Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Измерение временной эволюции наноразмерных материалов с остановленным потоком и малоугловым рассеянием нейтронов

Published: August 6, 2021 doi: 10.3791/62873
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1, 1
1NIST Center for Neutron Research, National Institute of Standards and Technology, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of Windsor, 3Department of Physics, University of Windsor

Summary

В этом протоколе представлено использование среды проб с остановленным потоком для быстрого смешивания нескольких жидких растворов in situ во время измерения малоуглового рассеяния нейтронов и для изучения кинетических процессов в нанометровых масштабах длины и во вторых временных масштабах.

Abstract

В этой статье представлено использование среды образца малоуглового рассеяния нейтронов (SANS) с остановленным потоком для быстрого смешивания жидких образцов и изучения наноразмерных кинетических процессов в масштабах времени от секунд до минут. В среде проб с остановленным потоком используются коммерчески доступные шприцевые насосы для смешивания желаемых объемов жидких образцов, которые затем впрыскиваются через динамический смеситель в ячейку из кварцевого стекла примерно за 1 с. Сбор данных SANS с временным разрешением синхронизируется со смешиванием образца, чтобы проследить эволюцию наноструктуры в растворе после смешивания.

Чтобы максимально эффективно использовать время нейтронного пучка, мы используем серию селекторных клапанов потока для автоматической загрузки, промывки и сушки ячейки между измерениями, что позволяет многократно собирать данные во время нескольких впрысков образца. Инъекции образцов повторяют до тех пор, пока не будет собрана достаточная статистика рассеяния нейтронов. Установка смешивания может быть запрограммирована на систематическое изменение условий для измерения кинетики при различных соотношениях смешивания, концентрациях проб, концентрациях добавок и температурах. Минимальный объем образца, необходимый для одной инъекции, составляет приблизительно 150 мкл в зависимости от длины пути кварцевой ячейки.

Представлены репрезентативные результаты с использованием этой среды образца с остановленным потоком для кинетики быстрого липидного обмена в присутствии добавки, циклодекстрина. Везикулы обмениваются наружными (внешними) липидами порядка секунд и полностью обмениваются как внутренними, так и внешними липидами в течение нескольких часов. Измерение кинетики липидного обмена требует смешивания in situ для захвата более быстрых (секунды) и более медленных (минуты) процессов и извлечения констант кинетической скорости. Одна и та же среда образца также может быть использована для зондирования молекулярного обмена в других типах жидких образцов, таких как липидные наночастицы, белки, поверхностно-активные вещества, полимеры, эмульсии или неорганические наночастицы. Измерение наноразмерных структурных преобразований и кинетики взаимозаменяющихся или реагирующих систем позволит по-новому взглянуть на процессы, которые развиваются на наноуровне.

Introduction

Малоугловое рассеяние нейтронов (SANS) обеспечивает уникальный способ измерения размеров, форм, взаимодействий и организации различных материалов на масштабах длин от ≈1 нм до ≈100 нм 1,2,3. Современные приборы, в том числе приборы VSANS (очень малоугловое рассеяние нейтронов) с фокусирующими зеркалами, раздвигают границы измерения еще больших масштабов длины до ≈1000 нм 4,5. В целом, уникальный контраст рассеяния, присущий методам рассеяния нейтронов, дает ряд преимуществ при измерении временной эволюции наноразмерных структур, таких как агрегация компонентов в фармацевтических препаратах6, реакции сшивания и гелеобразования в полимерных системах 7,8, мезокристаллизация мембранных белков9,10, деградация и развертывание белков11,12 и рост материалов на основе кремнезема13,14,15. Уникальный контраст рассеяния делает SANS С ВРЕМЕННЫМ РАЗРЕШЕНИЕМ (TR-SANS) полезным дополнением к другим измерениям на основе остановленного потока.

Методы смешивания с остановленным потоком часто реализуются при малоугловом рассеянии рентгеновских лучей (SAXS)16,17,18,19,20,21, флуоресцентной спектроскопии 22,23,24,25,26 и рассеянии света27,28,29,30, 31,32 эксперимента по изучению кинетических процессов на миллисекундных временных масштабах. Важное различие между SANS и SAXS заключается в том, что рассеяние нейтронов является методом неразрушающего определения характеристик, и поэтому SANS можно использовать для измерения одного и того же образца в течение нескольких часов или даже дней без повреждения образца ионизирующим излучением, что может произойти во время экспериментов по рассеянию рентгеновских лучей с более высоким потоком33. Поскольку повторные измерения SANS не изменят химическую структуру молекулы зонда или образца, эволюция времени может быть изучена, например, без эффектов фотообесцвечивания, что может усложнить измерения кинетики, основанные на флуоресценции23,24. Кроме того, SANS можно использовать для измерения высококонцентрированных и оптически непрозрачных образцов, которые часто трудно охарактеризовать с помощью методов, основанных на свете, таких как динамическое рассеяние света.

В дополнение к предоставлению структурной информации на наноуровне, SANS может быть использован для исследования локального состава этих структур через изменение контраста плотности длины рассеяния нейтронов. Плотность длины рассеяния (SLD) различных элементов случайным образом изменяется в периодической таблице и изменяется в зависимости от разных изотопов одного и того же элемента. Обычно используемым примером является водород (1H или H) и дейтерий (2H или D), которые имеют совершенно разные длины рассеяния нейтронов. Таким образом, богатые водородом материалы, такие как поверхностно-активные вещества, липиды, белки, РНК, ДНК и другие полимеры, можно отличить от дейтерированных растворителей с использованием SANS без существенного изменения физических свойств системы. Однако важно отметить, что H/D обмен может влиять на плотность, водородную связь и температуру фазового перехода в образце. Тем не менее, уникальная чувствительность SANS к материалам, богатым водородом, особенно полезна в исследованиях мягкой материи, где интересующие образцы имеют более низкий контраст рассеяния и сигнал в рентгеновских методах, таких как SAXS. Изотопное замещение также делает SANS мощным инструментом для изучения кинетики молекулярного обмена в богатых водородом материалах путем простого смешивания молекул, меченных H и D. Изотопное замещение особенно полезно в системах, где громоздкие флуоресцентные красители больше, чем интересующие молекулы поверхностно-активного вещества или липидов, и могут влиять на кинетику обмена34,35.

Измерения SANS с временным разрешением выгодны, поскольку измеренная интенсивность зависит от времени, шкалы длины и контраста SLD. Таким образом, эксперименты TR-SANS могут быть разработаны для исследования зависящих от времени изменений в пространственных распределениях и составах образцов. Эти уникальные преимущества SANS привели к важному пониманию кинетических процессов во многих системах мягких материалов, таких как поверхностно-активные вещества 36,37,38, эмульсии 39,40,41, липиды 34,42,43,44,45,46,47,48,49 ,50, и полимеры 51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62. Большинство исследований TR-SANS были сосредоточены на временных масштабах от минут до часов. Тем не менее, многие кинетические процессы, представляющие интерес, происходят на втором временном масштабе и необходимы для понимания основных механизмов. Захват этих ранних временных точек требует, чтобы растворы были быстро смешаны и измерены in situ, в котором смешивание синхронизируется со сбором данных во время рассеяния света с остановившимся потоком 27,28,29,30,31,32, флуоресценции 22,23,24,25,26 и рентгеновского излучения 16,17,18,19,20,21 экспериментов. В этой работе описывается использование среды для образцов, предназначенной для быстрого смешивания нескольких жидких образцов и впрыска смеси в ячейку из кварцевого стекла для измерений TR-SANS. Смесительное устройство является адаптацией недавно разработанного капиллярного устройства63 rheoSANS и использует несколько шприцевых насосов и клапанов для управления перемешиванием проб и автоматизации очистки клеток. Подключая шприцевые насосы к ряду клапанов селектора потока, можно многократно смешивать, измерять, промывать и сушить несколько входных потоков для облегчения измерений TR-SANS в секундной шкале времени.

Нынешняя процедура предполагает, что интересующие образцы были идентифицированы и подготовлены. Мы фокусируемся на установке смешивания in situ и методах сбора данных TR-SANS. Данные о рассеянии нейтронов были собраны на приборе VSANS в Центре нейтронных исследований NIST (NCNR); однако эта процедура должна быть применима к другим документам SANS. Читатели, заинтересованные в реализации аналогичных протоколов на других приборах SANS, должны проконсультироваться с местными учеными-приборостроителями, чтобы определить оптимальную конфигурацию прибора для максимизации потока нейтронов в желаемом масштабе длины и масштабе времени, наиболее подходящем для интересующих кинетических процессов. Представленные здесь данные были собраны с использованием конфигурации «белого луча» с высоким потоком на VSANS для максимизации количества нейтронов при потере пространственного разрешения5. Каретки детектора были расположены так, чтобы охватывать диапазон векторов рассеяния (q), 0,005 Å-1 < q < 0,5 Å-1, что соответствует масштабам длин от ≈130 нм до ≈13 нм. Вектор рассеяния определяется как q = 4π/λ sin (θ/2), где λ — длина волны нейтрона, а θ — угол рассеяния.

Устройство для смешивания с остановленным потоком, используемое для измерений TR-SANS, состоит из нескольких насосов, промывочных шприцев, шприцев для отбора проб, селекторов потока, а также адинамического смесителя, ячейки для проб и контейнера для смешанных образцов, как показано на рисунке 1. Все герметичные жидкостные тракты расположены внутри кондиционируемого корпуса, который включает в себя шприцы, клапаны, соединительные трубки, динамический смеситель и ячейки для проб. Программируемый термоэлектрический кондиционер используется для контроля температуры корпуса в диапазоне от 10 °C до 50 °C в пределах ±1 °C. Обратите внимание, что часть изоляции корпуса была удалена, чтобы показать рабочие части устройства. Корпус основного смесительного устройства расположен на ступени поступательного движения на лучевой линии NG3 VSANS в NCNR. Положение корпуса регулируется с помощью передаточного столика для позиционирования ячейки образца на пути нейтронного пучка (желтая пунктирная линия).

Figure 1
Рисунок 1: Пример установки для совмещения измерений смешивания остановленного потока и малоуглового рассеяния нейтронов на линии пучка VSANS в Центре нейтронных исследований NIST. Установка содержит четыре шприцевых насоса, два шприца для промывки растворителем и два шприца для впрыска пробы, четыре селекторных клапана насоса, два селекторных клапана смесителя, динамический смеситель, проточную кварцевую ячейку и контейнер для смешанных образцов. Падающие нейтроны рассеиваются от смешанного образца, находящегося внутри ячейки образца. Изолированный корпус с кварцевыми окнами и термоэлектрическим кондиционером используется для контроля образца и всего оборудования при постоянной температуре. Желтая пунктирная линия показывает траекторию пучка нейтронов. Масштабная линейка = 10 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Устройство, изображенное на фиг.1 , сконфигурировано с двумя шприцами для образцов, двумя шприцами для промывки и одной ячейкой для образца. Соответствующие блок-схемы для различных этапов протокола проиллюстрированы на рисунке 2. Желаемые объемы двух разных образцов впрыскиваются в смеситель и ячейку для образцов (рис. 2A). После заполнения ячейки для отбора проб впускной клапан (ISV) и выходной выключающий клапан (OSV) закрываются, чтобы изолировать ячейку для отбора проб от динамического смесителя и предотвратить обратную диффузию образца в ячейку во время сбора данных TR-SANS (рис. 2B). Перед динамическим смесителем соединительная трубка изменяется по длине от 10 см до 1 м и не влияет на время задержки смешивания. Однако соединения трубок между динамическим смесителем и ячейкой для отбора проб будут влиять на время задержки смешивания и требуемый объем впрыска образца. Предварительно нарезанные трубки из нержавеющей стали с внутренним диаметром 0,04 дюйма (1 мм) и длиной 100 мм используются для подключения динамического смесителя, селекторных клапанов смесителя (MSV1 и MSV2), а также независимых поставщиков программного обеспечения и OSV. Фторированная трубка с внутренним диаметром 1 мм и длиной 115 мм используется для подключения ISV и OSV (или выхода динамического смесителя) к ячейке для образцов. Общий объем пустоты, влияющий на время задержки смешивания, включает объем пустот смесителя (0,15 мл), трубку между выходным отверстием смесителя и входным отверстием ячейки для отбора проб (0,09 мл) и объем ячейки для отбора проб (0,16 мл). В этом примере общий объем пустоты составляет 0,4 мл. Внутренние объемы пустот клапанов незначительны по сравнению с объемами пустот трубок, смесителя и ячейки для образцов. Например, используемые селекторные клапаны низкого давления (диаметр отверстия 0,75 мм) содержат приблизительный объем пустот 4 мкл, в то время как селекторные клапаны высокого давления и переключающие клапаны (диаметр отверстия 0,25 мм) содержат приблизительные объемы пустот 0,5 мкл.

После завершения измерения TR-SANS образец выталкивается из ячейки с растворителем, и промывочный растворитель многократно прокачивается через ячейку для удаления остаточного образца и очистки ячейки для образца (рис. 2C). Обратите внимание, что шприцы для полоскания подключаются к большим резервуарам для растворителей (например, для воды и этанола) с помощью селектора значений насоса, чтобы обеспечить наличие достаточных объемов растворителя для очистки ячейки образца между прогонами. Источники растворителей, источники проб и емкости для смешанных образцов, содержащие легковоспламеняющиеся жидкости, размещаются в отдельном корпусе без электрооборудования для устранения всех возможных источников воспламенения. Кроме того, крышки бутылок с паровой блокировкой используются для минимизации легковоспламеняющихся паров и испарения растворителя. Наконец, ячейку для отбора проб сушат потоком газообразного азота для удаления остатков промывочного растворителя (рис. 2D). Давление газообразного азота на входе в селекторный клапан смесителя регулируется примерно до 2 бар (0,2 МПа, манометрическое давление) с помощью ручного регулятора давления, расположенного на баллоне с газообразным азотом. После того, как ячейка для отбора проб достаточно очищена и высушена, вновь смешанный образец вводится в ячейку для образца для следующего цикла измерения (повторяя смешивание и впрыск, показанные на блок-схеме на рисунке 2A).

Figure 2
Рисунок 2: Пример блок-схемы с использованием одной ячейки для образцов, смешивания двух образцов и двух промывочных растворителей для очистки . (A) Смешивание образца A (синий) и образца B (красный), а затем подача смешанного образца (фиолетового) в ячейку для образца. (B) Во время сбора данных - состояние устройства остановки потока, при котором переключающие клапаны ISV и OSV закрыты для изоляции ячейки для отбора проб и предотвращения обратной диффузии пробы во время сбора данных. (C) Этапы очистки, на которых ячейка для отбора проб промывается промывочным растворителем SS1 (зеленый) после сбора данных. (D) Стадия сушки, на которой ячейка для отбора проб осушается газообразным азотом (оранжевый). Сокращения: ПСВ = селекторный клапан насоса; MSV = селекторный клапан смесителя; OSV = выпускной выключательный клапан; ISV = впускной выключательный клапан; SS1 = источник растворителя 1; SSA = источник пробы A; N2 = источник газообразного азота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

На рисунке 3 показаны блок-схемы для несколько иной версии, в которой смесительная установка сконфигурирована с двумя отдельными ячейками для отбора проб, подключенными к одним и тем же переключающим клапанам (рис. 3A). В то время как данные TR-SANS собираются в ячейке образца 1, ячейка образца 2 промывается (рис. 3B) и сушат (рис. 3C). Когда сбор данных для ячейки образца 1 завершен, клапан впускного переключателя направляет вновь смешанный образец в ячейку образца 2 для сбора данных (рис. 3D). В то время как данные TR-SANS собираются в ячейке образца 2, ячейка образца 1 промывается и сушится (рис. 3E). Этот чередующийся, параллельный процесс между двумя ячейками для образцов сводит к минимуму время между последующими инъекциями образца и максимизирует использование времени нейтронного пучка.

Figure 3
Рисунок 3: Пример блок-схемы с использованием ячеек с двумя образцами, смешивания двух образцов и двух промывочных растворителей для очистки. (A) Смешивание образца A (синий) и образца B (красный) и последующее переливание смешанного образца (фиолетового) в ячейку для образца 1. (B) Состояние устройства остановки потока во время сбора данных на ячейке 1 для отбора проб, в то время как ячейка для отбора проб 2 промывается растворителем из SS1 (зеленый). (C) Состояние устройства остановки потока во время сбора данных на ячейке 1 для отбора проб, когда ячейка 2 для отбора проб осушается газообразным азотом (оранжевый). (D) После того, как сбор данных ячейки образца 1 завершен, новый образец (фиолетовый) немедленно смешивается и подается в ячейку образца 2. (E) Состояние устройства остановки потока во время сбора данных на ячейке 2 для отбора проб во время промывки ячейки 1 для отбора проб растворителем из SS1 (зеленый цвет). В то время как одна ячейка образца измеряется, другая ячейка образца очищается и сушится. Процесс измерения остановленного потока чередуется между двумя ячейками для отбора проб, чтобы свести к минимуму время между последующими впрысками для смешивания проб. Сокращения: ПСВ = селекторный клапан насоса; MSV = селекторный клапан смесителя; OSV = выпускной выключательный клапан; ISV = впускной выключательный клапан; SS1 = источник растворителя 1; SSA = источник пробы A; N2 = источник газообразного азота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Ниже описан пошаговый протокол для подключения насосов и трубопроводов насосно-компрессорных труб, заливки системы, промывки и сушки ячейки для отбора проб и впрыска смешанного образца. Несмотря на то, что конфигурация с одной ячейкой продемонстрирована для простоты (рис. 2), гибкая модульная установка, протокол и сценарии могут быть легко изменены для реализации большего количества шприцевых насосов, клапанов, смесителей или конфигураций ячеек для образцов, таких как конфигурация ячеек с двумя образцами, показанная на рисунке 3. Репрезентативные данные о скорости подсчета необработанных нейтронов, собранные во время циклов впрыска смешивания и очистки, показаны на рисунке 4, в то время как кинетика липидного обмена, измеренная при 3 различных температурах, и извлеченная нормализованная интенсивность рассеяния, соответствующая доле обмененных липидов, показаны на рисунке 5 и рисунке 6 соответственно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Настройте и запустите систему остановки потока.

  1. Включите все источники питания насоса и динамические смесители с помощью выключателя питания.
  2. Инициируйте все насосы и клапаны в графическом пользовательском интерфейсе (GUI) управления системой с остановленным потоком, введя путь конфигурации устройства и используя команды bus=qmixbus. Bus(), bus.open(), bus.start(), pump=qmixpump. Pump(), pump.enable() и valve=ViciMultiposSelector() (см. пример кода инициации, доступный в онлайн-репозитории с открытым исходным кодом64).
  3. Откалибруйте насосы перед подключением шприцев с помощью команды pump.calibrate().
  4. Убедитесь, что клапаны инициированы, и перейдите к правильному порту селектора по команде с помощью команд valve.setPort() и valve.getPort().
  5. Назначьте тип шприца, который будет использоваться для каждого насоса, используя команду pump.set_syringe_param(A , B)), где A — внутренний диаметр цилиндра шприца (мм), а B — максимальное расстояние хода шприца (мм).
  6. Подсоедините шприцы для образцов к шприцевым насосам.
    1. Убедившись, что насосы откалиброваны, прикрутите чистые цилиндры шприца к патрубку в верхней части насоса (головка крепления шприца).
    2. При использовании стеклянных шприцев перед дозированием объема наполнения убедитесь, что головка крепления шприца ослаблена, чтобы стеклянный шприц не разбился из-за чрезмерного усилия поршня шприца.
    3. Вкрутите поршень шприца в штуцер в нижней части насоса (хвост крепления шприца).
    4. После того, как цилиндр шприца и поршень шприца соединены с насосом, дозируйте объем наполнения шприца с помощью команды pump.empty(), которая перемещает поршень шприца в верхнюю часть ствола шприца.
    5. При использовании стеклянных шприцев затяните головку крепления шприца после прекращения движения поршня.
  7. Подсоедините трубку к источникам образцов и растворителей, шприцам, клапанам, смесителям, ячейкам для образцов и контейнеру для смешанных образцов.
    1. Подсоедините трубку шприцевого насоса к клапанам селектора насоса.
    2. Подсоедините трубку клапана селектора насоса к источникам проб.
    3. Подсоедините трубку селекторного клапана насоса к источникам промывочного растворителя.
    4. Подсоедините трубку селекторного клапана насоса к трубке селекторного клапана смесителя.
    5. Подсоедините трубку клапана селектора смесителя к источнику газообразного азота.
    6. Подсоедините трубку селекторного клапана смесителя к входным отверстиям смесителя.
    7. Подсоедините выходное отверстие смесителя к впускному клапану.
    8. Подсоедините клапан впускного переключателя к входному отверстию пробоотборника.
    9. Подсоедините выходное отверстие ячейки для отбора проб к выходному клапану.
    10. Подсоедините выпускной выключатель клапана к контейнеру для смешанных образцов.
  8. Определите все соединения трубок и клапанов (этап 1.7) в графическом интерфейсе управления системой остановленного потока, введя соответствующие номера портов, подключенные к каждому клапану (см. пример кода управления в онлайн-репозитории64 с открытым исходным кодом).
  9. Рассчитайте объем пустот трубки между входом смесителя и выходом ячейки для отбора проб, который определяет минимальное количество пробы, необходимое для заполнения ячейки для отбора проб для каждого измерения.

2. Загрузите образец.

  1. Установите желаемый объем заполнения образца и объем заполнения растворителем в графическом интерфейсе управления системой остановленного потока, введя желаемые числа (см. пример управляющего кода в онлайн-репозитории с открытым исходным кодом64).
  2. Используйте команду pump.aspirate () для втягивания (аспирации) желаемых объемов образца и растворителя из их источников в шприцы для образцов через селекторные клапаны насоса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При первой загрузке пустого шприца в верхней части шприца будет присутствовать воздух, который необходимо продуть, чтобы заполнить систему образцом и растворителем на шаге 3.

3. Подготовьте систему.

  1. Используйте команду pump.dispense(), чтобы вытолкнуть (выдать) весь воздух из шприцев, трубопроводов и клапанов. Убедитесь, что из каждого шприца выливается достаточный объем жидкости, чтобы полностью удалить весь воздух из шприцев, трубок и клапанов. Если внутри какой-либо трубки видны пузырьки воздуха, продолжайте дозировать растворитель или образец до тех пор, пока пузырьки не будут удалены.
  2. После того, как воздух будет очищен от системы, выполните по крайней мере одну процедуру впрыска и промывки образца (без сбора данных о рассеянии нейтронов).
    1. Щелкните, чтобы выбрать ячейку с надписью Начать эксперимент по смешиванию в графическом интерфейсе элемента управления.
    2. Когда эта ячейка активно выбрана, нажмите кнопку «Выполнить » (правый треугольник), расположенную в верхней части графического интерфейса управления, или одновременно нажмите клавиши Shift и Enter на клавиатуре.
    3. Визуально осмотрите ячейку для образца, чтобы убедиться, что пузырьки воздуха отсутствуют.
      1. Если пузырьки воздуха присутствуют, повторите шаги протокола 3.1 и 3.2 для дальнейшей очистки трубопроводов от воздуха.
      2. Если пузырьки воздуха отсутствуют в ячейке образца, перейдите к шагу 4, чтобы определить оставшиеся шаги протокола эксперимента.

4. Определите протокол смешивания с остановленным потоком в программном сценарии (см. пример кода в онлайн-репозитории с открытым исходным кодом64).

  1. Введите заданное значение температуры программируемого блока кондиционирования воздуха (AC), который контролирует температуру изолированного корпуса, окружающего устройство остановки потока.
    1. Удерживая кнопку со звездочкой на блоке управления переменным током, нажимайте стрелки вверх и вниз , чтобы изменить заданную температуру. Кроме того, введите желаемое заданное значение температуры в графическом интерфейсе управления и нажмите «Выполнить».
    2. Подождите 15-30 минут, чтобы внутренняя часть корпуса уравновесилась при желаемой температуре, прежде чем начинать кинетические эксперименты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Доступный диапазон температур в настоящее время составляет от 10 ° C до 50 ° C, а стабильность температуры составляет ± 1 ° C.
  2. Введите все этапы последовательности промывки, введя соответствующие объемы, скорости потока, время и количество повторений в графическом интерфейсе управления.
    1. Определите объем каждой впрыскиваемой пробы, который определяет общий расход (Q).
    2. Определите объем каждого растворителя, который будет вводиться во время процедуры промывки.
    3. Определите время сушки между каждым подэтапом промывки (tсушки).
    4. Определите количество подэтапов полоскания.
    5. Определите различные растворители для последующих этапов ополаскивания.
    6. Определите количество повторений полоскания, которые необходимо выполнять после каждого измерения (nполосканий).
    7. Определите время полного высыхания ячейки для отбора проб и смесителя, обеспечив чистую ячейку для последующего впрыска образца (tdry_final).
  3. Определите все этапы последовательности впрыска пробы, введя соответствующие объемы, скорости потока и время в графическом интерфейсе управления системой остановки потока.
    1. Определите объем каждой впрыскиваемой пробы и скорость потока.
    2. Рассчитайте время задержки (задержку t) по объему пустоты (V пустоты) и общему расходу (tзадержки = Vпустоты/Q).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время задержки - это время, необходимое для заполнения ячейки образца смешанным образцом.
    3. Определите желаемое время сбора данных TR-SANS таким образом, чтобы произошел весь интересующий кинетический процесс (tscatt).
    4. Установите время ожидания между окончанием эксперимента по рассеянию и началом циклов полоскания (tожидания).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это время ожидания должно составлять не менее 100 с, если необходимо измерить нейтронное пропускание образца до того, как он будет вымыт из ячейки. Передача образца необходима во время обработки данных, чтобы уменьшить данные до абсолютной интенсивности.
    5. Определите количество циклов впрыска, которые необходимо выполнить с последовательностями промывки, выполняемыми между каждым впрыском, которые определены на шаге 4.2 (nциклов).
  4. Рассчитайте общее время одного цикла сбора данных с остановленным потоком (t-цикл), используя уравнение (1).
    Цикл t = n ×полоскания (t задержка + tсушка) + tdry_final + tзадержка + tscatt (1)
    где n полосканий = количество повторенийполоскания (этап 4.2.6); tзадержка = время задержки устройства остановки потока (этап 4.3.2); tсушка = время высыхания между каждым подэтапом промывки (этап 4.2.3); tdry_final = время полного высыхания ячейки для отбора проб и смесителя (этап 4.2.7); tscatt = желаемое время сбора данных TR-SANS (этап 4.3.3)

5. Определите параметры малоуглового рассеяния нейтронов в графическом интерфейсе управления прибором SANS.

  1. Определите шкалы длины и интересующий q-диапазон для каждого образца.
  2. Определите конфигурацию прибора так, чтобы охватить желаемый диапазон добротности, максимизируя при этом поток нейтронов в образце.
  3. Установите общее время сбора данных VSANS в графическом интерфейсе управления прибором SANS на расчетное время цикла на шаге 4.4 (время сбора данных о рассеянии нейтронов= цикл t).
  4. Установите время измерения передачи образца равным 100 с в графическом интерфейсе управления прибором SANS.
  5. Используя графический интерфейс управления прибором SANS, включите сбор данных в режиме событий, введя GenerateEventModeData true в командной строке.

6. Соберите стандартные измерения рассеяния для уменьшения данных перед началом эксперимента с остановленным потоком для обработки данных TR-SANS.

  1. Измерьте фоновое рассеяние.
    1. Убедитесь, что шторка местного прибора закрыта.
    2. Прикрепите образец заблокированного луча к задней части отверстия образца, закрепите местную среду прибора и откройте затвор местного прибора.
    3. Определите время сбора данных о рассеянии заблокированного луча в программном обеспечении и соберите данные о рассеянии заблокированного луча, считая за ту же продолжительность, что и самое длинное время сбора данных о рассеянии (tscatt).
    4. После завершения сбора данных закройте затвор прибора и извлеките заблокированный образец луча из апертуры образца.
  2. Измерьте рассеяние пустых ячеек.
    1. Убедитесь, что ячейка образца была тщательно промыта и высушена.
    2. Откройте локальный затвор прибора.
    3. Соберите измерение пропускания пустой ячейки за 100 с.
    4. Соберите измерение рассеяния пустых ячеек, подсчитывая по крайней мере самое длинное время сбора (tscatt).

7. Начните эксперимент с остановленным потоком.

  1. Запустите сбор данных рассеяния VSANS в режиме событий .
    1. Убедитесь, что локальная область прибора надежно закреплена, а затем откройте шторку местного приборного луча.
    2. Начните сбор данных SANS с помощью программного обеспечения для управления прибором SANS на компьютере прибора, перетащив нужные прогоны в очередь приборов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться, что измерены самые ранние моменты времени, начните сбор данных перед началом эксперимента по смешиванию с остановленным потоком. Данные будут подвергнуты последующей обработке на более позднем этапе, чтобы учесть время задержки (tзадержки).
  2. Запустите эксперимент по смешиванию с остановленным потоком в графическом интерфейсе управления.
    1. Выберите ячейку записной книжки с надписью " Начать эксперимент по смешиванию " в графическом интерфейсе управления системой останового потока.
    2. При активном выделении этой ячейки нажмите на кнопку «Выполнить » (правый треугольник), расположенную в верхней части программы управления устройством остановившегося потока, или одновременно нажмите клавиши Shift и Enter на клавиатуре.
    3. Убедитесь, что протокол смешивания с остановленным потоком, определенный в разделе 4, начал работать.
    4. Добавьте измерение передачи 100 с в очередь приборов VSANS после запуска рассеяния с помощью графического интерфейса управления прибором SANS.
    5. Добавьте один цикл измерения рассеяния и один цикл измерения передачи в очередь приборов для каждого оставшегося цикла смешивания с остановленным потоком (nциклов - 1, шаг 4.3.5) в графическом интерфейсе управления прибором SANS.

8. Обработайте и сократите данные, чтобы удалить все фоны, исправить чувствительность детектора и скорректировать передачу образца.

  1. Загрузите файлы данных рассеяния и связанные с ними файлы событий с сервера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После каждого измерения VSANS будут генерироваться отдельные файлы событий детектора, по одному файлу событий для каждой активной каретки детектора (например, переднего, среднего и/или заднего детектора).
  2. Поместите данные рассеяния в нужные временные ячейки с помощью команды events=Rebin(filename), за которой следует команда e vents.do_rebinning(timebins), в которой входное имя файла соответствует имени нужного файла данных SANS, аtimebins представляет собой список желаемых границ временного интервала в секундах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если входные временные ячейки введены в виде одного числа, а не списка, то данные будут объединены в N ячеек с равной шириной времени, где N - входные временные ячейки (см. программные сценарии, предоставляемые лучевой линией и доступным онлайн-репозиторием с открытым исходным кодом64).
  3. Уменьшите количество бинированных данных рассеяния с помощью программного обеспечения, поставляемого с линиейлуча 65.

9. Проанализируйте данные TR-SANS.

  1. Рассчитайте интересующее время процесса(процесс t) из времени измерения, используя уравнение (2).
    Процесс t = ti - tостановка + tзадержка (2)
    Где ti — ячейки времени измерения, начинающиеся после остановки потока, tstop — время измерения сразу после остановки потока,а t задержка — время задержки.
  2. Постройте график q-зависимой интенсивности I(q) в зависимости от времени процесса, используя временные ячейки, определенные на шаге 8.2, иt-процесс, рассчитанный на шаге 9.1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Самое раннее доступное время процесса ограниченозадержкой t. Чтобы измерить более ранние моменты времени процесса, увеличьте общий расход (Q) или уменьшите общий объем пустот (Vпустоты).
  3. Извлеките интересующие кинетические параметры из изменения I(q) в зависимости от времени процесса.

10. Завершите эксперимент.

  1. Выключите пучок нейтронов, закрыв локальный затвор прибора.
  2. Выполните радиационную проверку с помощью радиационного монитора, предусмотренного линией луча, прежде чем отсоединять какие-либо детали, трубки или выгружать какие-либо образцы или контейнеры для смешанных образцов.
  3. Передайте шприцы, трубки и контейнер для смешанных образцов в отдел физики здоровья.
  4. Заполните формы по физике здоровья и дождитесь оценки персоналом по физике здоровья.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Репрезентативные нейтронные данные, показанные здесь, измеряют кинетику липидного обмена в присутствии метил-β-циклодекстрина (mβCD), добавки, катализирующей липидный обмен между везикулами со скоростью обмена (ke)66,67. Предыдущие флуоресцентные исследования показали, чтоke зависит от концентрации mβCD, а период полураспада обменного процесса составляет порядка68 минут. В настоящих экспериментах используется TR-SANS с остановленным потоком для измерения катализируемого mβCD липидного обмена между везикулами на секундной шкале времени. Были получены две изотопно различные популяции липидных везикул; одна популяция везикул была получена с помощью хвостовых гидрогенизированных липидов димиристоилфосфатидилхолина (DMPC) (H-липидные везикулы на рисунке 5), а другая популяция везикул была получена с помощью хвостовых дейтерированных липидов DMPC (DMPC-d54) (D-липидные везикулы на рисунке 5). Молярную долю 0,05 (5 мол%) заряженного липида димиризотилфосфатидилглиеркола (DMPG) добавляли к сухим липидным порошкам DMPC и DMPC-d54 для стимулирования образования однослойных везикул69.

Отдельные растворы H-везикул и D-везикул получали гидратацией соответствующих липидных пленок в растворителе, содержащем 45% объемной тяжелой воды (D2 O) и 55% объемной воды (H2O). Состав растворителя D 2 O / H2O был рассчитан таким образом, чтобы плотность длины рассеяния нейтронов (ρ) растворителя соответствовала случайной смеси H-липидов и D-липидов (Δρ = ρлипид- ρрастворитель = 0). Другими словами, случайно смешанная H/D-везикула будет «невидимой» для нейтронов и будет генерировать нулевое когерентное рассеяние нейтронов. Растворы однослойных везикул получали путем замораживания-размораживания растворов пять раз, а затем экструдирования отдельных растворов через поликарбонатный фильтр с порами диаметром 100 нм. Растворы везикул экструдировали взад и вперед между двумя шприцами и фильтром в общей сложности 31 раз при 30 ° C. Впоследствии к растворам везикул добавляли небольшой объем концентрированного исходного раствора mβCD, приготовленного в той жесмеси растворителей D 2 O / H2O. Конечная концентрация липидов составляла 14 ммоль/л (мМ), а концентрация mβCD составляла 30 мМ. Отдельные растворы везикул уравновешивали в течение, по меньшей мере, 30 мин с добавленным mβCD, прежде чем растворы загружали в шприцы для образцов в смесительном устройстве с остановленным потоком.

Пример измеренных скоростей счета нейтронов за несколько циклов инжекции показан на рисунке 4A. Каждый цикл состоял из 9 этапов промывки, 1 этапа сушки и 1 этапа впрыска образца. Для ясности представлены только скорости счета, измеренные на средней каретке детектора в приборе VSANS. Аналогичные тенденции были обнаружены на каретке переднего детектора, которая соответствовала данным, собранным при больших углах рассеяния или более высоких значениях q. Скорость подсчета увеличивалась с каждым впрыском промывочного растворителя (растворитель S1 и растворитель S2) и возвращалась к базовым показателям пустой ячейки, когда растворитель выталкивался из ячейки газообразным азотом и сушился. Окончательную промывку клетки проводили S2, который в данном примере представлял собой этанол, и клетку в последний раз сушили газообразным азотом в течение 3 мин перед впрыском образца. Вскоре после того, как образец был введен в клетку, скорость подсчета нейтронов резко возросла, и данные собирались непрерывно в течение 5 минут. Репрезентативная выборка, введенная в данные примера на рисунке 4A , представляла собой фон солевого буфера. Флуктуации измеренной интенсивности во времени отражают изменения скорости фонового счета нейтронов и не отражают изменения среднего состава образца. Полный цикл промывки, сушки, смешивания и впрыска образца повторялся дополнительное время в примере на рисунке 4А, где каждый цикл длился в общей сложности 15 минут.

Отдельные H-меченые и D-меченые растворы липидных везикул смешивали в момент tсмешивания и сразу же вливали в клетку-образец. Измеренная скорость подсчета нейтронов резко возросла, а затем достигла максимального значения, когда ячейка образца была заполнена призаполнении t, как показано на рисунке 4B. Время, затраченное на заполнение ячейки образца, называется временем задержки t и определяется как tзадержка = tfill-t смесь. Если объем пустот (Vпустоты) между смесителем и ячейкой для отбора проб известен, а общий расход (Q) известен, тозадержку t также можно рассчитать какзадержку t =пустоту V / Q (см. этап протокола 4.3.2), которая также является средним временем пребывания образца жидкости для входа в смеситель и выхода из ячейки для пробы. После достиженияt-заполнения поток продолжали с постоянной скоростью потока, чтобы убедиться, что ячейка заполнилась и достигла устойчивого состояния. Затем поток был немедленно остановлен наt остановке. Усредненная скорость счета нейтронов оставалась постоянной в зависимости от времени измерения междузаполнением t иостановкой t, поскольку скорость потока через ячейку образца была постоянной, и, следовательно, образец на пути пучка нейтронов находился в установившемся состоянии. Другими словами, данные, измеренные наt остановке, соответствуют образцу, который был смешан и эволюционировал сзадержкой t = tfill-t mix = Vvoid/Q. Бинированные измерения времени t i, собранные сразу послеостановки t, являются основными кинетическими данными, представляющими интерес.

На рисунке 4C количество нейтронов из образца смешанных липидных везикул при трех различных температурах построено как функция скорректированной шкалы времени процесса (t-процесс), которая представляет собой интересующее время процесса, которое было скорректировано для стационарного периода потока и времени задержки. Шкала времени процесса была рассчитана по формуле t процесса = t i- t остановка + tзадержка или, что эквивалентно, tпроцесс = ti- t остановка + t заполнение смеси. Данные SANS собирались непрерывно на рисунке 4 в так называемом режиме событий. При сборе данных в режиме событий каждое обнаруженное нейтронное событие записывается с уникальной отметкой времени и его расположением по осям x и y на двумерном нейтронном детекторе. Затем данные в режиме событий обрабатываются в желаемые временные ячейки (ti) на рисунке 4B.

Данные о режиме событий в пределах доступного временного окна процесса, представляющего интерес (т.е. рассеяние нейтронов, собранное на каждомti после остановки t на рисунке 4B), были реконструированы в двумерное (2D) изображение детектора для этого временного интервала с использованием протоколов и сценариев, доступных в онлайн-репозитории с открытым исходным кодом64. Затем каждое изображение 2D-детектора обрабатывалось с использованием процедур сокращения данных для вычитания различных источников фона, коррекции передачи образца и эффективности детектора и азимутальной интеграции данных 2D-детектора в графики интенсивности (I) и вектора рассеяния (q)65. Данные на рисунке 5 были объединены в равные (3 с) временные ячейки и являются репрезентативными для информации, зависящей от времени и длины, которая может быть получена из измерения TR-SANS. Подобно общей скорости необработанного счета, показанной на рисунке 4B, q-зависимая интенсивность I (q) уменьшается во времени по мере того, как липиды во внешней створке обмениваются и случайным образом смешиваются между различными везикулами.

На рисунке 5 представлены данные по кинетике липидного обмена, измеренной при 3 различных температурах. На каждом графике показаны данные, собранные в течение первых 110 минут после смешивания. Измеренная интенсивность уменьшается на порядок при самых низких значениях добротности при 36 °C и 30 °C, которые соответствуют липидной жидкой фазе. Между тем, данные о рассеянной интенсивности изменяются значительно медленнее со временем при 20 ° C, что указывает на то, что кинетика обмена внешними листочками намного медленнее в фазе липидного геля.

Измеренная интенсивность рассеяния, I(q), связана с контрастом SLD как Equation 1, где Δρ - разность SLD между везикулой и окружающим растворителем. Этот средний контраст SLD напрямую связан с относительным количеством H-липидов и D-липидов в везикуле в любой момент времени. Таким образом, измеренная интенсивность рассеяния в данный момент времени может быть нормализована для определения доли липидной популяции, которая обменялась. Эта нормализация достигается путем сбора двух дополнительных измерений, в том числе: (1) измеренная интенсивность I (0) в момент времени t = 0, когда нет липидного обмена между везикулами, и (2) измеренная интенсивность I (∞) в момент времени t = ∞, когда все липиды обменялись и популяции уравновесились. Нормализованная скорость счета, 42, Equation 2 показана как функция времени процесса для различных температур на рисунке 6. В этом примере I(t) представляет собой q-интегрированную интенсивность во время процесса t (интенсивность, вычитаемую фоном, интегрированную в зависимости от q), I(∞) представляет собой q-интегрированную интенсивность в бесконечное время после того, как все липиды обменялись (что должно быть аналогично фоновому рассеянию растворителя), а I(0) является q-интегрированным интенсивность в момент времени t = 0 (без липидного обмена). I(0) измеряли для смешанного образца при температуре фазового перехода ниже 20°С, где обмен был медленным, а I(∞) измеряли в отдельном образце, который уравновешивался более 36 ч при 40°С и имел и полностью обменивался Н-липидами и D-липидами.

Нормализованная скорость счета должна варьироваться от R(t) = 1 во время процесса t = 0 до R(t) = 0 при t = ∞ и напрямую связана с контрастом SLD в образце и, следовательно, степенью липидного обмена 27,28,29,30,31,32,33,34,35 . Обратите внимание, что самые ранние измеренные данные R(t) не начинаются с R(t)=1 при 30 °C и 36 °C, что указывает на то, что значительный объем липидного обмена происходил в течение первых 3 с после смешивания, что было экспериментально недоступно из-за времени задержки (tзадержки = 2,4 с) используемого протокола смешивания с остановленным потоком. Между тем, измеренный R(t) при 20 °C оставался приблизительно постоянным в течение первых (2-3) минут. Для кинетики липидного обмена, измеренной при 30 ° C и 36 ° C, R (t) быстро распадался до ≈0,5 в течение 100 с, что позволяет предположить, что липиды внешнего листка полностью менялись и уравновешивались в течение нескольких минут. Соответственно, захват липидного обмена, катализируемого mβCD, стал возможен с помощью SANS с остановившимся потоком, и его было бы трудно захватить при ручном смешивании пипетками. Для улавливания еще более ранних моментов времени процесса (t < 3 с) потребуется смеситель другого типа с меньшим объемом пустот, меньшими объемами пустот труб и более высокими общими расходами для уменьшения времени задержки.

R(t) продолжал распадаться в более длительные периоды времени, поскольку липиды переворачиваются между внутренним и внешним листочками. Данные TR-SANS для более медленного процесса триггера (t > 5 мин) могут быть собраны с помощью дискретных образцов, смешанных вручную, и загружены в стандартные ячейки для образцов SANS, так как ручной метод смешивания пипетками занимает около 5 минут. Аналогичным образом, липидный обмен при 20 °C в фазе липидного геля был достаточно медленным, чтобы его можно было смешивать и измерять дискретно, и это измерение не обязательно нужно было изучать с помощью метода смешивания с остановленным потоком. Измерения кинетических процессов в масштабах времени от нескольких минут до нескольких часов более эффективны, когда образцы смешиваются с помощью ручного пипеточного смешивания. Однако кинетические процессы в масштабах времени менее нескольких минут потребуют этой процедуры смешивания с остановленным потоком и измерения TR-SANS.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативные данные о скорости подсчета необработанных нейтронов, собранные во время циклов впрыска смешивания и очистки . (A) Пример скорости счета нейтронов (средний детектор) в зависимости от времени во время повторных последовательностей промывки, последовательности сушки и последовательности впрыска смешанных образцов в течение нескольких циклов. Образец в (А) представлял собой солевой буферный фон, и изменения интенсивности с течением времени отражают изменения скорости фонового счета, а не изменения в образце. (B) Нормализованная монитором скорость подсчета нейтронов в зависимости от времени эксперимента после инъекции смешанных Н-липидных и D-липидных везикул при 30 °C. Вертикальные пунктирные линии указывают время начала смешивания (tmix), время заполнения (tfill), время остановки потока (tstop) и область биннинга времени (ti). Снижение скорости счета послеостановки t связано с потерей контраста в образце по мере липидного обмена между везикулами. (C) Мониторинг нормализованных скоростей подсчета нейтронов в зависимости от времени процесса обмена в течение первых 100 с эксперимента при (синей) 20 °C, (зеленой) 30 °C и (красной) 36 °C. Данные в режиме событий обрабатываются в ячейки по 1 с. Сокращения: S1 = растворитель 1; S2 = растворитель 2; tmix = время эксперимента, в течение которого смешиваются растворы образцов; tзаполнение = время эксперимента, в течение которого ячейка образца заполняется; tstop = время эксперимента, при котором поток останавливается; tпроцесс = расчетное время интересующего кинетического процесса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Иллюстрация катализируемого обмена наружного слоя липидных везикул и соответствующих изменений интенсивности рассеяния (I) в зависимости от вектора рассеяния (q) при различных температурах. Схема, показывающая липидный обмен между Н-липидными и D-липидными везикулами после (А) начального смешивания при t = 0 и (В) обмена наружного слоя, катализируемого метил-β-циклодекстрином (mβCD). Приведенная интенсивность рассеяния нейтронов в зависимости от вектора волны рассеяния q. Эксперименты по смешиванию с остановленным потоком и измерения VSANS были повторены при (C) 36 °C, (D) 30 °C и (E) 20 °C. Представленные данные были объединены в интервалы 3 с в течение первых 10 минут после смешивания при каждой указанной температуре. Полосы погрешностей представляют собой распространенную неопределенность из статистики подсчета и представляют собой одно стандартное отклонение. Сокращения: ke = константа скорости межвезикулярного липидного обмена; mβCD = метил-β-циклодекстрин; kf = константа скорости липидного обмена между листками, также называемая липидным триггером; l(q) = измеренная интенсивность SANS в единицах см-1 ; q = вектор рассеяния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Нормализованная интенсивность рассеяния, соответствующая доле обмененных липидов, которая может быть смоделирована для извлечения констант скорости для интересующих кинетических процессов . (A) Липидный обмен между наружными створками везикул, происходящий в масштабах времени от 3 с до 600 с, измеренный при (синей) 20°С, (черной) 30°С и (красной) 36°С. Вставка на рисунке увеличивает первые 60 с кинетического процесса. Полосы погрешностей представляют собой распространенную неопределенность из численного интегрирования интенсивностей рассеяния и представляют собой одно стандартное отклонение. Сокращения: R(t) = нормализованная рассеянная интенсивность; tпроцесс = скорректированное время процесса, представляющее интерес. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Текущая процедура описывает смесительное устройство и шаги для выполнения измерений TR-SANS с остановленным потоком. Устройство и протокол оптимизированы для образцов жидкостей с низкой вязкостью, где интересующие временные масштабы составляют от ≈1 с до 5 минут. Для временных масштабов, превышающих 5 минут, ручное смешивание образцов и загрузка их в стандартные ячейки рассеяния может быть проще и желательно, особенно для образцов с высокой вязкостью, гелей или паст. Для доступа к временным шкалам менее 1 с требуется другое смесительное устройство, меньшие общие объемы пустот и более высокие общие скорости потока для снижения времени задержки. Также важно отметить, что изучение кинетических процессов в этих коротких временных масштабах, вероятно, потребует повторных инъекций образцов для накопления достаточной статистики подсчета рассеяния в миллисекундном масштабе времени с помощью TR-SANS. Если общий объем образца ограничен, может быть желательно использовать метод с более высоким потоком, такой как рассеяние света или рассеяние рентгеновских лучей, который требует меньшего количества инъекций образца или меньшего объема образца на инъекцию, предполагая, что существует достаточный контраст рассеяния света или рентгеновского излучения.

Этот модульный подход SANS с остановленным потоком создает несколько ключевых преимуществ и недостатков по сравнению с коммерчески доступными приборами для остановки потока, которые были оптимизированы для экспериментов по рассеянию нейтронов. Основные преимущества включают (1) чередование измерений TR-SANS между различными ячейками для образцов в периоды промывки для максимального использования времени пучка нейтронов, (2) адаптацию количества шприцев, объемов шприцев и типов смесителей для тройного смешивания образцов или других более сложных требований к смешиванию образцов, и (3) обеспечение более длительных периодов измерения за счет изоляции ячейки образца и устранения обратной диффузии в более длительных временных масштабах (>10 мин). Несмотря на то, что модульность конструкции смесительной ячейки здесь не реализована, она также позволяет осуществлять одновременный сбор данных с помощью нескольких методов измерения, таких как расчесывание SANS, УФ-Vis и флуоресцентные измерения70. Два основных недостатка этой модульной установки включают (1) относительно более длительное время задержки смешивания (от 1 до 3 с) по сравнению с другими системами, которые могут обеспечить время задержки от 1 мс до 100 мс, и (2) меньший диапазон рабочих температур (от 10 °C до 50 °C) по сравнению с другими доступными системами, которые могут получать доступ к рабочим температурам от -20 °C до более 80 °C.

Сбор предварительных данных SANS по интересующим образцам перед проведением экспериментов по смешиванию in situ важен для сбора наилучших данных TR-SANS, особенно в экспериментах, предназначенных для мониторинга кинетики молекулярного обмена, таких как пример, представленный здесь. Определение точных значений I(0) и I(∞) имеет решающее значение для расчета точных значений нормированной интенсивности R(t), которая моделируется для извлечения желаемых кинетических параметров. Значение I(0) может быть непосредственно рассчитано на основе измеренных интенсивностей рассеяния отдельных запасов H-везикулы и D-везикулы, и I(∞) может быть определено путем приготовления отдельного образца везикулы, приготовленного из смеси 50/50 H-липидов/D-липидов. Данные о рассеянии из этих контрольных образцов также могут быть использованы для определения оптимального диапазона добротности и конфигурации прибора SANS для измерения TR-SANS для максимизации сигнала и проверки прогрессии кинетики обмена во время экспериментов TR-SANS. Если измеренная интенсивность в первый момент времени после смешивания не равна расчетному I(0), то для охвата всех интересующих процессов может потребоваться более быстрое время перемешивания. Как только измеренная интенсивность достигает I (∞), процесс обмена завершается, и клетка может быть опорожнена и очищена для подготовки к следующей инъекции.

Для успешного смешивания жидкого образца для TR-SANS очень важно убедиться, что все шприцы, клапаны и трубопроводы для трубок заправлены и не содержат воздуха, а все соединения трубок надежно закреплены для предотвращения утечки. Неправильное выполнение этих критических шагов может привести к неточным объемам смешивания или неточным абсолютным интенсивностям рассеяния. Например, пузырьки воздуха, попавшие в ячейку образца, уменьшат измеренную интенсивность SANS из-за уменьшения объема образца на пути нейтронного пучка. Кроме того, пузырьки воздуха могут создавать «полосы» или «вспышки» высокой интенсивности на детекторе из-за преломления луча на границе раздела воздух-жидкость. Неожиданные изменения измеренной интенсивности рассеяния с течением времени могут указывать на плохое перемешивание образца, утечку клапана, пузырьки воздуха в ячейке образца или обратную диффузию образца.

Сбор данных о передаче для каждого образца во время эксперимента TR-SANS имеет решающее значение для снижения собранных данных до абсолютной интенсивности. Возможен одновременный сбор данных рассеяния и передачи на некоторых приборах SANS, что упрощает общее программирование сбора данных TR-SANS; однако это возможно не для всех инструментов, включая инструмент VSANS, используемый в этом протоколе. Поскольку для измерения пропускания и рассеяния образца требовались различные конфигурации прибора, измерения пропускания собирались в конце измерений рассеяния (этап протокола 7.2.4), чтобы гарантировать, что данные о рассеянии были измерены в самые ранние моменты времени после того, как образец был введен в ячейку. Пропускание зависит только от общего элементного состава, длины пути образца и длины волны нейтронов. Следовательно, передача не должна изменяться, если общий элементный состав остается постоянным на протяжении всего эксперимента с временным разрешением. Большие различия в значениях пропускания между повторными прогонами одного и того же образца указывают на проблему, связанную либо с непоследовательным смешиванием объемов образца, либо с неполным заполнением ячейки образца, либо с пузырьками воздуха, либо с утечкой клапана и обратным потоком образца во время эксперимента.

Уникальным преимуществом TR-SANS является то, что измеренная интенсивность зависит от вектора рассеяния (q) и может быть использована для исследования пространственных изменений на наноуровне. В сочетании с устройством смешивания с остановленным потоком TR-SANS может исследовать эти наноразмерные изменения в интервалах времени от секунды до минуты, обеспечивая понимание самосборки и обмена поверхностно-активных веществ и липидов, агрегации полимеров и белков при добавлении наполнителя, роста и распада наночастиц или обмена инкапсулированными продуктами в эмульсиях. Устройство с остановкой потока может быть сконфигурировано с несколькими шприцевыми насосами и шприцами для отбора проб для облегчения смешивания двух или более жидких образцов. Эта гибкость позволяет систематически исследовать добавки по интересующей кинетике. Например, различные объемы концентрированного раствора антимикробного пептида можно смешивать с растворами H-везикул и D-везикул для изучения влияния концентрации пептидов на кинетику липидного обмена45,46. Кроме того, поскольку все герметичные пути жидкости заключены в корпус с регулируемой температурой, который включает в себя шприцы для отбора проб, клапаны, смесители и трубки, температура системы может быть изменена для извлечения термодинамических параметров, связанных с интересующими кинетическими процессами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.

Acknowledgments

Доступ к NG3 VSANS был предоставлен Центром рассеяния нейтронов высокого разрешения, партнерством между Национальным институтом стандартов и технологий и Национальным научным фондом в соответствии с соглашением No DMR-2010792. M.H.L.N выражает признательность за финансирование, предоставленное компанией Mitacs Globalink (Канада). Идентификация любых коммерческих продуктов или торговых наименований призвана способствовать пониманию и не подразумевает одобрения или рекомендации со стороны Национального института стандартов и технологий.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynamic mixer Analytical Scientific Instruments 462-0150A Magnetically coupled rotor, binary dynamic mixer assembly (ternary type available), 0.15 mL dead volume (larger dead volume available)
Fluoropolymer tubing IDEX Health & Science 1507L PFA Tubing Natural 1/16 inch OD x 0.040 inch ID x 50 ft
Fluoropolymer 1/4-28 flangeless fittings IDEX Health & Science XP-245 PFA flangeless fitting with ferrules, 1/4-28 threading, 1/16 inch OD tubing
Glass syringes Hamilton Company 81660 Hamilton 1000 series syringes, 10 mL (81660), model 1010 C syr, 1/4"-28 thread termination, other volumes available
High-pressure flow selector valves Vici Valco C85X-1570EUTB Vici 10 position selector valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure switch valves Vici Valco C82X-1574EUHB Vici 4 port switch valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure syringes Cetoni A2019000358 3 mL stainless steel syringe, 510 bar max, 21 mL/min flow rate max
Low-pressure flow selector valves Vici Valco C25-3180EUHB Vici 10 position selector valves, max 250 psi liquid, 0.75 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 1/4-28 threaded ports, USB universal actuator
neMESYS high-pressure syringe pumps Cetoni A3921000103 Max force 2600 N
neMESYS mid-pressure syringe pumps Cetoni A3921000131 Max force 1000 N
Power supply Cetoni A3921000127 Base 600, supplies power for up to 4 high pressure pumps
Quartz flow-through sample cell Starna Scientific 3-2.30-Q-1/TC Quartz micro flow cells, 2 mm path length (1 mm available), 2 mm by 2 mm by 30 mm internal dimension
Quartz windows Technical Glass Products NA GE 124 Clear fused quartz ground and polished plates, 11.75 inch by 23.75 inch by 0.375 inch thick
Stainless steel 10-32 coned compression fittings IDEX Health & Science U-321X, U-320X 316 stainless steel ferrule (U-321X) and nut (U-320X) -Valco type, 10-32 coned, for 1/16 inch OD stainless steel tubing
Stainless steel tubing IDEX Health & Science U-102 Stainless Steel Tubing 1/16 inch OD x 0.020 inch ID, 10 cm, various precut lengths available
Syringe pump control software Cetoni T6000000004 QmixElements software for nemesys pumps, QmixSDK software development kit
Thermoelectric air conditioner EIC Solutions AAC-140C-4XT-HC Thermoelectric air conditioner mounted on insulated enclosure to control the pump, valve, mixer, and sample temperature
T-slot railing McMaster-Carr 47065T103 Aluminum t-slotted railing (1.5 inch by 1.5 inch) cut to various lengths
Vapor locking bottle caps  Cole-Parmer EW-12018-02 Four 304 SS port inserts, 1/4"-28 threads, GL45 bottle cap size, PTFE body, SS threads, PP collar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Melnichenko, Y. B., Wignall, G. D. Small-angle neutron scattering in materials science: Recent practical applications. Journal of Applied Physics. 102 (2), 021101 (2007).
  2. Grillo, I. Small-angle neutron scattering and applications in soft condensed matter. Soft Matter Characterization. Borsali, R., Pecora, R. , Springer. Dordrecht. (2008).
  3. Hollamby, M. J. Practical applications of small-angle neutron scattering. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (26), 10566-10579 (2013).
  4. Pipich, V., Fu, Z. KWS-3: Very small angle diffractor with focusing mirror. Journal of large-scale research. 1, 31 (2015).
  5. Kline, S. 2019 NCNR Annual Report, Special Publication (NIST SP). , National Institute of Standards and Technology. Gaithersburg, MD. (2019).
  6. Gilbert, P. H., et al. Preservative induced polysorbate 80 micelle aggregation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 10 (6), 2395-2404 (2021).
  7. Terashima, T., et al. In situ and time-resolved small-angle neutron scattering observation of star polymer formation via arm-linking reaction in ruthenium-catalyzed living radical polymerization. Macromolecules. 43 (19), 8218-8232 (2010).
  8. Hashimoto, K., Fujii, K., Nishi, K., Shibayama, M. Ion gel network formation in an ionic liquid studied by time-resolved small-angle neutron scattering. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (40), 9419-9424 (2018).
  9. Conn, C. E., et al. Membrane protein structures in lipid bilayers; small-Angle neutron scattering with contrast-matched bicontinuous cubic phases. Frontiers in Chemistry. 8, 619470 (2021).
  10. van't Hag, L., et al. Protein-eye view of the in meso crystallization mechanism. Langmuir. 35 (25), 8344-8356 (2019).
  11. Mahieu, E., et al. Observing protein degradation by the PAN-20S proteasome by time-resolved neutron scattering. Biophysical Journal. 119 (2), 375-388 (2020).
  12. Ibrahim, Z., et al. Time-resolved neutron scattering provides new insight into protein substrate processing by a AAA+ unfoldase. Scientific Reports. 7 (1), 40948 (2017).
  13. Hollamby, M. J., et al. Growth of mesoporous silica nanoparticles monitored by time-resolved small-angle neutron scattering. Langmuir. 28 (9), 4425-4433 (2012).
  14. Blin, J. L., Impéror-Clerc, M. Mechanism of self-assembly in the synthesis of silica mesoporous materials: in situ studies by X-ray and neutron scattering. Chemical Society Reviews. 42 (9), 4071-4082 (2013).
  15. Impéror-Clerc, M., Grillo, I., Khodakov, A. Y., Durand, D., Zholobenko, V. L. New insights into the initial steps of the formation of SBA-15 materials: an in situ small angle neutron scattering investigation. Chemical Communications. 8, 834-836 (2007).
  16. Narayanan, T., Rüter, A., Olsson, U. SAXS/WAXS investigation of amyloid-β(16-22) peptide nanotubes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 654349 (2021).
  17. Angelov, B., et al. DNA/Fusogenic lipid nanocarrier assembly: millisecond structural dynamics. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (11), 1959-1964 (2013).
  18. Amann, M., et al. Kinetic pathways for polyelectrolyte coacervate micelle formation revealed by time-resolved synchrotron SAXS. Macromolecules. 52 (21), 8227 (2019).
  19. Varga, Z., Wacha, A., Bóta, A. Osmotic shrinkage of sterically stabilized liposomes as revealed by time-resolved small-angle X-ray scattering. Journal of Applied Crystallography. 47 (1), 35-40 (2014).
  20. Panine, P., Finet, S., Weiss, T. M., Narayanan, T. Probing fast kinetics in complex fluids by combined rapid mixing and small-angle X-ray scattering. Advances in Colloid and Interface Science. 127 (1), 9-18 (2006).
  21. Grillo, I. Applications of stopped-flow in SAXS and SANS. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 14 (6), 402-408 (2009).
  22. Gomez-Hens, A., Perez-Bendito, D. The stopped-flow technique in analytical chemistry. Analytica Chimica Acta. 242, 147-177 (1991).
  23. Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. Use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the ATP turnover cycle of kinesins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52142 (2014).
  24. Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of stopped-flow kinetics methods to investigate the mechanism of action of a DNA repair protein. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1874 (2010).
  25. Raney, K. D., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. A fluorescence-based assay for monitoring helicase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6644-6648 (1994).
  26. Roder, H., Maki, K., Cheng, H. Early events in protein folding explored by rapid mixing methods. Chemical reviews. 106 (5), 1836-1861 (2006).
  27. Milon, A., et al. Osmotic swelling of unilamellar vesicles by the stopped-flow light scattering method. Influence of vesicle size, solute, temperature, cholesterol and three α,ω-dihydroxycarotenoids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 859 (1), 1-9 (1986).
  28. Gast, K., Nöppert, A., Müller-Frohne, M., Zirwer, D., Damaschun, G. Stopped-flow dynamic light scattering as a method to monitor compaction during protein folding. European Biophysics Journal. 25 (3), 211-219 (1997).
  29. Antoun, A., Pavlov, M. Y., Tenson, T., Ehrenberg, M. M. Ribosome formation from subunits studied by stopped-flow and Rayleigh light scattering. Biological Procedures Online. 6, 35-54 (2004).
  30. Zhu, Z., Armes, S. P., Liu, S. pH-Induced micellization kinetics of ABC triblock copolymers measured by stopped-flow light scattering. Macromolecules. 38 (23), 9803-9812 (2005).
  31. Ye, J., et al. Comparative study of temperature-induced association of cyclic and linear poly(N-isopropylacrylamide) chains in dilute solutions by laser light scattering and stopped-flow temperature jump. Macromolecules. 41 (12), 4416-4422 (2008).
  32. Liu, X., et al. Early stage kinetics of polyelectrolyte complex coacervation monitored through stopped-flow light scattering. Soft Matter. 12 (44), 9030-9038 (2016).
  33. Garman, E. F., Weik, M. X-ray radiation damage to biological samples: recent progress. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (4), 907-911 (2019).
  34. Garg, S., Porcar, L., Woodka, A. C., Butler, P. D., Perez-Salas, U. Noninvasive neutron scattering measurements reveal slower cholesterol transport in model lipid membranes. Biophysical Journal. 101 (2), 370-377 (2011).
  35. Marquardt, D., et al. 1H NMR shows slow phospholipid flip-flop in gel and fluid bilayers. Langmuir. 33 (15), 3731-3741 (2017).
  36. Egelhaaf, S. U., Olsson, U., Schurtenberger, P. Time-resolved SANS for surfactant phase transitions. Physica B: Condensed Matter. 276-278, 326-329 (2000).
  37. Tabor, R. F., Eastoe, J., Grillo, I. Time-resolved small-angle neutron scattering as a lamellar phase evolves into a microemulsion. Soft Matter. 5 (10), 2125-2129 (2009).
  38. Gradzielski, M., Bergmeier, M., Hoffmann, H., Müller, M., Grillo, I. Vesicle gel formed by a self-organization process. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (49), 11594-11597 (2000).
  39. Lee, Y. -T., Li, D. S., Pozzo, L. D. Kinetic analysis of ultrasound-induced oil exchange in oil-in-water emulsions through contrast variation time-resolved small-sngle neutron scattering. Langmuir. 35 (47), 15204-15213 (2019).
  40. Lee, Y. -T., Pozzo, L. D. Contrast-variation time-resolved small-angle neutron scattering analysis of oil-exchange kinetics between oil-in-water emulsions stabilized by anionic surfactants. Langmuir. 35 (47), 15192-15203 (2019).
  41. Roger, K., Olsson, U., Schweins, R., Cabane, B. Emulsion ripening through molecular exchange at droplet contacts. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1452-1455 (2015).
  42. Nakano, M., Fukuda, M., Kudo, T., Endo, H., Handa, T. Determination of Interbilayer and Transbilayer Lipid Transfers by Time-Resolved Small-Angle Neutron Scattering. Physical Review Letters. 98 (23), 238101 (2007).
  43. Nakano, M., et al. Flip-flop of phospholipids in vesicles: kinetic analysis with time-resolved small-angle neutron scattering. The Journal of Physical Chemistry B. 113 (19), 6745-6748 (2009).
  44. Nguyen, M. H. L., et al. Methanol accelerates DMPC flip-flop and transfer: A SANS study on lipid dynamics. Biophysical Journal. 116 (5), 755-759 (2019).
  45. Nguyen, M. H. L., et al. Peptide-induced Lipid flip-flop in asymmetric liposomes measured by small angle neutron scattering. Langmuir. 35 (36), 11735-11744 (2019).
  46. Nguyen, M. H. L., et al. Time-resolved SANS reveals pore-forming peptides cause rapid lipid reorganization. New Journal of Chemistry. 45 (1), 447-456 (2021).
  47. Xia, Y., et al. Effects of nanoparticle morphology and acyl chain length on spontaneous lipid transfer rates. Langmuir. 31 (47), 12920-12928 (2015).
  48. Xia, Y., et al. Morphology-induced defects enhance lipid transfer rates. Langmuir. 32 (38), 9757-9764 (2016).
  49. Maric, S., et al. Time-resolved small-angle neutron scattering as a probe for the dynamics of lipid exchange between human lipoproteins and naturally derived membranes. Scientific Reports. 9 (1), 7591 (2019).
  50. Nielsen, J. E., Bjørnestad, V. A., Pipich, V., Jenssen, H., Lund, R. Beyond structural models for the mode of action: How natural antimicrobial peptides affect lipid transport. Journal of Colloid and Interface Science. 582, 793-802 (2021).
  51. Willner, L., Poppe, A., Allgaier, J., Mokenbusch, M., Richter, D. TIme-resolved SANS for the determintioan of unimer exchange kinetics in block copolymer micelles. Europhysics Letters. 55 (5), 667 (2001).
  52. Lund, R., Willner, L., Stellbrink, J., Lindner, P., Richter, D. Logarithmic chain-exchange kinetics of diblock copolymer micelles. Physical Review Letters. 96 (6), 068302 (2006).
  53. Lund, R., Willner, L., Richter, D., Dormidontova, E. E. Equilibrium chain exchange kinetics of diblock copolymer micelles: Tuning and logarithmic relaxation. Macromolecules. 39 (13), 4566-4575 (2006).
  54. Lund, R., Willner, L., Richter, D. Kinetics of block copolymer micelles studied by small-angle scattering methods. in Controlled Polymerization and Polymeric Structures. Advances in Polymer Science. Abe, A., Lee, K. S., Leibler, L., Kobayashi, S. , Springer. Cham. 51 (2013).
  55. Choi, S. -H., Lodge, T. P., Bates, F. S. Mechanism of molecular exchange in diblock copolymer micelles: hypersensitivity to core chain length. Physical Review Letters. 104 (4), 047802 (2010).
  56. Choi, S. -H., Bates, F. S., Lodge, T. P. Molecular exchange in ordered diblock copolymer micelles. Macromolecules. 44 (9), 3594-3604 (2011).
  57. Lu, J., Bates, F. S., Lodge, T. P. Chain exchange in binary copolymer micelles at equilibrium: confirmation of the independent chain hypothesis. ACS Macro Letters. 2 (5), 451-455 (2013).
  58. Lu, J., Bates, F. S., Lodge, T. P. Remarkable effect of molecular architecture on chain exchange in triblock copolymer micelles. Macromolecules. 48 (8), 2667-2676 (2015).
  59. Kelley, E. G., et al. Size evolution of highly amphiphilic macromolecular solution assemblies via a distinct bimodal pathway. Nature Communications. 5 (1), 3599 (2014).
  60. Murphy, R. P., Kelley, E. G., Rogers, S. A., Sullivan, M. O., Epps, T. H. Unlocking chain exchange in highly amphiphilic block polymer micellar systems: influence of agitation. ACS Macro Letters. 3 (11), 1106-1111 (2014).
  61. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50 (6), 2484-2494 (2017).
  62. Lantz, K. A., et al. Cavitation enables switchable and rapid block polymer exchange under high-χN conditions. Macromolecules. 51 (17), 6967-6975 (2018).
  63. Murphy, R. P., et al. Capillary RheoSANS: measuring the rheology and nanostructure of complex fluids at high shear rates. Soft Matter. 16 (27), 6285-6293 (2020).
  64. Stopped Flow Sans. usnistgov. , Available from: https://github.com/usnistgov/stopped-flow-sans (2021).
  65. Kline, S. Reduction and analysis of SANS and USANS data using IGOR Pro. Journal of Applied Crystallography. 39 (6), 895-900 (2006).
  66. Doktorova, M., et al. Preparation of asymmetric phospholipid vesicles for use as cell membrane models. Nature Protocols. 13 (9), 2086-2101 (2018).
  67. Huang, Z., London, E. Effect of cyclodextrin and membrane lipid structure upon cyclodextrin-lipid interaction. Langmuir. 29 (47), 14631-14638 (2013).
  68. Sugiura, T., Ikeda, K., Nakano, M. Kinetic analysis of the methyl-β-cyclodextrin-mediated intervesicular transfer of pyrene-labeled phospholipids. Langmuir. 32 (51), 13697-13705 (2016).
  69. Scott, H. L., et al. On the mechanism of bilayer separation by extrusion, or why your LUVs are not really unilamellar. Biophysical Journal. 117 (8), 1381-1386 (2019).
  70. Dicko, C., et al. NUrF-Optimization of in situ UV-vis and fluorescence and autonomous characterization techniques with small-angle neutron scattering instrumentation. Review of Scientific Instruments. 91 (7), 075111 (2020).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 174 Малоугловое рассеяние нейтронов (SANS) рассеяние с временным разрешением смешивание с остановленным потоком кинетика молекулярного обмена липидные наночастицы липидные мембраны везикулы структурная эволюция
Измерение временной эволюции наноразмерных материалов с остановленным потоком и малоугловым рассеянием нейтронов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelley, E. G., Nguyen, M. H. L.,… More

Kelley, E. G., Nguyen, M. H. L., Marquardt, D., Maranville, B. B., Murphy, R. P. Measuring the Time-Evolution of Nanoscale Materials with Stopped-Flow and Small-Angle Neutron Scattering. J. Vis. Exp. (174), e62873, doi:10.3791/62873 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter