Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Het meten van de tijdsevolutie van materialen op nanoschaal met stop-flow en small-angle neutronenverstrooiing

Published: August 6, 2021 doi: 10.3791/62873
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1, 1
1NIST Center for Neutron Research, National Institute of Standards and Technology, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of Windsor, 3Department of Physics, University of Windsor

Summary

Dit protocol presenteert het gebruik van een gestopte stroommonsteromgeving om snel meerdere vloeibare oplossingen in situ te mengen tijdens een neutronenverstrooiingsmeting met een kleine hoek en om kinetische processen te bestuderen op nanometerlengteschalen en tweede tijdschalen.

Abstract

Dit artikel presenteert het gebruik van een sans-monsteromgeving (Stopped-Flow Small-Angle Neutron-Scattering) om snel vloeistofmonsters te mengen en kinetische processen op nanoschaal te bestuderen op tijdschalen van seconden tot minuten. De stop-flow monsteromgeving maakt gebruik van in de handel verkrijgbare spuitpompen om de gewenste volumes vloeistofmonsters te mengen die vervolgens door een dynamische mixer in een kwartsglascel in ongeveer 1 s worden geïnjecteerd. Tijd-opgeloste SANS-gegevensverzameling wordt gesynchroniseerd met het mengen van monsters om de evolutie van de nanostructuur in oplossing na het mengen te volgen.

Om de neutronenbundeltijd zo efficiënt mogelijk te benutten, gebruiken we een reeks stroomkeuzekleppen om de cel tussen de metingen automatisch te laden, te spoelen en te drogen, waardoor herhaalde gegevensverzameling mogelijk is gedurende meerdere monsterinjecties. Monsterinjecties worden herhaald totdat voldoende neutronenverstrooiingsstatistieken zijn verzameld. De mengopstelling kan worden geprogrammeerd om de omstandigheden systematisch te variëren om de kinetiek te meten bij verschillende mengverhoudingen, monsterconcentraties, additiefconcentraties en temperaturen. Het minimaal benodigde monstervolume per injectie is ongeveer 150 μl, afhankelijk van de padlengte van de kwartscel.

Representatieve resultaten met behulp van deze gestopte stroommonsteromgeving worden gepresenteerd voor snelle lipide-uitwisselingskinetiek in aanwezigheid van een additief, cyclodextrine. De blaasjes wisselen buitenste deelblad (buitenste) lipiden uit in de orde van seconden en wisselen zowel binnen- als buitenlipiden binnen enkele uren volledig uit. Het meten van lipide-uitwisselingskinetiek vereist in situ mengen om de snellere (seconden) en langzamere (minuten) processen vast te leggen en de kinetische snelheidsconstanten te extraheren. Dezelfde monsteromgeving kan ook worden gebruikt om moleculaire uitwisseling in andere soorten vloeibare monsters te onderzoeken, zoals lipide nanodeeltjes, eiwitten, oppervlakteactieve stoffen, polymeren, emulsies of anorganische nanodeeltjes. Het meten van de structurele transformaties op nanoschaal en de kinetiek van uitwisselende of reagerende systemen zal nieuwe inzichten opleveren in processen die op nanoschaal evolueren.

Introduction

Small-angle neutron scattering (SANS) biedt een unieke manier om de groottes, vormen, interacties en organisatie van verschillende materialen te meten op lengteschalen van ≈1 nm tot ≈100 nm 1,2,3. Recente instrumenten, waaronder VSANS (very small-angle neutron scattering) instrumenten met focusspiegels, verleggen de grenzen naar het meten van nog grotere lengteschalen tot ≈1000 nm 4,5. Over het algemeen biedt het unieke verstrooiingscontrast dat inherent is aan neutronenverstrooiingsmethoden verschillende voordelen bij het meten van de tijdsevolutie van nanoschaalstructuren, zoals de aggregatie van componenten in farmaceutische formuleringen6, crosslinking en gelatiereacties in polymeersystemen7,8, bij mesokristallisatie van membraaneiwitten 9,10, afbraak en ontvouwing van eiwitten11,12 , en groei van op silica gebaseerde materialen13,14,15. Het unieke verstrooiingscontrast maakt tijd-opgeloste SANS (TR-SANS) een nuttige aanvulling op andere op stop-flow gebaseerde metingen.

Stop-flow mengmethoden worden vaak geïmplementeerd in small-angle X-ray scattering (SAXS)16,17,18,19,20,21, fluorescentiespectroscopie 22,23,24,25,26 en lichtverstrooiing27,28,29,30, 31,32 experimenten om kinetische processen op de milliseconde tijdschalen te bestuderen. Een belangrijk verschil tussen SANS en SAXS is dat neutronenverstrooiing een niet-destructieve karakteriseringstechniek is, en als zodanig kan SANS worden gebruikt om hetzelfde monster uren of zelfs dagen te meten zonder ioniserende stralingsschade aan het monster, wat kan gebeuren tijdens röntgenverstrooiingsexperimenten met een hogere flux33. Omdat herhaalde SANS-metingen de chemische structuur van het sondemolecuul of monster niet zullen veranderen, kan de tijdsevolutie worden bestudeerd zonder effecten van bijvoorbeeld fotobleaching, wat kinetische metingen kan bemoeilijken die afhankelijk zijn van fluorescentie23,24. Bovendien kan SANS worden gebruikt om sterk geconcentreerde en optisch ondoorzichtige monsters te meten die vaak moeilijk te karakteriseren zijn met op licht gebaseerde technieken zoals dynamische lichtverstrooiing.

Naast het verstrekken van structurele informatie op nanoschaal, kan SANS worden gebruikt om de lokale samenstelling van deze structuren te onderzoeken door de variatie in neutronenverstrooiingslengtedichtheidscontrast. De verstrooiingslengtedichtheid (SLD) van verschillende elementen varieert willekeurig over het periodiek systeem en varieert met verschillende isotopen van hetzelfde element. Een vaak gebruikt voorbeeld is waterstof (1H of H) en deuterium (2H of D), die enorm verschillende neutronenverstrooiingslengtes hebben. Daarom kunnen waterstofrijke materialen, zoals oppervlakteactieve stoffen, lipiden, eiwitten, RNA, DNA en andere polymeren, worden onderscheiden van gedeutereerde oplosmiddelen met behulp van SANS zonder de fysische eigenschappen van het systeem aanzienlijk te veranderen. Het is echter belangrijk op te merken dat H/D-uitwisseling de dichtheid, waterstofbinding en faseovergangstemperaturen in het monster kan beïnvloeden. Niettemin is de unieke gevoeligheid van SANS voor waterstofrijke materialen vooral nuttig in onderzoek naar zachte materie, waar de monsters van belang een lager verstrooiingscontrast en signaal hebben in op röntgenstraling gebaseerde technieken zoals SAXS. Isotopische substitutie maakt SANS ook een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van moleculaire uitwisselingskinetiek in waterstofrijke materialen door eenvoudigweg H-gelabelde en D-gelabelde moleculen te mengen. Isotopische substitutie is vooral nuttig in systemen waar omvangrijke fluorescerende kleurstoffen groter zijn dan de oppervlakteactieve of lipidemoleculen van belang en kan de uitwisselingskinetiek beïnvloeden34,35.

Tijd-opgeloste SANS-metingen zijn voordelig omdat de gemeten intensiteit een functie is van tijd, lengteschaal en SLD-contrast. Als zodanig kunnen TR-SANS-experimenten worden ontworpen om de tijdsafhankelijke veranderingen in de ruimtelijke verdelingen en de samenstelling van de monsters te onderzoeken. Deze unieke voordelen van SANS hebben geleid tot belangrijke inzichten in kinetische processen in veel zachte materiaalsystemen zoals oppervlakteactieve stoffen 36,37,38, emulsies 39,40,41, lipiden 34,42,43,44,45,46,47,48,49 ,50, en polymeren 51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62. De meeste TR-SANS-studies hebben zich gericht op tijdschalen van minuten tot uren. Veel kinetische processen van belang vinden echter plaats op de tweede tijdschaal en zijn essentieel voor het begrijpen van de onderliggende mechanismen. Het vastleggen van deze vroege tijdstippen vereist dat de oplossingen snel worden gemengd en in situ worden gemeten, waarbij het mengen wordt gesynchroniseerd met gegevensverzameling tijdens gestopte lichtverstrooiing van 27,28,29,30,31,32, fluorescentie 22,23,24,25,26 en röntgenstraling 16,17,18,19,20,21 experimenten. Dit werk beschrijft het gebruik van een monsteromgeving die is ontworpen om snel meerdere vloeistofmonsters te mengen en het mengsel in een kwartsglascel te injecteren voor TR-SANS-metingen. Het mengapparaat is een aanpassing van het recent ontwikkelde capillaire rheoSANS-apparaat63 en maakt gebruik van meerdere spuitpompen en kleppen om het mengen van monsters te regelen en de celreiniging te automatiseren. Door spuitpompen aan te sluiten op een reeks stroomkeuzekleppen, kunnen meerdere inlaatstromen herhaaldelijk worden gemengd, gemeten, gespoeld en gedroogd om TR-SANS-metingen op de secondentijdschaal te vergemakkelijken.

De huidige procedure gaat ervan uit dat de monsters van belang zijn geïdentificeerd en voorbereid. We richten ons op de in situ mengopstelling en methoden om TR-SANS-gegevens te verzamelen. Neutronenverstrooiingsgegevens werden verzameld op het VSANS-instrument in het NIST Center for Neutron Research (NCNR); de procedure moet echter van toepassing zijn op andere SANS-instrumenten. Lezers die geïnteresseerd zijn in het implementeren van vergelijkbare protocollen op andere SANS-instrumenten, moeten de lokale instrumentwetenschappers raadplegen om de optimale instrumentconfiguratie te bepalen om de neutronenflux te maximaliseren op de gewenste lengteschaal en tijdschaal die het meest relevant zijn voor de kinetische processen van belang. De hier gepresenteerde gegevens werden verzameld met behulp van de high flux 'white beam'-configuratie op VSANS om het aantal neutronen te maximaliseren bij het verlies van ruimtelijke resolutie5. De detectorwagens werden gepositioneerd om een reeks verstrooiingsvectoren (q), 0,005 Å-1 < q < 0,5 Å-1 te bestrijken, overeenkomend met lengteschalen van ≈130 nm tot ≈13 nm. De verstrooiingsvector wordt gedefinieerd als q = 4π/λ sin (θ/2) waarbij λ de neutronengolflengte is en θ de verstrooiingshoek.

Het stop-flow mengapparaat dat wordt gebruikt voor de TR-SANS-metingen bestaat uit meerdere pompen, spoelspuiten, monsterspuiten, stroomkeuzeschakelaars, evenals een dynamische mixer, monstercel en gemengde monstercontainer, zoals weergegeven in figuur 1. Alle afgedichte vloeistofpaden bevinden zich in een behuizing met airconditioning, die de spuiten, kleppen, verbindingsbuizen, dynamische mixer en monstercellen omvat. Een programmeerbare thermo-elektrische airconditioner wordt gebruikt om de temperatuur van de behuizing te regelen in het bereik van 10 °C tot 50 °C binnen ±1 °C. Merk op dat een deel van de isolatie van de behuizing is verwijderd om de werkende delen van het apparaat te laten zien. De behuizing van het hoofdmengapparaat bevindt zich op een translatiefase op de NG3 VSANS-bundellijn bij de NCNR. De positie van de behuizing wordt aangepast met behulp van de translatiefase om de monstercel in het pad van de neutronenbundel te plaatsen (gele stippellijn).

Figure 1
Figuur 1: Een voorbeeldopstelling voor het combineren van stop-flow menging en kleinhoek neutronenverstrooiingsmetingen aan de VSANS-bundellijn in het NIST Center for Neutron Research. De opstelling bevat vier spuitpompen, twee spuiten voor het spoelen van oplosmiddelen en twee spuiten voor monsterinjectie, vier pompkeuzekleppen, twee mixerkeuzekleppen, een dynamische mixer, een doorstroomkwartscel en een gemengde monstercontainer. Invallende neutronen verstrooien het gemengde monster dat zich in de monstercel bevindt. Een geïsoleerde behuizing met kwartsvensters en een thermo-elektrische airconditioning wordt gebruikt om het monster en alle apparatuur op een constante temperatuur te regelen. De gele stippellijn toont het neutronenbundelpad. Schaalbalk = 10 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het apparaat in figuur 1 is geconfigureerd met twee monsterspuiten, twee spoelspuiten en één monstercel. Overeenkomstige stroomdiagrammen voor de verschillende stappen van het protocol worden geïllustreerd in figuur 2. De gewenste volumes van de twee verschillende monsters worden in de menger en de monstercel geïnjecteerd (figuur 2A). Zodra de monstercel is gevuld, worden de inlaatschakelaarklep (ISV) en de uitlaatschakelaarklep (OSV) gesloten om de monstercel te isoleren van de dynamische mixer en om te voorkomen dat het monster tijdens het verzamelen van TR-SANS-gegevens in de cel wordt teruggevoerd (figuur 2B). Vóór de dynamische mixer varieert de aansluitbuis in lengte van 10 cm tot 1 m en heeft deze geen invloed op de mengvertragingstijd. Buisverbindingen tussen de dynamische menger en de monstercel hebben echter invloed op de mengvertragingstijd en het vereiste monsterinjectievolume. Voorgesneden roestvrijstalen buizen met een binnendiameter van 0,04 inch (1 mm) en een lengte van 100 mm worden gebruikt om de dynamische mixer, de mixerkeuzekleppen (MSV1 en MSV2) en de ISV en OSV aan te sluiten. Gefluoreerde buizen met een binnendiameter van 1 mm en een lengte van 115 mm worden gebruikt om de ISV en OSV (of de dynamische mixeruitlaat) op de monstercel aan te sluiten. Het totale leegtevolume dat de mengvertragingstijd beïnvloedt, omvat het vacuülevolume van de menger (0,15 ml), de slang tussen de mixeruitlaat en de inlaat van de monstercel (0,09 ml) en het volume van de monstercel (0,16 ml). In dit voorbeeld is het totale leegtevolume 0,4 ml. De interne leegtevolumes van kleppen zijn verwaarloosbaar in vergelijking met de volumes van slangen, mixer en monstercellen. De gebruikte lagedrukkeuzekleppen (boringsdiameter van 0,75 mm) bevatten bijvoorbeeld geschatte leegtevolumes van 4 μl, terwijl de hogedrukkeuzekleppen en schakelkleppen (boringsdiameter van 0,25 mm) ongeveer lege volumes van 0,5 μl bevatten.

Nadat de TR-SANS-meting is voltooid, wordt het monster met oplosmiddel uit de cel geduwd en wordt het spoeloplosmiddel herhaaldelijk door de cel gepompt om het resterende monster te verwijderen en de monstercel te reinigen (figuur 2C). Merk op dat de spoelspuiten zijn aangesloten op grotere oplosmiddelreservoirs (bijv. Water en ethanol) via pompkeuzewaarden om ervoor te zorgen dat er voldoende oplosmiddelvolumes beschikbaar zijn om de monstercel tussen meetruns te reinigen. Oplosmiddelbronnen, monsterbronnen en gemengde monstercontainers die ontvlambare vloeistoffen bevatten, worden in een aparte behuizing zonder elektrische apparatuur geplaatst om alle mogelijke ontstekingsbronnen te elimineren. Bovendien worden dampsluitende flessendoppen gebruikt om brandbare dampen en oplosmiddelverdamping te minimaliseren. Ten slotte wordt de monstercel gedroogd met een stikstofgasstroom om het resterende spoeloplosmiddel te verwijderen (figuur 2D). De inlaatstikstofgasdruk naar de mixerkeuzeklep wordt geregeld tot ongeveer 2 bar (0,2 MPa, manometerdruk) met behulp van een handmatige drukregelaar op de stikstofgasfles. Zodra de monstercel voldoende is gereinigd en gedroogd, wordt een nieuw gemengd monster in de monstercel geïnjecteerd voor de volgende meetcyclus (waarbij het mengen en injecteren wordt herhaald zoals geïllustreerd in het stroomdiagram in figuur 2A).

Figure 2
Figuur 2: Voorbeeldstroomdiagram met één monstercel, twee mengmonsters en twee spoelmiddelen voor reiniging . (A) Mengen van monster A (blauw) en monster B (rood) en vervolgens het gemengde monster (paars) in de monstercel laten stromen. B) Tijdens het verzamelen van gegevens geeft de stop-flow-inrichting aan waar de ISV- en OSV-schakelkleppen gesloten zijn om de monstercel te isoleren en terugdiffusie van het monster tijdens het verzamelen van gegevens te voorkomen. (C) De reinigingsstappen waarbij de monstercel na gegevensverzameling wordt gespoeld met spoelmiddel uit SS1 (groen). D) Droogstap waarbij de monstercel wordt gedroogd met stikstofgas (oranje). Afkortingen: PSV = pompkeuzeklep; MSV = mixerkeuzeklep; OSV = uitlaatschakelaarklep; ISV = inlaatschakelaarklep; SS1 = oplosmiddelbron 1; SSA = monsterbron A; N2 = stikstofgasbron. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3 toont stroomschema's voor een iets andere versie waarin de mengopstelling is geconfigureerd met twee afzonderlijke monstercellen die op dezelfde schakelkleppen zijn aangesloten (figuur 3A). Terwijl TR-SANS-gegevens worden verzameld in monstercel 1, wordt monstercel 2 gespoeld (figuur 3B) en gedroogd (figuur 3C). Wanneer de gegevensverzameling voor monstercel 1 is voltooid, leidt de inlaatschakelaarklep een nieuw gemengd monster naar monstercel 2 voor gegevensverzameling (figuur 3D). Terwijl TR-SANS-gegevens worden verzameld in monstercel 2, wordt monstercel 1 gespoeld en gedroogd (figuur 3E). Dit alternatieve, parallelle proces tussen twee monstercellen minimaliseert de tijd tussen volgende monsterinjecties en maximaliseert het gebruik van neutronenbundeltijd.

Figure 3
Figuur 3: Voorbeeld stroomdiagram met behulp van cellen met twee monsters, twee mengmonsters en twee spoelmiddelen voor reiniging. A) Meng monster A (blauw) en monster B (rood) en laat het gemengde monster (paars) vervolgens in monstercel 1 stromen. B) De toestand van de stop-flow inrichting tijdens het verzamelen van gegevens op monstercel 1, terwijl monstercel 2 wordt gespoeld met oplosmiddel uit SS1 (groen). (C) De toestand van de gestopte stroominrichting tijdens het verzamelen van gegevens op monstercel 1 terwijl monstercel 2 wordt gedroogd met stikstofgas (oranje). D) Zodra de gegevensverzameling van monstercel 1 is voltooid, wordt onmiddellijk een nieuw monster (paars) gemengd en in monstercel 2 gestroomd. (E) De toestand van de stop-flow inrichting tijdens het verzamelen van gegevens op monstercel 2 terwijl monstercel 1 wordt gespoeld met oplosmiddel uit SS1 (groen). Terwijl de ene monstercel wordt gemeten, wordt de andere monstercel gereinigd en gedroogd. Het stop-flow meetproces wisselt af tussen twee monstercellen om de tijd tussen volgende monstermenginjecties te minimaliseren. Afkortingen: PSV = pompkeuzeklep; MSV = mixerkeuzeklep; OSV = uitlaatschakelaarklep; ISV = inlaatschakelaarklep; SS1 = oplosmiddelbron 1; SSA = monsterbron A; N2 = stikstofgasbron. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Hieronder wordt een stapsgewijs protocol beschreven voor het aansluiten van de pompen en leidingen, het primen van het systeem, het spoelen en drogen van de monstercel en het injecteren van het gemengde monster. Hoewel de eencellige configuratie voor eenvoud wordt gedemonstreerd (figuur 2), kunnen de flexibele modulaire opstelling, het protocol en de scripts eenvoudig worden gewijzigd om meer spuitpompen, kleppen, mixers of monstercelconfiguraties te implementeren, zoals de configuratie met twee monstercellen in figuur 3. Representatieve gegevens over de snelheid van het aantal ruwe neutronen die tijdens meng- en reinigingsinjectiecycli zijn verzameld, worden weergegeven in figuur 4, terwijl de lipidenuitwisselingskinetiek gemeten bij 3 verschillende temperaturen en de geëxtraheerde genormaliseerde verspreide intensiteit die overeenkomt met de fractie van uitgewisselde lipiden worden weergegeven in respectievelijk figuur 5 en figuur 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Stel het stop-flow systeem in en start het.

  1. Schakel alle voedingen van de pomp en dynamische mixers in met behulp van de aan / uit-schakelaar.
  2. Start alle pompen en kleppen in de grafische gebruikersinterface (GUI) van het stopped-flow system control door het configuratiepad van het apparaat in te voeren en de opdrachten bus=qmixbus te gebruiken. Bus(), bus.open(), bus.start(), pump=qmixpump. Pump(), pump.enable(), en valve=ViciMultiposSelector() (zie voorbeeld initiatiecode beschikbaar in een online open-source repository64).
  3. Kalibreer de pompen voordat u spuiten bevestigt met het commando pump.calibrate().
  4. Controleer of de kleppen zijn gestart en ga op commando naar de juiste keuzepoort met de opdracht valve.setPort() en valve.getPort().
  5. Wijs het type spuit toe dat voor elke pomp moet worden gebruikt met behulp van het commando pump.set_syringe_param(A, B), waarbij A de binnendiameter van de spuitkop (mm) is en B de maximale zuigerslagafstand van de spuit (mm).
  6. Sluit de monsterspuiten aan op de spuitpompen.
    1. Nadat u ervoor hebt gezorgd dat de pompen zijn gekalibreerd, schroeft u schone spuitvaten in op de aansluiting aan de bovenkant van de pomp (spuitbevestigingskop).
    2. Wanneer u glazen spuiten gebruikt, moet u ervoor zorgen dat de kop van de spuitbevestiging wordt losgemaakt voordat u het vulvolume doseert, zodat de glazen spuit niet breekt als gevolg van overmatige kracht van de zuiger van de spuit.
    3. Schroef de zuiger van de spuit vast aan de aansluiting aan de onderkant van de pomp (spuitbevestigingstaart).
    4. Nadat de cilinder van de spuit en de zuiger van de spuit op de pomp zijn aangesloten, doseert u het vulvolume van het type spuit met behulp van de opdracht pump.empty(), die de zuiger van de spuit naar de bovenkant van de spuitloop verplaatst.
    5. Wanneer u glazen spuiten gebruikt, draait u de kop van de spuitbevestiging vast nadat de zuigerbeweging is gestopt.
  7. Sluit de slang aan op de monster- en oplosmiddelbronnen, spuiten, kleppen, mixers, monstercellen en gemengde monstercontainer.
    1. Sluit de spuitpompslang aan op de pompkeuzekleppen.
    2. Sluit de pompkeuzeklepslang aan op de monsterbronnen.
    3. Sluit de pompkeuzeklepslang aan op de spoelmiddelbronnen.
    4. Sluit de pompkeuzeklepslang aan op de mixerkeuzeklepslang.
    5. Sluit de mengerkeuzeklepslang aan op de stikstofgasbron.
    6. Sluit de mixerkeuzeklepslang aan op de mixerinlaten.
    7. Sluit de mengkraan aan op de inlaatschakelaar.
    8. Sluit de inlaatschakelaarklep aan op de inlaat van de monstercel.
    9. Sluit de monsterceluitlaat aan op de uitlaatschakelaarklep.
    10. Sluit de uitlaatschakelaarklep aan op de gemengde monstercontainer.
  8. Definieer alle buis- en klepverbindingen (stap 1.7) in de besturings-GUI van het stop-flow systeem door het overeenkomstige poortnummer in te voeren dat op elke klep is gemaakt (zie voorbeeldbesturingscode in de online open-source repository64).
  9. Bereken het lege volume van de slang tussen de inlaat van de menger en de uitlaat van de monstercel, die de minimale hoeveelheid monster definieert die nodig is om de monstercel voor elke meting te vullen.

2. Laad het monster.

  1. Stel het gewenste monstervulvolume en oplosmiddelvulvolume in de GUI voor de besturing van het stopped-flow systeem in door de gewenste getallen te typen (zie voorbeeldbesturingscode in de online open-source repository64).
  2. Gebruik de opdracht pump.aspirate() om de gewenste monster- en oplosmiddelvolumes van hun bronnen via de pompkeuzekleppen in de monsterspuiten te trekken (aspirateren).
    OPMERKING: Wanneer u een lege spuit voor het eerst laadt, is er lucht aanwezig aan de bovenkant van de spuit die moet worden gespoeld om het systeem in stap 3 voor te bereiden met monster en oplosmiddel.

3. Bereid het systeem voor.

  1. Gebruik de opdracht pump.dispense() om alle lucht uit spuiten, slangenleidingen en kleppen naar buiten te duwen (af te geven). Zorg ervoor dat er voldoende vloeistofvolume uit elke spuit wordt afgegeven om alle lucht volledig uit de spuiten, slangen en kleppen te verwijderen. Als er luchtbellen zichtbaar zijn in een buis, ga dan door met het doseren van oplosmiddel of monster totdat de bellen zijn verwijderd.
  2. Zodra de lucht uit het systeem is gespoeld, voert u ten minste één monsterinjectie- en spoelprocedure uit (zonder dat neutronenverstrooiingsgegevens worden verzameld).
    1. Klik om de cel met het label Mengexperiment starten in de besturings-GUI te selecteren.
    2. Terwijl deze cel actief is geselecteerd, klikt u op de knop Uitvoeren (rechterdriehoek) boven aan de besturings-GUI of drukt u op de shift - en entertoetsen samen op het toetsenbord.
    3. Inspecteer de monstercel visueel om te bevestigen dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.
      1. Als er luchtbellen aanwezig zijn, herhaalt u protocolstappen 3.1 en 3.2 om eventuele lucht verder uit de leidingen te verwijderen.
      2. Als er geen luchtbellen aanwezig zijn in de monstercel, gaat u verder met stap 4 om de resterende stappen van het experimentprotocol te definiëren.

4. Definieer het stopped-flow mixprotocol in het programmascript (zie codevoorbeeld in de online open-source repository64).

  1. Voer het temperatuurinstelpunt in van de programmeerbare airconditioner (AC) die de temperatuur van de geïsoleerde behuizing rond het stop-flow apparaat regelt.
    1. Terwijl u de sterknop op de AC-besturingseenheid ingedrukt houdt, drukt u op de pijlen omhoog en omlaag om de instelpunttemperatuur te wijzigen. U kunt ook het gewenste temperatuurinstelpunt in de besturings-GUI typen en op Uitvoeren klikken.
    2. Wacht 15-30 minuten om de binnenkant van de behuizing op de gewenste temperatuur te laten balanceren voordat u met de kinetische experimenten begint.
      OPMERKING: Het toegankelijke temperatuurbereik ligt momenteel tussen 10 °C en 50 °C en de temperatuurstabiliteit is ± 1 °C.
  2. Voer alle spoelvolgordestappen in door de juiste volumes, stroomsnelheden, tijden en het aantal herhalingen in de besturings-GUI in te voeren.
    1. Definieer het volume van elk te injecteren monster, dat het totale debiet (Q) definieert.
    2. Bepaal het volume van elk oplosmiddel dat tijdens de spoelprocedure moet worden geïnjecteerd.
    3. Bepaal de droogtijd tussen elke spoelsubstap (tdroog).
    4. Definieer het aantal spoelsubstappen.
    5. Definieer de verschillende oplosmiddelen voor de volgende spoelstappen.
    6. Definieer het aantal spoelherhalingen dat na elke meting moet worden uitgevoerd (nspoeling).
    7. Bepaal de tijd die nodig is om de monstercel en de mixer volledig te drogen, zodat u een schone monstercel krijgt voor de daaropvolgende monsterinjectie (tdry_final).
  3. Definieer alle stappen voor de monsterinjectievolgorde door de juiste volumes, stroomsnelheden en tijden in de besturings-GUI van het stopped-flow systeem te typen.
    1. Definieer het volume van elk te injecteren monster en het debiet.
    2. Bereken de vertragingstijd (t vertraging) van het leegtevolume (V-leegte) en het totale debiet (t-vertraging =V-leegte/Q).
      OPMERKING: De vertragingstijd is de tijd die nodig is om de monstercel met het gemengde monster te vullen.
    3. Definieer de gewenste acquisitietijd voor de TR-SANS-gegevens, zodat het volledige kinetische proces van belang heeft plaatsgevonden (tscatt).
    4. Stel de wachttijd in tussen het einde van het verstrooiingsexperiment en het begin van de spoelcycli (twait).
      OPMERKING: Deze wachttijd moet ten minste 100 s bedragen als de neutronentransmissie van het monster moet worden gemeten voordat deze uit de cel wordt gespoeld. De monsteroverdracht is nodig tijdens de gegevensverwerking om de gegevens tot absolute intensiteit te reduceren.
    5. Definieer het aantal injectiecycli dat moet worden uitgevoerd met spoelsequenties tussen elke injectie die zijn gedefinieerd in stap 4.2 (n-cyclus).
  4. Bereken de totale tijd van een enkele gestopte gegevensverzamelingscyclus (t-cyclus) met behulp van vergelijking (1).
    tcyclus = nspoel × (t vertraging + tdroog) + tdry_final + tvertraging + tscatt (1)
    waarbij nspoeling = aantal spoelherhalingen (stap 4.2.6); t vertraging = vertragingstijd van de gestopte stroomvoorziening (stap 4.3.2); tdroog = droogtijd tussen elke spoelsubstap (stap 4.2.3); t dry_final = tijd om de monstercel en de menger volledig te drogen (stap 4.2.7); tscatt = gewenste TR-SANS data-acquisitietijd (stap 4.3.3)

5. Definieer de neutronenverstrooiingsparameters met een kleine hoek in de GUI van de SANS-instrumentbesturing.

  1. Bepaal de lengteschalen en het q-bereik van belang voor elk monster.
  2. Definieer de instrumentconfiguratie om het gewenste q-bereik van belang te dekken, terwijl de neutronenflux bij het monster wordt gemaximaliseerd.
  3. Stel de totale VSANS-gegevensacquisitietijd in de GUI van het SANS-instrumentbesturingselement in op de berekende cyclustijd in stap 4.4 (neutronenverstrooiingsgegevensacquisitietijd =t-cyclus).
  4. Stel de meettijd voor monsteroverdracht in op 100 s in de GUI voor SANS-instrumentbesturing.
  5. Schakel met de GUI van het SANS-instrumentbesturingselement het verzamelen van gegevens in de gebeurtenismodus in door GenerateEventModeData true op de opdrachtregel te typen.

6. Verzamel standaard verstrooiingsmetingen voor gegevensreductie voordat u begint met het experiment met gestopte stroom om de TR-SANS-gegevens te verwerken.

  1. Meet de achtergrondverstrooiing.
    1. Zorg ervoor dat de sluiter van het lokale instrument gesloten is.
    2. Bevestig het monster met geblokkeerde bundel aan de achterkant van de monsteropening, bevestig de lokale instrumentomgeving en open de sluiter van het lokale instrument.
    3. Definieer de data-acquisitietijd van geblokkeerde bundelverstrooiing in de software en verzamel geblokkeerde bundelverstrooiingsgegevens, die voor dezelfde duur tellen als de langste verstrooiingsgegevensacquisitietijd (t-scatt).
    4. Zodra de gegevensverzameling is voltooid, sluit u de sluiter van het instrument en verwijdert u het geblokkeerde bundelmonster uit de monsteropening.
  2. Meet de verstrooiing van de lege cellen.
    1. Zorg ervoor dat de monstercel grondig is gespoeld en gedroogd.
    2. Open de sluiter van het lokale instrument.
    3. Verzamel de meting van de lege celtransmissie gedurende 100 s.
    4. Verzamel de lege celverstrooiingsmeting en tel mee voor ten minste de langste acquisitietijd (t-scatt).

7. Begin met het experiment met gestopte stroom.

  1. Start het verzamelen van VSANS-verstrooiingsgegevens in de gebeurtenismodus .
    1. Zorg ervoor dat het lokale instrumentgebied veilig is en open vervolgens de sluiter van de lokale instrumentenbundel.
    2. Begin met het verzamelen van SANS-gegevens met behulp van de SANS-instrumentbesturingssoftware op de instrumentcomputer door de gewenste runs naar de instrumentwachtrij te slepen en neer te zetten.
      OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat de vroegste tijdspunten worden gemeten, begint u met het verzamelen van gegevens voordat u het experiment met het mengen van gestopte stromen start. De gegevens worden in een later stadium nabewerkt om rekening te houden met de vertragingstijd (t-vertraging).
  2. Start het experiment met het mengen van gestopte stromen in de besturings-GUI.
    1. Selecteer de notebookcel met het label Mengexperiment starten in de besturings-GUI van het stopped-flow systeem.
    2. Terwijl deze cel actief is geselecteerd, klikt u op de knop Uitvoeren (rechterdriehoek) boven aan het besturingsprogramma voor apparaten met gestopte stroom of drukt u op de toetsen Shift en Enter samen op het toetsenbord.
    3. Controleer of het in punt 4 gedefinieerde protocol voor het mengen van gestopte stromen in werking is getreden.
    4. Voeg de 100 s-transmissiemeting toe aan de VSANS-instrumentwachtrij na de verstrooiingsrun met behulp van de SANS-instrumentbesturings-GUI.
    5. Voeg één verstrooiingsmeetrun en één transmissiemeetrun toe aan de instrumentwachtrij voor elke resterende stop-flow mengcyclus (ncyclus - 1, stap 4.3.5) in de SANS-instrumentbesturings-GUI.

8. Verwerk en verminder gegevens om alle achtergronden te verwijderen, corrigeer voor detectorgevoeligheid en corrigeer voor monsteroverdracht.

  1. Download de verspreidingsgegevensbestanden en bijbehorende gebeurtenisbestanden van de server.
    OPMERKING: Na elke VSANS-meting worden afzonderlijke detectorgebeurtenisbestanden gegenereerd, één gebeurtenisbestand voor elke actieve detectorwagen (bijv. Voor-, Midden- en/of Achterdetector).
  2. Zet de verstrooiingsgegevens in de gewenste tijdbins met de opdracht events=Rebin(bestandsnaam ) gevolgd door de opdracht events.do_rebinning(timebins), waarbij de invoerbestandsnaam overeenkomt met de naam van het gewenste SANS-gegevensbestand en timebins een lijst is met de gewenste tijdbingrenzen in seconden.
    OPMERKING: Als de invoertijdbins worden ingevoerd als een enkel nummer in plaats van een lijst, worden de gegevens in de binaire bestanden opgeslagen in het N-aantal bins met gelijke tijdbreedtes, waarbij N de invoertijdbins zijn (zie softwarescripts die worden geleverd door de beamline en beschikbare online open-source repository64).
  3. Verminder de verstrooiingsgegevens in de prullenbak met behulp van de software die de beamline65 heeft geleverd.

9. Analyseer de TR-SANS-gegevens.

  1. Bereken de procestijd van belang (t-proces) uit de meettijden met behulp van vergelijking (2).
    t-proces = ti - tstop + tvertraging (2)
    Waarbij ti de meettijdbakken zijn die beginnen nadat de stroom is gestopt, is tstop de meettijd onmiddellijk wanneer de stroom wordt gestopt en tvertraging de vertragingstijd.
  2. Plot de q-afhankelijke intensiteit I(q) als functie van de procestijd met behulp van de tijdbakken die zijn gedefinieerd in stap 8.2 en hett-proces berekend in stap 9.1.
    OPMERKING: De vroegst toegankelijke procestijd wordt beperkt doort-vertraging. Als u eerdere procestijdpunten wilt meten, verhoogt u het totale debiet (Q) of verlaagt u het totale leegtevolume (V-leegte).
  3. Haal de kinetische parameters van belang uit de verandering in I(q) als functie van de procestijd.

10. Beëindig het experiment.

  1. Schakel de neutronenbundel uit door de sluiter van het lokale instrument te sluiten.
  2. Voer een stralingscontrole uit met behulp van een stralingsmonitor die door de bundellijn wordt geleverd voordat u onderdelen, slangen loskoppelt of monsters of gemengde monstercontainers lost.
  3. Breng de spuiten, slangen en gemengde monstercontainer over naar de afdeling gezondheidsfysica.
  4. Vul gezondheidsfysicaformulieren in en wacht op evaluatie door gezondheidsfysicapersoneel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De hier getoonde representatieve neutronengegevens meten de lipide-uitwisselingskinetiek in aanwezigheid van methyl-β-cyclodextrine (mβCD), een additief dat de lipide-uitwisseling tussen blaasjes katalyseert met de wisselkoers (ke)66,67. Eerdere fluorescentiestudies hebben aangetoond dat ke afhankelijk is van de mβCD-concentratie en dat de halfwaardetijd van het uitwisselingsproces in de orde van grootte vanminuut 68 ligt. De huidige experimenten gebruiken stop-flow TR-SANS om mβCD-gekatalyseerde lipidenuitwisseling tussen blaasjes op de secondentijdschaal te meten. Er werden twee isotopisch verschillende lipideblaasjespopulaties bereid; één blaasjespopulatie werd bereid met staartgehydrogeneerde dimyristoylfosfatidylcholine (DMPC) lipiden (H-lipideblaasjes in figuur 5), en de andere blaasjespopulatie werd bereid met staart-gedeutereerde DMPC (DMPC-d54) lipiden (D-lipideblaasjes in figuur 5). Een molfractie van 0,05 (5 mol%) geladen dimyrisotylfosfatidylglyercol (DMPG) lipide werd toegevoegd aan zowel de DMPC als DMPC-d54 droge lipidepoeders om de vorming van unilamellaire blaasjes te bevorderen69.

Afzonderlijke H-vesikel- en D-blaasjesoplossingen werden bereid door de respectieve lipidefilms te hydrateren in een oplosmiddel dat 45% van het volume zwaar water (D2O) en 55% van het volume water (H2O) bevatte. De samenstelling vanhet oplosmiddel D 2 O/H2O werd zodanig berekend dat de neutronenverstrooiingslengtedichtheid (ρ) van het oplosmiddel overeenkwam met een willekeurig mengsel van de H-lipiden en D-lipiden (Δρ = ρlipide- ρoplosmiddel = 0). Met andere woorden, een willekeurig gemengd H/D-blaasje zou 'onzichtbaar' zijn voor de neutronen en nul coherente neutronenverstrooiing genereren. Unilamellaire blaasjesoplossingen werden bereid door de oplossingen vijf keer te bevriezen en vervolgens de afzonderlijke oplossingen te extruderen door een polycarbonaatfilter met poriën met een diameter van 100 nm. De blaasjesoplossingen werden in totaal 31 keer bij 30 °C heen en weer geëxtrudeerd tussen twee spuiten en het filter. Vervolgens werd een klein volume van een geconcentreerde mβCD-stamoplossing bereid in hetzelfde D 2 O/H2O-oplosmiddelmengsel aan de blaasjesoplossingen toegevoegd. De uiteindelijke lipideconcentratie was 14 mmol/l (mM) en de mβCD-concentratie was 30 mM. De afzonderlijke blaasjesoplossingen werden gedurende ten minste 30 minuten in evenwicht gebracht met de toegevoegde mβCD voordat de oplossingen in de monsterspuiten in de stopstroommenginrichting werden geladen.

Een voorbeeld van de gemeten neutronentellingen over meerdere injectiecycli is weergegeven in figuur 4A. Elke cyclus bestond uit 9 spoelstappen, 1 droogstap en 1 monsterinjectiestap. Alleen telsnelheden gemeten op de middelste detectorwagen in het VSANS-instrument worden voor de duidelijkheid weergegeven. Vergelijkbare trends werden gevonden op de voorste detectorwagen, die overeenkwamen met gegevens verzameld bij grotere verstrooiingshoeken of hogere q-waarden. De telsnelheid piekte bij elke injectie met spoelmiddel (oplosmiddel S1 en oplosmiddel S2) en keerde terug naar de basislijntellingen van de lege cel wanneer het oplosmiddel met stikstofgas uit de cel werd geduwd en gedroogd. De laatste celspoeling was met S2, wat in dit voorbeeld ethanol was, en de cel werd een laatste keer gedroogd met stikstofgas gedurende 3 minuten voordat het monster werd geïnjecteerd. Kort nadat het monster in de cel was geïnjecteerd, piekte de neutronentelling en werden gegevens gedurende 5 minuten continu verzameld. De representatieve steekproef die in de voorbeeldgegevens in figuur 4A werd geïnjecteerd, was een zoutbufferachtergrond. De fluctuaties in de gemeten intensiteit in de loop van de tijd weerspiegelen de variaties in de neutronentelling op de achtergrond en weerspiegelen geen verandering in de gemiddelde samenstelling van het monster. De volledige cyclus van spoelen, drogen, mengen en injecteren van monsters werd een extra keer herhaald in het voorbeeld in figuur 4A, waarbij elke cyclus in totaal 15 minuten duurde.

De afzonderlijke H-gelabelde en D-gelabelde lipideblaasjesoplossingen werden gemengd op tijdstipt-mix en stroomden onmiddellijk in de monstercel. De gemeten neutronentelling piekte en bereikte vervolgens een maximale waarde wanneer de monstercel bijt-vulling werd gevuld, zoals weergegeven in figuur 4B. De verstreken tijd die nodig is om de monstercel te vullen wordt de vertragingstijd t delay genoemd en wordt gegeven door tdelay = tfill-t mix. Als het leegtevolume (V-leegte) tussen de menger en de monstercel bekend is en het totale debiet (Q) bekend is, kan t-vertraging ook worden berekend alst-vertraging = V-leegte/Q (zie protocolstap 4.3.2), wat ook de gemiddelde verblijftijd is voor het vloeistofmonster om de menger binnen te gaan en de monstercel te verlaten. Na het bereiken van det-vulling werd de stroom voortgezet met een constante stroomsnelheid om ervoor te zorgen dat de cel zich had gevuld en steady-state had bereikt. De stroom werd toen meteen gestopt bij tstop. De gemiddelde neutronentellingssnelheid bleef constant als functie van de meettijd tussent-vulling en t-stop omdat de stroomsnelheid door de monstercel constant was en daarom het monster binnen het neutronenbundelpad in steady-state was. Met andere woorden, de gegevens gemeten bij tstop komen overeen met het monster dat is gemengd en geëvolueerd door tvertraging = tfill- tmix = Vvoid/Q. De binned meettijden tdie ik onmiddellijk na tstop heb verzameld, zijn de belangrijkste kinetische gegevens van belang.

In figuur 4C worden de neutronentellingen van het monster van de gemengde lipideblaasjes bij drie verschillende temperaturen uitgezet als functie van de gecorrigeerde procestijdschaal (t-proces), de procestijd van belang die is gecorrigeerd voor de steady-state stroomperiode en vertragingstijd. De procestijdschaal werd berekend door t proces = t i- t stop + tvertraging, of gelijkwaardig, tproces = ti- t stop + t fill-t mix. SANS-gegevens werden continu verzameld in figuur 4 in de zogenaamde gebeurtenismodus. Tijdens het verzamelen van gegevens in de gebeurtenismodus wordt elke gedetecteerde neutronengebeurtenis geregistreerd met een unieke tijdstempel en de x- en y-locatie op de tweedimensionale neutronendetector. Gegevens over de gebeurtenismodus worden vervolgens naverwerkt in de gewenste tijdbins (ti) in figuur 4B.

Gegevens over de gebeurtenismodus binnen het toegankelijke procestijdvenster van belang (d.w.z. neutronenverstrooiing verzameld bij elke ti na tstop in figuur 4B) werden gereconstrueerd in een tweedimensionaal (2D) detectorbeeld voor die tijdsbak met behulp van protocollen en scripts die beschikbaar zijn in de online open-source repository64. Elk 2D-detectorbeeld werd vervolgens verwerkt met behulp van datareductieroutines om de verschillende bronnen van achtergrond af te trekken, correct voor de monstertransmissie en detectorefficiëntie, en azimutally de 2D-detectorgegevens te integreren in intensiteit (I) versus verstrooiingsvector (q) plots65. De gegevens in figuur 5 zijn in gelijke (3 s) tijdbakken geplaatst en zijn representatief voor de tijd- en lengteschaalafhankelijke informatie die kan worden verkregen uit een TR-SANS-meting. Vergelijkbaar met de totale ruwe telsnelheid in figuur 4B, neemt de q-afhankelijke intensiteit I (q) in de tijd af naarmate de lipiden in de buitenste folder uitwisselen en willekeurig mengen tussen verschillende blaasjes.

De gegevens zijn weergegeven in figuur 5 voor de lipidenuitwisselingskinetiek gemeten bij 3 verschillende temperaturen. Elk perceel toont de gegevens die gedurende de eerste 110 minuten na het mengen zijn verzameld. De gemeten intensiteit neemt met een orde van grootte af bij de laagste q-waarden bij 36 °C en 30 °C, die overeenkomen met de lipidevloeistoffase. Ondertussen veranderen de verspreide intensiteitsgegevens aanzienlijk langzamer met de tijd bij 20 °C, wat aangeeft dat de buitenste folderuitwisselingkinetiek veel langzamer is in de lipidegelfase.

De gemeten verstrooiingsintensiteit, I(q), is gerelateerd aan het SLD-contrast als Equation 1, waarbij Δρ het SLD-verschil is tussen het blaasje en het omringende oplosmiddel. Dit gemiddelde SLD-contrast is direct gerelateerd aan het relatieve aantal H-lipiden en D-lipiden in een blaasje op een bepaald moment. Als zodanig kan de gemeten verstrooiingsintensiteit op een bepaald moment worden genormaliseerd om de fractie van de lipidenpopulatie te bepalen die is uitgewisseld. Deze normalisatie wordt bereikt door twee aanvullende metingen te verzamelen, waaronder: (1) de gemeten intensiteit I (0) op tijdstip t = 0, wanneer er geen lipidenuitwisseling tussen blaasjes is, en (2) de gemeten intensiteit I (∞) op tijdstip t = ∞, wanneer alle lipiden zijn uitgewisseld en de populaties in evenwicht zijn gebracht. De genormaliseerde telsnelheid, 42, Equation 2 is uitgezet als functie van de procestijd voor de verschillende temperaturen in figuur 6. In dit voorbeeld is I(t) de q-geïntegreerde intensiteit op procestijd t (achtergrond-afgetrokken intensiteit geïntegreerd als functie van q), I(∞) is de q-geïntegreerde intensiteit op oneindige tijd nadat alle lipiden zijn uitgewisseld (die vergelijkbaar moet zijn met de oplosmiddelachtergrondverstrooiing), en I(0) is de q-geïntegreerde intensiteit op tijdstip t = 0 (zonder lipidenuitwisseling). I(0) werd gemeten voor een gemengd monster onder de faseovergangstemperatuur bij 20 °C waar de uitwisseling traag was, en I(∞) werd gemeten in een afzonderlijk monster dat meer dan 36 uur bij 40 °C in evenwicht was geweest en H-lipiden en D-lipiden had en volledig had uitgewisseld.

De genormaliseerde telsnelheid moet vervallen van R(t) = 1 op procestijd t = 0, tot R(t) = 0 op t = ∞, en is direct gerelateerd aan SLD-contrast in het monster en dus de mate van lipidenuitwisseling 27,28,29,30,31,32,33,34,35 . Merk op dat de vroegst gemeten R(t)-gegevens niet beginnen bij R(t)=1 bij 30 °C en 36 °C, wat erop wijst dat er tijdens de eerste 3 s na het mengen een aanzienlijke hoeveelheid lipidenuitwisseling plaatsvond, die niet experimenteel toegankelijk was vanwege de vertragingstijd (tvertraging = 2,4 s) van het gebruikte stop-flow mengprotocol. Ondertussen bleef de gemeten R(t) bij 20 °C de eerste (2-3) minuten ongeveer constant. Voor de lipidenuitwisselingskinetiek gemeten bij 30 °C en 36 °C verviel R(t) snel tot ≈0,5 binnen 100 s, wat suggereert dat de buitenste bladlipiden binnen enkele minuten volledig zijn uitgewisseld en in evenwicht zijn gebracht. Dienovereenkomstig werd het vastleggen van de mβCD-gekatalyseerde lipidenuitwisseling mogelijk gemaakt met behulp van SANS met stopstroom en zou het moeilijk zijn om te vangen met handmatige pipetmenging. Het vastleggen van nog eerdere procestijdpunten (t < 3 s) vereist een ander mixertype met een kleiner leegtevolume, kleinere buisleegtevolumes en hogere totale stroomsnelheden om de vertragingstijd te verkorten.

De R(t) bleef op langere momenten vervallen als de lipiden flip-flop tussen de binnenste en buitenste blaadjes. TR-SANS-gegevens voor het langzamere flip-flopproces (t > 5 min) kunnen worden verzameld met afzonderlijke monsters die met de hand worden gemengd en in standaard SANS-monstercellen worden geladen, omdat de handmatige pipetmengmethode ongeveer 5 minuten duurt. Evenzo was de lipidenuitwisseling bij 20 °C in de lipidegelfase langzaam genoeg om discreet te worden gemengd en gemeten, en deze meting hoefde niet noodzakelijkerwijs te worden bestudeerd met de stop-flow mengmethode. Metingen van kinetische processen op tijdschalen van enkele minuten tot uren zijn efficiënter wanneer de monsters worden gemengd door handmatige pipetmenging. Kinetische processen op tijdschalen van minder dan minuten vereisen echter deze gestopte stroommenging en TR-SANS-meetprocedure.

