組換えペルフリンゴライシンO-透過細胞におけるミトコンドリア基質フラックスの測定
Summary
本研究では、マイクロプレートベースの呼吸法と組み合わせて組み換えパーフリンゴライシンOを用いてミトコンドリア呼吸基質フラックスを試験する改変プロトコルについて説明する。このプロトコルを用いて、メトホルミンが2つの異なる腫瘍細胞株のミトコンドリア呼吸にどのように影響するかを示す。
Abstract
ミトコンドリア基質フラックスは、各細胞型の特徴であり、トランスポーター、チャネル、酵素などの成分の変化が、いくつかの疾患の病因に関与している。ミトコンドリア基質フラックスは、インタクト細胞、透過細胞、または単離ミトコンドリアを用いて研究することができる。無傷の細胞を調査することは、異なる基質の同時酸化のためにいくつかの問題に遭遇する。また、いくつかの細胞タイプは結果解釈を複雑にする異なる基質の内部ストアを含む。ミトコンドリアの分離や透過性の薬剤の使用などの方法は、容易に再現できません。小さいサンプルから十分な量の無傷の膜で純粋なミトコンドリアを分離することは問題である。非選択的パーメアビライザーを使用すると、さまざまな程度の不可避ミトコンドリア膜損傷を引き起こす。組換えペルフリンゴライシンO(rPFO)は、ミトコンドリア完全性に影響を与えることなく、細胞膜を選択的に透過させる能力のおかげで、より適切なパーメアビライザーとして提供された。マイクロプレートの呼吸数と組み合わせて使用すると、最小数の細胞を使用しながら、1回の実験内で十分な反復を伴ういくつかのミトコンドリア基質のフラックスをテストすることができます。本研究では、このプロトコルは、2つの異なる細胞表現型または遺伝子型のミトコンドリア基質フラックスを比較する方法を説明し、様々なミトコンドリア基質または阻害剤を試験するようにカスタマイズすることができる。
Introduction
マイクロプレートベースの呼吸数は、小さいサンプルサイズ1の細胞呼吸の研究を可能にすることによってミトコンドリア研究に革命を起こしました。細胞呼吸は、ミトコンドリア機能または「機能不全」の指標として一般的に考えられるが、ミトコンドリアの機能範囲がエネルギー産生を超えて広がっている2。好気条件では、ミトコンドリアは、これらの基質を分解して、クエン酸サイクル3 を燃料とすることができる代謝中間体に変換することによって、異なる基質に蓄えられているエネルギーを抽出する(図1)。基質の連続流束は、クエン酸サイクルの流れに不可欠であり、高エネルギーの「電子ドナー」を生成し、内部ミトコンドリア膜を横切って陽子勾配を生成する電子輸送鎖に電子を送達し、ATP合成酵素がADPをATP4にリン酸化することを可能にする。したがって、ミトコンドリア呼吸をアッセイする実験計画には、サンプル性質(無傷細胞、透過細胞、または単離ミトコンドリア)およびミトコンドリア基質を含まなければならない。
細胞は先住民族の基質5の貯蔵を維持し、ミトコンドリアは、同時に数種類の基質を酸化する6、無傷の細胞に対して行われた実験から得られた結果の解釈を複雑にする。選択した基質を酸化するミトコンドリア能力を調査する一般的なアプローチは、ミトコンドリアを単離するか、または調査した細胞5を透過させることである。分離ミトコンドリアは定量的研究に理想的ですが、分離プロセスは面倒です。大きなサンプルサイズ、収率の純度、技術5の再現性などの技術的な困難に直面しています。透過細胞はミトコンドリアの分離の欠点のためのソリューションを提供します;;しかし、洗剤の日常的な透過性剤は特異的ではなく、ミトコンドリア膜5に損傷を与える可能性がある。
組換えペルフリンゴライシンO(rPFO)は、選択的な血漿膜透過性剤7として提供され、そして、いくつかの研究7、8、9、10において細胞外フラックス分析装置との併用に成功した。XFe96細胞外フラックス分析装置を用いて、rPFOを用いてミトコンドリア基質フラックスをスクリーニングするプロトコルを改変した。このプロトコルでは、2つの細胞型の4つの異なる基質酸化経路を比較し、試験した各材料に対して十分な反復と適切な制御を有する。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、以前に発表された研究7、8、9、10と製品ユーザーガイドの変更です。メーカーのプロトコルとは対照的に、2x MASは3倍MASの代わりに使用され、2×MASは溶解しやすく、凍結後に沈殿物を形成しません。凍結された2x MASアリコートは、最大6ヶ月保存でき、一貫した結果を示すことが…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、フラデック・クラロヴェの医学部生理学部門の職員と第3医学部の病態生理学科の職員に、化学物質とサンプルの調製に協力してくれたことに感謝する。この研究は、チャールズ大学の助成プログラムPROGRES Q40/02、チェコ保健省補助金NU21-01-00259、チェコ科学財団助成金18-10144、INOMEDプロジェクトCZ.02.1.01/0.0/18_069/0010046によって支援されました。
Materials
| Adinosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
| Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 – 8 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
| HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
| L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
| L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
| Magnissium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
| Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
| Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
| Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 – 8 °C |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
| Water | Merck | W3500 | store at RT |
| XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
| XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) – Aliquot and store at -20 °C |
References
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
- Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics 3. , (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).
- Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).
