Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

מדידת התפתחות הזמן של חומרים ננומטריים באמצעות זרימה עצורה ופיזור נייטרונים בזווית קטנה

Published: August 6, 2021 doi: 10.3791/62873
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1, 1
1NIST Center for Neutron Research, National Institute of Standards and Technology, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of Windsor, 3Department of Physics, University of Windsor

Summary

פרוטוקול זה מציג את השימוש בסביבת דגימה של זרימה עצורה כדי לערבב במהירות תמיסות נוזליות מרובות באתרן במהלך מדידת פיזור נייטרונים בזווית קטנה וללמוד תהליכים קינטיים בסקאלות אורך ננומטריות ובסקאלות זמן שניות.

Abstract

מאמר זה מציג את השימוש בסביבת דגימת פיזור נייטרונים בזרימה עצורה בזווית קטנה (SANS) כדי לערבב במהירות דגימות נוזלים ולחקור תהליכים קינטיים ננומטריים בסקאלות זמן של שניות עד דקות. סביבת הדגימה של זרימה עצורה משתמשת במשאבות מזרקים זמינות מסחרית כדי לערבב את הכמויות הרצויות של דגימות נוזל המוזרקות לאחר מכן דרך מיקסר דינמי לתוך תא זכוכית קוורץ בערך 1 s. רכישת נתוני SANS שנפתרה בזמן מסונכרנת עם ערבוב הדגימות כדי לעקוב אחר התפתחות המבנה הננומטרי בתמיסה לאחר הערבוב.

כדי לנצל בצורה היעילה ביותר את זמן קרן הנייטרונים, אנו משתמשים בסדרה של שסתומי בורר זרימה כדי לטעון, לשטוף ולייבש את התא באופן אוטומטי בין מדידות, מה שמאפשר איסוף נתונים חוזר ונשנה במהלך הזרקות דגימה מרובות. זריקות הדגימה חוזרות על עצמן עד לאיסוף סטטיסטיקות מספיקות של פיזור נייטרונים. ניתן לתכנת את מערך הערבוב כך שישתנה באופן שיטתי בתנאים כדי למדוד את הקינטיקה ביחסי ערבוב שונים, ריכוזי דגימות, ריכוזי תוספים וטמפרטורות. נפח הדגימה המינימלי הנדרש לכל הזרקה הוא כ-150 μL בהתאם לאורך הנתיב של תא הקוורץ.

תוצאות מייצגות המשתמשות בסביבת דגימה זו של זרימה עצורה מוצגות עבור קינטיקה של החלפת שומנים מהירה בנוכחות תוסף, ציקלודקסטרין. השלפוחיות מחליפות שומנים בעלון החיצוני (חיצוני) בסדר גודל של שניות ומחליפות באופן מלא שומנים פנימיים וחיצוניים תוך שעות. מדידת קינטיקה של חילופי שומנים דורשת ערבוב באתרו כדי ללכוד את התהליכים המהירים יותר (שניות) והאיטיים יותר (דקות) ולחלץ את קבועי הקצב הקינטי. אותה סביבת דגימה יכולה לשמש גם לבדיקת חילופי מולקולות בסוגים אחרים של דגימות נוזליות כגון ננו-חלקיקי שומנים, חלבונים, חומרים פעילי שטח, פולימרים, תחליבים או ננו-חלקיקים אנאורגניים. מדידת השינויים המבניים הננומטריים והקינטיקה של מערכות מחליפות או מגיבות תספק תובנות חדשות על תהליכים המתפתחים בקנה מידה ננומטרי.

Introduction

פיזור נייטרונים בזווית קטנה (SANS) מספק דרך ייחודית למדוד את הגדלים, הצורות, האינטראקציות והארגון של חומרים שונים בסקאלות אורך מ-≈1 ננומטר עד ≈100 ננומטר 1,2,3. מכשירים עדכניים, כולל מכשירי VSANS (פיזור נייטרונים בזווית קטנה מאוד) עם מראות ממוקדות, מותחים את הגבולות לכיוון מדידת סקאלות אורך גדולות עוד יותר עד ≈1000 ננומטר 4,5. באופן כללי, ניגודיות הפיזור הייחודית הטבועה בשיטות פיזור נייטרונים מציעה מספר יתרונות במדידת התפתחות הזמן של מבנים ננומטריים, כגון צבירת רכיבים בפורמולציות פרמצבטיות6, תגובות הצלבה וג'לציה במערכות פולימריות 7,8, בהתגבשות מזו של חלבוני ממברנה9,10, פירוק והתפתחות חלבונים11,12 וגידול חומרים מבוססי סיליקה13,14,15., ניגודיות הפיזור הייחודית הופכת את SANS (TR-SANS) לפתרון הזמן כהשלמה שימושית למדידות אחרות המבוססות על זרימה עצורה.

שיטות ערבוב זרימה עצורה מיושמות לעתים קרובות בפיזור קרני רנטגן בזווית קטנה (SAXS)16,17,18,19,20,21, ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית 22,23,24,25,26, ופיזור אור 27,28,29,30, 31,32 ניסויים לחקר תהליכים קינטיים בסקאלות הזמן של אלפיות השנייה. הבדל חשוב בין SANS ל-SAXS הוא שפיזור נייטרונים הוא טכניקת אפיון לא הרסנית, וככזו, ניתן להשתמש ב-SANS כדי למדוד את אותה דגימה במשך שעות או אפילו ימים ללא נזקי קרינה מייננת לדגימה, מה שיכול לקרות במהלך ניסויי פיזור קרני רנטגן בשטף גבוה יותר33. מכיוון שמדידות SANS חוזרות ונשנות לא ישנו את המבנה הכימי של מולקולת הגשושית או הדגימה, ניתן לחקור את התפתחות הזמן ללא השפעות של הלבנה, למשל, מה שיכול לסבך מדידות קינטיקה המסתמכות על פלואורסצנטיות23,24. יתר על כן, ניתן להשתמש ב-SANS כדי למדוד דגימות מרוכזות מאוד ואטומות אופטית שלעתים קרובות קשה לאפיין באמצעות טכניקות מבוססות אור כגון פיזור אור דינמי.

בנוסף לאספקת מידע מבני בקנה מידה ננומטרי, SANS יכול לשמש כדי לחקור את ההרכב המקומי של מבנים אלה באמצעות השונות בניגודיות צפיפות אורך פיזור נייטרונים. צפיפות אורך הפיזור (SLD) של יסודות שונים משתנה באופן אקראי על פני הטבלה המחזורית ומשתנה עם איזוטופים שונים של אותו יסוד. דוגמה נפוצה היא מימן (1H או H) ודאוטריום (2H או D), שיש להם אורכי פיזור נייטרונים שונים בתכלית. לכן, ניתן להבדיל בין חומרים עשירים במימן, כגון חומרים פעילי שטח, ליפידים, חלבונים, רנ"א, דנ"א ופולימרים אחרים, לבין ממיסים מפורקים באמצעות SANS מבלי לשנות באופן משמעותי את התכונות הפיזיקליות של המערכת. עם זאת, חשוב לציין כי חילופי H/D יכולים להשפיע על הצפיפות, קשרי המימן וטמפרטורות מעבר הפאזה בדגימה. עם זאת, הרגישות הייחודית של SANS לחומרים עשירים במימן שימושית במיוחד במחקר חומר רך, שבו הדגימות המעניינות הן בעלות ניגודיות פיזור ואות נמוכים יותר בטכניקות מבוססות קרני רנטגן כגון SAXS. החלפה איזוטופית גם הופכת את SANS לכלי רב עוצמה לחקר קינטיקה של חליפין מולקולרי בחומרים עשירים במימן פשוט על ידי ערבוב מולקולות המסומנות בתווית H ו-D. החלפה איזוטופית שימושית במיוחד במערכות שבהן צבעים פלואורסצנטיים מגושמים גדולים יותר ממולקולות פעילי השטח או השומנים המעניינות ויכולים להשפיע על קינטיקה של חליפין34,35.

מדידות SANS שנפתרו בזמן הן יתרון מכיוון שהעוצמה הנמדדת היא פונקציה של זמן, סולם אורך וניגודיות SLD. לפיכך, ניסויי TR-SANS יכולים להיות מתוכננים לחקור את השינויים תלויי הזמן בהתפלגות המרחבית ובהרכב הדגימות. יתרונות ייחודיים אלה של SANS הובילו לתובנות חשובות לגבי תהליכים קינטיים במערכות רבות של חומרים רכים כגון חומרים פעילי שטח 36,37,38, תחליבים 39,40,41, ליפידים 34,42,43,44,45,46,47,48,49 ,50, ופולימרים 51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62. רוב מחקרי TR-SANS התמקדו בסקאלות זמן של דקות עד שעות. עם זאת, תהליכים קינטיים רבים של עניין מתרחשים בסולם הזמן השני והם חיוניים להבנת המנגנונים הבסיסיים. לכידת נקודות זמן מוקדמות אלה דורשת ערבוב מהיר של התמיסות ומדידה באתרן, כאשר הערבוב מסונכרן עם איסוף נתונים במהלך פיזור אור עצור זרימה 27,28,29,30,31,32, פלואורסצנטיות 22,23,24,25,26 ורנטגן 16,17,18,19,20,21 ניסויים. עבודה זו מתארת את השימוש בסביבת דגימה שנועדה לערבב במהירות דגימות נוזל מרובות ולהזריק את התערובת לתוך תא זכוכית קוורץ למדידות TR-SANS. מכשיר הערבוב הוא אדפטציה של מכשיר rheoSANS נימישפותח לאחרונה 63 ומשתמש במספר משאבות מזרקים ושסתומים כדי לשלוט בערבוב הדגימות ולהפוך את ניקוי התאים לאוטומטי. על-ידי חיבור משאבות מזרקים לסדרה של שסתומי בורר זרימה, ניתן לערבב, למדוד, לשטוף ולייבש זרמי כניסה מרובים שוב ושוב כדי להקל על מדידות TR-SANS בסקאלת הזמן של השניות.

הנוהל הנוכחי מניח כי הדגימות המעניינות זוהו והוכנו. אנו מתמקדים בהגדרת ערבוב באתרו ובשיטות לאיסוף נתוני TR-SANS. נתוני פיזור נייטרונים נאספו במכשיר VSANS במרכז NIST לחקר נויטרונים (NCNR); עם זאת, ההליך צריך להיות ישים למכשירי SANS אחרים. קוראים המעוניינים ליישם פרוטוקולים דומים על מכשירי SANS אחרים צריכים להתייעץ עם מדעני המכשירים המקומיים כדי לקבוע את תצורת המכשירים האופטימלית כדי למקסם את שטף הנייטרונים בסקאלת האורך הרצויה ובסקאלת הזמן הרלוונטית ביותר לתהליכים הקינטיים המעניינים. הנתונים המוצגים כאן נאספו באמצעות תצורת "קרן לבנה" בשטף גבוה ב- VSANS כדי למקסם את ספירת הנייטרונים באובדן רזולוציה מרחבית5. קרונות הגלאי הוצבו כדי לכסות מגוון של וקטורי פיזור (q), 0.005 Å-1 < q < 0.5 Å-1, המתאימים לסקאלות אורך של ≈130 ננומטר עד ≈13 ננומטר. וקטור הפיזור מוגדר כ-q = 4π/λ sin (θ/2) כאשר λ הוא אורך גל הנייטרונים, ו-θ היא זווית הפיזור.

התקן ערבוב הזרימה המופסקת המשמש למדידות TR-SANS מורכב ממשאבות מרובות, מזרקי שטיפה, מזרקי דגימה, בוררי זרימה, כמו גם מיקסר דינמי, תא דגימה ומיכל דגימה מעורב, כפי שמוצג באיור 1. כל נתיבי הנוזל האטומים ממוקמים בתוך מארז ממוזג, הכולל את המזרקים, השסתומים, צינורות החיבור, המיקסר הדינמי ותאי הדגימה. מזגן תרמואלקטרי ניתן לתכנות משמש לשליטה על טמפרטורת המארז בטווח שבין 10 °C (75 °F) ל- 50 °C (75 °F) בתוך ± °C (75 °F). שים לב שחלק מבידוד המארז הוסר כדי להציג את חלקי העבודה של המכשיר. מארז התקן הערבוב הראשי ממוקם על במת תרגום בקו אלומת NG3 VSANS ב- NCNR. מיקום המארז מותאם באמצעות שלב התרגום כדי למקם את תא הדגימה בנתיב קרן הנייטרונים (קו מקווקו צהוב).

Figure 1
איור 1: מערך לדוגמה לשילוב של ערבוב זרימה עצורה ומדידות פיזור נייטרונים בזווית קטנה בקו הקרן VSANS במרכז NIST לחקר נייטרונים. ההתקנה כוללת ארבע משאבות מזרקים, שני מזרקים לשטיפת ממסים ושני מזרקים להזרקת דגימה, ארבעה שסתומי בורר משאבות, שני שסתומי בורר מיקסר, מיקסר דינמי, תא קוורץ זורם ומיכל דגימה מעורב. נייטרונים מקריים מתפזרים מהדגימה המעורבת הממוקמת בתוך תא הדגימה. מתחם מבודד עם חלונות קוורץ ויחידת מיזוג אוויר תרמואלקטרית משמש לשליטה על הדגימה וכל הציוד בטמפרטורה קבועה. הקו המקווקו הצהוב מראה את נתיב קרן הנייטרונים. סרגל קנה מידה = 10 ס"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ההתקן המתואר באיור 1 מוגדר עם שני מזרקים לדוגמה, שני מזרקי שטיפה ותא דגימה אחד. דיאגרמות זרימה תואמות עבור השלבים השונים של הפרוטוקול מודגמות באיור 2. הנפחים הרצויים של שתי הדגימות השונות מוזרקים למיקסר ולתא הדגימה (איור 2A). לאחר מילוי תא הדגימה, שסתום מתג הכניסה (ISV) ושסתום מתג היציאה (OSV) נסגרים כדי לבודד את תא הדגימה מהמערבל הדינמי ולמנוע דיפוזיה לאחור של הדגימה לתוך התא במהלך איסוף הנתונים TR-SANS (איור 2B). לפני המיקסר הדינמי, צינור החיבור משתנה באורכו בין 10 ס"מ ל-1 מ' ואינו משפיע על זמן השהיית הערבוב. עם זאת, חיבורי צינורות בין המערבל הדינמי לתא הדגימה ישפיעו על זמן השהיית הערבוב ועל נפח הזרקת הדגימה הנדרש. צינורות נירוסטה חתוכים מראש בקוטר פנימי של 0.04 אינץ' (1 מ"מ) ובאורך 100 מ"מ משמשים לחיבור המיקסר הדינמי, שסתומי בורר המיקסר (MSV1 ו- MSV2) וה- ISV וה- OSV. צינורות פלואור בקוטר פנימי של 1 מ"מ ובאורך 115 מ"מ משמשים לחיבור ספק התוכנה העצמאי (ISV) וה-OSV (או יציאת המיקסר הדינמי) לתא הדגימה. נפח החלל הכולל המשפיע על זמן השהיית הערבוב כולל את נפח חלל המיקסר (0.15 מ"ל), הצינור בין יציאת המיקסר לכניסת תא הדגימה (0.09 מ"ל) ונפח תא הדגימה (0.16 מ"ל). בדוגמה זו, נפח הריק הכולל הוא 0.4 מ"ל. נפחי החלל הפנימי של השסתומים זניחים בהשוואה לנפחי הצינורות, המיקסר ותאי הריק לדוגמה. לדוגמה, שסתומי בורר הלחץ הנמוך (קוטר בור 0.75 מ"מ) מכילים נפחי ריק משוערים של 4 מיקרוליטר, בעוד ששסתומי בורר הלחץ הגבוה ושסתומי המתג (קוטר בור 0.25 מ"מ) מכילים נפחי ריק משוערים של 0.5 מיקרוליטר.

לאחר השלמת המדידה של TR-SANS, הדגימה נדחפת החוצה מהתא באמצעות ממס, וממס השטיפה נשאב שוב ושוב דרך התא כדי להסיר את הדגימה השיורית ולנקות את תא הדגימה (איור 2C). שים לב שמזרקי השטיפה מחוברים למאגרי ממס גדולים יותר (למשל, מים ואתנול) באמצעות ערכי בורר משאבות כדי להבטיח נפחי ממס נאותים זמינים לניקוי תא הדגימה בין ריצות מדידה. מקורות ממס, מקורות דגימה ומיכלי דגימה מעורבים המכילים נוזלים דליקים ממוקמים במארז נפרד ללא ציוד חשמלי כדי לחסל את כל מקורות ההצתה האפשריים. בנוסף, פקקי בקבוקים ננעלים אדים משמשים כדי למזער אדים דליקים ואידוי ממס. לבסוף, תא הדגימה מיובש עם זרם גז חנקן כדי להסיר את שאריות ממס השטיפה (איור 2D). לחץ גז החנקן הנכנס לשסתום בורר המיקסר מווסת לכ -2 בר (0.2 מגפ"ס, לחץ מד) באמצעות וסת לחץ ידני הממוקם על בלון גז החנקן. לאחר שתא הדגימה מנוקה ומיובש מספיק, דגימה שזה עתה מעורבבת מוזרקת לתוך תא הדגימה עבור מחזור המדידה הבא (חזרה על הערבוב וההזרקה המודגמים בדיאגרמת הזרימה באיור 2A).

Figure 2
איור 2: דיאגרמת זרימה לדוגמה באמצעות תא דגימה אחד, ערבוב של שתי דוגמאות ושני ממיסי שטיפה לניקוי . (A) ערבוב של מדגם A (כחול) ומדגם B (אדום), ולאחר מכן הזרמת הדגימה המעורבת (סגול) לתוך תא הדגימה. (B) במהלך איסוף הנתונים, מצב התקן הזרימה המופסקת שבו שסתומי המתג ISV ו- OSV סגורים כדי לבודד את תא הדגימה ולמנוע דיפוזיה לאחור של הדגימה במהלך איסוף הנתונים. (C) שלבי הניקוי שבהם תא הדגימה נשטף בממס שטיפה מ-SS1 (ירוק) לאחר איסוף הנתונים. (D) שלב ייבוש שבו תא הדגימה מיובש בגז חנקן (כתום). קיצורים: PSV = שסתום בורר משאבות; MSV = שסתום בורר מיקסר; OSV = שסתום מתג שקע; ISV = שסתום מתג כניסה; SS1 = מקור ממס 1; SSA = מקור מדגם A; N2 = מקור גז חנקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3 מציג דיאגרמות זרימה עבור גרסה שונה במקצת שבה הגדרת הערבוב מוגדרת עם שני תאי דגימה נפרדים המחוברים לאותם שסתומי מתג (איור 3A). בעוד שנתוני TR-SANS נאספים בתא לדוגמה 1, תא דגימה 2 נשטף (איור 3B) ומיובש (איור 3C). לאחר השלמת איסוף הנתונים עבור תא לדוגמה 1, שסתום מתג הכניסה מפנה דגימה מעורבת חדשה לתוך תא מדגם 2 לצורך איסוף נתונים (איור 3D). בעוד שנתוני TR-SANS נאספים בתא לדוגמה 2, תא דגימה 1 נשטף ומיובש (איור 3E). תהליך מקביל לסירוגין זה בין שני תאי דגימה ממזער את הזמן בין הזרקות הדגימה הבאות וממקסם את השימוש בזמן קרן נויטרונים.

Figure 3
איור 3: דיאגרמת זרימה לדוגמה באמצעות תאים בני שתי דגימות, ערבוב של שתי דגימות ושני ממיסי שטיפה לניקוי. (A) ערבוב מדגם A (כחול) ומדגם B (אדום) ולאחר מכן הזרמת הדגימה המעורבת (סגול) לתא מדגם 1. (B) מצב התקן הזרימה המופסקת במהלך איסוף הנתונים בתא מדגם 1 בעוד תא מדגם 2 נשטף בממס מ-SS1 (ירוק). (C) מצב התקן הזרימה המופסקת במהלך איסוף הנתונים בתא מדגם 1 בעוד תא דגימה 2 מיובש בגז חנקן (כתום). (D) לאחר השלמת איסוף הנתונים של תא מדגם 1, מדגם חדש (סגול) מעורבב מיד ומוזרם לתא מדגם 2. (E) מצב התקן הזרימה המופסקת במהלך איסוף נתונים בתא מדגם 2 בעוד תא דגימה 1 נשטף בממס מ-SS1 (ירוק). בזמן שתא דגימה אחד נמדד, תא הדגימה השני מנוקה ומיובש. תהליך מדידת הזרימה המופסקת עובר לסירוגין בין שני תאי דגימה כדי למזער את הזמן בין זריקות ערבוב הדגימה הבאות. קיצורים: PSV = שסתום בורר משאבות; MSV = שסתום בורר מיקסר; OSV = שסתום מתג שקע; ISV = שסתום מתג כניסה; SS1 = מקור ממס 1; SSA = מקור מדגם A; N2 = מקור גז חנקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

להלן מתואר פרוטוקול שלב אחר שלב לחיבור המשאבות וקווי הצינורות, הכנת המערכת, שטיפה וייבוש תא הדגימה והזרקת הדגימה המעורבת. אף על פי שתצורת התא הבודד מודגמת בפשטות (איור 2), ניתן לשנות בקלות את ההגדרה, הפרוטוקול והסקריפטים המודולריים הגמישים כדי ליישם יותר משאבות מזרקים, שסתומים, מערבלים או תצורות תאים לדוגמה, כמו תצורת התא בן שתי הדגימות שמוצגת באיור 3. נתוני קצב ספירת נייטרונים גולמיים מייצגים שנאספו במהלך מחזורי הזרקת ערבוב וניקוי מוצגים באיור 4, בעוד שקינטיקה של חילופי שומנים שנמדדה ב-3 טמפרטורות שונות והעוצמה המפוזרת המנורמלת שחולצה המתאימה לחלק השומנים המוחלפים מוצגים באיור 5 ובאיור 6, בהתאמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הגדר והתחל את מערכת הזרימה המופסקת.

  1. הפעל את כל ספקי הכוח של המשאבה ואת כל המיקסרים הדינמיים באמצעות מתג ההפעלה.
  2. הפעל את כל המשאבות והשסתומים בממשק המשתמש הגרפי (GUI) של בקרת מערכת הזרימה המופסקת על-ידי הזנת נתיב תצורת ההתקן ושימוש בפקודות bus=qmixbus. Bus(), bus.open(), bus.start(), pump=qmixpump. Pump(), pump.enable(), ו- valve=ViciMultiposSelector() (ראה קוד אתחול לדוגמה הזמין במאגר קוד פתוח מקוון64).
  3. כייל את המשאבות לפני חיבור מזרקים באמצעות משאבת הפקודה.calibrate().
  4. ודא שהשסתומים מופעלים ועבור ליציאת הבורר הנכונה לפי פקודה באמצעות הפקודה valve.setPort() ו- valve.getPort().
  5. הקצה את סוג המזרק שישמש עבור כל משאבה באמצעות הפקודה pump.set_syringe_param(A, B ), שבה A הוא הקוטר הפנימי של קנה המזרק (mm), ו - B הוא מרחק משיכת הבוכנה המרבי של המזרק (mm).
  6. חברו את מזרקי הדגימה למשאבות המזרקים.
    1. לאחר שווידאתם שהמשאבות כוילו, הבריגו חביות מזרק נקיות לחיבור בחלק העליון של המשאבה (ראש תושבת מזרק).
    2. בעת שימוש במזרקי זכוכית, יש לוודא שראש הרכבה של המזרק משוחרר לפני חלוקת נפח המילוי, כך שמזרק הזכוכית לא יישבר עקב כוח מופרז של בוכנה המזרק.
    3. הברג את בוכנה מזרק לחיבור בתחתית המשאבה (מזרק הר זנב).
    4. לאחר חיבור קנה המזרק ובוכנה המזרק למשאבה, יש לחלק את נפח המילוי של סוג המזרק באמצעות משאבת הפקודה.empty(), המעבירה את בוכנה המזרק לראש קנה המזרק.
    5. בעת שימוש מזרקי זכוכית, להדק את ראש הרכבה מזרק לאחר תנועת הבוכנה מפסיק.
  7. חבר את הצינור למקורות הדגימה והממס, מזרקים, שסתומים, מערבלים, תאי דגימה ומיכל דגימה מעורב.
    1. חבר את צינור משאבת המזרק לשסתומי בורר המשאבות.
    2. חבר את צינורות שסתום בורר המשאבה למקורות הדגימה.
    3. חבר את צינורות שסתום בורר המשאבה למקורות ממס השטיפה.
    4. חבר את צינורות שסתום בורר המשאבה לצינורות שסתום בורר המיקסר.
    5. חבר את צינורות שסתום בורר המיקסר למקור גז החנקן.
    6. חבר את צינורות שסתום בורר המיקסר לפתחי המיקסר.
    7. חבר את שקע המיקסר לשסתום מתג הכניסה.
    8. חבר את שסתום מתג הכניסה לכניסת התא לדוגמה.
    9. חבר את שקע התא לדוגמה לשסתום מתג היציאה.
    10. חבר את שסתום מתג היציאה למיכל הדגימה המעורב.
  8. הגדר את כל חיבורי הצינורות והשסתומים שבוצעו (שלב 1.7) בממשק המשתמש הגרפי של בקרת מערכת הזרימה המופסקת על-ידי הקלדת חיבורי מספר היציאה המתאימים שבוצעו לכל שסתום (ראה קוד בקרה לדוגמה במאגר הקוד הפתוחהמקוון 64).
  9. חשב את נפח החלל של הצינורית בין כניסת המיקסר ליציאת תא הדגימה, המגדיר את כמות הדגימה המינימלית הדרושה למילוי תא הדגימה עבור כל מדידה.

2. טען את הדגימה.

  1. הגדר את נפח מילוי הדגימה הרצוי ואת נפח מילוי הממס בממשק המשתמש הגרפי של בקרת מערכת הזרימה המופסקת על-ידי הקלדת המספרים הרצויים (ראה קוד בקרה לדוגמה במאגר הקוד הפתוחהמקוון 64).
  2. השתמש בפקודה pump.aspirate () כדי למשוך (לשאוף) את הדגימה הרצויה ואת נפחי הממס ממקורותיהם לתוך מזרקי הדגימה דרך שסתומי בורר המשאבה.
    הערה: בעת העמסה ראשונה של מזרק ריק, האוויר יהיה נוכח בחלק העליון של המזרק שיש לטהר כדי להפעיל את המערכת עם דגימה וממס בשלב 3.

3. ראש המערכת.

  1. השתמש בפקודה pump.dispense () כדי לדחוף החוצה (לנפק) את כל האוויר ממזרקים, צינורות ושסתומים. ודא כי נפח נוזל מספיק מופק מכל מזרק כדי להסיר לחלוטין את כל האוויר מן מזרקים, צינורות ושסתומים. אם ניתן לראות בועות אוויר בתוך צינור כלשהו, המשיכו לפזר ממס או דגימה עד להסרת הבועות.
  2. לאחר ניקוי האוויר מהמערכת, יש לבצע לפחות הליך הזרקה ושטיפה של דגימה אחת (ללא איסוף נתוני פיזור נייטרונים).
    1. לחץ כדי לבחור את התא שכותרתו התחל ניסוי ערבוב בממשק המשתמש הגרפי של הבקרה.
    2. כאשר תא זה נבחר באופן פעיל, לחץ על לחצן הפעלה (משולש ימני) הממוקם בחלק העליון של ממשק המשתמש הגרפי של הבקרה, או לחץ על המקשים Shift ו - Enter יחד במקלדת.
    3. בדוק חזותית את תא הדגימה כדי לוודא שבועות אוויר אינן קיימות.
      1. אם קיימות בועות אוויר, חזור על שלבי פרוטוקול 3.1 ו-3.2 כדי לטהר עוד יותר את האוויר מקווי הצינורות.
      2. אם בועות אוויר אינן קיימות בתא הדגימה, המשך לשלב 4 כדי להגדיר את שלבי פרוטוקול הניסוי הנותרים.

4. הגדר את פרוטוקול ערבוב הזרימה המופסקת בסקריפט התוכנית (ראה דוגמת קוד במאגר הקוד הפתוח המקוון64).

  1. הזן את נקודת הגדרת הטמפרטורה של יחידת המזגן (AC) הניתנת לתכנות השולטת בטמפרטורת המארז המבודד המקיף את התקן הזרימה המופסקת.
    1. תוך כדי לחיצה ממושכת על לחצן הכוכב ביחידת הבקרה AC, לחץ על החצים למעלה ולמטה כדי לשנות את טמפרטורת נקודת ההגדרה. לחלופין, הקלד את נקודת הגדרת הטמפרטורה הרצויה בממשק המשתמש הגרפי של הבקרה ולחץ על הפעל.
    2. המתן 15-30 דקות כדי לאפשר לפנים המארז להתאזן בטמפרטורה הרצויה לפני תחילת הניסויים הקינטיים.
      הערה: טווח הטמפרטורות הנגיש הוא כיום בין 10 °C (75 °F) ו- 50 °C (75 °F), ויציבות הטמפרטורה היא ± 1 °C (75 °F).
  2. הזן את כל שלבי רצף השטיפה על-ידי הקלדת נפחי האחסון, קצבי הזרימה, הזמנים ומספר החזרות המתאימים בממשק המשתמש הגרפי של הבקרה.
    1. הגדר את הנפח של כל דגימה שיש להזריק, המגדיר את קצב הזרימה הכולל (Q).
    2. הגדירו את הנפח של כל ממס שיש להזריק במהלך הליך השטיפה.
    3. הגדירו את זמן הייבוש בין כל תת-שלב של השטיפה (tdry).
    4. הגדירו את מספר שלבי המשנה של השטיפה.
    5. הגדירו את הממיסים השונים לשלבי השטיפה הבאים.
    6. הגדר את מספר חזרות השטיפה שיש לבצע לאחר כל מדידה (nשטיפה).
    7. הגדר את הזמן לייבוש מלא של תא הדגימה והמיקסר, וספק תא דגימה נקי להזרקת הדגימה הבאה (tdry_final).
  3. הגדר את כל שלבי רצף הזרקת הדגימה על-ידי הקלדת אמצעי האחסון, קצבי הזרימה והזמנים המתאימים בממשק המשתמש הגרפי של בקרת מערכת הזרימה המופסקת.
    1. הגדר את הנפח של כל דגימה שיש להזריק ואת קצב הזרימה.
    2. חשב את זמן ההשהיה (t delay) מנפח הריק (V void) ואת קצב הזרימה הכולל (tdelay = Vvoid/Q).
      הערה: זמן ההשהיה הוא הזמן הדרוש למילוי תא הדגימה במדגם המעורב.
    3. הגדר את זמן הרכישה הרצוי עבור נתוני TR-SANS כך שכל התהליך הקינטי של העניין יתרחש (tscatt).
    4. הגדר את זמן ההמתנה בין סוף ניסוי הפיזור לתחילת מחזורי השטיפה (twait).
      הערה: זמן המתנה זה צריך להיות לפחות 100 שניות אם יש למדוד את שידור הנייטרונים לדוגמה לפני שהוא נשטף מהתא. שידור הדגימה נדרש במהלך עיבוד הנתונים כדי להפחית את הנתונים לעוצמה מוחלטת.
    5. הגדר את מספר מחזורי ההזרקה שיש לבצע עם רצפי שטיפה בין כל הזרקה המוגדרים בשלב 4.2 (nמחזור).
  4. חשב את הזמן הכולל של מחזור איסוף נתונים יחיד של זרימה עצורה (מחזור t) באמצעות משוואה (1).
    מחזור t = nשטיפה × (עיכוב t + tיבש) + tdry_final +t עיכוב + tscatt (1)
    שבו nשטיפה = מספר חזרות השטיפה (שלב 4.2.6); עיכוב t = זמן השהיה של התקן הזרימה שנעצרה (שלב 4.3.2); t יבש = זמן ייבוש בין כל תת-שלבי שטיפה (שלב 4.2.3); t dry_final = זמן לייבוש מלא של תא הדגימה והמיקסר (שלב 4.2.7); t scatt = זמן רכישת הנתונים הרצוי של TR-SANS (שלב 4.3.3)

5. הגדר את פרמטרי פיזור הנייטרונים בזווית קטנה בממשק המשתמש הגרפי של בקרת מכשיר SANS.

  1. קבע את סולמות האורך ואת טווח העניין של Q עבור כל דגימה.
  2. הגדר את תצורת המכשיר כך שתכסה את טווח העניין הרצוי, תוך מקסום שטף הנייטרונים בדגימה.
  3. הגדר את זמן רכישת הנתונים הכולל של VSANS בממשק המשתמש הגרפי של פקד מכשיר SANS לזמן המחזור המחושב בשלב 4.4 (זמן רכישת נתוני פיזור נייטרונים =מחזור t).
  4. הגדר את זמן מדידת שידור הדגימה ל- 100 שניות בממשק המשתמש הגרפי של בקרת מכשיר SANS.
  5. באמצעות ממשק המשתמש הגרפי של בקרת כלי SANS, הפעל את איסוף הנתונים במצב אירוע על-ידי הקלדת GenerateEventModeData true בשורת הפקודה.

6. אסוף מדידות פיזור סטנדרטיות להפחתת נתונים לפני תחילת ניסוי הזרימה המופסקת כדי לעבד את נתוני TR-SANS.

  1. מדוד את פיזור הרקע.
    1. ודא שתריס המכשירים המקומי סגור.
    2. חבר את דגימת הקרן החסומה לחלק האחורי של מפתח הצמצם של הדגימה, אבטח את סביבת המכשיר המקומית ופתח את תריס המכשיר המקומי.
    3. הגדר את זמן איסוף נתוני פיזור האלומה החסומה בתוכנה, ואסוף נתוני פיזור אלומה חסומה, תוך ספירה למשך אותו משך כמו זמן איסוף נתוני הפיזור הארוך ביותר (tscatt).
    4. לאחר השלמת איסוף הנתונים, סגור את תריס המכשיר והסר את דגימת הקרן החסומה מפתח הצמצם של הדגימה.
  2. מדוד את פיזור התאים הריקים.
    1. ודא שתא הדגימה נשטף והתייבש היטב.
    2. פתח את תריס המכשיר המקומי.
    3. אסוף את מדידת שידור התא הריק במשך 100 שניות.
    4. אסוף את מדידת פיזור התאים הריקים, וספור לפחות את זמן הרכישה הארוך ביותר (tscatt).

7. התחל את ניסוי עצירת הזרימה.

  1. הפעל את איסוף הנתונים בפיזור VSANS במצב אירוע .
    1. ודא שאזור המכשירים המקומי מאובטח ולאחר מכן פתח את תריס קרן המכשירים המקומי.
    2. התחל באיסוף נתוני SANS באמצעות תוכנת בקרת המכשירים SANS במחשב המכשיר על-ידי גרירה ושחרור של הריצות הרצויות לתור המכשירים.
      הערה: כדי להבטיח שנקודות הזמן המוקדמות ביותר נמדדות, התחל באיסוף נתונים לפני תחילת ניסוי ערבוב הזרימה המופסקת. הנתונים יעובדו לאחר מכן בשלב מאוחר יותר כדי לקחת בחשבון את זמן העיכוב (tעיכוב).
  2. התחל את ניסוי ערבוב הזרימה המופסקת בממשק המשתמש הגרפי של הבקרה.
    1. בחר את תא המחברת שכותרתו התחל ניסוי ערבוב בממשק המשתמש הגרפי של בקרת מערכת הזרימה המופסקת.
    2. כאשר תא זה נבחר באופן פעיל, לחץ על לחצן הפעלה (משולש ימני) הממוקם בחלק העליון של תוכנית בקרת התקן זרימה עצורה, או לחץ על המקשים Shift ו - Enter יחד במקלדת.
    3. ודא שפרוטוקול ערבוב הזרימה המופסקת המוגדר בסעיף 4 החל לפעול.
    4. הוסף את מדידת השידור של 100 שניות לתור המכשירים של VSANS לאחר ריצת הפיזור באמצעות ממשק המשתמש הגרפי של בקרת המכשירים SANS.
    5. הוסף ריצת מדידת פיזור אחת והפעלת מדידת שידור אחת לתור המכשירים עבור כל מחזור ערבוב זרימה עצורה שנותר (nמחזור - 1, שלב 4.3.5) בממשק המשתמש הגרפי של בקרת לוח המחוונים SANS.

8. עבד וצמצם נתונים כדי להסיר את כל הרקעים, לתקן את רגישות הגלאי ולתקן להעברת דגימה.

  1. הורד את קבצי נתוני הפיזור ואת קבצי האירועים המשויכים מהשרת.
    הערה: קובצי אירועים נפרדים של הגלאי ייווצרו לאחר כל מדידת VSANS, קובץ אירועים אחד עבור כל גלאי פעיל (לדוגמה, גלאי קדמי, אמצעי ו/או אחורי).
  2. סל את נתוני הפיזור לסלי הזמן הרצויים באמצעות הפקודה events=Rebin(filename ) ואחריה הפקודה events.do_rebinning(timebins), שבה שם קובץ הקלט מתאים לשם קובץ נתוני SANS הרצוי, וסלי הזמן הם רשימה של גבולות סל הזמן הרצוי בשניות.
    הערה: אם סלי הזמן של הקלט מוזנים כמספר יחיד במקום כרשימה, הנתונים יאוגדו למספר N של סלים עם רוחב זמן שווה, כאשר N הוא סלי הזמן של הקלט (ראה סקריפטים של תוכנה המסופקים על-ידי beamline ומאגר קוד פתוח מקווןזמין 64).
  3. צמצם את נתוני הפיזור באמצעות התוכנה שסופקה לקו65.

9. נתח את נתוני TR-SANS.

  1. חשב את זמן התהליך של עניין (tprocess) מזמני המדידה באמצעות משוואה (2).
    תהליך t = ti - tלהפסיק + tעיכוב (2)
    כאשר ti הוא סל זמן המדידה המתחיל לאחר עצירת הזרימה, tstop הוא זמן המדידה מיד כאשר הזרימה נעצרת, ו- tdelay הוא זמן ההשהיה.
  2. התווה את העוצמה I(q) התלויה ב- q כפונקציה של זמן התהליך באמצעות סלי הזמן שהוגדרו בשלב 8.2ותהליך t המחושב בשלב 9.1.
    הערה: זמן התהליך הנגיש המוקדם ביותר מוגבל על-ידיעיכוב. כדי למדוד נקודות זמן קודמות של תהליך, הגדל את קצב הזרימה הכולל (Q) או הקטן את נפח הריק הכולל (Vvoid).
  3. חלץ את הפרמטרים הקינטיים המעניינים מהשינוי ב- I(q) כפונקציה של זמן תהליך.

10. סיימו את הניסוי.

  1. כבה את קרן הנייטרונים על ידי סגירת תריס המכשיר המקומי.
  2. בצע בדיקת קרינה באמצעות מוניטור קרינה המסופק על ידי קו הקרן לפני ניתוק חלקים, צינורות או פריקת דגימות או מיכלי דגימה מעורבים.
  3. העבירו את המזרקים, הצינוריות ומיכל הדגימה המעורבת למחלקה לפיסיקה בריאותית.
  4. מלאו טפסים לפיסיקה רפואית והמתינו להערכה על ידי אנשי פיסיקה רפואית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

נתוני הנייטרונים המייצגים המוצגים כאן מודדים קינטיקה של חילופי שומנים בנוכחות מתיל-β-ציקלודקסטרין (mβCD), תוסף המזרז את חילופי השומנים בין שלפוחיות עם שער החליפין (ke)66,67. מחקרים פלואורסצנטיים קודמים הראו כי ke תלוי בריכוז mβCD, וזמן מחצית החיים של תהליך ההחלפה הוא בסדר גודל של דקות68. הניסויים הנוכחיים משתמשים בזרימה עצורה TR-SANS כדי למדוד את חילופי השומנים המזורזים על ידי mβCD בין בועיות בסקאלת הזמן של שניות. הוכנו שתי אוכלוסיות שלפוחית שומנים מובחנות איזוטופית; אוכלוסיית שלפוחיות אחת הוכנה עם ליפידים מוקשים בזנב של דימיריסטואילפוספטידילכולין (DMPC) (בועיות H-ליפידים באיור 5), ואוכלוסיית השלפוחיות השנייה הוכנה עם ליפידים DMPC (DMPC-d54) נטולי זנב (שלפוחיות D-ליפידים באיור 5). חלק שומה של 0.05 (5 mol%) של שומנים טעונים dimyrisotylphosphatidylglyercol (DMPG) נוסף הן אבקות DMPC ו DMPC-d54 שומנים יבשים כדי לקדם היווצרות שלפוחית unilamellar69.

תמיסות H-שלפוחית ושלפוחית D נפרדות הוכנו על ידי לחות יריעות השומנים בהתאמה בממס המכיל 45% על ידי מים כבדים נפח (D 2O) ו 55% על ידי מים נפח (H2O). הרכב הממס D 2 O/H2O חושב כך שצפיפות אורך פיזור הנייטרונים (ρ) של הממס תאמה תערובת אקראית של H-ליפידים ו-D-ליפידים (Δρ = ρליפידים- ρממס = 0). במילים אחרות, שלפוחית H/D מעורבת באופן אקראי תהיה "בלתי נראית" לנייטרונים ותיצור אפס פיזור נייטרונים קוהרנטי. תמיסות שלפוחית Unilamellar הוכנו על ידי הפשרת הקפאה של התמיסות חמש פעמים ולאחר מכן שחול התמיסות הבודדות דרך מסנן פוליקרבונט עם נקבוביות בקוטר 100 ננומטר. תמיסות השלפוחית נמתחו הלוך ושוב בין שני מזרקים והמסנן בסך הכל 31 פעמים ב -30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, נפח קטן של תמיסת mβCD מרוכזת שהוכנה באותה תערובת ממס D 2 O/H2Oהתווסףלתמיסות השלפוחית. ריכוז השומנים הסופי היה 14 mmol / L (mM) וריכוז mβCD היה 30 mM. תמיסות השלפוחית הבודדות היו שוות משקל במשך 30 דקות לפחות עם mβCD שנוסף לפני שהתמיסות הועמסו לתוך מזרקי הדגימה במכשיר הערבוב של זרימה עצורה.

דוגמה לקצבי ספירת הנייטרונים הנמדדים על פני מחזורי הזרקה מרובים מוצגת באיור 4A. כל מחזור כלל 9 שלבי שטיפה, שלב ייבוש אחד ושלב הזרקת דגימה אחד. רק קצבי הספירה הנמדדים על מרכבה הגלאי האמצעי במכשיר VSANS מוצגים לבהירות. מגמות דומות נמצאו בקרון הגלאי הקדמי, אשר תאמו לנתונים שנאספו בזוויות פיזור גדולות יותר או בערכי q גבוהים יותר. קצב הספירה זינק עם כל הזרקת ממס שטיפה (ממס S1 וממס S2) וחזר לספירה הבסיסית של התא הריק כאשר הממס נדחף החוצה מהתא עם גז חנקן והתייבש. שטיפת התא האחרונה הייתה עם S2, שהיה אתנול בדוגמה זו, והתא יובש בפעם האחרונה עם גז חנקן במשך 3 דקות לפני הזרקת הדגימה. זמן קצר לאחר הזרקת הדגימה לתא, קצב ספירת הנייטרונים זינק, והנתונים נאספו ברציפות במשך 5 דקות. המדגם המייצג שהוזרק בנתוני הדוגמה באיור 4A היה רקע של חיץ מלח. התנודות בעוצמה הנמדדת לאורך זמן משקפות את השינויים בקצב ספירת הנייטרונים ברקע ואינן משקפות שינוי בהרכב המדגם הממוצע. המחזור המלא של שטיפה, ייבוש, ערבוב והזרקת דגימה חזר על עצמו פעם נוספת בדוגמה באיור 4A, כאשר כל מחזור נמשך בסך הכל 15 דקות.

תמיסות שלפוחית השומנים הבודדות המסומנות בתווית H ו- D עורבבו בזמןתערובת t וזרמו מיד לתא הדגימה. קצב ספירת הנייטרונים שנמדד זינק ואז הגיע לערך מקסימלי כאשר תא הדגימה התמלאבמילוי t, כפי שמוצג באיור 4B. הזמן שחלף הדרוש למילוי תא הדגימה נקרא זמן ההשהיה t delay והוא נתון על ידי tdelay = tfill- tmix. אם נפח הריק (V void) בין המערבל לתא הדגימה ידוע וקצב הזרימה הכולל (Q) ידוע, ניתן לחשב גםאת t delay כ- t delay = Vvoid/Q (ראה שלב פרוטוקול 4.3.2), שהוא גם זמן השהייה הממוצע של הדגימה הנוזלית להיכנס למיקסר ולצאת מתא הדגימה. לאחר שהגיעלמילוי t, הזרימה נמשכה בקצב זרימה קבוע כדי להבטיח שהתא התמלא והגיע למצב יציב. הזרימה נעצרה מידבעצירה. קצב ספירת הנייטרונים הממוצע נשאר קבוע כפונקציה של זמן המדידה ביןt מילוי לעצירת t מכיוון שקצב הזרימה דרך תא הדגימה היה קבוע, ולכן הדגימה בנתיב קרן הנייטרונים הייתה במצב יציב. במילים אחרות, הנתונים שנמדדו ב-t stop תואמים למדגם שעורבב והתפתח על ידי tdelay = tfill- tmix = Vvoid/Q. זמני המדידה המאוגדים tשאספתי מיד לאחרt stop הם הנתונים הקינטיים העיקריים המעניינים.

באיור 4C, ספירת הנייטרונים מדגימת בועיות השומנים המעורבים בשלוש טמפרטורות שונות משורטטת כפונקציה של סקאלת הזמן של התהליך המתוקן (תהליך t), שהוא זמן התהליך המעניין שתוקן עבור תקופת הזרימה במצב יציב וזמן השהיה. סולם הזמן של התהליך חושב על ידי t process = ti- t stop + tdelay, או שווה ערך,t process = ti- t stop + t fill- tmix. נתוני SANS נאספו ברציפות באיור 4 במה שנקרא מצב אירוע. במהלך איסוף נתוני מצב אירוע, כל אירוע נייטרונים שזוהה נרשם עם חותמת זמן ייחודית ומיקומו x ו- y על גלאי הנייטרונים הדו-ממדי. לאחר מכן נתוני מצב אירוע מעובדים לאחר מכן לסלי הזמן הרצויים (ti) באיור 4B.

נתוני מצב אירוע בתוך חלון הזמן הנגיש של התהליך (כלומר, פיזור נייטרונים שנאספו בכל ti לאחרעצירת t באיור 4B) שוחזרו לתמונת גלאי דו-ממדית (2D) עבור סל הזמן הזה באמצעות פרוטוקולים וסקריפטים הזמינים במאגר הקוד הפתוחהמקוון 64. לאחר מכן כל תמונת גלאי דו-ממדית עובדה באמצעות שגרות הפחתת נתונים כדי להחסיר את מקורות הרקע השונים, לתקן את העברת הדגימה ואת יעילות הגלאי, ולשלב באופן אזימוטאלי את נתוני הגלאי הדו-ממדי בעוצמה (I) לעומת וקטור פיזור (q)תרשים 65. הנתונים באיור 5 אוגדו לסלי זמן שווים (3 שניות) והם מייצגים את המידע תלוי זמן ואורך שניתן לקבל ממדידת TR-SANS. בדומה לקצב ספירת הגלם הכולל המוצג באיור 4B, העוצמה I(q) התלויה ב-q פוחתת עם הזמן כאשר השומנים בעלון החיצוני מתחלפים ומתערבבים באופן אקראי בין שלפוחיות שונות.

הנתונים מוצגים באיור 5 עבור קינטיקה של החלפת שומנים שנמדדה ב-3 טמפרטורות שונות. כל חלקה מציגה את הנתונים שנאספו במשך 110 הדקות הראשונות לאחר הערבוב. העוצמה הנמדדת יורדת בסדר גודל בערכי ה- q הנמוכים ביותר ב- 36 ° C ו- 30 ° C, המתאימים לשלב נוזל השומנים. בינתיים, נתוני העוצמה המפוזרת משתנים באופן איטי משמעותית עם הזמן ב -20 מעלות צלזיוס, מה שמצביע על כך שהקינטיקה של החלפת העלונים החיצוניים איטית בהרבה בשלב ג'ל השומנים.

עוצמת הפיזור הנמדדת, I(q), קשורה לניגודיות SLD כEquation 1- , כאשר Δρ הוא הפרש SLD בין השלפוחית לבין הממס שמסביב. ניגודיות SLD ממוצעת זו קשורה ישירות למספר היחסי של H-ליפידים וליפידים D בשלפוחית בכל זמן נתון. ככזה, ניתן לנרמל את עוצמת הפיזור הנמדדת בזמן נתון כדי לקבוע את החלק של אוכלוסיית השומנים שהוחלפה. נורמליזציה זו מושגת על ידי איסוף שתי מדידות נוספות, כולל: (1) העוצמה הנמדדת I(0) בזמן t = 0, כאשר אין חילופי שומנים בין שלפוחיות, ו (2) העוצמה הנמדדת I(∞) בזמן t = ∞, כאשר כל השומנים התחלפו והאוכלוסיות התאזנו. קצב הספירה המנורמל, 42, Equation 2 מתואר כפונקציה של זמן התהליך עבור הטמפרטורות השונות באיור 6. בדוגמה זו, I(t) היא העוצמה המשולבת q בזמן התהליך t (עוצמה מופחתת רקע משולבת כפונקציה של q), I(∞) היא העוצמה המשולבת q בזמן אינסופי לאחר שכל השומנים התחלפו (מה שאמור להיות דומה לפיזור הרקע הממס), ו- I(0) הוא ה- q משולב עוצמה בזמן t = 0 (ללא החלפת שומנים). I(0) נמדד עבור מדגם מעורב מתחת לטמפרטורת מעבר הפאזה ב-20°C שבו ההחלפה הייתה איטית, ו-I(∞) נמדד במדגם נפרד שהתאזן במשך יותר מ-36 שעות ב-40°C והחליף באופן מלא ליפידים H וליפידים D.

קצב הספירה המנורמל אמור לדעוך מ-R(t) = 1 בזמן התהליך t = 0, ל-R(t) = 0 ב-t = ∞, והוא קשור ישירות לניגודיות SLD במדגם ולכן למידת חילופי השומנים 27,28,29,30,31,32,33,34,35 . שימו לב שנתוני R(t) המוקדמים ביותר שנמדדו אינם מתחילים ב-R(t)=1 ב-30°C וב-36°C, מה שמצביע על כך שכמות משמעותית של חילופי שומנים התרחשה במהלך 3 השניות הראשונות לאחר הערבוב, שלא הייתה נגישה בניסוי בגלל זמן ההשהיה (עיכוב t = 2.4 שניות) של פרוטוקול ערבוב הזרימה המופסקת. בינתיים, R(t) שנמדד ב 20 ° C נשאר קבוע בערך במשך 2-3 הדקות הראשונות. עבור קינטיקה של החלפת שומנים שנמדדה ב-30°C וב-36°C, R(t) דעך במהירות ל-0.5 ≈ בתוך 100 שניות, מה שמרמז על כך ששומני העלון החיצוניים התחלפו לחלוטין והתאזנם תוך דקות. בהתאם לכך, לכידת חילופי השומנים המזורזים על ידי mβCD התאפשרה באמצעות SANS עצור זרימה והיה קשה ללכוד באמצעות ערבוב פיפטה ידני. לכידת נקודות זמן תהליך מוקדמות עוד יותר (t < 3 שניות) תדרוש סוג מערבל שונה עם נפח ריק קטן יותר, נפחי ריק צינורות קטנים יותר וקצבי זרימה כוללים גבוהים יותר כדי להקטין את זמן ההשהיה.

ה-R(t) המשיך לדעוך בזמנים ארוכים יותר כאשר כפכפי השומנים מתהפכים בין העלעלים הפנימיים והחיצוניים. ניתן לאסוף נתוני TR-SANS עבור תהליך הכפכפים האיטי יותר (t > 5 דקות) עם דגימות בדידות מעורבבות ביד ונטענו לתאים לדוגמה סטנדרטיים של SANS, מכיוון ששיטת ערבוב פיפטה ידנית אורכת כ- 5 דקות. באופן דומה, חילופי השומנים ב -20 מעלות צלזיוס בשלב ג'ל השומנים היו איטיים מספיק כדי להיות מעורבבים ונמדדים בדיסקרטיות, ולא בהכרח היה צורך ללמוד מדידה זו בשיטת ערבוב הזרימה המופסקת. מדידות של תהליכים קינטיים בסקאלות זמן של מספר דקות עד שעות יעילות יותר כאשר הדגימות מעורבבות על ידי ערבוב פיפטה ידני. עם זאת, תהליכים קינטיים בסקאלות זמן של פחות מדקות ידרשו ערבוב זרימה עצורה והליך מדידה TR-SANS זה.

Figure 4
איור 4: נתוני קצב ספירת נייטרונים גולמיים מייצגים שנאספו במהלך מחזורי הזרקת ערבוב וניקוי . (A) דוגמה לקצב ספירת נייטרונים (גלאי אמצעי) כפונקציה של זמן במהלך רצפי שטיפה חוזרים, רצף ייבוש ורצף הזרקת דגימה מעורבת על פני מחזורים מרובים. הדגימה ב-(A) הייתה רקע של חיץ מלח, והשינויים בעוצמתו לאורך זמן משקפים את השינויים בקצב ספירת הרקע, ולא שינוי בדגימה. (B) קצב ספירת נייטרונים מנורמל לניטור כפונקציה של זמן הניסוי לאחר הזרקת שלפוחיות H-ליפיד ו-D מעורבות ב-30°C. הקווים המקווקווים האנכיים מציינים את זמן התחלת הערבוב (tmix), את זמן המילוי (tfill), את זמן עצירת הזרימה (tstop) ואת אזור הזמן binning (ti). הדעיכה בקצב הספירה לאחרעצירת t נובעת מאובדן הניגודיות בדגימה כחילופי השומנים בין השלפוחיות. (C) ניטור קצבי ספירת נייטרונים מנורמלים כפונקציה של זמן תהליך החליפין עבור 100 השניות הראשונות של הניסוי ב-20°C (כחול), 30°C (ירוק) ו-36°C (אדום). נתוני מצב האירוע מעובדים לסלים של 1 שניות. קיצורים: S1 = ממס 1; S2 = ממס 2; t mix = זמן ניסוי שבו פתרונות הדגימה מעורבים; t fill = זמן הניסוי שבו תא הדגימה מתמלא; t stop = זמן ניסוי שבו נעצרת הזרימה; תהליך t = תהליך קינטי מחושב זמן עניין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: איור של חילופי זרזים של השכבה החיצונית של בועיות השומנים ושינויים מקבילים בעוצמה המפוזרת (I) כפונקציה של וקטור הפיזור (q) בטמפרטורות שונות. סכמטי המראה חילופי שומנים בין H-lipid ו- D-lipid vesicles לאחר (A) ערבוב ראשוני ב t = 0 ו (B) חילופי השכבה החיצונית מזורז על ידי methyl-β-cyclodextrin (mβCD). עוצמת פיזור נייטרונים מופחתת כפונקציה של וקטור גל פיזור q. ניסויי ערבוב זרימה עצורה ומדידות VSANS חזרו על עצמם ב-(C) 36°C, (D) 30°C ו-(E) 20°C. הנתונים המוצגים אוגדו למרווחים של 3 שניות במהלך 10 הדקות הראשונות לאחר ערבוב בכל טמפרטורה שצוינה. פסי שגיאה הם אי-הוודאות המופצת מסטטיסטיקת הספירה ומייצגים סטיית תקן אחת. קיצורים: ke = קבוע קצב לחילופי שומנים בין שלפוחיתיים; mβCD = מתיל-β-ציקלודקסטרין; kf = קבוע קצב לחילופי שומנים בין עלונים, המכונה גם ליפ-פלופ שומנים; l(q) = עוצמת SANS נמדדת עם יחידות של cm-1 ; q = וקטור פיזור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: עוצמה מנורמלת מפוזרת המתאימה לחלק השומנים המוחלפים שניתן למדל כדי לחלץ קבועי קצב עבור התהליכים הקינטיים המעניינים. (A) חילופי שומנים בין העלון החיצוני של השלפוחיות המתרחשים בסקאלות זמן בין 3 שניות ל-600 שניות הנמדדות ב-20°C (כחול), 30°C (שחור) ו-36°C (אדום). הכניסה באיור מתקרבת ל-60 השניות הראשונות של התהליך הקינטי. פסי שגיאה הם אי-הוודאות המתפשטת מהאינטגרציה המספרית של עוצמות הפיזור ומייצגים סטיית תקן אחת. קיצורים: R(t) = עוצמה מפוזרת מנורמלת; תהליך t = תהליך מתוקן זמן עניין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ההליך הנוכחי מתאר את התקן הערבוב ואת השלבים לביצוע מדידות TR-SANS של זרימה עצורה. המכשיר והפרוטוקול מותאמים לדגימות נוזלים בצמיגות נמוכה שבהן סקאלות הזמן המעניינות הן ≈1 שניות עד 5 דקות. עבור טווחי זמן גדולים מ-5 דקות, ערבוב ידני של הדגימות והטענתן לתאי פיזור סטנדרטיים עשוי להיות קל ורצוי יותר, במיוחד עבור דגימות, ג'לים או משחות בעלי צמיגות גבוהה. גישה לטווחי זמן של פחות מ-1 שניות דורשת מנגנון ערבוב שונה, נפחי ריק כוללים נמוכים יותר וקצבי זרימה כוללים גבוהים יותר כדי להפחית את זמן ההשהיה. חשוב גם לציין כי חקר תהליכים קינטיים בסקאלות זמן קצרות אלה ידרוש ככל הנראה זריקות דגימה חוזרות ונשנות כדי לצבור סטטיסטיקות ספירת פיזור מספיקות בסקאלת הזמן של אלפיות השנייה עם TR-SANS. אם נפחי הדגימה הכוללים מוגבלים, ייתכן שרצוי להשתמש בטכניקת שטף גבוהה יותר, כגון פיזור אור או פיזור קרני רנטגן, הדורשת פחות זריקות דגימה או פחות נפח דגימה לכל הזרקה, בהנחה שקיים ניגודיות פיזור מספקת עם פיזור אור או קרני רנטגן.

גישת SANS מודולרית זו של זרימה עצורה יוצרת מספר יתרונות וחסרונות עיקריים בהשוואה למכשירי זרימה עצורה הזמינים באופן מסחרי ועברו אופטימיזציה לניסויי פיזור נייטרונים. היתרונות העיקריים כוללים (1) מדידות TR-SANS לסירוגין בין תאי דגימה שונים במהלך תקופות שטיפה כדי למקסם את השימוש בזמן קרן נויטרונים, (2) התאמת מספר המזרקים, נפחי המזרקים וסוגי המערבלים עבור ערבוב דגימות טרינרי או דרישות ערבוב דגימות מורכבות יותר, ו-(3) מתן אפשרות לפרקי מדידה ארוכים יותר על ידי בידוד תא הדגימה וביטול דיפוזיה אחורית בסקאלות זמן ארוכות יותר (>10 דקות). למרות שלא יושם כאן, המודולריות של תכנון תא הערבוב תאפשר גם איסוף נתונים בו זמנית עם שיטות מדידה מרובות, כגון סירוק SANS, UV-Vis ומדידות פלואורסצנטיות70. שני חסרונות עיקריים של התקנה מודולרית זו כוללים: (1) זמני השהיית ערבוב ארוכים יחסית (1 שניות עד 3 שניות) בהשוואה למערכות אחרות שיכולות לספק זמני השהיה של 1 אלפית השנייה עד 100 אלפיות השנייה, ו-(2) טווח טמפרטורות הפעלה קטן יותר (10 ° C עד 50 ° C) בהשוואה למערכות זמינות אחרות שיכולות לגשת לטמפרטורות הפעלה מ -20 ° C עד יותר מ -80 ° C.

איסוף נתוני SANS ראשוניים על הדגימות המעניינות לפני ביצוע ניסויי ערבוב באתרם חשוב לאיסוף נתוני TR-SANS הטובים ביותר, במיוחד בניסויים שנועדו לנטר קינטיקה של חליפין מולקולרי, כמו הדוגמה המוצגת כאן. קביעת ערכים מדויקים של I(0) ו- I(∞) היא קריטית לחישוב ערכים מדויקים של העוצמה המנורמלת, R(t), המעוצבת כדי לחלץ את הפרמטרים הקינטיים הרצויים. ניתן לחשב את הערך של I(0) ישירות מעוצמות הפיזור הנמדדות של מלאי שלפוחית H ושלפוחית D, וניתן לקבוע את I(∞) על ידי הכנת דגימת שלפוחית נפרדת שהוכנה מתערובת 50/50 של H-lipids/D-lipids. ניתן להשתמש בנתוני הפיזור מדגימות בקרה אלה גם כדי לקבוע את תצורת מכשירי טווח ה-Q וה-SANS האופטימלית עבור מדידת TR-SANS כדי למקסם את האות ולאמת את התקדמות קינטיקה של חליפין במהלך ניסויי TR-SANS. אם העוצמה הנמדדת בנקודת הזמן הראשונה לאחר הערבוב אינה שווה ל- I(0) המחושב, ייתכן שיהיה צורך בזמני ערבוב מהירים יותר כדי ללכוד את כל תהליכי העניין. לאחר שהעוצמה הנמדדת הגיעה ל-I(∞), תהליך ההחלפה הושלם, וניתן לרוקן ולנקות את התא לקראת הזריקה הבאה.

כדי לערבב בהצלחה דגימת נוזל עבור TR-SANS, חיוני לוודא שכל המזרקים, השסתומים וקווי הצינורות דרוכים ונטולי אוויר, ושכל חיבורי הצינורות מאובטחים כדי למנוע דליפה. אי ביצוע נכון של שלבים קריטיים אלה עלול לגרום לנפחי ערבוב לא מדויקים או לעוצמות פיזור מוחלטות לא מדויקות. לדוגמה, בועות אוויר הכלואות בתוך תא הדגימה יפחיתו את עוצמת ה-SANS הנמדדת בגלל נפח דגימה מופחת בנתיב קרן הנייטרונים. לחלופין, בועות אוויר יכולות לייצר "פסים" או "התלקחויות" בעוצמה גבוהה על הגלאי עקב שבירת קרן בממשק אוויר-נוזל. שינויים בלתי צפויים בעוצמת הפיזור הנמדדת לאורך זמן עשויים להצביע על ערבוב דגימה לקוי, דליפת שסתומים, בועות אוויר בתא הדגימה או דיפוזיה אחורית של הדגימה.

איסוף מדידת שידור עבור כל דגימה במהלך ניסוי TR-SANS הוא קריטי להפחתת הנתונים שנאספו לעוצמה מוחלטת. ניתן לאסוף בו-זמנית נתוני פיזור ושידור בחלק ממכשירי SANS, דבר המפשט את התכנות הכולל של רכישת נתוני TR-SANS; עם זאת, הדבר אינו אפשרי בכל המכשירים, כולל מכשיר VSANS המשמש בפרוטוקול זה. מכיוון שמדידות העברת הדגימה ופיזור הדגימה דרשו תצורות שונות של מכשירים, נאספו מדידות השידור בסוף מדידות הפיזור (שלב פרוטוקול 7.2.4) כדי להבטיח שנתוני הפיזור נמדדו בנקודות הזמן המוקדמות ביותר לאחר הזרקת הדגימה לתא. השידור תלוי רק בהרכב היסוד הכולל, אורך נתיב הדגימה ואורך גל הנייטרונים. לכן, השידור לא אמור להשתנות אם הרכב היסוד הכולל נשאר קבוע לאורך כל הניסוי שנפתר בזמן. הבדלים גדולים בערכי השידור בין ריצות חוזרות ונשנות של אותה דגימה מצביעים על בעיה כתוצאה מנפחי דגימה לא עקביים, מילוי לא שלם של תא הדגימה, בועות אוויר, או דליפת שסתום וזרימה חוזרת של הדגימה במהלך הניסוי.

יתרון ייחודי של TR-SANS הוא שהעוצמה הנמדדת תלויה בווקטור הפיזור (q) וניתן להשתמש בה כדי לחקור שינויים מרחביים בקנה מידה ננומטרי. בשילוב עם התקן ערבוב זרימה עצורה, TR-SANS יכול לחקור שינויים ננומטריים אלה בסקאלות הזמן השנייה עד הדקה, ולספק תובנות לגבי הרכבה עצמית והחלפה של חומרים פעילי שטח ושומנים, צבירת פולימרים וחלבונים עם הוספה מעוררת, צמיחה ודעיכה של ננו-חלקיקים, או החלפת מוצרים עטופים באמולסיות. ניתן להגדיר את התקן הזרימה המופסקת עם משאבות מזרקים ומזרקים לדוגמה מרובים כדי להקל על ערבוב של שתי דגימות נוזליות או יותר. גמישות זו מאפשרת חקירה שיטתית של תוספים על הקינטיקה של עניין. לדוגמה, ניתן לערבב נפחים שונים של תמיסת פפטיד אנטי-מיקרוביאלית מרוכזת עם תמיסות H-שלפוחית ו-D-vesicle כדי לחקור את ההשפעות של ריכוז פפטיד על קינטיקה של חילופי שומנים45,46. בנוסף, מכיוון שכל נתיבי הנוזל האטומים עטופים במארז מבוקר טמפרטורה, הכולל את מזרקי הדגימה, השסתומים, המערבלים והצינורות, ניתן לשנות את טמפרטורת המערכת כדי לחלץ את הפרמטרים התרמודינמיים הקשורים לתהליכים הקינטיים המעניינים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgments

הגישה ל-NG3 VSANS סופקה על ידי המרכז לפיזור נויטרונים ברזולוציה גבוהה, שותפות בין המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה והקרן הלאומית למדע תחת הסכם מס' DMR-2010792. M.H.L.N מכירה במימון שניתן על ידי Mitacs Globalink (קנדה). הזיהוי של מוצרים מסחריים או שמות מסחריים כלשהם נועד לטפח הבנה ואינו מרמז על תמיכה או המלצה של המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynamic mixer Analytical Scientific Instruments 462-0150A Magnetically coupled rotor, binary dynamic mixer assembly (ternary type available), 0.15 mL dead volume (larger dead volume available)
Fluoropolymer tubing IDEX Health & Science 1507L PFA Tubing Natural 1/16 inch OD x 0.040 inch ID x 50 ft
Fluoropolymer 1/4-28 flangeless fittings IDEX Health & Science XP-245 PFA flangeless fitting with ferrules, 1/4-28 threading, 1/16 inch OD tubing
Glass syringes Hamilton Company 81660 Hamilton 1000 series syringes, 10 mL (81660), model 1010 C syr, 1/4"-28 thread termination, other volumes available
High-pressure flow selector valves Vici Valco C85X-1570EUTB Vici 10 position selector valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure switch valves Vici Valco C82X-1574EUHB Vici 4 port switch valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure syringes Cetoni A2019000358 3 mL stainless steel syringe, 510 bar max, 21 mL/min flow rate max
Low-pressure flow selector valves Vici Valco C25-3180EUHB Vici 10 position selector valves, max 250 psi liquid, 0.75 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 1/4-28 threaded ports, USB universal actuator
neMESYS high-pressure syringe pumps Cetoni A3921000103 Max force 2600 N
neMESYS mid-pressure syringe pumps Cetoni A3921000131 Max force 1000 N
Power supply Cetoni A3921000127 Base 600, supplies power for up to 4 high pressure pumps
Quartz flow-through sample cell Starna Scientific 3-2.30-Q-1/TC Quartz micro flow cells, 2 mm path length (1 mm available), 2 mm by 2 mm by 30 mm internal dimension
Quartz windows Technical Glass Products NA GE 124 Clear fused quartz ground and polished plates, 11.75 inch by 23.75 inch by 0.375 inch thick
Stainless steel 10-32 coned compression fittings IDEX Health & Science U-321X, U-320X 316 stainless steel ferrule (U-321X) and nut (U-320X) -Valco type, 10-32 coned, for 1/16 inch OD stainless steel tubing
Stainless steel tubing IDEX Health & Science U-102 Stainless Steel Tubing 1/16 inch OD x 0.020 inch ID, 10 cm, various precut lengths available
Syringe pump control software Cetoni T6000000004 QmixElements software for nemesys pumps, QmixSDK software development kit
Thermoelectric air conditioner EIC Solutions AAC-140C-4XT-HC Thermoelectric air conditioner mounted on insulated enclosure to control the pump, valve, mixer, and sample temperature
T-slot railing McMaster-Carr 47065T103 Aluminum t-slotted railing (1.5 inch by 1.5 inch) cut to various lengths
Vapor locking bottle caps  Cole-Parmer EW-12018-02 Four 304 SS port inserts, 1/4"-28 threads, GL45 bottle cap size, PTFE body, SS threads, PP collar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Melnichenko, Y. B., Wignall, G. D. Small-angle neutron scattering in materials science: Recent practical applications. Journal of Applied Physics. 102 (2), 021101 (2007).
  2. Grillo, I. Small-angle neutron scattering and applications in soft condensed matter. Soft Matter Characterization. Borsali, R., Pecora, R. , Springer. Dordrecht. (2008).
  3. Hollamby, M. J. Practical applications of small-angle neutron scattering. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (26), 10566-10579 (2013).
  4. Pipich, V., Fu, Z. KWS-3: Very small angle diffractor with focusing mirror. Journal of large-scale research. 1, 31 (2015).
  5. Kline, S. 2019 NCNR Annual Report, Special Publication (NIST SP). , National Institute of Standards and Technology. Gaithersburg, MD. (2019).
  6. Gilbert, P. H., et al. Preservative induced polysorbate 80 micelle aggregation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 10 (6), 2395-2404 (2021).
  7. Terashima, T., et al. In situ and time-resolved small-angle neutron scattering observation of star polymer formation via arm-linking reaction in ruthenium-catalyzed living radical polymerization. Macromolecules. 43 (19), 8218-8232 (2010).
  8. Hashimoto, K., Fujii, K., Nishi, K., Shibayama, M. Ion gel network formation in an ionic liquid studied by time-resolved small-angle neutron scattering. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (40), 9419-9424 (2018).
  9. Conn, C. E., et al. Membrane protein structures in lipid bilayers; small-Angle neutron scattering with contrast-matched bicontinuous cubic phases. Frontiers in Chemistry. 8, 619470 (2021).
  10. van't Hag, L., et al. Protein-eye view of the in meso crystallization mechanism. Langmuir. 35 (25), 8344-8356 (2019).
  11. Mahieu, E., et al. Observing protein degradation by the PAN-20S proteasome by time-resolved neutron scattering. Biophysical Journal. 119 (2), 375-388 (2020).
  12. Ibrahim, Z., et al. Time-resolved neutron scattering provides new insight into protein substrate processing by a AAA+ unfoldase. Scientific Reports. 7 (1), 40948 (2017).
  13. Hollamby, M. J., et al. Growth of mesoporous silica nanoparticles monitored by time-resolved small-angle neutron scattering. Langmuir. 28 (9), 4425-4433 (2012).
  14. Blin, J. L., Impéror-Clerc, M. Mechanism of self-assembly in the synthesis of silica mesoporous materials: in situ studies by X-ray and neutron scattering. Chemical Society Reviews. 42 (9), 4071-4082 (2013).
  15. Impéror-Clerc, M., Grillo, I., Khodakov, A. Y., Durand, D., Zholobenko, V. L. New insights into the initial steps of the formation of SBA-15 materials: an in situ small angle neutron scattering investigation. Chemical Communications. 8, 834-836 (2007).
  16. Narayanan, T., Rüter, A., Olsson, U. SAXS/WAXS investigation of amyloid-β(16-22) peptide nanotubes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 654349 (2021).
  17. Angelov, B., et al. DNA/Fusogenic lipid nanocarrier assembly: millisecond structural dynamics. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (11), 1959-1964 (2013).
  18. Amann, M., et al. Kinetic pathways for polyelectrolyte coacervate micelle formation revealed by time-resolved synchrotron SAXS. Macromolecules. 52 (21), 8227 (2019).
  19. Varga, Z., Wacha, A., Bóta, A. Osmotic shrinkage of sterically stabilized liposomes as revealed by time-resolved small-angle X-ray scattering. Journal of Applied Crystallography. 47 (1), 35-40 (2014).
  20. Panine, P., Finet, S., Weiss, T. M., Narayanan, T. Probing fast kinetics in complex fluids by combined rapid mixing and small-angle X-ray scattering. Advances in Colloid and Interface Science. 127 (1), 9-18 (2006).
  21. Grillo, I. Applications of stopped-flow in SAXS and SANS. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 14 (6), 402-408 (2009).
  22. Gomez-Hens, A., Perez-Bendito, D. The stopped-flow technique in analytical chemistry. Analytica Chimica Acta. 242, 147-177 (1991).
  23. Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. Use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the ATP turnover cycle of kinesins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52142 (2014).
  24. Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of stopped-flow kinetics methods to investigate the mechanism of action of a DNA repair protein. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1874 (2010).
  25. Raney, K. D., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. A fluorescence-based assay for monitoring helicase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6644-6648 (1994).
  26. Roder, H., Maki, K., Cheng, H. Early events in protein folding explored by rapid mixing methods. Chemical reviews. 106 (5), 1836-1861 (2006).
  27. Milon, A., et al. Osmotic swelling of unilamellar vesicles by the stopped-flow light scattering method. Influence of vesicle size, solute, temperature, cholesterol and three α,ω-dihydroxycarotenoids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 859 (1), 1-9 (1986).
  28. Gast, K., Nöppert, A., Müller-Frohne, M., Zirwer, D., Damaschun, G. Stopped-flow dynamic light scattering as a method to monitor compaction during protein folding. European Biophysics Journal. 25 (3), 211-219 (1997).
  29. Antoun, A., Pavlov, M. Y., Tenson, T., Ehrenberg, M. M. Ribosome formation from subunits studied by stopped-flow and Rayleigh light scattering. Biological Procedures Online. 6, 35-54 (2004).
  30. Zhu, Z., Armes, S. P., Liu, S. pH-Induced micellization kinetics of ABC triblock copolymers measured by stopped-flow light scattering. Macromolecules. 38 (23), 9803-9812 (2005).
  31. Ye, J., et al. Comparative study of temperature-induced association of cyclic and linear poly(N-isopropylacrylamide) chains in dilute solutions by laser light scattering and stopped-flow temperature jump. Macromolecules. 41 (12), 4416-4422 (2008).
  32. Liu, X., et al. Early stage kinetics of polyelectrolyte complex coacervation monitored through stopped-flow light scattering. Soft Matter. 12 (44), 9030-9038 (2016).
  33. Garman, E. F., Weik, M. X-ray radiation damage to biological samples: recent progress. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (4), 907-911 (2019).
  34. Garg, S., Porcar, L., Woodka, A. C., Butler, P. D., Perez-Salas, U. Noninvasive neutron scattering measurements reveal slower cholesterol transport in model lipid membranes. Biophysical Journal. 101 (2), 370-377 (2011).
  35. Marquardt, D., et al. 1H NMR shows slow phospholipid flip-flop in gel and fluid bilayers. Langmuir. 33 (15), 3731-3741 (2017).
  36. Egelhaaf, S. U., Olsson, U., Schurtenberger, P. Time-resolved SANS for surfactant phase transitions. Physica B: Condensed Matter. 276-278, 326-329 (2000).
  37. Tabor, R. F., Eastoe, J., Grillo, I. Time-resolved small-angle neutron scattering as a lamellar phase evolves into a microemulsion. Soft Matter. 5 (10), 2125-2129 (2009).
  38. Gradzielski, M., Bergmeier, M., Hoffmann, H., Müller, M., Grillo, I. Vesicle gel formed by a self-organization process. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (49), 11594-11597 (2000).
  39. Lee, Y. -T., Li, D. S., Pozzo, L. D. Kinetic analysis of ultrasound-induced oil exchange in oil-in-water emulsions through contrast variation time-resolved small-sngle neutron scattering. Langmuir. 35 (47), 15204-15213 (2019).
  40. Lee, Y. -T., Pozzo, L. D. Contrast-variation time-resolved small-angle neutron scattering analysis of oil-exchange kinetics between oil-in-water emulsions stabilized by anionic surfactants. Langmuir. 35 (47), 15192-15203 (2019).
  41. Roger, K., Olsson, U., Schweins, R., Cabane, B. Emulsion ripening through molecular exchange at droplet contacts. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1452-1455 (2015).
  42. Nakano, M., Fukuda, M., Kudo, T., Endo, H., Handa, T. Determination of Interbilayer and Transbilayer Lipid Transfers by Time-Resolved Small-Angle Neutron Scattering. Physical Review Letters. 98 (23), 238101 (2007).
  43. Nakano, M., et al. Flip-flop of phospholipids in vesicles: kinetic analysis with time-resolved small-angle neutron scattering. The Journal of Physical Chemistry B. 113 (19), 6745-6748 (2009).
  44. Nguyen, M. H. L., et al. Methanol accelerates DMPC flip-flop and transfer: A SANS study on lipid dynamics. Biophysical Journal. 116 (5), 755-759 (2019).
  45. Nguyen, M. H. L., et al. Peptide-induced Lipid flip-flop in asymmetric liposomes measured by small angle neutron scattering. Langmuir. 35 (36), 11735-11744 (2019).
  46. Nguyen, M. H. L., et al. Time-resolved SANS reveals pore-forming peptides cause rapid lipid reorganization. New Journal of Chemistry. 45 (1), 447-456 (2021).
  47. Xia, Y., et al. Effects of nanoparticle morphology and acyl chain length on spontaneous lipid transfer rates. Langmuir. 31 (47), 12920-12928 (2015).
  48. Xia, Y., et al. Morphology-induced defects enhance lipid transfer rates. Langmuir. 32 (38), 9757-9764 (2016).
  49. Maric, S., et al. Time-resolved small-angle neutron scattering as a probe for the dynamics of lipid exchange between human lipoproteins and naturally derived membranes. Scientific Reports. 9 (1), 7591 (2019).
  50. Nielsen, J. E., Bjørnestad, V. A., Pipich, V., Jenssen, H., Lund, R. Beyond structural models for the mode of action: How natural antimicrobial peptides affect lipid transport. Journal of Colloid and Interface Science. 582, 793-802 (2021).
  51. Willner, L., Poppe, A., Allgaier, J., Mokenbusch, M., Richter, D. TIme-resolved SANS for the determintioan of unimer exchange kinetics in block copolymer micelles. Europhysics Letters. 55 (5), 667 (2001).
  52. Lund, R., Willner, L., Stellbrink, J., Lindner, P., Richter, D. Logarithmic chain-exchange kinetics of diblock copolymer micelles. Physical Review Letters. 96 (6), 068302 (2006).
  53. Lund, R., Willner, L., Richter, D., Dormidontova, E. E. Equilibrium chain exchange kinetics of diblock copolymer micelles: Tuning and logarithmic relaxation. Macromolecules. 39 (13), 4566-4575 (2006).
  54. Lund, R., Willner, L., Richter, D. Kinetics of block copolymer micelles studied by small-angle scattering methods. in Controlled Polymerization and Polymeric Structures. Advances in Polymer Science. Abe, A., Lee, K. S., Leibler, L., Kobayashi, S. , Springer. Cham. 51 (2013).
  55. Choi, S. -H., Lodge, T. P., Bates, F. S. Mechanism of molecular exchange in diblock copolymer micelles: hypersensitivity to core chain length. Physical Review Letters. 104 (4), 047802 (2010).
  56. Choi, S. -H., Bates, F. S., Lodge, T. P. Molecular exchange in ordered diblock copolymer micelles. Macromolecules. 44 (9), 3594-3604 (2011).
  57. Lu, J., Bates, F. S., Lodge, T. P. Chain exchange in binary copolymer micelles at equilibrium: confirmation of the independent chain hypothesis. ACS Macro Letters. 2 (5), 451-455 (2013).
  58. Lu, J., Bates, F. S., Lodge, T. P. Remarkable effect of molecular architecture on chain exchange in triblock copolymer micelles. Macromolecules. 48 (8), 2667-2676 (2015).
  59. Kelley, E. G., et al. Size evolution of highly amphiphilic macromolecular solution assemblies via a distinct bimodal pathway. Nature Communications. 5 (1), 3599 (2014).
  60. Murphy, R. P., Kelley, E. G., Rogers, S. A., Sullivan, M. O., Epps, T. H. Unlocking chain exchange in highly amphiphilic block polymer micellar systems: influence of agitation. ACS Macro Letters. 3 (11), 1106-1111 (2014).
  61. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50 (6), 2484-2494 (2017).
  62. Lantz, K. A., et al. Cavitation enables switchable and rapid block polymer exchange under high-χN conditions. Macromolecules. 51 (17), 6967-6975 (2018).
  63. Murphy, R. P., et al. Capillary RheoSANS: measuring the rheology and nanostructure of complex fluids at high shear rates. Soft Matter. 16 (27), 6285-6293 (2020).
  64. Stopped Flow Sans. usnistgov. , Available from: https://github.com/usnistgov/stopped-flow-sans (2021).
  65. Kline, S. Reduction and analysis of SANS and USANS data using IGOR Pro. Journal of Applied Crystallography. 39 (6), 895-900 (2006).
  66. Doktorova, M., et al. Preparation of asymmetric phospholipid vesicles for use as cell membrane models. Nature Protocols. 13 (9), 2086-2101 (2018).
  67. Huang, Z., London, E. Effect of cyclodextrin and membrane lipid structure upon cyclodextrin-lipid interaction. Langmuir. 29 (47), 14631-14638 (2013).
  68. Sugiura, T., Ikeda, K., Nakano, M. Kinetic analysis of the methyl-β-cyclodextrin-mediated intervesicular transfer of pyrene-labeled phospholipids. Langmuir. 32 (51), 13697-13705 (2016).
  69. Scott, H. L., et al. On the mechanism of bilayer separation by extrusion, or why your LUVs are not really unilamellar. Biophysical Journal. 117 (8), 1381-1386 (2019).
  70. Dicko, C., et al. NUrF-Optimization of in situ UV-vis and fluorescence and autonomous characterization techniques with small-angle neutron scattering instrumentation. Review of Scientific Instruments. 91 (7), 075111 (2020).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 174 פיזור נייטרונים בזווית קטנה (SANS) פיזור בזמן ערבוב זרימה עצורה קינטיקה של חליפין מולקולרי ננו-חלקיקי שומנים קרומי שומנים שלפוחיות אבולוציה מבנית
מדידת התפתחות הזמן של חומרים ננומטריים באמצעות זרימה עצורה ופיזור נייטרונים בזווית קטנה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelley, E. G., Nguyen, M. H. L.,… More

Kelley, E. G., Nguyen, M. H. L., Marquardt, D., Maranville, B. B., Murphy, R. P. Measuring the Time-Evolution of Nanoscale Materials with Stopped-Flow and Small-Angle Neutron Scattering. J. Vis. Exp. (174), e62873, doi:10.3791/62873 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter