcellsöverföring i 100 sekunder.
    4. Samla in mätningen av tomcellsspridning och räkna med åtminstone den längsta förvärvstiden (tscatt).

7. Börja experimentet med stoppat flöde.

  1. Starta insamling av VSANS-spridningsdata i händelseläge .
    1. Se till att det lokala instrumentområdet är säkert och öppna sedan den lokala instrumentstrålens slutare.
    2. Börja insamlingen av SANS-data med hjälp av SANS-instrumentkontrollprogramvaran på instrumentdatorn genom att dra och släppa önskade körningar i instrumentkön.
      OBS: För att säkerställa att de tidigaste tidpunkterna mäts, börja datainsamlingen innan du startar blandningsexperimentet med stoppat flöde. Uppgifterna kommer att efterbehandlas i ett senare steg för att ta hänsyn till fördröjningstiden (t-fördröjning).
  2. Starta blandningsexperimentet med stoppat flöde i kontroll-GUI.
    1. Välj anteckningsbokscellen med etiketten Starta blandningsexperiment i det grafiska användargränssnittet för systemkontroll med stoppat flöde.
    2. Med den här cellen aktivt vald, klicka på knappen Kör (höger triangel) längst upp i kontrollprogrammet för stoppat flöde, eller tryck på Skift- och Enter-tangenterna tillsammans på tangentbordet.
    3. Bekräfta att blandningsprotokollet för stoppat flöde som definieras i avsnitt 4 har börjat fungera.
    4. Lägg till 100 s-transmissionsmätningen i VSANS-instrumentkön efter spridningskörningen med hjälp av SANS instrumentkontroll-GUI.
    5. Lägg till en spridningsmätningskörning och en transmissionsmätningskörning i instrumentkön för varje återstående blandningscykel med stoppat flöde (ncykel - 1, steg 4.3.5) i SANS instrumentkontroll-GUI.

8. Bearbeta och reducera data för att ta bort alla bakgrunder, korrigera för detektorkänslighet och korrigera för provöverföring.

  1. Ladda ned spridningsdatafilerna och tillhörande händelsefiler från servern.
    OBS: Separata detektorhändelsefiler genereras efter varje VSANS-mätning, en händelsefil för varje aktiv detektorvagn (t.ex. främre, mellersta och/eller bakre detektor).
  2. Placeraspridningsdata i önskade tidsfack med kommandot events=Rebin(filnamn) följt av kommandot e vents.do_rebinning(timebins), där indatafilnamnet motsvarar namnet på önskad SANS-datafil och timebins är en lista över önskade tidsfacksgränser i sekunder.
    OBS: Om inmatningstidsfacken anges som ett enda nummer istället för en lista, kommer data att binnas i N antal fack med samma tidsbredd, där N är ingångstidsfacken (se programvaruskript som tillhandahålls av strålröret och tillgängligt online-arkiv med öppen källkod64).
  3. Minska binned spridningsdata med hjälp av programvaran som tillhandahålls strålröret65.

9. Analysera TR-SANS-data.

  1. Beräkna processtiden av intresse (t-process) från mättiderna med ekvation (2).
    tprocess = ti - tstopp + tfördröjning (2)
    Där ti är mättidsfacken som börjar efter att flödet stoppats, tstopp är mättiden omedelbart när flödet stoppas och tfördröjning är fördröjningstiden.
  2. Plotta den q-beroende intensiteten I(q) som en funktion av processtiden med hjälp av de tidsfack som definieras i steg 8.2 ocht-processen som beräknas i steg 9.1.
    OBS: Den tidigaste tillgängliga processtiden begränsas avt-fördröjning. För att mäta tidigare processtidpunkter, öka den totala flödeshastigheten (Q) eller minska den totala hålrumsvolymen (Vvoid).
  3. Extrahera de kinetiska parametrarna av intresse från förändringen i I (q) som en funktion av processtiden.

10. Avsluta experimentet.

  1. Stäng av neutronstrålen genom att stänga den lokala instrumentluckan.
  2. Gör en strålningskontroll med hjälp av en strålningsmonitor som tillhandahålls av strålröret innan du kopplar bort delar, rör eller lossar prover eller blandade provbehållare.
  3. Överför sprutorna, slangarna och den blandade provbehållaren till hälsofysikavdelningen.
  4. Fyll i hälsofysikformulär och vänta på utvärdering av hälsofysikpersonal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De representativa neutrondata som visas här mäter lipidutbyteskinetiken i närvaro av metyl-β-cyklodextrin (mβCD), en tillsats som katalyserar lipidutbytet mellan vesiklar med växelkursen (ke)66,67. Tidigare fluorescensstudier har visat att ke beror på mβCD-koncentrationen, och halveringstiden för utbytesprocessen är i storleksordningenminuter 68. De aktuella experimenten använder TR-SANS med stoppat flöde för att mäta mβCD-katalyserat lipidutbyte mellan vesiklar på sekundtidsskalan. Två isotopiskt distinkta lipidvesikelpopulationer framställdes; en vesikelpopulation preparerades med svanshydrerade dimyristoylfosfatidylkolinlipider (DMPC) (H-lipidvesiklar i figur 5) och den andra vesikelpopulationen bereddes med svansdeutererade DMPC-lipider (DMPC-d54) (D-lipidvesiklar i figur 5). En molfraktion av 0,05 (5 mol%) laddad dimyrisotylfosfatidylglyercol (DMPG) lipid tillsattes till både DMPC och DMPC-d54 torra lipidpulver för att främja unilamellär vesikelbildning69.

Separata H-vesikel- och D-vesikellösningar framställdes genom hydratisering av respektive lipidfilmer i ett lösningsmedel innehållande 45 volymprocent tungt vatten (D2O) och 55 volymprocent vatten (H2O). LösningsmedelskompositionenD2O/H2Oberäknades så att neutronspridningens längdtäthet (ρ) för lösningsmedlet matchade en slumpmässig blandning av H-lipider och D-lipider (Δρ = ρlipid- ρlösningsmedel = 0). Med andra ord skulle en slumpmässigt blandad H / D-vesikel vara "osynlig" för neutronerna och generera noll koherent neutronspridning. Unilamellar vesikellösningar framställdes genom frysupptining av lösningarna fem gånger och sedan extrudering av de enskilda lösningarna genom ett polykarbonatfilter med porer med en diameter på 100 nm. Vesikellösningarna extruderades fram och tillbaka mellan två sprutor och filtret totalt 31 gånger vid 30 °C. Därefter tillsattes en liten volym av en koncentrerad mβCD-stamlösning framställd i samma D2O/H2O-lösningsmedelsblandningtill vesikellösningarna. Den slutliga lipidkoncentrationen var 14 mmol/L (mM) och mβCD-koncentrationen var 30 mM. De enskilda vesikellösningarna balanserades i minst 30 minuter med tillsatt mβCD innan lösningarna laddades i provsprutorna i stoppflödesblandningsanordningen.

Ett exempel på uppmätta neutronräkningshastigheter under flera injektionscykler visas i figur 4A. Varje cykel bestod av 9 sköljsteg, 1 torkningssteg och 1 provinjektionssteg. Endast räkningshastigheter uppmätta på den mellersta detektorvagnen i VSANS-instrumentet presenteras för tydlighetens skull. Liknande trender hittades på den främre detektorvagnen, vilket motsvarade data som samlats in vid större spridningsvinklar eller högre q-värden. Räkningshastigheten spikade med varje sköljinjektion av lösningsmedel (lösningsmedel S1 och lösningsmedel S2) och återgick till de tomma cellbaslinjeräkningarna när lösningsmedlet trycktes ut ur cellen med kvävgas och torkades. Den slutliga cellsköljningen var med S2, som var etanol i detta exempel, och cellen torkades en sista gång med kvävgas i 3 min före provinjektion. Strax efter att provet injicerades i cellen ökade neutronräkningshastigheten och data samlades in kontinuerligt i 5 minuter. Det representativa prov som injicerades i exempeldata i figur 4A var en saltbuffertbakgrund. Fluktuationerna i uppmätt intensitet över tid återspeglar variationerna i neutronräkningshastigheten i bakgrunden och återspeglar inte en förändring i den genomsnittliga provsammansättningen. Hela cykeln med sköljning, torkning, blandning och injektion av provet upprepades ytterligare en gång i exemplet i figur 4A, där varje cykel varade i totalt 15 minuter.

De enskilda H-märkta och D-märkta lipidvesikellösningarna blandades vid tidpunkten tblandning och flödade omedelbart in i provcellen. Den uppmätta neutronräkningshastigheten ökade och nådde sedan ett maximalt värde när provcellen fylldes vidt-fyllning, som visas i figur 4B. Den förflutna tiden som krävs för att fylla provcellen kallas fördröjningstiden t fördröjning och ges av tfördröjning = tfyllningsblandning. Om tomrumsvolymen (V void) mellan blandaren och provcellen är känd och den totala flödeshastigheten (Q) är känd, kant-fördröjningen också beräknas som tdelay = Vvoid/Q (se protokollsteg 4.3.2), vilket också är den genomsnittliga uppehållstiden för vätskeprovet att komma in i mixern och lämna provcellen. Efter att ha nåttt-fyllningen fortsatte flödet med konstant flödeshastighet för att säkerställa att cellen hade fyllts och nått stabilt tillstånd. Flödet stoppades sedan omedelbart vidt-stoppet. Den genomsnittliga neutronräkningshastigheten förblev konstant som en funktion av mättiden mellant-fyllning ocht-stopp eftersom flödeshastigheten genom provcellen var konstant, och därför var provet inom neutronstrålens väg vid stationärt tillstånd. Med andra ord motsvarar de data som uppmätts vid tstopp det prov som har blandats och utvecklats med tfördröjning = tfyllning- tmix = Vvoid / Q. De inspärrade mättiderna ti samlade in omedelbart efter tstopp är de viktigaste kinetiska data av intresse.

I figur 4C plottas neutronräkningarna från det blandade lipidvesikelprovet vid tre olika temperaturer som en funktion av den korrigerade processtidsskalan (t-processen), vilket är processtiden av intresse som har korrigerats för steady-state-flödesperioden och fördröjningstiden. Processtidsskalan beräknades med t process = t i- t stopp + tfördröjning, eller motsvarande, tprocess = ti- tstopp + t fyllningsblandning. SANS-data samlades in kontinuerligt i figur 4 i så kallat händelseläge. Under datainsamling i händelseläge registreras varje detekterad neutronhändelse med en unik tidsstämpel och dess x- och y-position på den tvådimensionella neutrondetektorn. Händelselägesdata efterbehandlas sedan till önskade tidsfack (t i)i figur 4B.

Händelselägesdata inom det tillgängliga processtidsfönstret av intresse (dvs. neutronspridning som samlats in vid varje t i eftert-stopp i figur 4B) rekonstruerades till en tvådimensionell (2D) detektorbild för den tidsbehållaren med hjälp av protokoll och skript tillgängligai online-arkivet med öppen källkod64. Varje 2D-detektorbild bearbetades sedan med hjälp av datareduktionsrutiner för att subtrahera de olika bakgrundskällorna, korrigera för provöverföringen och detektoreffektiviteten och azimutalt integrera 2D-detektordata i intensitet (I) kontra spridningsvektor (q) diagram65. Data i figur 5 delades in i lika (3 s) tidsfack och är representativa för den tids- och längdskaleberoende information som kan erhållas från en TR-SANS-mätning. I likhet med den totala råräkningshastigheten som visas i figur 4B minskar den q-beroende intensiteten I(q) med tiden när lipiderna i den yttre broschyren utbyts och blandas slumpmässigt mellan olika blåsor.

Data presenteras i figur 5 för lipidutbyteskinetiken mätt vid 3 olika temperaturer. Varje diagram visar de data som samlats in under de första 110 minuterna efter blandning. Den uppmätta intensiteten minskar med en storleksordning vid de lägsta q-värdena vid 36 °C och 30 °C, vilket motsvarar lipidvätskefasen. Samtidigt förändras data om spridd intensitet betydligt långsammare med tiden vid 20 °C, vilket indikerar att den yttre bipacksedelns utbyteskinetik är mycket långsammare i lipidgelfasen.

Den uppmätta spridningsintensiteten, I(q), är relaterad till SLD-kontrasten som Equation 1, där Δρ är SLD-skillnaden mellan vesikeln och det omgivande lösningsmedlet. Denna genomsnittliga SLD-kontrast är direkt relaterad till det relativa antalet H-lipider och D-lipider i en vesikel vid varje given tidpunkt. Som sådan kan den uppmätta spridningsintensiteten vid en given tidpunkt normaliseras för att bestämma fraktionen av lipidpopulationen som har utbytts. Denna normalisering uppnås genom att samla in ytterligare två mätningar, inklusive: (1) den uppmätta intensiteten I (0) vid tiden t = 0, när det inte finns något lipidutbyte mellan vesiklar, och (2) den uppmätta intensiteten I (∞) vid tiden t = ∞, när alla lipider har utbytts och populationerna har jämvikt. Den normaliserade räkningshastigheten, 42, Equation 2 plottas som en funktion av processtiden för de olika temperaturerna i figur 6. I detta exempel är I (t) den q-integrerade intensiteten vid processtiden t (bakgrundssubtraherad intensitet integrerad som en funktion av q), I (∞) är den q-integrerade intensiteten vid oändlig tid efter att alla lipider har utbytts (vilket borde likna lösningsmedelsbakgrundsspridningen) och I (0) är q-integrerad intensitet vid tiden t = 0 (utan lipidbyte). I(0) mättes för ett blandat prov under fasövergångstemperaturen vid 20 °C där utbytet var långsamt, och I(∞) mättes i ett separat prov som hade jämvikt i mer än 36 timmar vid 40 °C och hade och helt utbytt H-lipider och D-lipider.

Den normaliserade räkningshastigheten bör sönderfalla från R (t) = 1 vid processtiden t = 0, till R (t) = 0 vid t = ∞, och är direkt relaterad till SLD-kontrast i provet och därför omfattningen av lipidutbytet 27,28,29,30,31,32,33,34,35 . Observera att de tidigaste uppmätta R(t)-data inte börjar vid R(t)=1 vid 30 °C och 36 °C, vilket indikerar att en signifikant mängd lipidutbyte inträffade under de första 3 sekunderna efter blandning, vilket inte var experimentellt tillgängligt på grund av fördröjningstiden (t-fördröjning = 2,4 s) för det använda blandningsprotokollet med stoppat flöde. Under tiden förblev den uppmätta R(t) vid 20 °C ungefär konstant under de första (2-3) minuterna. För lipidutbyteskinetiken uppmätt vid 30 °C och 36 °C sönderföll R(t) snabbt till ≈0,5 inom 100 s, vilket tyder på att de yttre bipacksedellipiderna har utbytts fullständigt och balanserats inom några minuter. Följaktligen möjliggjordes infångning av det mβCD-katalyserade lipidutbytet med hjälp av SANS med stoppat flöde och skulle vara svårt att fånga med manuell pipettblandning. Att fånga ännu tidigare processtidpunkter (t < 3 s) kräver en annan blandartyp med mindre hålrumsvolym, mindre hålrumsvolymer för slangar och högre totala flödeshastigheter för att minska fördröjningstiden.

R(t) fortsatte att sönderfalla vid längre tidpunkter när lipiderna flip-flop mellan de inre och yttre broschyrerna. TR-SANS-data för den långsammare flip-flop-processen (t > 5 min) kan samlas in med diskreta prover blandade för hand och laddas i vanliga SANS-provceller, eftersom den manuella pipettblandningsmetoden tar cirka 5 minuter. På samma sätt var lipidutbytet vid 20 °C i lipidgelfasen tillräckligt långsamt för att blandas och mätas diskret, och denna mätning behövde inte nödvändigtvis studeras med stoppflödesblandningsmetoden. Mätningar av kinetiska processer på tidsskalor från flera minuter till timmar är effektivare när proverna blandas genom manuell pipettblandning. Kinetiska processer på tidsskalor mindre än minuter kräver dock denna stoppade flödesblandning och TR-SANS-mätprocedur.

Figure 4
Figur 4: Representativa rådata för neutronräkning som samlats in under blandnings- och rengöringsinsprutningscyklerna. a) Exempel på neutronräkningshastighet (mellandetektor) som en funktion av tiden under upprepade sköljsekvenser, torkningssekvens och blandad provinjektionssekvens under flera cykler. Provet i (A) var en saltbuffertbakgrund, och förändringarna i intensitet över tiden återspeglar variationerna i bakgrundsräkningshastigheten, inte en förändring i provet. (B) Monitornormaliserad neutronräkningshastighet som en funktion av experimenttiden efter injektion av blandade H-lipid- och D-lipidvesiklar vid 30 °C. De lodräta streckade linjerna anger blandningens starttid (t-blandning), fyllningstiden (t-fyllning), flödesstopptiden (t-stopp) och tidsbinningsområdet (ti). Sönderfallet i räkningshastighet eftert-stopp beror på förlust av kontrast i provet som lipidutbytet mellan blåsorna. (C) Övervaka normaliserade neutronräkningshastigheter som en funktion av utbytesprocesstiden under de första 100 sekunderna av experimentet vid (blå) 20 °C, (grön) 30 °C och (röd) 36 °C. Händelselägesdata bearbetas till 1 s-lagerplatser. Förkortningar: S1 = lösningsmedel 1; S2 = lösningsmedel 2; tmix = den experimentella tidpunkt då provlösningarna blandas, tfill = experimenttid då provcellen fylls; tstop = experimentell tid då flödet stoppas, tprocess = beräknad kinetisk processtid av intresse. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Illustration av katalyserat utbyte av det yttre lagret av lipidvesiklar och motsvarande förändringar i den spridda intensiteten (I) som en funktion av spridningsvektorn (q) vid olika temperaturer. Schematiskt schema som visar lipidutbytet mellan H-lipid- och D-lipidvesiklar efter (A) initial blandning vid t = 0 och (B) utbyte av det yttre skiktet katalyserat av metyl-β-cyklodextrin (mβCD). Minskad neutronspridningsintensitet som en funktion av spridningsvågvektorn q. Experiment med stoppad flödesblandning och VSANS-mätningar upprepades vid (C) 36 °C, (D) 30 °C och (E) 20 °C. De presenterade data delades in i 3 s intervall under de första 10 minuterna efter blandning vid varje specificerad temperatur. Felstaplar är den förökade osäkerheten från räkningsstatistiken och representerar en standardavvikelse. Förkortningar: ke = hastighetskonstant för lipidutbyte mellan vesiklar; mβCD = metyl-β-cyklodextrin; k f = hastighetskonstant för lipidutbyte mellan broschyrer, även kallad lipidflip-flop; l(q) = uppmätt SANS intensitet med enheterna cm-1 ; q = spridningsvektor. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Normaliserad spridd intensitet motsvarande fraktionen av utbytta lipider som kan modelleras för att extrahera hastighetskonstanter för de kinetiska processerna av intresse . a) Lipidutbyte mellan blåsornas yttre bipacksedel vid tidsskalor mellan 3 s och 600 s mätt vid (blå) 20 °C, (svart) 30 °C och (röd) 36 °C. Infällningen i figuren zoomar in på de första 60 sekunderna av den kinetiska processen. Felstaplar är den förökade osäkerheten från den numeriska integrationen av spridningsintensiteterna och representerar en standardavvikelse. Förkortningar: R(t) = normaliserad spridd intensitet; tprocess = korrigerad processtid av intresse. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den aktuella proceduren beskriver blandningsanordningen och stegen för att utföra TR-SANS-mätningar med stoppat flöde. Enheten och protokollet är optimerade för vätskeprover med låg viskositet där tidsskalorna av intresse är ≈1 s till 5 min. För tidsskalor större än 5 minuter kan det vara enklare och önskvärt att manuellt blanda proverna och ladda dem i vanliga spridningsceller, särskilt för högviskositetsprover, geler eller pastor. Åtkomst till tidsskalor mindre än 1 s kräver en annan blandningsapparat, lägre totala hålrumsvolymer och högre totala flödeshastigheter för att sänka fördröjningstiden. Det är också viktigt att notera att studier av kinetiska processer på dessa korta tidsskalor sannolikt kommer att kräva upprepade provinjektioner för att ackumulera tillräcklig spridningsräkningsstatistik på millisekundskalan med TR-SANS. Om de totala provvolymerna är begränsade kan det vara önskvärt att använda en högre flödesteknik, såsom ljusspridning eller röntgenspridning, som kräver färre provinjektioner eller mindre provvolym per injektion, förutsatt att tillräcklig spridningskontrast finns med ljus- eller röntgenspridning.

Detta modulära SANS-tillvägagångssätt med stoppat flöde skapar flera viktiga fördelar och nackdelar jämfört med kommersiellt tillgängliga stoppflödesinstrument som har optimerats för neutronspridningsexperiment. Viktiga fördelar inkluderar (1) alternerande TR-SANS-mätningar mellan olika provceller under sköljperioder för att maximera användningen av neutronstråletid, (2) anpassning av antalet sprutor, sprutvolymer och mixertyper för ternära provblandning eller andra mer komplexa provblandningskrav, och (3) möjliggör längre mätperioder genom att isolera provcellen och eliminera bakåtdiffusion vid längre tidsskalor (>10 min). Även om det inte implementeras här, skulle modulariteten hos blandningscelldesignen också möjliggöra samtidig datainsamling med flera mätmetoder, såsom kamning av SANS, UV-Vis och fluorescensmätningar70. Två viktiga nackdelar med denna modulära installation inkluderar (1) relativt längre blandningsfördröjningstider (1 s till 3 s) jämfört med andra system som kan ge 1 ms till 100 ms fördröjningstider och (2) ett mindre driftstemperaturområde (10 °C till 50 °C) jämfört med andra tillgängliga system som kan komma åt driftstemperaturer från -20 °C till mer än 80 °C.

Att samla in preliminära SANS-data om proverna av intresse innan man utför in situ-blandningsexperiment är viktigt för att samla in de bästa TR-SANS-data, särskilt i experiment som är utformade för att övervaka molekylär utbyteskinetik, som exemplet som presenteras här. Att bestämma exakta värden på I (0) och I (∞) är avgörande för att beräkna exakta värden för den normaliserade intensiteten, R (t), som modelleras för att extrahera de önskade kinetiska parametrarna. Värdet på I(0) kan beräknas direkt utifrån de uppmätta spridningsintensiteterna hos de separata H-vesikel- och D-vesikelbestånden, och I(∞) kan bestämmas genom framställning av ett separat vesikelprov framställt av en 50/50-blandning av H-lipider/D-lipider. Spridningsdata från dessa kontrollprover kan också användas för att bestämma det optimala q-området och SANS-instrumentkonfigurationen för TR-SANS-mätningen för att maximera signalen och verifiera utvecklingen av utbyteskinetiken under TR-SANS-experimenten. Om den uppmätta intensiteten vid den första tidpunkten efter blandning inte är lika med den beräknade I(0), kan snabbare blandningstider behövas för att fånga alla processer av intresse. När den uppmätta intensiteten har nått I(∞) är utbytesprocessen avslutad och cellen kan tömmas och rengöras som förberedelse för nästa injektion.

För att framgångsrikt blanda vätskeprov för TR-SANS är det viktigt att se till att alla sprutor, ventiler och slangledningar är grundade och luftfria och att alla slanganslutningar är säkra för att förhindra läckage. Underlåtenhet att utföra dessa kritiska steg korrekt kan resultera i felaktiga blandningsvolymer eller felaktiga absoluta spridningsintensiteter. Till exempel kommer luftbubblor som fångas i provcellen att minska den uppmätta SANS-intensiteten på grund av minskad provvolym i neutronstrålens väg. Alternativt kan luftbubblor producera "streck" eller "facklor" med hög intensitet på detektorn på grund av strålbrytning vid luft-vätskegränssnittet. Oväntade förändringar i den uppmätta spridningsintensiteten över tid kan indikera dålig provblandning, ventilläckage, luftbubblor i provcellen eller provets bakåtdiffusion.

Att samla in en transmissionsmätning för varje prov under ett TR-SANS-experiment är avgörande för att reducera insamlade data till en absolut intensitet. Det är möjligt att samtidigt samla in spridnings- och överföringsdata på vissa SANS-instrument, vilket förenklar den övergripande TR-SANS-datainsamlingsprogrammeringen; Detta är dock inte möjligt på alla instrument, inklusive VSANS-instrumentet som används i detta protokoll. Eftersom provöverföringen och provspridningsmätningarna krävde olika instrumentkonfigurationer samlades överföringsmätningar in i slutet av spridningsmätningarna (protokollsteg 7.2.4) för att säkerställa att spridningsdata mättes vid de tidigaste tidpunkterna efter att provet injicerades i cellen. Överföringen beror endast på den totala elementära kompositionen, provvägslängden och neutronvåglängden. Därför bör överföringen inte ändras om den totala elementära sammansättningen förblir konstant under hela det tidsupplösta experimentet. Stora skillnader i överföringsvärdena mellan upprepade körningar av samma prov indikerar ett problem från antingen inkonsekventa blandningsprovvolymer, ofullständig fyllning av provcellen, luftbubblor eller ventilläckage och provåterflöde under experimentet.

En unik fördel med TR-SANS är att den uppmätta intensiteten är beroende av spridningsvektorn (q) och kan användas för att undersöka rumsliga förändringar på nanoskalan. I kombination med blandningsanordningen med stoppat flöde kan TR-SANS undersöka dessa förändringar i nanoskala på andra till minuts tidsskalor, vilket ger insikter i självmontering och utbyte av ytaktiva ämnen och lipider, polymer- och proteinaggregering vid tillsats av hjälpämnen, nanopartikeltillväxt och sönderfall eller utbyte av inkapslade produkter i emulsioner. Stoppflödesanordningen kan konfigureras med flera provsprutpumpar och sprutor för att underlätta blandningen av två eller flera vätskeprover. Denna flexibilitet möjliggör systematisk undersökning av tillsatser på kinetiken av intresse. Till exempel kan olika volymer av en koncentrerad antimikrobiell peptidlösning blandas med H-vesikel- och D-vesikellösningar för att studera effekterna av peptidkoncentration på lipidutbyteskinetik45,46. Dessutom, eftersom alla förseglade vätskevägar är inneslutna i ett temperaturkontrollerat hölje, vilket inkluderar provsprutor, ventiler, blandare och slangar, kan systemets temperatur ändras för att extrahera de termodynamiska parametrarna relaterade till de kinetiska processerna av intresse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.

Acknowledgments

Tillgång till NG3 VSANS tillhandahölls av Center for High-Resolution Neutron Scattering, ett partnerskap mellan National Institute of Standards and Technology och National Science Foundation enligt avtal nr. DMR-2010792. M.H.L.N erkänner finansieringen från Mitacs Globalink (Kanada). Identifieringen av kommersiella produkter eller handelsnamn är att främja förståelse och innebär inte godkännande eller rekommendation från National Institute of Standards and Technology.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynamic mixer Analytical Scientific Instruments 462-0150A Magnetically coupled rotor, binary dynamic mixer assembly (ternary type available), 0.15 mL dead volume (larger dead volume available)
Fluoropolymer tubing IDEX Health & Science 1507L PFA Tubing Natural 1/16 inch OD x 0.040 inch ID x 50 ft
Fluoropolymer 1/4-28 flangeless fittings IDEX Health & Science XP-245 PFA flangeless fitting with ferrules, 1/4-28 threading, 1/16 inch OD tubing
Glass syringes Hamilton Company 81660 Hamilton 1000 series syringes, 10 mL (81660), model 1010 C syr, 1/4"-28 thread termination, other volumes available
High-pressure flow selector valves Vici Valco C85X-1570EUTB Vici 10 position selector valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure switch valves Vici Valco C82X-1574EUHB Vici 4 port switch valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure syringes Cetoni A2019000358 3 mL stainless steel syringe, 510 bar max, 21 mL/min flow rate max
Low-pressure flow selector valves Vici Valco C25-3180EUHB Vici 10 position selector valves, max 250 psi liquid, 0.75 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 1/4-28 threaded ports, USB universal actuator
neMESYS high-pressure syringe pumps Cetoni A3921000103 Max force 2600 N
neMESYS mid-pressure syringe pumps Cetoni A3921000131 Max force 1000 N
Power supply Cetoni A3921000127 Base 600, supplies power for up to 4 high pressure pumps
Quartz flow-through sample cell Starna Scientific 3-2.30-Q-1/TC Quartz micro flow cells, 2 mm path length (1 mm available), 2 mm by 2 mm by 30 mm internal dimension
Quartz windows Technical Glass Products NA GE 124 Clear fused quartz ground and polished plates, 11.75 inch by 23.75 inch by 0.375 inch thick
Stainless steel 10-32 coned compression fittings IDEX Health & Science U-321X, U-320X 316 stainless steel ferrule (U-321X) and nut (U-320X) -Valco type, 10-32 coned, for 1/16 inch OD stainless steel tubing
Stainless steel tubing IDEX Health & Science U-102 Stainless Steel Tubing 1/16 inch OD x 0.020 inch ID, 10 cm, various precut lengths available
Syringe pump control software Cetoni T6000000004 QmixElements software for nemesys pumps, QmixSDK software development kit
Thermoelectric air conditioner EIC Solutions AAC-140C-4XT-HC Thermoelectric air conditioner mounted on insulated enclosure to control the pump, valve, mixer, and sample temperature
T-slot railing McMaster-Carr 47065T103 Aluminum t-slotted railing (1.5 inch by 1.5 inch) cut to various lengths
Vapor locking bottle caps  Cole-Parmer EW-12018-02 Four 304 SS port inserts, 1/4"-28 threads, GL45 bottle cap size, PTFE body, SS threads, PP collar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Melnichenko, Y. B., Wignall, G. D. Small-angle neutron scattering in materials science: Recent practical applications. Journal of Applied Physics. 102 (2), 021101 (2007).
  2. Grillo, I. Small-angle neutron scattering and applications in soft condensed matter. Soft Matter Characterization. Borsali, R., Pecora, R. , Springer. Dordrecht. (2008).
  3. Hollamby, M. J. Practical applications of small-angle neutron scattering. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (26), 10566-10579 (2013).
  4. Pipich, V., Fu, Z. KWS-3: Very small angle diffractor with focusing mirror. Journal of large-scale research. 1, 31 (2015).
  5. Kline, S. 2019 NCNR Annual Report, Special Publication (NIST SP). , National Institute of Standards and Technology. Gaithersburg, MD. (2019).
  6. Gilbert, P. H., et al. Preservative induced polysorbate 80 micelle aggregation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 10 (6), 2395-2404 (2021).
  7. Terashima, T., et al. In situ and time-resolved small-angle neutron scattering observation of star polymer formation via arm-linking reaction in ruthenium-catalyzed living radical polymerization. Macromolecules. 43 (19), 8218-8232 (2010).
  8. Hashimoto, K., Fujii, K., Nishi, K., Shibayama, M. Ion gel network formation in an ionic liquid studied by time-resolved small-angle neutron scattering. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (40), 9419-9424 (2018).
  9. Conn, C. E., et al. Membrane protein structures in lipid bilayers; small-Angle neutron scattering with contrast-matched bicontinuous cubic phases. Frontiers in Chemistry. 8, 619470 (2021).
  10. van't Hag, L., et al. Protein-eye view of the in meso crystallization mechanism. Langmuir. 35 (25), 8344-8356 (2019).
  11. Mahieu, E., et al. Observing protein degradation by the PAN-20S proteasome by time-resolved neutron scattering. Biophysical Journal. 119 (2), 375-388 (2020).
  12. Ibrahim, Z., et al. Time-resolved neutron scattering provides new insight into protein substrate processing by a AAA+ unfoldase. Scientific Reports. 7 (1), 40948 (2017).
  13. Hollamby, M. J., et al. Growth of mesoporous silica nanoparticles monitored by time-resolved small-angle neutron scattering. Langmuir. 28 (9), 4425-4433 (2012).
  14. Blin, J. L., Impéror-Clerc, M. Mechanism of self-assembly in the synthesis of silica mesoporous materials: in situ studies by X-ray and neutron scattering. Chemical Society Reviews. 42 (9), 4071-4082 (2013).
  15. Impéror-Clerc, M., Grillo, I., Khodakov, A. Y., Durand, D., Zholobenko, V. L. New insights into the initial steps of the formation of SBA-15 materials: an in situ small angle neutron scattering investigation. Chemical Communications. 8, 834-836 (2007).
  16. Narayanan, T., Rüter, A., Olsson, U. SAXS/WAXS investigation of amyloid-β(16-22) peptide nanotubes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 654349 (2021).
  17. Angelov, B., et al. DNA/Fusogenic lipid nanocarrier assembly: millisecond structural dynamics. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (11), 1959-1964 (2013).
  18. Amann, M., et al. Kinetic pathways for polyelectrolyte coacervate micelle formation revealed by time-resolved synchrotron SAXS. Macromolecules. 52 (21), 8227 (2019).
  19. Varga, Z., Wacha, A., Bóta, A. Osmotic shrinkage of sterically stabilized liposomes as revealed by time-resolved small-angle X-ray scattering. Journal of Applied Crystallography. 47 (1), 35-40 (2014).
  20. Panine, P., Finet, S., Weiss, T. M., Narayanan, T. Probing fast kinetics in complex fluids by combined rapid mixing and small-angle X-ray scattering. Advances in Colloid and Interface Science. 127 (1), 9-18 (2006).
  21. Grillo, I. Applications of stopped-flow in SAXS and SANS. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 14 (6), 402-408 (2009).
  22. Gomez-Hens, A., Perez-Bendito, D. The stopped-flow technique in analytical chemistry. Analytica Chimica Acta. 242, 147-177 (1991).
  23. Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. Use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the ATP turnover cycle of kinesins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52142 (2014).
  24. Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of stopped-flow kinetics methods to investigate the mechanism of action of a DNA repair protein. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1874 (2010).
  25. Raney, K. D., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. A fluorescence-based assay for monitoring helicase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6644-6648 (1994).
  26. Roder, H., Maki, K., Cheng, H. Early events in protein folding explored by rapid mixing methods. Chemical reviews. 106 (5), 1836-1861 (2006).
  27. Milon, A., et al. Osmotic swelling of unilamellar vesicles by the stopped-flow light scattering method. Influence of vesicle size, solute, temperature, cholesterol and three α,ω-dihydroxycarotenoids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 859 (1), 1-9 (1986).
  28. Gast, K., Nöppert, A., Müller-Frohne, M., Zirwer, D., Damaschun, G. Stopped-flow dynamic light scattering as a method to monitor compaction during protein folding. European Biophysics Journal. 25 (3), 211-219 (1997).
  29. Antoun, A., Pavlov, M. Y., Tenson, T., Ehrenberg, M. M. Ribosome formation from subunits studied by stopped-flow and Rayleigh light scattering. Biological Procedures Online. 6, 35-54 (2004).
  30. Zhu, Z., Armes, S. P., Liu, S. pH-Induced micellization kinetics of ABC triblock copolymers measured by stopped-flow light scattering. Macromolecules. 38 (23), 9803-9812 (2005).
  31. Ye, J., et al. Comparative study of temperature-induced association of cyclic and linear poly(N-isopropylacrylamide) chains in dilute solutions by laser light scattering and stopped-flow temperature jump. Macromolecules. 41 (12), 4416-4422 (2008).
  32. Liu, X., et al. Early stage kinetics of polyelectrolyte complex coacervation monitored through stopped-flow light scattering. Soft Matter. 12 (44), 9030-9038 (2016).
  33. Garman, E. F., Weik, M. X-ray radiation damage to biological samples: recent progress. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (4), 907-911 (2019).
  34. Garg, S., Porcar, L., Woodka, A. C., Butler, P. D., Perez-Salas, U. Noninvasive neutron scattering measurements reveal slower cholesterol transport in model lipid membranes. Biophysical Journal. 101 (2), 370-377 (2011).
  35. Marquardt, D., et al. 1H NMR shows slow phospholipid flip-flop in gel and fluid bilayers. Langmuir. 33 (15), 3731-3741 (2017).
  36. Egelhaaf, S. U., Olsson, U., Schurtenberger, P. Time-resolved SANS for surfactant phase transitions. Physica B: Condensed Matter. 276-278, 326-329 (2000).
  37. Tabor, R. F., Eastoe, J., Grillo, I. Time-resolved small-angle neutron scattering as a lamellar phase evolves into a microemulsion. Soft Matter. 5 (10), 2125-2129 (2009).
  38. Gradzielski, M., Bergmeier, M., Hoffmann, H., Müller, M., Grillo, I. Vesicle gel formed by a self-organization process. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (49), 11594-11597 (2000).
  39. Lee, Y. -T., Li, D. S., Pozzo, L. D. Kinetic analysis of ultrasound-induced oil exchange in oil-in-water emulsions through contrast variation time-resolved small-sngle neutron scattering. Langmuir. 35 (47), 15204-15213 (2019).
  40. Lee, Y. -T., Pozzo, L. D. Contrast-variation time-resolved small-angle neutron scattering analysis of oil-exchange kinetics between oil-in-water emulsions stabilized by anionic surfactants. Langmuir. 35 (47), 15192-15203 (2019).
  41. Roger, K., Olsson, U., Schweins, R., Cabane, B. Emulsion ripening through molecular exchange at droplet contacts. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1452-1455 (2015).
  42. Nakano, M., Fukuda, M., Kudo, T., Endo, H., Handa, T. Determination of Interbilayer and Transbilayer Lipid Transfers by Time-Resolved Small-Angle Neutron Scattering. Physical Review Letters. 98 (23), 238101 (2007).
  43. Nakano, M., et al. Flip-flop of phospholipids in vesicles: kinetic analysis with time-resolved small-angle neutron scattering. The Journal of Physical Chemistry B. 113 (19), 6745-6748 (2009).
  44. Nguyen, M. H. L., et al. Methanol accelerates DMPC flip-flop and transfer: A SANS study on lipid dynamics. Biophysical Journal. 116 (5), 755-759 (2019).
  45. Nguyen, M. H. L., et al. Peptide-induced Lipid flip-flop in asymmetric liposomes measured by small angle neutron scattering. Langmuir. 35 (36), 11735-11744 (2019).
  46. Nguyen, M. H. L., et al. Time-resolved SANS reveals pore-forming peptides cause rapid lipid reorganization. New Journal of Chemistry. 45 (1), 447-456 (2021).
  47. Xia, Y., et al. Effects of nanoparticle morphology and acyl chain length on spontaneous lipid transfer rates. Langmuir. 31 (47), 12920-12928 (2015).
  48. Xia, Y., et al. Morphology-induced defects enhance lipid transfer rates. Langmuir. 32 (38), 9757-9764 (2016).
  49. Maric, S., et al. Time-resolved small-angle neutron scattering as a probe for the dynamics of lipid exchange between human lipoproteins and naturally derived membranes. Scientific Reports. 9 (1), 7591 (2019).
  50. Nielsen, J. E., Bjørnestad, V. A., Pipich, V., Jenssen, H., Lund, R. Beyond structural models for the mode of action: How natural antimicrobial peptides affect lipid transport. Journal of Colloid and Interface Science. 582, 793-802 (2021).
  51. Willner, L., Poppe, A., Allgaier, J., Mokenbusch, M., Richter, D. TIme-resolved SANS for the determintioan of unimer exchange kinetics in block copolymer micelles. Europhysics Letters. 55 (5), 667 (2001).
  52. Lund, R., Willner, L., Stellbrink, J., Lindner, P., Richter, D. Logarithmic chain-exchange kinetics of diblock copolymer micelles. Physical Review Letters. 96 (6), 068302 (2006).
  53. Lund, R., Willner, L., Richter, D., Dormidontova, E. E. Equilibrium chain exchange kinetics of diblock copolymer micelles: Tuning and logarithmic relaxation. Macromolecules. 39 (13), 4566-4575 (2006).
  54. Lund, R., Willner, L., Richter, D. Kinetics of block copolymer micelles studied by small-angle scattering methods. in Controlled Polymerization and Polymeric Structures. Advances in Polymer Science. Abe, A., Lee, K. S., Leibler, L., Kobayashi, S. , Springer. Cham. 51 (2013).
  55. Choi, S. -H., Lodge, T. P., Bates, F. S. Mechanism of molecular exchange in diblock copolymer micelles: hypersensitivity to core chain length. Physical Review Letters. 104 (4), 047802 (2010).
  56. Choi, S. -H., Bates, F. S., Lodge, T. P. Molecular exchange in ordered diblock copolymer micelles. Macromolecules. 44 (9), 3594-3604 (2011).
  57. Lu, J., Bates, F. S., Lodge, T. P. Chain exchange in binary copolymer micelles at equilibrium: confirmation of the independent chain hypothesis. ACS Macro Letters. 2 (5), 451-455 (2013).
  58. Lu, J., Bates, F. S., Lodge, T. P. Remarkable effect of molecular architecture on chain exchange in triblock copolymer micelles. Macromolecules. 48 (8), 2667-2676 (2015).
  59. Kelley, E. G., et al. Size evolution of highly amphiphilic macromolecular solution assemblies via a distinct bimodal pathway. Nature Communications. 5 (1), 3599 (2014).
  60. Murphy, R. P., Kelley, E. G., Rogers, S. A., Sullivan, M. O., Epps, T. H. Unlocking chain exchange in highly amphiphilic block polymer micellar systems: influence of agitation. ACS Macro Letters. 3 (11), 1106-1111 (2014).
  61. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50 (6), 2484-2494 (2017).
  62. Lantz, K. A., et al. Cavitation enables switchable and rapid block polymer exchange under high-χN conditions. Macromolecules. 51 (17), 6967-6975 (2018).
  63. Murphy, R. P., et al. Capillary RheoSANS: measuring the rheology and nanostructure of complex fluids at high shear rates. Soft Matter. 16 (27), 6285-6293 (2020).
  64. Stopped Flow Sans. usnistgov. , Available from: https://github.com/usnistgov/stopped-flow-sans (2021).
  65. Kline, S. Reduction and analysis of SANS and USANS data using IGOR Pro. Journal of Applied Crystallography. 39 (6), 895-900 (2006).
  66. Doktorova, M., et al. Preparation of asymmetric phospholipid vesicles for use as cell membrane models. Nature Protocols. 13 (9), 2086-2101 (2018).
  67. Huang, Z., London, E. Effect of cyclodextrin and membrane lipid structure upon cyclodextrin-lipid interaction. Langmuir. 29 (47), 14631-14638 (2013).
  68. Sugiura, T., Ikeda, K., Nakano, M. Kinetic analysis of the methyl-β-cyclodextrin-mediated intervesicular transfer of pyrene-labeled phospholipids. Langmuir. 32 (51), 13697-13705 (2016).
  69. Scott, H. L., et al. On the mechanism of bilayer separation by extrusion, or why your LUVs are not really unilamellar. Biophysical Journal. 117 (8), 1381-1386 (2019).
  70. Dicko, C., et al. NUrF-Optimization of in situ UV-vis and fluorescence and autonomous characterization techniques with small-angle neutron scattering instrumentation. Review of Scientific Instruments. 91 (7), 075111 (2020).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 174 Liten vinkelneutronspridning (SANS) tidsupplöst spridning stoppad flödesblandning molekylär utbyteskinetik lipidnanopartiklar lipidmembran vesiklar strukturell evolution
Mätning av tidsutvecklingen av nanoskala material med stoppat flöde och liten vinkel neutronspridning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelley, E. G., Nguyen, M. H. L.,… More

Kelley, E. G., Nguyen, M. H. L., Marquardt, D., Maranville, B. B., Murphy, R. P. Measuring the Time-Evolution of Nanoscale Materials with Stopped-Flow and Small-Angle Neutron Scattering. J. Vis. Exp. (174), e62873, doi:10.3791/62873 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter