Summary
本研究では、マイクロプレートベースの呼吸法と組み合わせて組み換えパーフリンゴライシンOを用いてミトコンドリア呼吸基質フラックスを試験する改変プロトコルについて説明する。このプロトコルを用いて、メトホルミンが2つの異なる腫瘍細胞株のミトコンドリア呼吸にどのように影響するかを示す。
Abstract
ミトコンドリア基質フラックスは、各細胞型の特徴であり、トランスポーター、チャネル、酵素などの成分の変化が、いくつかの疾患の病因に関与している。ミトコンドリア基質フラックスは、インタクト細胞、透過細胞、または単離ミトコンドリアを用いて研究することができる。無傷の細胞を調査することは、異なる基質の同時酸化のためにいくつかの問題に遭遇する。また、いくつかの細胞タイプは結果解釈を複雑にする異なる基質の内部ストアを含む。ミトコンドリアの分離や透過性の薬剤の使用などの方法は、容易に再現できません。小さいサンプルから十分な量の無傷の膜で純粋なミトコンドリアを分離することは問題である。非選択的パーメアビライザーを使用すると、さまざまな程度の不可避ミトコンドリア膜損傷を引き起こす。組換えペルフリンゴライシンO(rPFO)は、ミトコンドリア完全性に影響を与えることなく、細胞膜を選択的に透過させる能力のおかげで、より適切なパーメアビライザーとして提供された。マイクロプレートの呼吸数と組み合わせて使用すると、最小数の細胞を使用しながら、1回の実験内で十分な反復を伴ういくつかのミトコンドリア基質のフラックスをテストすることができます。本研究では、このプロトコルは、2つの異なる細胞表現型または遺伝子型のミトコンドリア基質フラックスを比較する方法を説明し、様々なミトコンドリア基質または阻害剤を試験するようにカスタマイズすることができる。
Introduction
マイクロプレートベースの呼吸数は、小さいサンプルサイズ1の細胞呼吸の研究を可能にすることによってミトコンドリア研究に革命を起こしました。細胞呼吸は、ミトコンドリア機能または「機能不全」の指標として一般的に考えられるが、ミトコンドリアの機能範囲がエネルギー産生を超えて広がっている2。好気条件では、ミトコンドリアは、これらの基質を分解して、クエン酸サイクル3 を燃料とすることができる代謝中間体に変換することによって、異なる基質に蓄えられているエネルギーを抽出する(図1)。基質の連続流束は、クエン酸サイクルの流れに不可欠であり、高エネルギーの「電子ドナー」を生成し、内部ミトコンドリア膜を横切って陽子勾配を生成する電子輸送鎖に電子を送達し、ATP合成酵素がADPをATP4にリン酸化することを可能にする。したがって、ミトコンドリア呼吸をアッセイする実験計画には、サンプル性質(無傷細胞、透過細胞、または単離ミトコンドリア)およびミトコンドリア基質を含まなければならない。
細胞は先住民族の基質5の貯蔵を維持し、ミトコンドリアは、同時に数種類の基質を酸化する6、無傷の細胞に対して行われた実験から得られた結果の解釈を複雑にする。選択した基質を酸化するミトコンドリア能力を調査する一般的なアプローチは、ミトコンドリアを単離するか、または調査した細胞5を透過させることである。分離ミトコンドリアは定量的研究に理想的ですが、分離プロセスは面倒です。大きなサンプルサイズ、収率の純度、技術5の再現性などの技術的な困難に直面しています。透過細胞はミトコンドリアの分離の欠点のためのソリューションを提供します;;しかし、洗剤の日常的な透過性剤は特異的ではなく、ミトコンドリア膜5に損傷を与える可能性がある。
組換えペルフリンゴライシンO(rPFO)は、選択的な血漿膜透過性剤7として提供され、そして、いくつかの研究7、8、9、10において細胞外フラックス分析装置との併用に成功した。XFe96細胞外フラックス分析装置を用いて、rPFOを用いてミトコンドリア基質フラックスをスクリーニングするプロトコルを改変した。このプロトコルでは、2つの細胞型の4つの異なる基質酸化経路を比較し、試験した各材料に対して十分な反復と適切な制御を有する。
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Protocol
1. アッセイの前日
- 試薬および基質の調製。
- ミトコンドリアアッセイ溶液(MAS): 表1に記載されている全ての試薬のストック溶液を準備する。マンリトールとスクロースの在庫を37°Cに温め、完全に溶解します。試薬を混合して2倍のMASを調製し、その後、混合物を37°Cに温める。 5N KOHでpHを7.4(〜7 mL)に調整し、水を加え、体積を最大1 L.ろ過滅にし、測定日まで-20°Cでアリコートを保存します。
- ウシ血清アルブミン(5%BSA):BSAの5gを90mLのプリウォーム無菌水で磁気攪拌機で溶解し、揺れを避ける。5 N KOH で pH を 7.4 に調整し、水を加え、最大 100 mL のボリュームを持たします。フィルター殺菌し、測定日まで-20°Cでアリコートを保管します。
- ミトコンドリア基質:コハク酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウムの1Mストック溶液を滅菌水中で調製します。無菌水中のナトリウムマル酸の100 mMストック溶液を調製し、パルミトイルカルニチンの10 mMストック溶液を調製するために、事前に温めた無菌水を使用します。各溶液のpHを7.4,5 N KOHに調整し、フィルター滅菌します。基板は2~8°Cで保管してください。 使用時に、パルミトイルカルニチンを37°Cに温め、任意の沈殿物を溶解させた。後で使用するために、-20°Cでピルビン酸を除くすべての基質のアリコートを保存する。
- ミトコンドリア阻害剤:ジメチルスルホキシド(DMSO)を使用して、25 mMオリゴマイシン、50mMカルボニルシアニド4-(トリフルロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)、20mMロテネン、20mM抗ミシンAのストック溶液を調製します。
- セルのシード処理と処理: 図 2に示すように、列 2 から 11 にセルをシードします。列 1 と 12 は、背景ウェルとして機能するために空のままにする必要があります。本研究では、HepG2およびA549細胞を用いた。
- ウェルあたり20,000個の細胞の密度で細胞を播種します。播種には50~80μLの細胞培養培地を使用してください。
- ブランクウェルを等量の細胞培養培地で満たし、5%CO2で加湿インキュベーターで37°Cの細胞をインキュベートする。細胞を3〜4時間取り付け、100μLの細胞培養培地を全てのウェルに加えます。
- その最終的な媒体の追加で、列7-11で処理を適用します。本研究では、実験群を1mMメトホルミン塩酸塩で16時間処理し、対照群を車両制御として等量の無菌蒸留水で処理した。
- センサーのハイドレート:ユーティリティプレートに入れて、滅菌水のピペット200 μLをユーティリティプレートに入れ、センサーを水中に浸しながらセンサーカートリッジを慎重に戻します。次の日まで37°CでCO2フリーインキュベーターにカートリッジをインキュベートします。
- アッセイプロトコルテンプレート:アナライザのスイッチ( 材料表を参照)とコントローラユニット。計測器制御およびデータ取得ソフトウェアを起動し、 表2に記載されているアッセイプロトコルを設計します。 [グループ定義] で、注入された基板に応じてポート A が異なる 4 つの射出方法を作成します (図 3)。基板またはその略称の後に戦略に名前を付けます。
- ポートB、C、およびDに、それぞれオリゴマイシン、FCCP、ロテロン/アンチマイシンAの化合物を割り当てます。 図 4に示すように、8 つのグループを作成し、名前を付けます。プレート マップ で、対応するウェルにグループを割り当て、すぐに使用できるテンプレートとしてプロトコルを保存します。温度が一晩安定するように、アナライザーの電源を入れたままにしておきます。温度の急激な変化を避けるために、安定した温度の場所に分析装置を保管してください。
2. アッセイの日
- 水をキャリバートに置き換える:ユーティリティプレートから水を捨て、プリウォームキャリブラントのピペット200 μLをユーティリティプレートに入れます。カートリッジをアッセイの時点までCO2-freeインキュベーターに戻します。キャリブラントの急速な蒸発を避けるために、インキュベーター内の湿度の源を維持し、ファンの速度を最小限にオフにするか、または減らします。
- 作業ソリューションの準備:2x MAS、5%BSA、無菌水を37°Cに温めることから始めます。 一方、阻害剤の在庫が室温に達することを可能にする。表 3に記載されているように、5mLの基質および阻害剤の作業濃度を調製するために、温かい2x MASおよび滅菌蒸留水を使用する。
- 注入ポートのロード: 図3に示すように、20 μLの基板をポートAにロードし、より小さい方/ロテノン混合物を行AのポートAにロードし、B.行CとD.ロード・グルタミン酸/マレート混合物を行EとF.ロードパルミトイル・カルニチン/マレート混合物を行AとHのポートにロードします。プレート全体では、22 μLのオリゴマイシン調製でポートBをロードし、25 μLのFCCP調製を用いたポートC、ロテノーン/アンチマイシンA混合物の27 μLを用いたポートDをロードします。
- キャリブレーションステップの開始:[ アッセイの実行 ]タブで、[ 実行開始 ]をクリックしてアッセイを開始します。ロードしたセンサーカートリッジを挿入し、キャリブレーションステップを開始します。キャリブレーションが完了するまで待ってから、次の手順に進みます。
- アッセイ媒体(MAS-BSA-rPFO)の調製:20mLのアッセイ培地を調製し、2x MASの10mL、無菌水9.2mL、50mLのBSAの0.8mLを50mLチューブに混合します。10 μM rPFOの2 μLを加えて1 nMの濃度を達成し、穏やかなピペットで混合物を再懸濁させます。揺れを避け、混合には渦ミキサーを使用しないでください。使用時まで37°Cでチューブをインキュベートする。
- 細胞を洗う:マルチチャネルピペットを使用して、細胞と空の空の井戸を、プリウォームカルシウムおよびマグネシウムフリーのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄します。細胞培養培地を廃棄し、PBSを追加するために同じヒントを再利用しないでください。このステップを層流の外側で行い、空気流による乾燥から細胞を保護します。
- アッセイ媒体中の細胞透過化:マルチチャネルピペットを使用して、PBSを廃棄し、プリウォーム付きアッセイ媒体(MAS-BSA-rPFO)の180 μLに交換します。
- 測定開始:パーメアビライゼーションの直後に、校正されたセンサカートリッジのユーティリティプレートをセルプレートに交換し、測定を開始します。
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Representative Results
まず、結果をベースライン呼吸の2回目の測定に正規化し、酸素消費率(OCR%)として値を示します。アッセイの結果は、図5、図6、図7、図8に示されています。各グループに適切なバックグラウンドウェルを割り当て、他のグループのバックグラウンドウェルを無効にすることが重要です。図5は、処置群がコハク酸誘導呼吸率が高いことを示す。メトホルミン治療に対するA549細胞の応答(図5A)は、HepG2細胞よりも高かった(図5B)。バックグラウンドコントロールウェルは、比較されたグループの同じ行(この場合はウェルA1、B1、A12、B12)のもののみであった。図6は、ピルビン酸/マレート誘発呼吸の変化を示す。図7はグルタミン酸/マレート誘発呼吸の変化を示し、図8はパルミトイルカルニチン/マレート誘発呼吸の変化を示す。
図1:クエン酸サイクルの概略図 ミトコンドリア基質フラックスを試験するために使用される基質は赤色である。マルレートは単独で使用されるのではなく、ピルビン酸、パルミトイルカルニチン、グルタミン酸と組み合わせて使用されます。ピルビン酸/マル酸とパルミトイルカルニチン/マレート誘発呼吸におけるマレートの役割は、マレートデヒドロゲナーゼ酵素の作用を通じてオキサセテートを提供することです。グルタミン酸/マレート誘発呼吸では、マレートは、マレートアスパラギン酸シャトルに参加します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:細胞培養マイクロプレートにおける細胞播種計画の図示 列 1 と 12 の空白のウェルは、セルなしで空のままにする必要があります。7~11列は実験群の治療に用いられる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: 射出戦略の図。 行AとBのポートAはコハク/ロテノーネ混合物でロードされます。行CおよびDのポートAは、ピルビン酸/マレート混合物でロードされます。行EとFのポートAは、グルタミン酸/マレート混合物でロードされます。行GとHのポートAはパルミトイルカルニチン/マレート混合物でロードされます。プレート全体の場合、ポートB、C、Dにはそれぞれオリゴマイシン、FCCP、ロテロン/アンチマイシンAが搭載されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:グループ名とプレートマップ 各グループは、表現型(制御または処理)および呼吸を誘発するために使用される基質に従って命名される。(S)、コハク酸誘発呼吸。(P/M)、ピルビン酸/マレート誘発呼吸。(G/M)、グルタミン酸/マレート誘発呼吸。(CP/M)、パルミトイルカルニチン/マレート誘発呼吸。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:コハク酸誘発呼吸 (A) A549 および (B) HepG2.試験された群を1mMメトホルミン塩酸塩で16時間処理した。補正には、バックグラウンド ウェル A1、B1、A12、および B12 のみが使用されます。結果は、SD±平均OCR%として示されています。グラフとプレートグリッドは、アッセイ設計、データ解析、およびファイル管理ソフトウェアによってイメージファイルとして作成され、エクスポートされました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ピルビン酸/マレート誘発呼吸法( A) A549 および (B) HepG2.試験された群を1mMメトホルミン塩酸塩で16時間処理した。修正には、バックグラウンド ウェル C1、D1、C12、および D12 のみが使用されます。結果は、SD±平均OCR%として示されています。グラフとプレートグリッドは、アッセイ設計、データ解析、およびファイル管理ソフトウェアによってイメージファイルとして作成され、エクスポートされました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7: グルタミン酸/マレート誘発呼吸法( A) A549 および (B) HepG2.試験された群を1mMメトホルミン塩酸塩で16時間処理した。補正にはバックグラウンド ウェル E1、F1、E12、および F12 のみが使用されます。結果は、SD±平均OCR%として示されています。グラフとプレートグリッドは、アッセイ設計、データ解析、およびファイル管理ソフトウェアによってイメージファイルとして作成され、エクスポートされました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:パルミトイルカルニチン/マレート誘発呼吸( A)A549および(B)HepG2.試験された群を1mMメトホルミン塩酸塩で16時間処理した。補正には、バックグラウンドウェル G1、H1、G12、H12 のみが使用されます。結果は、SD±平均OCR%として示されています。グラフとプレートグリッドは、アッセイ設計、データ解析、およびファイル管理ソフトウェアによってイメージファイルとして作成され、エクスポートされました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| ミトコンドリアアッセイ培地 | ||||
| ストック (mM) | 1リットル当たりの在庫からの数量 (mL) | 2x MAS (mM) | MAS (mM) | |
| 蔗糖 | 1000 | 140 | 140 | 70 |
| マンニトール | 1000 | 440 | 440 | 220 |
| KH2PO4 | 1000 | 20 | 20 | 10 |
| MgCl2 | 200 | 50 | 10 | 5 |
| ヘペス | 200 | 20 | 4 | 2 |
| EGTA | 200 | 10 | 2 | 1 |
| ADP | 200 | 20 | 4 | 2 |
表1 ミトコンドリアアッセイ溶液各成分ストック溶液の示された容積を混ぜて準備します(2倍MAS)。溶液を37°Cに温め、5 N KOHでpHを7.4に調整します。蒸留水を加え、体積を最大1 L.フィルター滅菌し、アリコートを-20°Cに保存します。 2x MASを用いてミトコンドリア基質および阻害剤のアッセイ培地および作動溶液を調製する。
| 命令 | 期間 | 注入された化合物 |
| キャリブレーション | デフォルトで | |
| 平衡 | はい | |
| ベースライン | ||
| 2 サイクル | ||
| 混ぜる | 30 s | |
| 待つ | 30 s | |
| 測る | 2分 | |
| ポート A を挿入する | 基板 | |
| 2 サイクル | ||
| 混ぜる | 30 s | |
| 待つ | 30 s | |
| 測る | 2分 | |
| ポート B を注入する | オリゴマイシン | |
| 2 サイクル | ||
| 混ぜる | 30 s | |
| 待つ | 30 s | |
| 測る | 2分 | |
| ポート C を注入する | FCCP | |
| 2 サイクル | ||
| 混ぜる | 30 s | |
| 待つ | 30 s | |
| 測る | 2分 | |
| ポート D を注入する | ロテノーネ+ アンティマイシンA | |
| 2 サイクル | ||
| 混ぜる | 30 s | |
| 待つ | 30 s | |
| 測る | 2分 |
表2: アッセイプロトコルのコマンド
| 5 mLの容積 | ||||||
| 基板 | ストックコンク。 | 作業conc. | 株式 | 2x MAS | dH2O | 最後の簡潔な. |
| コハク酸/ロテノーネ | 1 M/20 mM | 100 mM/10 μM | 500 μL/ 2.5 μL | 2.5 mL | 1997.5 μL | 10 mM/1 μM |
| ピルビン酸/スレート | 1 M/100 mM | 100 mM /10 mM | 500 μL/500 μL | 2.5 mL | 1500 μL | 10 mM /1 mM |
| グルタミン酸/スレート | 1 M/100 mM | 100 mM /10 mM | 500 μL/500 μL | 2.5 mL | 1500 μL | 10 mM /1 mM |
| パルミトイル カルニチン/マレート | 10mM/100 mM | 400 μM /10 mM | 200 μL/500 μL | 2.5 mL | 1800 μL | 40 μM /1 mM |
| 阻害 剤 | ||||||
| オリゴマイシン | 25mM | 15 μM | 3 μL | 2.5 mL | 2497 μL | 1.5 μM |
| FCCP | 50mM | 40 μM | 4 μL | 2.5 mL | 2496 μL | 4 μM |
| ロテノーネ/アンチミシンA | 20mM/20 mM | 10 μM/ 10 μM | 2.5 μL/2.5 μL | 2.5 mL | 2495 μL | 1 μM/ 1 μM |
表3: 図3で既に説明したように、センサカートリッジの注入ポートに装填されるミトコンドリア基質および阻害剤のリスト。 ストック溶液から示された体積を混合し、2x MAS、および蒸留水を混合し、各基質またはインヒビター混合物の5mLの作業濃度を調製する。最終的な濃度は、注入プロセス後のウェルで達成されます。
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Discussion
このプロトコルは、以前に発表された研究7、8、9、10と製品ユーザーガイドの変更です。メーカーのプロトコルとは対照的に、2x MASは3倍MASの代わりに使用され、2×MASは溶解しやすく、凍結後に沈殿物を形成しません。凍結された2x MASアリコートは、最大6ヶ月保存でき、一貫した結果を示すことができます。もう一つの違いは、2x MASの成分にADPを含み、式からBSAを省略する。BSAを含む溶液は、注入することがより困難であり、エラーや外れ値の大きな可能性を引き起こします.しかし、BSAの存在は、適切な透過性を達成するためにrPFOの必要量を減らすために不可欠である。したがって、BSAは、細胞洗浄後の透過化工程で使用されるアッセイ媒体(MAS-BSA-rPFO)にのみ添加される。
細胞培養培地から細胞を洗浄するために、このプロトコルはMASの代わりにPBSを使用する。PBSは等張性であり、カリウムが豊富で細胞形態を変えることができるナトリウムフリーMASとは対照的に、細胞形状に変化を引き起こさない。もう一つの大きな違いは、アッセイプロトコルの平衡ステップを維持することです。平衡ステップは12分間続き、2つの測定サイクルに等しい。平衡段階を維持する目的は、機器内部の温度を安定させ、同時に、細胞がアッセイ媒体中のADPの存在によって増強される任意の可能な内部酸化可能な店舗を酸化できるようにすることである。
細胞培養技術に関するいくつかの考慮事項を与えるべきである。本研究では、検査した細胞をアッセイの前日に播種した。しかし、一部の細胞は、より長い培養または治療時間を必要とします。研究の設計が分化した細胞、新たに単離された、または非接着細胞を含む場合、細胞培養マイクロプレートに細胞を固定するために適切なコーティングが必要である。このプロトコルは、懸濁液中の細胞には適しておらず、細胞および組織接着剤の使用が推奨される。このプロトコルのもう一つの制限は、この方法が定量的データを締結するのに適していないということです。つまり、この方法では、測定前の各ウェルのミトコンドリアタンパク質の実際の量を推定することはできない。従って、この方法は、リン酸/酸素比(P/O比)5の正確な推定値を提供することなく、ミトコンドリア基質フラックスの迅速なスクリーニングを生成する。しかし、このプロトコルを小さいサンプル11の定量的研究に使用することができる。そのためには、分離したばかりのミトコンドリアを得て、細胞および組織接着剤を使用してミトコンドリアを細胞培養マイクロプレートに固定する必要があります。
このプロトコルを使用して、最良の再現性の結果を得るためには、使用される試薬の濃度に注意してください。使用される溶液、インキュベーターおよび器械の温度は安定しているべきである。すべてのソリューションと基板に調整されたpHがあることを確認します。前述のように、注入される予定のソリューションにBSAを含めないことを推奨します。結果に広範囲のエラー範囲が表示される場合は、グループ形式ではなくウェル形式で結果を表示し、可能な外れ値を検索して削除します。
この研究では、単一の測定を最大限に活用して、適切なバックグラウンドコントロールと十分な反復を比較的短時間で同時にスクリーニングする試み。結果に示すように、この方法は、1つの群を1つの濃度の薬物で処理することによって作成された2つの表現型を比較するのに有用である。異なる細胞株または遺伝子操作された細胞を比較するために採用することができます。.プロトコルは、汎用性と異なる基質、または阻害剤は、任意の細胞モデルにおけるミトコンドリア基質フラックスの適応をスクリーニングするために使用することができる。
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Disclosures
著者は宣言する利害の対立はありません。
Acknowledgments
著者らは、フラデック・クラロヴェの医学部生理学部門の職員と第3医学部の病態生理学科の職員に、化学物質とサンプルの調製に協力してくれたことに感謝する。この研究は、チャールズ大学の助成プログラムPROGRES Q40/02、チェコ保健省補助金NU21-01-00259、チェコ科学財団助成金18-10144、INOMEDプロジェクトCZ.02.1.01/0.0/18_069/0010046によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
| Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 - 8 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
| HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
| L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
| L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
| Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
| Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
| Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 - 8 °C |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
| Water | Merck | W3500 | store at RT |
| XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
| XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 °C |
References
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