قياس تدفق الركيزة الميتوكوندريا في الخلايا المتالفة Perfringolysin O-Permeabilized
Summary
في هذا العمل، ونحن نصف بروتوكول معدل لاختبار تدفق الركيزة التنفسية الميتوكوندريا باستخدام perfringolysin O المؤتلف في تركيبة مع قياس التنفس القائم على الصفائح الدقيقة. مع هذا البروتوكول، نظهر كيف يؤثر الميتفورمين على تنفس الميتوكوندريا لخطين مختلفين للخلايا السرطانية.
Abstract
تدفق الركيزة الميتوكوندريا هو سمة مميزة لكل نوع من أنواع الخلايا، وتشارك التغيرات في مكوناته مثل الناقلين، والقنوات، أو الإنزيمات في مسببات الأمراض من عدة أمراض. يمكن دراسة تدفق الركيزة الميتوكوندريا باستخدام الخلايا السليمة، والخلايا permeabilized، أو الميتوكوندريا المعزولة. التحقيق في الخلايا سليمة يواجه العديد من المشاكل بسبب الأكسدة في وقت واحد من الركائز المختلفة. الى جانب ذلك ، تحتوي عدة أنواع من الخلايا على مخازن داخلية من الركائز المختلفة التي تعقد تفسير النتائج. طرق مثل عزل الميتوكوندريا أو استخدام عوامل البيرميلينج ليست قابلة للاستنساخ بسهولة. عزل الميتوكوندريا النقية مع الأغشية سليمة بكميات كافية من عينات صغيرة إشكالية. استخدام permeabilizers غير انتقائية يسبب درجات مختلفة من تلف غشاء الميتوكوندريا لا مفر منه. تم تقديم perfringolysin O المؤتلف (rPFO) كمطهر أكثر ملاءمة ، وذلك بفضل قدرته على اختراق غشاء البلازما بشكل انتقائي دون التأثير على سلامة الميتوكوندريا. عندما تستخدم في تركيبة مع قياس التنفس microplate، فإنه يسمح اختبار تدفق العديد من الركائز الميتوكوندريا مع ما يكفي من يكرر داخل تجربة واحدة أثناء استخدام الحد الأدنى من عدد الخلايا. في هذا العمل، يصف البروتوكول طريقة لمقارنة تدفق الركيزة الميتوكوندريا من اثنين من الأنماط الظاهرية الخلوية المختلفة أو الأنماط الجينية ويمكن تخصيصها لاختبار ركائز الميتوكوندريا المختلفة أو مثبطات.
Introduction
وقد أحدثت ثورة في قياس التنفس القائم على الصفائح الدقيقة أبحاث الميتوكوندريا من خلال تمكين دراسة التنفس الخلوي لحجم عينة صغيرة1. ويعتبر التنفس الخلوي عموما كمؤشر على وظيفة الميتوكوندريا أو “خلل وظيفي”, على الرغم من حقيقة أن مجموعة الميتوكوندريا من الوظائف يمتد إلى ما بعد إنتاج الطاقة2. في الظروف الهوائية، الميتوكوندريا استخراج الطاقة المخزنة في ركائز مختلفة عن طريق كسر وتحويل هذه الركائز إلى وسيطة الأيض التي يمكن أن تغذي دورة حمض الستريك3 (الشكل 1). التدفق المستمر للركائز ضروري لتدفق دورة حمض الستريك لتوليد الطاقة العالية “المتبرعين بالإلكترون”، والتي توفر الإلكترونات إلى سلسلة نقل الإلكترون التي تولد تدرج البروتون عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلي، مما يتيح ATP-synthase إلى فوسفوريلات ADP إلى ATP4. لذلك ، يجب أن يتضمن التصميم التجريبي لاحساس تنفس الميتوكوندريا طبيعة العينة (الخلايا السليمة ، والخلايا permeabilized ، أو الميتوكوندريا المعزولة) وركائز الميتوكوندريا.
تحتفظ الخلايا بتخزين الركائز الأصلية5، وتأكسد الميتوكوندريا عدة أنواع من الركائز في وقت واحد6، مما يعقد تفسير النتائج التي تم الحصول عليها من التجارب التي أجريت على خلايا سليمة. نهج مشترك للتحقيق في قدرة الميتوكوندريا لأكسدة ركيزة مختارة هو عزل الميتوكوندريا أو permeabilize الخلايا التحقيق5. على الرغم من أن الميتوكوندريا المعزولة مثالية للدراسات الكمية ، إلا أن عملية العزل شاقة. ويواجه صعوبات تقنية مثل الحاجة إلى حجم عينة كبيرة، ونقاء الغلة، وإعادة إنتاج تقنية5. الخلايا Permeabilized تقدم حلا لعيوب عزل الميتوكوندريا; ومع ذلك، فإن عوامل البيرمابيلينج الروتينية لطبيعة المنظفات ليست محددة وقد تلحق الضرر بالأغشية الميتوكوندريا5.
تم تقديم perfringolysin O المؤتلف (rPFO) كعامل انتقائي لغشاء البلازما permeabilizing7، وتم استخدامه بنجاح في تركيبة مع محلل تدفق خارج الخلية في العديد من الدراسات7و8و9و10. لقد قمنا بتعديل بروتوكول باستخدام rPFO لفحص تدفق الركيزة الميتوكوندريا باستخدام محلل التدفق خارج الخلية XFe96. في هذا البروتوكول، تتم مقارنة أربعة مسارات أكسدة ركائز مختلفة في اثنين من الأنماط الظاهرية الخلوية مع وجود تكرارات كافية والتحكم المناسب لكل مادة تم اختبارها.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول هو تعديلللدراسات المنشورة سابقا7و8و9و10 ودليل مستخدم المنتج. على النقيض من بروتوكول الشركة المصنعة، يستخدم 2x ماس بدلا من ماس 3x، منذ 2× ماس هو أسهل لتذوب ولا تشكل هطول الأمطار بعد التجمد. المجمدة 2x MAS aliquots يم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون موظفي قسم علم وظائف الأعضاء في كلية الطب في هراديك كرالوفي وقسم الفيزيولوجيا المرضية في الكلية الثالثة للطب على المساعدة في إعداد المواد الكيميائية والعينات. وقد تم دعم هذا العمل من قبل جامعة تشارلز برامج المنح PROGRES Q40/02، منحة وزارة الصحة التشيكية NU21-01-00259، منحة مؤسسة العلوم التشيكية 18-10144 ومشروع INOMED CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 بتمويل من وزارة التعليم والشباب والرياضة في الجمهورية التشيكية والاتحاد الأوروبي.
Materials
| Adinosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
| Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 – 8 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
| HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
| L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
| L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
| Magnissium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
| Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
| Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
| Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 – 8 °C |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
| Water | Merck | W3500 | store at RT |
| XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
| XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) – Aliquot and store at -20 °C |
References
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
- Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics 3. , (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).
- Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).
