Summary
في هذا العمل، ونحن نصف بروتوكول معدل لاختبار تدفق الركيزة التنفسية الميتوكوندريا باستخدام perfringolysin O المؤتلف في تركيبة مع قياس التنفس القائم على الصفائح الدقيقة. مع هذا البروتوكول، نظهر كيف يؤثر الميتفورمين على تنفس الميتوكوندريا لخطين مختلفين للخلايا السرطانية.
Abstract
تدفق الركيزة الميتوكوندريا هو سمة مميزة لكل نوع من أنواع الخلايا، وتشارك التغيرات في مكوناته مثل الناقلين، والقنوات، أو الإنزيمات في مسببات الأمراض من عدة أمراض. يمكن دراسة تدفق الركيزة الميتوكوندريا باستخدام الخلايا السليمة، والخلايا permeabilized، أو الميتوكوندريا المعزولة. التحقيق في الخلايا سليمة يواجه العديد من المشاكل بسبب الأكسدة في وقت واحد من الركائز المختلفة. الى جانب ذلك ، تحتوي عدة أنواع من الخلايا على مخازن داخلية من الركائز المختلفة التي تعقد تفسير النتائج. طرق مثل عزل الميتوكوندريا أو استخدام عوامل البيرميلينج ليست قابلة للاستنساخ بسهولة. عزل الميتوكوندريا النقية مع الأغشية سليمة بكميات كافية من عينات صغيرة إشكالية. استخدام permeabilizers غير انتقائية يسبب درجات مختلفة من تلف غشاء الميتوكوندريا لا مفر منه. تم تقديم perfringolysin O المؤتلف (rPFO) كمطهر أكثر ملاءمة ، وذلك بفضل قدرته على اختراق غشاء البلازما بشكل انتقائي دون التأثير على سلامة الميتوكوندريا. عندما تستخدم في تركيبة مع قياس التنفس microplate، فإنه يسمح اختبار تدفق العديد من الركائز الميتوكوندريا مع ما يكفي من يكرر داخل تجربة واحدة أثناء استخدام الحد الأدنى من عدد الخلايا. في هذا العمل، يصف البروتوكول طريقة لمقارنة تدفق الركيزة الميتوكوندريا من اثنين من الأنماط الظاهرية الخلوية المختلفة أو الأنماط الجينية ويمكن تخصيصها لاختبار ركائز الميتوكوندريا المختلفة أو مثبطات.
Introduction
وقد أحدثت ثورة في قياس التنفس القائم على الصفائح الدقيقة أبحاث الميتوكوندريا من خلال تمكين دراسة التنفس الخلوي لحجم عينة صغيرة1. ويعتبر التنفس الخلوي عموما كمؤشر على وظيفة الميتوكوندريا أو "خلل وظيفي", على الرغم من حقيقة أن مجموعة الميتوكوندريا من الوظائف يمتد إلى ما بعد إنتاج الطاقة2. في الظروف الهوائية، الميتوكوندريا استخراج الطاقة المخزنة في ركائز مختلفة عن طريق كسر وتحويل هذه الركائز إلى وسيطة الأيض التي يمكن أن تغذي دورة حمض الستريك3 (الشكل 1). التدفق المستمر للركائز ضروري لتدفق دورة حمض الستريك لتوليد الطاقة العالية "المتبرعين بالإلكترون"، والتي توفر الإلكترونات إلى سلسلة نقل الإلكترون التي تولد تدرج البروتون عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلي، مما يتيح ATP-synthase إلى فوسفوريلات ADP إلى ATP4. لذلك ، يجب أن يتضمن التصميم التجريبي لاحساس تنفس الميتوكوندريا طبيعة العينة (الخلايا السليمة ، والخلايا permeabilized ، أو الميتوكوندريا المعزولة) وركائز الميتوكوندريا.
تحتفظ الخلايا بتخزين الركائز الأصلية5، وتأكسد الميتوكوندريا عدة أنواع من الركائز في وقت واحد6، مما يعقد تفسير النتائج التي تم الحصول عليها من التجارب التي أجريت على خلايا سليمة. نهج مشترك للتحقيق في قدرة الميتوكوندريا لأكسدة ركيزة مختارة هو عزل الميتوكوندريا أو permeabilize الخلايا التحقيق5. على الرغم من أن الميتوكوندريا المعزولة مثالية للدراسات الكمية ، إلا أن عملية العزل شاقة. ويواجه صعوبات تقنية مثل الحاجة إلى حجم عينة كبيرة، ونقاء الغلة، وإعادة إنتاج تقنية5. الخلايا Permeabilized تقدم حلا لعيوب عزل الميتوكوندريا; ومع ذلك، فإن عوامل البيرمابيلينج الروتينية لطبيعة المنظفات ليست محددة وقد تلحق الضرر بالأغشية الميتوكوندريا5.
تم تقديم perfringolysin O المؤتلف (rPFO) كعامل انتقائي لغشاء البلازما permeabilizing7، وتم استخدامه بنجاح في تركيبة مع محلل تدفق خارج الخلية في العديد من الدراسات7و8و9و10. لقد قمنا بتعديل بروتوكول باستخدام rPFO لفحص تدفق الركيزة الميتوكوندريا باستخدام محلل التدفق خارج الخلية XFe96. في هذا البروتوكول، تتم مقارنة أربعة مسارات أكسدة ركائز مختلفة في اثنين من الأنماط الظاهرية الخلوية مع وجود تكرارات كافية والتحكم المناسب لكل مادة تم اختبارها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. قبل يوم واحد من الفحص
- إعداد الكواشف والركائز.
- محلول المقايسة الميتوكوندريا (MAS): إعداد حلول المخزون لجميع الكواشف كما هو موضح في الجدول 1. تدفئة مخزونات مانيتول و السكروز إلى 37 درجة مئوية لتذوب تماما. تخلط الكواشف لإعداد ماس 2x، ثم تسخين الخليط إلى 37 درجة مئوية. ضبط درجة الحموضة مع 5N KOH إلى 7.4 (~ 7 مل)، ثم إضافة الماء لجعل حجم يصل إلى 1 L. تصفية تعقيم وتخزين الاقتباسات في -20 درجة مئوية حتى يوم القياس.
- الألبومين مصل البقر (5٪ BSA): حل 5 غرام من جيش استقلال اليابان في 90 مل من الماء العقيم قبل الحرب على ستيرر المغناطيسي وتجنب اهتزاز. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع 5 N KOH، ثم إضافة الماء لرفع مستوى الصوت يصل إلى 100 مل. تصفية تعقيم وتخزين aliquots في -20 درجة مئوية حتى يوم القياس.
- ركائز الميتوكوندريا: إعداد 1 M حلول الأسهم من الصوديوم succinate، بيروفات الصوديوم، وغلوتامات الصوديوم في الماء العقيم. إعداد محلول مخزون 100 mM من مالات الصوديوم في الماء العقيم واستخدام المياه العقيمة قبل الحرب لإعداد محلول مخزون 10 mM من كارنيتين بالميتويل. ضبط درجة الحموضة لكل حل إلى 7.4 في 5 N KOH ومرشح تعقيم. تخزين الركائز في 2-8 درجة مئوية. في وقت الاستخدام، دافئ البالميتويل كارنيتين إلى 37 درجة مئوية لإذابة أي رواسب. للاستخدام في وقت لاحق، متجر aliquots من جميع الركائز باستثناء بيروفات في -20 درجة مئوية.
- مثبطات الميتوكوندريا: استخدم ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لإعداد حلول المخزون من أوليغومايسين 25 مللي متر، 50 مللي متر سيانيد الكربونيل 4-(ثلاثي فلوريوميثوكسي) فينيلهيدرازون (FCCP)، 20 مليون روكتون، و 20 مللي متر أنتيميسين A. تخزين اليكوتس في -20 درجة مئوية.
- بذر وعلاج الخلايا: كما هو مبين في الشكل 2، بذرة الخلايا في الأعمدة 2-11. يجب ترك العمودين 1 و12 فارغين ليكونا بمثابة آبار خلفية. في هذا العمل، تم استخدام خلايا HepG2 و A549.
- زرع الخلايا في كثافة 20،000 خلية لكل بئر. استخدام 50-80 ميكرولتر من الخلايا ثقافة المتوسطة للبذر.
- ملء الآبار الفارغة مع حجم متساو من الخلايا ثقافة المتوسطة واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب مع 5٪ CO2. السماح للخلايا لإرفاق لمدة 3-4 ساعات، ومن ثم إضافة 100 ميكرولتر من الخلايا الثقافة المتوسطة لجميع الآبار.
- مع هذه الإضافة المتوسطة النهائية ، طبق العلاج في الأعمدة 7-11. وفي هذا العمل، عولجت المجموعة التجريبية بهيدروكلوريد ميتفورمين طوله مليون متر لمدة 16 ساعة، وعولجت مجموعة المراقبة بحجم متساو من الماء المقطر العقيم كتحكم في السيارة.
- ترطيب أجهزة الاستشعار: ماصة 200 ميكرولتر من الماء العقيم لكل بئر في لوحة المرافق، ثم العودة بعناية خرطوشة الاستشعار في حين غمر أجهزة الاستشعار في الماء. احتضان خرطوشة في حاضنة CO2خالية في 37 درجة مئوية حتى اليوم التالي.
- قالب بروتوكول المقايسة: قم بتشغيل محلل (راجع جدول المواد)ووحدة وحدة التحكم. بدء تشغيل برنامج التحكم في الأدوات والحصول على البيانات وتصميم بروتوكول المقايسة كما هو موضح في الجدول 2. تحت تعريفات المجموعة، إنشاء أربع استراتيجيات الحقن حيث المنفذ A يختلف وفقا للركيزة حقن (الشكل 3). قم بتسمية الاستراتيجيات بعد الركائز أو اختصاراتها.
- إلى المنافذ B و C و D، قم بتعيين مركبات أوليغومايسين، FCCP، وروتينون/أنتيميسين A، على التوالي. إنشاء ثماني مجموعات وتسميتها كما هو موضح في الشكل 4. ضمن خريطة لوحة تعيين المجموعات إلى الآبار المطابقة، ثم حفظ البروتوكول كقالب جاهز للاستخدام. اترك المحلل قيد التشغيل للسماح لدرجة الحرارة بالاستقرار بين عشية وضحاها. الحفاظ على محلل في مكان مع درجة حرارة مستقرة لتجنب التغيرات المفاجئة في درجة الحرارة.
2. يوم الفحص
- استبدال الماء مع calibrant: تجاهل المياه من لوحة المرافق وماصة 200 ميكرولتر من calibrant prewarmed لكل بئر في لوحة المرافق. أعد الخرطوشة إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون2-freeحتى وقت الفحص. لتجنب التبخر السريع للخلاب، حافظ على مصدر للرطوبة داخل الحاضنة واطفئ سرعة المروحة أو قللها إلى أدنى حد ممكن.
- إعداد حلول العمل: ابدأ بارتفاع درجة حرارة 2x MAS، و5٪ BSA، والمياه العقيمة إلى 37 درجة مئوية. وفي الوقت نفسه، السماح للمخزونات المثبطة للوصول إلى درجة حرارة الغرفة. استخدام الحارة 2x ماس والماء المقطر العقيم لإعداد 5 مل من تركيز العمل من الركائز ومثبطات كما هو موضح في الجدول 3.
- تحميل منافذ الحقن: كما هو مبين في الشكل 3، تحميل 20 ميكرولتر من الركائز في المنفذ A. تحميل خليط succinate / rotenone في المنفذ A من الصفوف A و B. تحميل خليط بيروفيت / مالات في الميناء A من الصفوف C و D. تحميل خليط الغلوتامات / مالات في المنفذ A من الصفوف E و F. تحميل خليط كارنيتين البالميتويل / مالات في المنفذ A من الصفين G و H. لوحة كاملة، تحميل ميناء B مع 22 ميكرولتر من إعداد أوليغوميسين، ميناء C مع 25 ميكرولتر من إعداد FCCP، وميناء D مع 27 ميكروغرام من rotenone / antimycin خليط.
- بدء خطوة المعايرة: ضمن علامة التبويب تشغيل الفحص، انقر على تشغيل البدء لبدء الفحص. أدخل خرطوشة المستشعر المحملة وابدأ خطوة المعايرة. انتظر حتى تكتمل المعايرة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
- إعداد وسيط الفحص (MAS-BSA-rPFO): لإعداد 20 مل من وسيط المقايسة، اخلط 10 مل من 2x MAS، و9.2 مل من الماء العقيم، و0.8 مل من 5٪ BSA في أنبوب 50 مل. إضافة 2 ميكرولتر من 10 ميكرومتر rPFO لتحقيق تركيز 1 nM وإعادة إنفاق الخليط مع pipetting لطيف. تجنب الهز ولا تستخدم خلاط دوامة للخلط. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية حتى وقت الاستخدام.
- غسل الخلايا: اغسل الخلايا والآبار الفارغة الفارغة مرتين باستخدام فوسفات مسبق الالسيوم والمغنيسيوم الخالي من الملحية (PBS) باستخدام ماصة متعددة القنوات. تجنب إعادة استخدام نفس النصائح لتجاهل وسيطة ثقافة الخلية وإضافة PBS. نفذ هذه الخطوة خارج تدفق صفح لحماية الخلايا من الجفاف من تدفق الهواء.
- permeabilization الخلية في المتوسط المقايسة: باستخدام ماصة متعددة القنوات، تجاهل برنامج تلفزيوني واستبداله مع 180 ميكرولتر من المتوسطة المقايسة prewarmed (MAS-BSA-rPFO).
- بدء القياس: بعد البيرميلات مباشرة، استبدل لوحة المنفعة لخرطوشة المستشعر المعايرة بلوحة الخلية وابدأ القياس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ابدأ بتطبيع النتائج إلى القياس الثاني للتنفس الأساسي لإظهار القيم كنسبة مئوية لمعدل استهلاك الأكسجين (OCR٪). تظهر نتائج الفحص في الشكل 5والشكل 6 والشكل 7 والشكل 8. من المهم تعيين الآبار الخلفية المناسبة لكل مجموعة وتعطيل الآبار الخلفية للمجموعات الأخرى. ويبين الشكل 5 أن المجموعة المعالجة لديها معدل أعلى من التنفس الناجم عن النجدة. وكانت استجابة خلايا A549 لعلاج الميتفورمين(الشكل 5A)أعلى من خلايا HepG2 (الشكل 5B). كانت آبار التحكم في الخلفية فقط تلك من نفس صفوف المجموعة المقارنة ، في هذه الحالة ، آبار A1 و B1 و A12 و B12. ويبين الشكل 6 التغيرات في التنفس الناجم عن البيروفات/ماليت. ويبين الشكل 7 التغيرات في التنفس الناجم عن الغلوتامات/المالات، ويبين الشكل 8 التغيرات في كارنيتين البالميتويل/التنفس الناجم عن الماليت.
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لدورة حمض الستريك. الركائز المستخدمة لاختبار تدفق الركيزة الميتوكوندريا باللون الأحمر. لا يستخدم مالات وحده ولكن تستخدم في تركيبة مع بيروفاتي, بالميتويل كارنيتين, والغلوتامات. دور مالات في بيروفاتي / مالات- وبالميتويل كارنيتين / التنفس الناجم عن مالات هو توفير أوكسالواسيتات من خلال عمل إنزيم ديهيدروجيناز مالات. في الغلوتامات / التنفس الناجم عن المالات ، يشارك مالات في المكوك الممالات الأسبارتات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:توضيح لخطة بذر الخلية في لوحة الخلايا المجهرية. يجب ترك الآبار الفارغة في العمودين 1 و12 فارغة بدون خلايا. تستخدم الأعمدة 7-11 لعلاج المجموعة التجريبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: توضيح لاستراتيجية الحقن. يتم تحميل المنفذ A من الصفوف A و B مع خليط succinate/ rotenone. يتم تحميل المنفذ A من الصفوف C و D بخليط بيروفاتي/مالات. يتم تحميل المنفذ A من الصفوف E و F مع خليط الغلوتامات / مالات. يتم تحميل ميناء A من الصفين G و H مع خليط كارنيتين بالميتويل / مالات. بالنسبة للوح بالكامل، يتم تحميل المنافذ B وC وD مع أوليغوميسين، FCCP، وروتينون/ أنتيميسين A، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: أسماء المجموعات وخريطة اللوحة. يتم تسمية كل مجموعة وفقا للنمط الظاهري (التحكم أو المعالجة) والركيزة المستخدمة للحث على التنفس. (S)، التنفس الناجم عن العصارة. (P/M)، التنفس الناجم عن البيروفات/المالات. (G/M)، الغلوتامات/التنفس الناجم عن المالات. (CP / M)، بالميتويل كارنيتين / التنفس الناجم عن المالات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5:التنفس الناجم عن السكرينات. أ) A549 و (B) HepG2. وعولجت المجموعة المختبرة بميثكلوريد ميتفورمين واحد من الميثيلفورمين لمدة 16 ساعة. تستخدم فقط الآبار الخلفية A1 و B1 و A12 و B12 للتصحيح. تظهر النتائج كمتوسط OCR٪ ± SD. تم إنشاء شبكة الرسم البياني واللوحة وتصديرها كملفات صور من خلال تصميم الفحص وتحليل البيانات وبرامج إدارة الملفات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: بيروفات/التعرق الناجم عن المالات. وعولجت المجموعة المختبرة بميثكلوريد ميتفورمين واحد من الميثيلفورمين لمدة 16 ساعة. تستخدم فقط الآبار الخلفية C1 و D1 و C12 و D12 للتصحيح. تظهر النتائج كمتوسط OCR٪ ± SD. تم إنشاء شبكة الرسم البياني واللوحة وتصديرها كملفات صور من خلال تصميم الفحص وتحليل البيانات وبرامج إدارة الملفات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: الغلوتامات/ التنفس الناجم عن المالوت. وعولجت المجموعة المختبرة بميثكلوريد ميتفورمين واحد من الميثيلفورمين لمدة 16 ساعة. تستخدم فقط الآبار الخلفية E1 و F1 و E12 و F12 للتصحيح. تظهر النتائج كمتوسط OCR٪ ± SD. تم إنشاء شبكة الرسم البياني واللوحة وتصديرها كملفات صور من خلال تصميم الفحص وتحليل البيانات وبرامج إدارة الملفات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: بالميتويل كارنيتين / التنفس الناجم عن مالات. (أ) A549 و (ب) HepG2. وعولجت المجموعة المختبرة بميثكلوريد ميتفورمين واحد من الميثيلفورمين لمدة 16 ساعة. تستخدم فقط الآبار الخلفية G1 و H1 و G12 و H12 للتصحيح. تظهر النتائج كمتوسط OCR٪ ± SD. تم إنشاء شبكة الرسم البياني واللوحة وتصديرها كملفات صور من خلال تصميم الفحص وتحليل البيانات وبرامج إدارة الملفات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الميتوكوندريا المقايسة المتوسطة | ||||
| المخزون (mM) | الحجم من المخزون للتر الواحد (مل) | 2x ماس (mM) | ماس (mM) | |
| سكروز | 1000 | 140 | 140 | 70 |
| مانيتول | 1000 | 440 | 440 | 220 |
| KH2PO4 | 1000 | 20 | 20 | 10 |
| مجمكل2 | 200 | 50 | 10 | 5 |
| هيبس | 200 | 20 | 4 | 2 |
| EGTA | 200 | 10 | 2 | 1 |
| شرطة أبوظبي | 200 | 20 | 4 | 2 |
الجدول 1: حل فحص الميتوكوندريا. امزج الحجم المشار إليه لكل محلول مخزون مكون لإعداده (2x MAS). قم بتدفئة المحلول إلى 37 درجة مئوية، ثم اضبط درجة الحموضة مع 5 N KOH إلى 7.4. إضافة الماء المقطر لجعل حجم يصل إلى 1 L. تصفية تعقيم ومن ثم تخزين aliquots في -20 درجة مئوية. إعداد الحلول المتوسطة والعمل المقايسة من الركائز الميتوكوندريا ومثبطات باستخدام ماس 2x.
| أمر | مدة | مركب حقن |
| المعايره | بشكل افتراضي | |
| التوازن | نعم | |
| الاساس | ||
| دورتين | ||
| خلط | 30 ق | |
| انتظري | 30 ق | |
| قاس | دقيقتان | |
| حقن المنفذ A | ركائز | |
| دورتين | ||
| خلط | 30 ق | |
| انتظري | 30 ق | |
| قاس | دقيقتان | |
| حقن المنفذ B | أوليغومايسين | |
| دورتين | ||
| خلط | 30 ق | |
| انتظري | 30 ق | |
| قاس | دقيقتان | |
| حقن المنفذ C | لجنة الاتصالات الفدرالية | |
| دورتين | ||
| خلط | 30 ق | |
| انتظري | 30 ق | |
| قاس | دقيقتان | |
| حقن المنفذ D | روتينون + أنتيميسين أ | |
| دورتين | ||
| خلط | 30 ق | |
| انتظري | 30 ق | |
| قاس | دقيقتان |
الجدول 2: أوامر بروتوكول الفحص.
| الحجم في 5 مل | ||||||
| ركائز | الأسهم conc. | العمل conc. | رصيد | 2x ماس | dH2O | آخر ارتجاج. |
| سوشينات/روتينون | 1 م/20 م | 100 م م/10 ميكرومتر | 500 ميكرولتر/ 2.5 ميكرولتر | 2.5 مل | 1997.5 ميكرولتر | 10 م م/1 ميكرومتر |
| بيروفات/مالات | 1 م/100 م م | 100 مليون متر /10 م م | 500 ميكرولتر/500 ميكرولتر | 2.5 مل | 1500 ميكرولتر | 10 mM /1 mM |
| الغلوتامات/مالات | 1 م/100 م م | 100 مليون متر /10 م م | 500 ميكرولتر/500 ميكرولتر | 2.5 مل | 1500 ميكرولتر | 10 mM /1 mM |
| بالميتويل كارنيتين/ مالات | 10 mM/100 mM | 400 ميكرومتر /10 م م | 200 ميكرولتر/500 ميكرولتر | 2.5 مل | 1800 ميكرولتر | 40 ميكرومتر /1 متر م |
| مثبطات | ||||||
| أوليغومايسين | 25 مليون متر | 15 ميكرومتر | 3 ميكرولتر | 2.5 مل | 2497 ميكرولتر | 1.5 ميكرومتر |
| لجنة الاتصالات الفدرالية | 50 مليون متر | 40 ميكرومتر | 4 ميكرولتر | 2.5 مل | 2496 ميكرولتر | 4 ميكرومتر |
| روتينون/ أنتيميسين أ | 20 mM/20 mM | 10 ميكرومتر/ 10 ميكرومتر | 2.5 ميكرولتر/2.5 ميكرولتر | 2.5 مل | 2495 ميكرولتر | 1 ميكرومتر/ 1 ميكرومتر |
الجدول 3: قائمة الركائز الميتوكوندريا ومثبطات ليتم تحميلها في منافذ الحقن من خراطيش الاستشعار كما نوقشت سابقا في الشكل 3. امزج الكميات المشار إليها من حلول المخزون و2x MAS والماء المقطر لإعداد 5 مل من تركيز العمل لكل خليط ركيزة أو مثبط. يتم تحقيق التركيز النهائي في الآبار بعد عملية الحقن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول هو تعديلللدراسات المنشورة سابقا7و8و9و10 ودليل مستخدم المنتج. على النقيض من بروتوكول الشركة المصنعة، يستخدم 2x ماس بدلا من ماس 3x، منذ 2× ماس هو أسهل لتذوب ولا تشكل هطول الأمطار بعد التجمد. المجمدة 2x MAS aliquots يمكن تخزينها حتى ستة أشهر وتظهر نتائج متسقة. وثمة فرق آخر هو بما في ذلك ADP في مكونات ماس 2x وحذف BSA من الصيغة. الحلول التي تحتوي على BSA هي أكثر صعوبة لحقن وتسبب إمكانية أكبر من الأخطاء و القيم المتطرفة. ومع ذلك، فإن وجود الشراكة بين القطاعين العام والخاص ضروري لتقليل الكمية اللازمة من المنظمات الوطنية للمعاشات التقاعدية لتحقيق التهيئة المناسبة. لذلك، يتم إضافة BSA فقط إلى الوسيطة المقايسة (MAS-BSA-rPFO) المستخدمة في خطوة permeabilization بعد غسل الخلايا.
لغسل الخلايا من الخلايا الثقافة المتوسطة، يستخدم هذا البروتوكول برنامج تلفزيوني بدلا من MAS. برنامج تلفزيوني هو isotonic ولا يسبب أي تغيير في الشكل الخلوي، على النقيض من ماس خالية من الصوديوم التي هي غنية بالبوتاسيوم ويمكن أن تغير مورفولوجيا الخلوية. وثمة فرق رئيسي آخر هو الحفاظ على خطوة التوازن في بروتوكول الفحص. تستمر خطوة التوازن لمدة 12 دقيقة، أي ما يعادل دورتي قياس. والهدف من الحفاظ على خطوة التوازن هو تثبيت درجة الحرارة داخل الجهاز، وفي الوقت نفسه، السماح للخلايا لأكسدة أي مخازن مؤتأكسد الداخلية المحتملة، والتي يتم تعزيزها من خلال وجود ADP في المتوسط المقايسة.
وينبغي إيلاء بعض الاعتبارات المتعلقة بتقنيات زراعة الخلايا. في هذا العمل، تم زرع الخلايا التي تم فحصها في اليوم السابق للمقاهية. ومع ذلك، تتطلب بعض الخلايا فترة أطول من الثقافة أو العلاج. إذا كان تصميم الدراسة يتضمن خلايا متمايزة، أو خلايا معزولة حديثا، أو غير معتنقة، مطلوب طلاء مناسب لإصلاح الخلايا في الصفيحة الدقيقة لثقافة الخلية. هذا البروتوكول غير مناسب للخلايا المعلقة ، ويوصى باستخدام لاصق الخلية والأنسجة. وهناك قيد آخر على هذا البروتوكول هو أن هذا الأسلوب غير مناسب لاختتام البيانات الكمية. وبعبارة أخرى، فإنه ليس من الممكن من خلال هذه الطريقة لتقدير الكمية الفعلية من بروتين الميتوكوندريا في كل قبل فترة طويلة من القياس. لذلك ، تولد هذه الطريقة فحصا سريعا لتدفق ركيزة الميتوكوندريا دون تقديم تقدير دقيق لنسبة الفوسفات / الأكسجين (نسبة P / O)5. ومع ذلك، فمن الممكن استخدام هذا البروتوكول للدراسات الكمية على عينات صغيرة11. لهذا الغرض، فمن الضروري الحصول على الميتوكوندريا المعزولة حديثا واستخدام لاصق الخلية والأنسجة لإصلاح الميتوكوندريا إلى الصفائح الدقيقة ثقافة الخلية.
للحصول على أفضل النتائج القابلة للاستنساخ من استخدام هذا البروتوكول، انتبه إلى تركيز الكواشف المستخدمة. يجب أن تكون درجة حرارة الحلول والحاضنات والأجهزة المستخدمة مستقرة. تأكد من أن جميع الحلول والركائز لديها درجة الحموضة المعدلة. كما ذكر سابقا، لا ينصح بإدراج BSA في الحلول المخطط حقنها. إذا أظهرت النتائج نطاق خطأ واسع، عرض النتائج بتنسيق جيد بدلا من تنسيق المجموعة للبحث عن القيم المتطرفة المحتملة وحذفها.
في هذا العمل، حاولنا تحقيق أقصى قدر من الاستخدام لقياس واحد لفحص في وقت واحد تدفقات الركيزة الميتوكوندريا متعددة مع السيطرة على الخلفية المناسبة ويكرر ما يكفي في وقت قصير نسبيا. كما هو مبين في النتائج ، فإن الطريقة مفيدة في مقارنة نوعين افتراضيين تم إنشاؤهما عن طريق علاج مجموعة واحدة بتركيز واحد من الدواء. ويمكن استخدامه لمقارنة خطوط الخلايا المختلفة أو الخلايا المعدلة وراثيا. البروتوكول متعدد الاستخدامات ومختلف الركائز، أو يمكن استخدام مثبطات لفحص التكيف من تدفق الركيزة الميتوكوندريا في أي نموذج الخلوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يعلنانه.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون موظفي قسم علم وظائف الأعضاء في كلية الطب في هراديك كرالوفي وقسم الفيزيولوجيا المرضية في الكلية الثالثة للطب على المساعدة في إعداد المواد الكيميائية والعينات. وقد تم دعم هذا العمل من قبل جامعة تشارلز برامج المنح PROGRES Q40/02، منحة وزارة الصحة التشيكية NU21-01-00259، منحة مؤسسة العلوم التشيكية 18-10144 ومشروع INOMED CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 بتمويل من وزارة التعليم والشباب والرياضة في الجمهورية التشيكية والاتحاد الأوروبي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
| Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 - 8 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
| HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
| L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
| L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
| Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
| Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
| Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 - 8 °C |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
| Water | Merck | W3500 | store at RT |
| XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
| XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 °C |
References
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
- Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. , Academic press. London. (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).
- Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).