Figure 4
Figuur 4: Representatieve gegevens over het aantal ruwe neutronen die zijn verzameld tijdens meng- en reinigingsinjectiecycli. (A) Voorbeeld van de neutronentelling (middelste detector) als functie van de tijd tijdens herhaalde spoelsequenties, droogvolgorde en gemengde monsterinjectiesequentie gedurende meerdere cycli. Het monster in (A) was een zoutbufferachtergrond en de veranderingen in intensiteit in de loop van de tijd weerspiegelen de variaties in de achtergrondtelling, niet een verandering in de steekproef. (B) Monitor-genormaliseerde neutronentelling als functie van de experimenteertijd na de injectie van gemengde H-lipide- en D-lipideblaasjes bij 30 °C. De verticale stippellijnen geven de starttijd van het mengen (t-mix), de vultijd (t-vulling), de stroomstoptijd (t-stop) en het tijdbinninggebied (ti) aan. Het verval in telsnelheid nat-stop is te wijten aan verlies van contrast in het monster als de lipidenuitwisseling tussen blaasjes. (C) Bewaak de genormaliseerde neutronentellingssnelheden als functie van de uitwisselingsprocestijd voor de eerste 100 s van het experiment bij (blauw) 20 °C, (groen) 30 °C en (rood) 36 °C. De gegevens van de gebeurtenismodus worden verwerkt in 1 s-bakken. Afkortingen: S1 = oplosmiddel 1; S2 = oplosmiddel 2; tmix = experimenteertijd waarop de monsteroplossingen worden gemengd; tfill = experimenteertijd waarop de monstercel wordt gevuld; tstop = experimenteertijd waarop de stroom wordt gestopt; tproces = berekende kinetische procestijd van belang. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Illustratie van gekatalyseerde uitwisseling van de buitenste laag lipideblaasjes en overeenkomstige veranderingen in de verstrooide intensiteit (I) als functie van de verstrooiingsvector (q) bij verschillende temperaturen. Schematische weergave van lipidenuitwisseling tussen H-lipide en D-lipideblaasjes na (A) initiële menging bij t = 0 en (B) uitwisseling van de buitenste laag gekatalyseerd door methyl-β-cyclodextrine (mβCD). Verminderde neutronenverstrooiingsintensiteit als functie van verstrooiingsgolfvector q. Experimenten met het mengen van gestopte stroming en VSANS-metingen werden herhaald bij (C) 36 °C, (D) 30 °C en (E) 20 °C. De gepresenteerde gegevens werden in 3 s-intervallen over de eerste 10 minuten na het mengen bij elke opgegeven temperatuur weggegooid. Foutbalken zijn de gepropageerde onzekerheid uit de telstatistieken en vertegenwoordigen één standaarddeviatie. Afkortingen: ke = snelheidsconstante voor uitwisseling van lipiden tussen blaasjes; mβCD = methyl-β-cyclodextrine; kf = snelheidsconstante voor de uitwisseling van lipiden tussen de folders, ook wel lipide flip-flop genoemd; l(q) = gemeten SANS-intensiteit met eenheden van cm-1 ; q = verstrooiingsvector. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Genormaliseerde verspreide intensiteit die overeenkomt met de fractie van uitgewisselde lipiden die kan worden gemodelleerd om snelheidsconstanten te extraheren voor de kinetische processen van belang . (A) Lipidenuitwisseling tussen de buitenste blaadjes van de blaasjes op tijdschalen tussen 3 s en 600 s gemeten bij (blauw) 20 °C, (zwart) 30 °C en (rood) 36 °C. De inzet in de figuur zoomt in op de eerste 60 s van het kinetische proces. Foutbalken zijn de gepropageerde onzekerheid van de numerieke integratie van de verstrooiingsintensiteiten en vertegenwoordigen één standaarddeviatie. Afkortingen: R(t) = genormaliseerde verspreide intensiteit; tproces = gecorrigeerde procestijd van belang. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De huidige procedure beschrijft het mengapparaat en de stappen voor het uitvoeren van TR-SANS-metingen met gestopt stroom. Het apparaat en protocol zijn geoptimaliseerd voor vloeistofmonsters met een lage viscositeit waarbij de relevante tijdschalen ≈1 s tot 5 minuten zijn. Voor tijdschalen van meer dan 5 minuten kan het handmatig mengen van de monsters en het laden ervan in standaard verstrooiingscellen gemakkelijker en wenselijk zijn, vooral voor monsters met een hoge viscositeit, gels of pasta's. Toegang tot tijdschalen van minder dan 1 s vereist een ander mengapparaat, lagere totale leegtevolumes en hogere totale stroomsnelheden om de vertragingstijd te verkorten. Het is ook belangrijk op te merken dat het bestuderen van kinetische processen op deze korte tijdschalen waarschijnlijk herhaalde monsterinjecties vereist om voldoende verstrooiingstellingsstatistieken te verzamelen op de milliseconde tijdschaal met TR-SANS. Als de totale monstervolumes beperkt zijn, kan het wenselijk zijn een techniek met een hogere flux te gebruiken, zoals lichtverstrooiing of röntgenverstrooiing, waarvoor minder monsterinjecties of minder monstervolume per injectie nodig zijn, ervan uitgaande dat er voldoende verstrooiingscontrast bestaat met licht- of röntgenverstrooiing.

Deze modulaire sans-aanpak met stopstroom creëert verschillende belangrijke voor- en nadelen in vergelijking met in de handel verkrijgbare gestopte stroominstrumenten die zijn geoptimaliseerd voor neutronenverstrooiingsexperimenten. Belangrijke voordelen zijn (1) het afwisselen van TR-SANS-metingen tussen verschillende monstercellen tijdens spoelperioden om het gebruik van neutronenbundeltijd te maximaliseren, (2) het aanpassen van het aantal spuiten, spuitvolumes en mixertypen voor ternaire monstermenging of andere complexere monstermengvereisten, en (3) het mogelijk maken van langere meetperioden door de monstercel te isoleren en terugdiffusie op langere tijdschalen (>10 min.) te elimineren. Hoewel hier niet geïmplementeerd, zou de modulariteit van het mengcelontwerp ook gelijktijdige gegevensverzameling met meerdere meetmethoden mogelijk maken, zoals het kammen van SANS, UV-Vis en fluorescentiemetingen70. Twee belangrijke nadelen van deze modulaire opstelling zijn (1) relatief langere mengvertragingstijden (1 s tot 3 s) in vergelijking met andere systemen die vertragingstijden van 1 ms tot 100 ms kunnen bieden, en (2) een kleiner bedrijfstemperatuurbereik (10 °C tot 50 °C) in vergelijking met andere beschikbare systemen die toegang hebben tot bedrijfstemperaturen van -20 °C tot meer dan 80 °C.

Het verzamelen van voorlopige SANS-gegevens over de monsters van belang voorafgaand aan het uitvoeren van in-situ mengexperimenten is belangrijk voor het verzamelen van de beste TR-SANS-gegevens, met name in experimenten die zijn ontworpen om moleculaire uitwisselingskinetiek te monitoren, zoals het hier gepresenteerde voorbeeld. Het bepalen van nauwkeurige waarden van I(0) en I(∞) is van cruciaal belang voor het berekenen van nauwkeurige waarden van de genormaliseerde intensiteit, R(t), die is gemodelleerd om de gewenste kinetische parameters te extraheren. De waarde van I(0) kan rechtstreeks worden berekend uit de gemeten verstrooiingsintensiteiten van de afzonderlijke H-blaasjes- en D-blaasjesvoorraden, en I(∞) kan worden bepaald door een afzonderlijk blaasjesmonster te bereiden dat is bereid uit een 50/50-mengsel van H-lipiden/D-lipiden. De verstrooiingsgegevens van deze controlemonsters kunnen ook worden gebruikt om de optimale q-range en SANS-instrumentconfiguratie voor de TR-SANS-meting te bepalen om het signaal te maximaliseren en de progressie van de uitwisselingskinetiek tijdens de TR-SANS-experimenten te verifiëren. Als de gemeten intensiteit op het eerste tijdstip na het mengen niet gelijk is aan de berekende I(0), kunnen snellere mengtijden nodig zijn om alle interessante processen vast te leggen. Zodra de gemeten intensiteit I(∞) heeft bereikt, is het uitwisselingsproces voltooid en kan de cel worden geleegd en gereinigd ter voorbereiding op de volgende injectie.

Om het vloeistofmonster voor TR-SANS met succes te mengen, is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat alle spuiten, kleppen en buisleidingen geprimed en luchtvrij zijn en dat alle buisverbindingen veilig zijn om lekkage te voorkomen. Het niet correct uitvoeren van deze kritieke stappen kan leiden tot onnauwkeurige mengvolumes of onnauwkeurige absolute verstrooiingsintensiteiten. Luchtbellen die in de monstercel gevangen zitten, zullen bijvoorbeeld de gemeten SANS-intensiteit verminderen vanwege een verminderd monstervolume in het neutronenbundelpad. Als alternatief kunnen luchtbellen 'strepen' of 'fakkels' van hoge intensiteit op de detector produceren als gevolg van bundelbreking op de lucht-vloeistofinterface. Onverwachte veranderingen in de gemeten verstrooiingsintensiteit in de loop van de tijd kunnen wijzen op slechte monstermenging, kleplekkage, luchtbellen in de monstercel of terugdiffusie van het monster.

Het verzamelen van een transmissiemeting voor elk monster tijdens een TR-SANS-experiment is van cruciaal belang om de verzamelde gegevens tot een absolute intensiteit te reduceren. Het is mogelijk om gelijktijdig verstrooiings- en transmissiegegevens te verzamelen op sommige SANS-instrumenten, wat de algehele TR-SANS-gegevensacquisitieprogrammering vereenvoudigt; dit is echter niet mogelijk op alle instrumenten, met inbegrip van het VSANS-instrument dat in dit protocol wordt gebruikt. Omdat voor de monstertransmissie- en monsterverstrooiingsmetingen verschillende instrumentconfiguraties nodig waren, werden transmissiemetingen verzameld aan het einde van de verstrooiingsmetingen (protocolstap 7.2.4) om ervoor te zorgen dat verstrooiingsgegevens werden gemeten op de vroegste tijdstippen nadat het monster in de cel was geïnjecteerd. De transmissie is alleen afhankelijk van de totale elementaire samenstelling, de lengte van het monsterpad en de neutronengolflengte. Daarom mag de transmissie niet veranderen als de totale elementaire samenstelling constant blijft gedurende het tijd-opgeloste experiment. Grote verschillen in de transmissiewaarden tussen herhaalde runs van hetzelfde monster wijzen op een probleem door inconsistente mengmonstervolumes, onvolledige vulling van de monstercel, luchtbellen of kleplekkage en terugstroom van monsters tijdens het experiment.

Een uniek voordeel van TR-SANS is dat de gemeten intensiteit afhankelijk is van de verstrooiingsvector (q) en gebruikt kan worden om ruimtelijke veranderingen op nanoschaal te onderzoeken. In combinatie met het stop-flow mengapparaat kan TR-SANS deze veranderingen op nanoschaal op de tweede tot minuut tijdschalen onderzoeken, waardoor inzicht wordt verkregen in de zelfassemblage en uitwisseling van oppervlakteactieve stoffen en lipiden, polymeer- en eiwitaggregatie bij toevoeging van hulpstoffen, groei en verval van nanodeeltjes, of de uitwisseling van ingekapselde producten in emulsies. Het apparaat met stopstroom kan worden geconfigureerd met meerdere spuitpompen en spuiten om het mengen van twee of meer vloeistofmonsters te vergemakkelijken. Deze flexibiliteit maakt het mogelijk om systematisch onderzoek te doen naar additieven op de kinetiek van belang. Verschillende volumes van een geconcentreerde antimicrobiële peptideoplossing kunnen bijvoorbeeld worden gemengd met H-vesikel- en D-vesikeloplossingen om de effecten van peptideconcentratie op lipide-uitwisselingskinetiek te bestuderen45,46. Bovendien, omdat alle afgedichte vloeistofpaden zijn ingepakt in een temperatuurgecontroleerde behuizing, die de monsterspuiten, kleppen, mixers en slangen omvat, kan de temperatuur van het systeem worden gewijzigd om de thermodynamische parameters te extraheren die verband houden met de kinetische processen van belang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Acknowledgments

Toegang tot de NG3 VSANS werd geboden door het Center for High-Resolution Neutron Scattering, een samenwerkingsverband tussen het National Institute of Standards and Technology en de National Science Foundation onder overeenkomst nr. DMR-2010792. M.H.L.N erkent de financiering door Mitacs Globalink (Canada). De identificatie van commerciële producten of handelsnamen is bedoeld om begrip te bevorderen en impliceert geen goedkeuring of aanbeveling door het National Institute of Standards and Technology.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynamic mixer Analytical Scientific Instruments 462-0150A Magnetically coupled rotor, binary dynamic mixer assembly (ternary type available), 0.15 mL dead volume (larger dead volume available)
Fluoropolymer tubing IDEX Health & Science 1507L PFA Tubing Natural 1/16 inch OD x 0.040 inch ID x 50 ft
Fluoropolymer 1/4-28 flangeless fittings IDEX Health & Science XP-245 PFA flangeless fitting with ferrules, 1/4-28 threading, 1/16 inch OD tubing
Glass syringes Hamilton Company 81660 Hamilton 1000 series syringes, 10 mL (81660), model 1010 C syr, 1/4"-28 thread termination, other volumes available
High-pressure flow selector valves Vici Valco C85X-1570EUTB Vici 10 position selector valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure switch valves Vici Valco C82X-1574EUHB Vici 4 port switch valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure syringes Cetoni A2019000358 3 mL stainless steel syringe, 510 bar max, 21 mL/min flow rate max
Low-pressure flow selector valves Vici Valco C25-3180EUHB Vici 10 position selector valves, max 250 psi liquid, 0.75 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 1/4-28 threaded ports, USB universal actuator
neMESYS high-pressure syringe pumps Cetoni A3921000103 Max force 2600 N
neMESYS mid-pressure syringe pumps Cetoni A3921000131 Max force 1000 N
Power supply Cetoni A3921000127 Base 600, supplies power for up to 4 high pressure pumps
Quartz flow-through sample cell Starna Scientific 3-2.30-Q-1/TC Quartz micro flow cells, 2 mm path length (1 mm available), 2 mm by 2 mm by 30 mm internal dimension
Quartz windows Technical Glass Products NA GE 124 Clear fused quartz ground and polished plates, 11.75 inch by 23.75 inch by 0.375 inch thick
Stainless steel 10-32 coned compression fittings IDEX Health & Science U-321X, U-320X 316 stainless steel ferrule (U-321X) and nut (U-320X) -Valco type, 10-32 coned, for 1/16 inch OD stainless steel tubing
Stainless steel tubing IDEX Health & Science U-102 Stainless Steel Tubing 1/16 inch OD x 0.020 inch ID, 10 cm, various precut lengths available
Syringe pump control software Cetoni T6000000004 QmixElements software for nemesys pumps, QmixSDK software development kit
Thermoelectric air conditioner EIC Solutions AAC-140C-4XT-HC Thermoelectric air conditioner mounted on insulated enclosure to control the pump, valve, mixer, and sample temperature
T-slot railing McMaster-Carr 47065T103 Aluminum t-slotted railing (1.5 inch by 1.5 inch) cut to various lengths
Vapor locking bottle caps  Cole-Parmer EW-12018-02 Four 304 SS port inserts, 1/4"-28 threads, GL45 bottle cap size, PTFE body, SS threads, PP collar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Melnichenko, Y. B., Wignall, G. D. Small-angle neutron scattering in materials science: Recent practical applications. Journal of Applied Physics. 102 (2), 021101 (2007).
  2. Grillo, I. Small-angle neutron scattering and applications in soft condensed matter. Soft Matter Characterization. Borsali, R., Pecora, R. , Springer. Dordrecht. (2008).
  3. Hollamby, M. J. Practical applications of small-angle neutron scattering. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (26), 10566-10579 (2013).
  4. Pipich, V., Fu, Z. KWS-3: Very small angle diffractor with focusing mirror. Journal of large-scale research. 1, 31 (2015).
  5. Kline, S. 2019 NCNR Annual Report, Special Publication (NIST SP). , National Institute of Standards and Technology. Gaithersburg, MD. (2019).
  6. Gilbert, P. H., et al. Preservative induced polysorbate 80 micelle aggregation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 10 (6), 2395-2404 (2021).
  7. Terashima, T., et al. In situ and time-resolved small-angle neutron scattering observation of star polymer formation via arm-linking reaction in ruthenium-catalyzed living radical polymerization. Macromolecules. 43 (19), 8218-8232 (2010).
  8. Hashimoto, K., Fujii, K., Nishi, K., Shibayama, M. Ion gel network formation in an ionic liquid studied by time-resolved small-angle neutron scattering. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (40), 9419-9424 (2018).
  9. Conn, C. E., et al. Membrane protein structures in lipid bilayers; small-Angle neutron scattering with contrast-matched bicontinuous cubic phases. Frontiers in Chemistry. 8, 619470 (2021).
  10. van't Hag, L., et al. Protein-eye view of the in meso crystallization mechanism. Langmuir. 35 (25), 8344-8356 (2019).
  11. Mahieu, E., et al. Observing protein degradation by the PAN-20S proteasome by time-resolved neutron scattering. Biophysical Journal. 119 (2), 375-388 (2020).
  12. Ibrahim, Z., et al. Time-resolved neutron scattering provides new insight into protein substrate processing by a AAA+ unfoldase. Scientific Reports. 7 (1), 40948 (2017).
  13. Hollamby, M. J., et al. Growth of mesoporous silica nanoparticles monitored by time-resolved small-angle neutron scattering. Langmuir. 28 (9), 4425-4433 (2012).
  14. Blin, J. L., Impéror-Clerc, M. Mechanism of self-assembly in the synthesis of silica mesoporous materials: in situ studies by X-ray and neutron scattering. Chemical Society Reviews. 42 (9), 4071-4082 (2013).
  15. Impéror-Clerc, M., Grillo, I., Khodakov, A. Y., Durand, D., Zholobenko, V. L. New insights into the initial steps of the formation of SBA-15 materials: an in situ small angle neutron scattering investigation. Chemical Communications. 8, 834-836 (2007).
  16. Narayanan, T., Rüter, A., Olsson, U. SAXS/WAXS investigation of amyloid-β(16-22) peptide nanotubes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 654349 (2021).
  17. Angelov, B., et al. DNA/Fusogenic lipid nanocarrier assembly: millisecond structural dynamics. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (11), 1959-1964 (2013).
  18. Amann, M., et al. Kinetic pathways for polyelectrolyte coacervate micelle formation revealed by time-resolved synchrotron SAXS. Macromolecules. 52 (21), 8227 (2019).
  19. Varga, Z., Wacha, A., Bóta, A. Osmotic shrinkage of sterically stabilized liposomes as revealed by time-resolved small-angle X-ray scattering. Journal of Applied Crystallography. 47 (1), 35-40 (2014).
  20. Panine, P., Finet, S., Weiss, T. M., Narayanan, T. Probing fast kinetics in complex fluids by combined rapid mixing and small-angle X-ray scattering. Advances in Colloid and Interface Science. 127 (1), 9-18 (2006).
  21. Grillo, I. Applications of stopped-flow in SAXS and SANS. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 14 (6), 402-408 (2009).
  22. Gomez-Hens, A., Perez-Bendito, D. The stopped-flow technique in analytical chemistry. Analytica Chimica Acta. 242, 147-177 (1991).
  23. Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. Use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the ATP turnover cycle of kinesins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52142 (2014).
  24. Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of stopped-flow kinetics methods to investigate the mechanism of action of a DNA repair protein. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1874 (2010).
  25. Raney, K. D., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. A fluorescence-based assay for monitoring helicase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6644-6648 (1994).
  26. Roder, H., Maki, K., Cheng, H. Early events in protein folding explored by rapid mixing methods. Chemical reviews. 106 (5), 1836-1861 (2006).
  27. Milon, A., et al. Osmotic swelling of unilamellar vesicles by the stopped-flow light scattering method. Influence of vesicle size, solute, temperature, cholesterol and three α,ω-dihydroxycarotenoids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 859 (1), 1-9 (1986).
  28. Gast, K., Nöppert, A., Müller-Frohne, M., Zirwer, D., Damaschun, G. Stopped-flow dynamic light scattering as a method to monitor compaction during protein folding. European Biophysics Journal. 25 (3), 211-219 (1997).
  29. Antoun, A., Pavlov, M. Y., Tenson, T., Ehrenberg, M. M. Ribosome formation from subunits studied by stopped-flow and Rayleigh light scattering. Biological Procedures Online. 6, 35-54 (2004).
  30. Zhu, Z., Armes, S. P., Liu, S. pH-Induced micellization kinetics of ABC triblock copolymers measured by stopped-flow light scattering. Macromolecules. 38 (23), 9803-9812 (2005).
  31. Ye, J., et al. Comparative study of temperature-induced association of cyclic and linear poly(N-isopropylacrylamide) chains in dilute solutions by laser light scattering and stopped-flow temperature jump. Macromolecules. 41 (12), 4416-4422 (2008).
  32. Liu, X., et al. Early stage kinetics of polyelectrolyte complex coacervation monitored through stopped-flow light scattering. Soft Matter. 12 (44), 9030-9038 (2016).
  33. Garman, E. F., Weik, M. X-ray radiation damage to biological samples: recent progress. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (4), 907-911 (2019).
  34. Garg, S., Porcar, L., Woodka, A. C., Butler, P. D., Perez-Salas, U. Noninvasive neutron scattering measurements reveal slower cholesterol transport in model lipid membranes. Biophysical Journal. 101 (2), 370-377 (2011).
  35. Marquardt, D., et al. 1H NMR shows slow phospholipid flip-flop in gel and fluid bilayers. Langmuir. 33 (15), 3731-3741 (2017).
  36. Egelhaaf, S. U., Olsson, U., Schurtenberger, P. Time-resolved SANS for surfactant phase transitions. Physica B: Condensed Matter. 276-278, 326-329 (2000).
  37. Tabor, R. F., Eastoe, J., Grillo, I. Time-resolved small-angle neutron scattering as a lamellar phase evolves into a microemulsion. Soft Matter. 5 (10), 2125-2129 (2009).
  38. Gradzielski, M., Bergmeier, M., Hoffmann, H., Müller, M., Grillo, I. Vesicle gel formed by a self-organization process. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (49), 11594-11597 (2000).
  39. Lee, Y. -T., Li, D. S., Pozzo, L. D. Kinetic analysis of ultrasound-induced oil exchange in oil-in-water emulsions through contrast variation time-resolved small-sngle neutron scattering. Langmuir. 35 (47), 15204-15213 (2019).
  40. Lee, Y. -T., Pozzo, L. D. Contrast-variation time-resolved small-angle neutron scattering analysis of oil-exchange kinetics between oil-in-water emulsions stabilized by anionic surfactants. Langmuir. 35 (47), 15192-15203 (2019).
  41. Roger, K., Olsson, U., Schweins, R., Cabane, B. Emulsion ripening through molecular exchange at droplet contacts. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1452-1455 (2015).
  42. Nakano, M., Fukuda, M., Kudo, T., Endo, H., Handa, T. Determination of Interbilayer and Transbilayer Lipid Transfers by Time-Resolved Small-Angle Neutron Scattering. Physical Review Letters. 98 (23), 238101 (2007).
  43. Nakano, M., et al. Flip-flop of phospholipids in vesicles: kinetic analysis with time-resolved small-angle neutron scattering. The Journal of Physical Chemistry B. 113 (19), 6745-6748 (2009).
  44. Nguyen, M. H. L., et al. Methanol accelerates DMPC flip-flop and transfer: A SANS study on lipid dynamics. Biophysical Journal. 116 (5), 755-759 (2019).
  45. Nguyen, M. H. L., et al. Peptide-induced Lipid flip-flop in asymmetric liposomes measured by small angle neutron scattering. Langmuir. 35 (36), 11735-11744 (2019).
  46. Nguyen, M. H. L., et al. Time-resolved SANS reveals pore-forming peptides cause rapid lipid reorganization. New Journal of Chemistry. 45 (1), 447-456 (2021).
  47. Xia, Y., et al. Effects of nanoparticle morphology and acyl chain length on spontaneous lipid transfer rates. Langmuir. 31 (47), 12920-12928 (2015).
  48. Xia, Y., et al. Morphology-induced defects enhance lipid transfer rates. Langmuir. 32 (38), 9757-9764 (2016).
  49. Maric, S., et al. Time-resolved small-angle neutron scattering as a probe for the dynamics of lipid exchange between human lipoproteins and naturally derived membranes. Scientific Reports. 9 (1), 7591 (2019).
  50. Nielsen, J. E., Bjørnestad, V. A., Pipich, V., Jenssen, H., Lund, R. Beyond structural models for the mode of action: How natural antimicrobial peptides affect lipid transport. Journal of Colloid and Interface Science. 582, 793-802 (2021).
  51. Willner, L., Poppe, A., Allgaier, J., Mokenbusch, M., Richter, D. TIme-resolved SANS for the determintioan of unimer exchange kinetics in block copolymer micelles. Europhysics Letters. 55 (5), 667 (2001).
  52. Lund, R., Willner, L., Stellbrink, J., Lindner, P., Richter, D. Logarithmic chain-exchange kinetics of diblock copolymer micelles. Physical Review Letters. 96 (6), 068302 (2006).
  53. Lund, R., Willner, L., Richter, D., Dormidontova, E. E. Equilibrium chain exchange kinetics of diblock copolymer micelles: Tuning and logarithmic relaxation. Macromolecules. 39 (13), 4566-4575 (2006).
  54. Lund, R., Willner, L., Richter, D. Kinetics of block copolymer micelles studied by small-angle scattering methods. in Controlled Polymerization and Polymeric Structures. Advances in Polymer Science. Abe, A., Lee, K. S., Leibler, L., Kobayashi, S. , Springer. Cham. 51 (2013).
  55. Choi, S. -H., Lodge, T. P., Bates, F. S. Mechanism of molecular exchange in diblock copolymer micelles: hypersensitivity to core chain length. Physical Review Letters. 104 (4), 047802 (2010).
  56. Choi, S. -H., Bates, F. S., Lodge, T. P. Molecular exchange in ordered diblock copolymer micelles. Macromolecules. 44 (9), 3594-3604 (2011).
  57. Lu, J., Bates, F. S., Lodge, T. P. Chain exchange in binary copolymer micelles at equilibrium: confirmation of the independent chain hypothesis. ACS Macro Letters. 2 (5), 451-455 (2013).
  58. Lu, J., Bates, F. S., Lodge, T. P. Remarkable effect of molecular architecture on chain exchange in triblock copolymer micelles. Macromolecules. 48 (8), 2667-2676 (2015).
  59. Kelley, E. G., et al. Size evolution of highly amphiphilic macromolecular solution assemblies via a distinct bimodal pathway. Nature Communications. 5 (1), 3599 (2014).
  60. Murphy, R. P., Kelley, E. G., Rogers, S. A., Sullivan, M. O., Epps, T. H. Unlocking chain exchange in highly amphiphilic block polymer micellar systems: influence of agitation. ACS Macro Letters. 3 (11), 1106-1111 (2014).
  61. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50 (6), 2484-2494 (2017).
  62. Lantz, K. A., et al. Cavitation enables switchable and rapid block polymer exchange under high-χN conditions. Macromolecules. 51 (17), 6967-6975 (2018).
  63. Murphy, R. P., et al. Capillary RheoSANS: measuring the rheology and nanostructure of complex fluids at high shear rates. Soft Matter. 16 (27), 6285-6293 (2020).
  64. Stopped Flow Sans. usnistgov. , Available from: https://github.com/usnistgov/stopped-flow-sans (2021).
  65. Kline, S. Reduction and analysis of SANS and USANS data using IGOR Pro. Journal of Applied Crystallography. 39 (6), 895-900 (2006).
  66. Doktorova, M., et al. Preparation of asymmetric phospholipid vesicles for use as cell membrane models. Nature Protocols. 13 (9), 2086-2101 (2018).
  67. Huang, Z., London, E. Effect of cyclodextrin and membrane lipid structure upon cyclodextrin-lipid interaction. Langmuir. 29 (47), 14631-14638 (2013).
  68. Sugiura, T., Ikeda, K., Nakano, M. Kinetic analysis of the methyl-β-cyclodextrin-mediated intervesicular transfer of pyrene-labeled phospholipids. Langmuir. 32 (51), 13697-13705 (2016).
  69. Scott, H. L., et al. On the mechanism of bilayer separation by extrusion, or why your LUVs are not really unilamellar. Biophysical Journal. 117 (8), 1381-1386 (2019).
  70. Dicko, C., et al. NUrF-Optimization of in situ UV-vis and fluorescence and autonomous characterization techniques with small-angle neutron scattering instrumentation. Review of Scientific Instruments. 91 (7), 075111 (2020).

Tags

Deze maand in JoVE Nummer 174 Small-angle neutron scattering (SANS) time-resolved scattering stopped-flow mixing molecular exchange kinetics lipid nanoparticles lipid membranes vesikles structural evolution
Het meten van de tijdsevolutie van materialen op nanoschaal met stop-flow en small-angle neutronenverstrooiing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelley, E. G., Nguyen, M. H. L.,… More

Kelley, E. G., Nguyen, M. H. L., Marquardt, D., Maranville, B. B., Murphy, R. P. Measuring the Time-Evolution of Nanoscale Materials with Stopped-Flow and Small-Angle Neutron Scattering. J. Vis. Exp. (174), e62873, doi:10.3791/62873 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter