Summary
I dette arbejde beskriver vi en modificeret protokol til test af mitokondriesubstratstrømpe ved hjælp af rekombinant perfringolysin O i kombination med mikropladebaseret respirometri. Med denne protokol viser vi, hvordan metformin påvirker mitokondrie respiration af to forskellige tumorcellelinjer.
Abstract
Mitokondrie substrat flux er et kendetegn ved hver celletype, og ændringer i dens komponenter såsom transportører, kanaler eller enzymer er involveret i patogenesen af flere sygdomme. Mitokondrie substrat flux kan studeres ved hjælp af intakte celler, permeabilized celler, eller isolerede mitokondrier. Undersøgelse af intakte celler støder på flere problemer på grund af samtidig oxidation af forskellige substrater. Desuden indeholder flere celletyper interne lagre af forskellige substrater, der komplicerer resultatfortolkning. Metoder såsom mitokondrie isolation eller ved hjælp af permeabilizing agenter er ikke let reproducerbare. Isolering af ren mitokondrier med intakte membraner i tilstrækkelige mængder fra små prøver er problematisk. Brug af ikke-selektive permeabilizers forårsager forskellige grader af uundgåelige mitokondrie membran skader. Rekombinant perfringolysin O (rPFO) blev tilbudt som en mere passende permeabilizer, takket være sin evne til selektivt permeabilize plasmamembran uden at påvirke mitokondrie integritet. Når det bruges i kombination med mikroplade respirometri, det gør det muligt at teste flux af flere mitokondrie substrater med nok replikerer inden for et eksperiment, mens du bruger et minimalt antal celler. I dette arbejde beskriver protokollen en metode til at sammenligne mitokondriesubstrat flux af to forskellige cellulære fænotyper eller genotyper og kan tilpasses til at teste forskellige mitokondrie substrater eller hæmmere.
Introduction
Mikropladebaseret respirometri har revolutioneret mitokondrieforskning ved at muliggøre studiet af cellulært åndedræt af en lille prøvestørrelse1. Cellulær respiration betragtes generelt som en indikator for mitokondriefunktion eller 'dysfunktion', på trods af at mitokondriespektret af funktioner strækker sig ud over energiproduktion2. Under aerobe forhold udvinder mitokondrier den energi, der lagres i forskellige substrater, ved at nedbryde og omdanne disse substrater til metaboliske mellemprodukter, der kan give næring tilcitronsyrecyklussen 3 (Figur 1). Den kontinuerlige flux af substrater er afgørende for strømmen af citronsyre cyklus til at generere høj energi 'elektron donorer', som leverer elektroner til elektron transport kæde, der genererer en proton gradient på tværs af den indre mitokondriemembran, gør det muligt ATP-synthase at fosforylatere ADP til ATP4. Derfor skal et eksperimentelt design til analyse af mitokondrie respiration omfatte prøven naturen (intakte celler, permeabilized celler, eller isolerede mitokondrier) og mitokondrie substrater.
Celler holder et lager af indfødte substrater5, og mitokondrier oxiderer flere typer substrater samtidigt6, hvilket komplicerer fortolkningen af resultater fra eksperimenter udført på intakte celler. En fælles tilgang til at undersøge mitokondrie evne til at oxidere et udvalgt substrat er at isolere mitokondrier eller permeabilize de undersøgte celler5. Selvom isolerede mitokondrier er ideelle til kvantitative undersøgelser, er isolationsprocessen besværlig. Det står over for tekniske vanskeligheder såsom behovet for stor prøvestørrelse, renhed af udbyttet og reproducerbarhed af teknikken5. Permeabiliserede celler tilbyder en løsning til ulemperne ved mitokondrieisolering; rutinemæssige permeabiliseringsmidler af vaskemiddelkarakter er dog ikke specifikke og kan beskadige mitokondriemembraner5.
Rekombinant perfringolysin O (rPFO) blev tilbudt som et selektivt plasmamembranpermeabiliserende middel7, og det blev anvendt med succes i kombination med en ekstracellulær fluxanalysator i flere undersøgelser7,8,9,10. Vi har ændret en protokol ved hjælp af rPFO til at screene mitokondrie substrat flux ved hjælp af XFe96 ekstracellulære flux analysator. I denne protokol sammenlignes fire forskellige substratoxiderende veje i to cellulære fænotyper, mens der er tilstrækkelige replikater og den korrekte kontrol for hvert testet materiale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. En dag før analysen
- Fremstilling af reagenser og substrater.
- Mitokondrieanalyseopløsning (MAS): Udarbejde lageropløsninger af alle reagenser som beskrevet i tabel 1. Varm lagrene af mannitol og saccharose til 37 °C for at opløses fuldstændigt. Bland reagenserne til fremstilling af 2x MAS, og varm derefter blandingen til 37 °C. Juster pH med 5N KOH til 7,4 (~7 mL), tilsæt derefter vand for at bringe volumen op til 1 L. Filtersterilisation og opbevar aliquots ved -20 °C indtil måledagen.
- Kvæg serum albumin (5% BSA): Opløs 5 g BSA i 90 mL af præwarmed sterilt vand på en magnetisk omrører og undgå at ryste. Juster pH til 7,4 med 5 N KOH, og tilsæt derefter vand for at bringe lydstyrken op til 100 mL. Filtersterilalisere og opbevar aliquoterne ved -20 °C indtil måledagen.
- Mitokondriesubstrater: Forbered 1 M lageropløsninger af natrium succinate, natrium pyruvat og natriumglutamat i sterilt vand. Forbered 100 mM lageropløsning af natrium malat i sterilt vand og brug forwarmed sterilt vand til at forberede en 10 mM lageropløsning af palmitoylcarnitin. Juster pH for hver opløsning til 7,4 ved 5 N KOH, og filtersteriliseres. Underlaget opbevares ved 2-8 °C. På brugstidspunktet opvarmes palmitoylcarnitin til 37 °C for at opløse eventuelle bundfald. Til senere brug opbevares aliquots af alle substrater undtagen pyruvat ved -20 °C.
- Mitokondriehæmmere: Brug dimethylsulfoxid (DMSO) til at forberede lageropløsninger på 25 mM oligomycin, 50 mM carbonylcyanid 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), 20 mM rotenone og 20 mM antimycin A. Opbevar aliquots ved -20 °C.
- Såning og behandling af cellerne: Som vist i figur 2, så cellerne i kolonne 2-11. Kolonne 1 og 12 skal stå tomme for at fungere som baggrunds brønde. I dette arbejde blev HepG2 og A549 celler brugt.
- Frø cellerne med en massefylde på 20.000 celler pr. Brønd. Brug 50-80 μL cellekulturmedium til såning.
- Fyld de tomme brønde med et tilsvarende volumen af cellekulturmediet og inkuber cellerne ved 37 °C i en befugtet inkubator med 5% CO2. Lad cellerne fastgøre i 3-4 timer, og tilsæt derefter 100 μL cellekulturmedie til alle brønde.
- Med den sidste medium tilføjelse skal behandlingen anvendes i kolonne 7-11. I dette arbejde blev forsøgsgruppen behandlet med 1 mM metforminhydrochlorid i 16 timer, og kontrolgruppen blev behandlet med en lige stor mængde sterilt destilleret vand som køretøjskontrol.
- Fugtgivende sensorerne: Pipette 200 μL sterilt vand pr. brønd ind i brugspladen, og returner derefter forsigtigt sensorpatronen, mens sensorerne nedsænkes i vand. Inkuberes patronen i en CO2-friinkubator ved 37 °C indtil næste dag.
- Analyseprotokolskabelonen: Tænd analysator (se Materialetabel) og controllerenheden. Start instrumentstyrings- og dataindsamlingssoftwaren, og design analyseprotokollen som beskrevet i tabel 2. Under Gruppedefinitionerskal du oprette fire injektionsstrategier, hvor port A adskiller sig alt efter det injicerede substrat (Figur 3). Navngiv strategierne efter substraterne eller deres forkortelser.
- Til henholdsvis havne B, C og D skal du tildele forbindelserne oligomycin, FCCP og rotenone/antimycin A. Opret otte grupper, og navngiv dem som vist i figur 4. Under Pladeoversigten tildele grupperne til de tilsvarende brønde, og gem derefter protokollen som en brugsklar skabelon. Lad analysatoren være tændt, så temperaturen kan stabilisere sig natten over. Hold analysator på et sted med en stabil temperatur for at undgå pludselige temperaturændringer.
2. Dagen for analysen
- Udskiftning af vand med calibrant: Kassér vandet fra brugspladen og pipetten 200 μL for forvarm calibrant per godt ind i brugspladen. Patronen returneres til den CO2-frieinkubator indtil analysetidspunktet. For at undgå hurtig fordampning af calibranten skal du opretholde en fugtighedskilde inde i inkubatoren og slukke eller reducere blæserhastigheden til et minimum.
- Forberedelse af arbejdsløsningerne: Start med opvarmning af 2x MAS, 5% BSA og sterilt vand til 37 °C. I mellemtiden, lad hæmmer bestande at nå stuetemperatur. Brug varmt 2x MAS og sterilt destilleret vand til at forberede 5 mL af arbejdskoncentrationen af substrater og hæmmere som beskrevet i tabel 3.
- Lastning af injektionsportene: Som vist i figur 3skal der indlæses 20 μL af substraterne i port A. Læg succinate/rotenonblanding i port A i række A og B. Læg pyruvat/malatblanding i port A i række C og D. Læg glutamat/malatblanding i port A i række A og F. Læg palmitoylcarnitin/malatblanding i port A i række A og H. For hele pladen skal der fyldes port B med 22 μL oligomycinpræparat, port C med 25 μL FCCP-præparat og port D med 27 μL rotenone/antimycin A-blanding.
- Start kalibreringstrinnet: Klik på Startkørsel under fanen Kør analyse for at starte analysen. Sæt den indlæste sensorpatron i gang, og start kalibreringstrinnet. Vent på, at kalibreringen fuldføres, før du går videre til næste trin.
- Fremstilling af analysemediet (MAS-BSA-rPFO): For at forberede 20 mL af analysemediet blandes 10 mL 2x MAS, 9,2 mL sterilt vand og 0,8 mL 5% BSA i et 50 mL rør. Der tilsættes 2 μL på 10 μM rPFO for at opnå en koncentration på 1 nM og genanvende blandingen med skånsom pipettering. Undgå at ryste og brug ikke en vortex mixer til blanding. Inkuberes røret ved 37 °C indtil brugstidspunktet.
- Vask cellerne: Vask cellerne og de tomme tomme brønde to gange med forvarmet calcium- og magnesiumfri fosfatbufferet saltvand (PBS) ved hjælp af en multikanalpipette. Undgå at genbruge de samme tips til at kassere cellekulturmediet og tilsætte PBS. Udfør dette trin uden for laminarstrømmen for at beskytte cellerne mod udtørring af luftstrømmen.
- Cellepermeabilisering i analysemedium: Ved hjælp af en multikanalpipette skal pbs'en kasseres og erstattes med 180 μL af det forvarmede analysemedium (MAS-BSA-rPFO).
- Start af målingen: Umiddelbart efter permeabilisering skal du udskifte brugspladen på den kalibrerede sensorpatron med cellepladen og starte målingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Start med at normalisere resultaterne til den anden måling af baseline respiration for at vise værdier som iltforbrugsprocent (OCR%). Resultaterne af analysen er vist i figur 5, figur 6, figur 7 og figur 8. Det er vigtigt at tildele de rigtige baggrunds brønde for hver gruppe og inaktivere baggrunds brønde i andre grupper. Figur 5 viser, at den behandlede gruppe har en højere grad af succinate-induceret respiration. A549-cellernes respons på metforminbehandling (Figur 5A) var højere end HepG2-celler (figur 5B). Baggrundskontrolbjerne var kun dem fra de samme rækker i den sammenlignede gruppe, i dette tilfælde brønde A1, B1, A12 og B12. Figur 6 viser ændringerne i respirationen i pyruvat/malate-induceret respiration. Figur 7 viser ændringerne i glutamat/malate-induceret åndedræt, og figur 8 viser ændringerne i palmitoylcarnitin/malat-induceret respiration.
Figur 1: En skematisk repræsentation af citronsyrecyklus. De anvendte substrater til at teste mitokondrie substrat flux er i rødt. Malat bruges ikke alene, men anvendes i kombination med pyruvat, palmitoylcarnitin og glutamat. Malats rolle i pyruvat/malate- og palmitoylcarnitin/malate-induceret respiration er at give oxaloacetat gennem virkningen af malate dehydrogenaseenzymet. I glutamat/malat-induceret åndedræt deltager malat i malate-aspartat shuttle. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Illustration af celle såning planen i cellekultur mikropladen. Tomme brønde i kolonne 1 og 12 skal stå tomme uden celler. Kolonne 7-11 bruges til behandling af forsøgsgruppen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Illustration af injektionsstrategien. Port A af række A og B er fyldt med succinate /rotenone blanding. Port A af række C og D er fyldt med pyruvat /malat blanding. Port A af række E og F er fyldt med glutamat / malat blanding. Port A af række G og H er fyldt med palmitoyl carnitin / malat blanding. For hele pladen er havne B, C og D lastet med henholdsvis oligomycin, FCCP og rotenone/antimycin A. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Gruppenavne og pladekort. Hver gruppe er navngivet i henhold til fænotypen (kontrol eller behandlet) og substratet bruges til at fremkalde respiration. (S), succinate-induceret respiration. (P/M), pyruvat/malate-induceret åndedræt. (G/M), glutamat/malate-induceret åndedræt. (CP/M), palmitoylcarnitin/malate-induceret åndedræt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Succinate-induceret åndedræt. (A) A549 og (B) HepG2. Den testede gruppe blev behandlet med 1 mM metforminhydrochlorid i 16 timer. Kun baggrundsbjerne A1, B1, A12 og B12 bruges til korrektion. Resultaterne vises som gennemsnitlige OCR% ± SD. Grafen og plade gitter blev oprettet og eksporteret som billedfiler af analysen design, dataanalyse, og filhåndtering software. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Pyruvat/malate-induceret respiration. (A) A549 og (B) HepG2. Den testede gruppe blev behandlet med 1 mM metforminhydrochlorid i 16 timer. Kun baggrundsjerne C1, D1, C12 og D12 bruges til korrektion. Resultaterne vises som gennemsnitlige OCR% ± SD. Grafen og plade gitter blev oprettet og eksporteret som billedfiler af analysen design, dataanalyse, og filhåndtering software. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Glutamat/malate-induceret respiration. (A) A549 og (B) HepG2. Den testede gruppe blev behandlet med 1 mM metforminhydrochlorid i 16 timer. Kun baggrundsbejlerne E1, F1, E12 og F12 bruges til korrektion. Resultaterne vises som gennemsnitlige OCR% ± SD. Grafen og plade gitter blev oprettet og eksporteret som billedfiler af analysen design, dataanalyse, og filhåndtering software. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Palmitoyl carnitin/malate-induceret respiration. (A) A549 og (B) HepG2. Den testede gruppe blev behandlet med 1 mM metforminhydrochlorid i 16 timer. Kun baggrundsjerne G1, H1, G12 og H12 bruges til korrektion. Resultaterne vises som gennemsnitlige OCR% ± SD. Grafen og plade gitter blev oprettet og eksporteret som billedfiler af analysen design, dataanalyse, og filhåndtering software. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Mitokondrie assay medium | ||||
| Lager (mM) | Volumen fra lager pr. liter (mL) | 2x MAS (mM) | MAS (mM) | |
| Saccharose | 1000 | 140 | 140 | 70 |
| Mannitol | 1000 | 440 | 440 | 220 |
| KH2PO4 | 1000 | 20 | 20 | 10 |
| MgCl2 | 200 | 50 | 10 | 5 |
| HEPES | 200 | 20 | 4 | 2 |
| EGTA | 200 | 10 | 2 | 1 |
| ADP | 200 | 20 | 4 | 2 |
Tabel 1: Mitokondrie assay opløsning. Bland den angivne mængde af hver ingrediens lageropløsning til at forberede (2x MAS). Opløsningen opvarmes til 37 °C, og juster derefter pH med 5 N KOH til 7,4. Tilsæt destilleret vand for at bringe volumen op til 1 L. Filter-sterilisere og derefter opbevare aliquots på -20 °C. Forbered analysemediet og arbejdsopløsningerne af mitokondriesubstrater og hæmmere ved hjælp af 2x MAS.
| Kommando | Varighed | Indsprøjtet forbindelse |
| Kalibrering | som standard | |
| Ekvilibrering | Ja | |
| Grundlinje | ||
| 2 cyklusser | ||
| Blande | 30 s | |
| Vent | 30 s | |
| Måle | 2 min | |
| Indsprøjt port A | Substrater | |
| 2 cyklusser | ||
| Blande | 30 s | |
| Vent | 30 s | |
| Måle | 2 min | |
| Indsprøjt port B | Oligomycin | |
| 2 cyklusser | ||
| Blande | 30 s | |
| Vent | 30 s | |
| Måle | 2 min | |
| Indsprøjt port C | FCCP | |
| 2 cyklusser | ||
| Blande | 30 s | |
| Vent | 30 s | |
| Måle | 2 min | |
| Indsprøjt port D | Rotenone + Antimycin A | |
| 2 cyklusser | ||
| Blande | 30 s | |
| Vent | 30 s | |
| Måle | 2 min |
Tabel 2: Kommandoer i analyseprotokollen.
| Volumen i 5 mL | ||||||
| Substrater | Aktiekonk. | Arbejdende konc. | Lager | 2x MAS | dH2O | Sidste konk. |
| Succinate/rotenone | 1 M/20 mM | 100 mM/10 μM | 500 μL/ 2,5 μL | 2,5 mL | 1997,5 μL | 10 mM/1 μM |
| Pyruvat/malate | 1 M/100 mM | 100 mM /10 mM | 500 μL/500 μL | 2,5 mL | 1500 μL | 10 mM /1 mM |
| Glutamat/malat | 1 M/100 mM | 100 mM /10 mM | 500 μL/500 μL | 2,5 mL | 1500 μL | 10 mM /1 mM |
| Palmitoyl carnitin/malate | 10 mM/100 mM | 400 μM /10 mM | 200 μL/500 μL | 2,5 mL | 1800 μL | 40 μM /1 mM |
| Hæmmere | ||||||
| Oligomycin | 25 mM | 15 μM | 3 μL | 2,5 mL | 2497 μL | 1,5 μM |
| FCCP | 50 mM | 40 μM | 4 μL | 2,5 mL | 2496 μL | 4 μM |
| Rotenone/antimycin A | 20 mM/20 mM | 10 μM/ 10 μM | 2,5 μL/2,5 μL | 2,5 mL | 2495 μL | 1 μM/ 1 μM |
Tabel 3: Liste over mitokondriesubstrater og hæmmere, der skal lægges i sensorpatronernes injektionsporte som tidligere omtalt i figur 3. Bland de angivne mængder fra lageropløsninger, 2x MAS og destilleret vand for at forberede 5 mL af arbejdskoncentrationen af hvert substrat eller inhibitorblanding. Den endelige koncentration opnås i brøndene efter injektionsprocessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol er en ændring af tidligere offentliggjorte undersøgelser7,8,9,10 og produktbrugervejledningen. I modsætning til producentens protokol anvendes 2x MAS i stedet for 3x MAS, da 2× MAS er lettere at opløse og ikke danner nedbør efter frysning. Frosne 2x MAS aliquots kan opbevares op til seks måneder og vise ensartede resultater. En anden forskel er at inkludere ADP i komponenterne i 2x MAS og udelade BSA fra formlen. Løsninger, der indeholder BSA, er vanskeligere at injicere og forårsage større risiko for fejl og afvigelser. Tilstedeværelsen af BSA er imidlertid afgørende for at reducere mængden af rPFO for at opnå korrekt permeabilisering. Derfor tilsættes BSA kun til analysemediet (MAS-BSA-rPFO), der anvendes i permeabiliseringstrinnet efter cellevask.
For at vaske cellerne fra cellekulturmediet bruger denne protokol PBS i stedet for MAS. PBS er isotonisk og forårsager ingen ændring i cellulær form, i modsætning til natriumfri MAS, der er rig på kalium og kan ændre cellulær morfologi. En anden stor forskel er at holde ækvilibrering skridt i analysen protokollen. Ækvilibreringstrinnet varer i 12 min, hvilket er lig med 2 målecyklusser. Formålet med at holde ækvilibreringstrinnet er at stabilisere temperaturen inde i instrumentet og samtidig gøre det muligt for cellerne at oxidere eventuelle interne oxiderede lagre, hvilket forstærkes af tilstedeværelsen af ADP i analysemediet.
Der bør tages hensyn til cellekulturteknikker. I dette arbejde blev de undersøgte celler sået dagen før analysen. Nogle celler kræver dog længere kultur eller behandlingstid. Hvis undersøgelsesdesignet omfatter differentierede celler, frisk isolerede eller ikke-klæbende celler, kræves der en korrekt belægning for at fastgøre celler i cellekulturens mikroplade. Denne protokol er ikke egnet til celler i suspension, og brugen af celle- og vævslim anbefales. En anden begrænsning af denne protokol er, at denne metode ikke er egnet til at konkludere kvantitative data. Med andre ord er det ikke muligt ved denne metode at estimere den faktiske mængde mitokondrieprotein i hver brønd før målingen. Derfor genererer denne metode en hurtig screening af mitokondriesubstratstrømpe uden at give et nøjagtigt skøn over fosfat /ilt-forholdet (P/O-forhold)5. Det er dog muligt at anvende denne protokol til kvantitative undersøgelser af små prøver11. Til dette formål er det nødvendigt at opnå friskisoleret mitokondrier og bruge celle- og vævslim til at fastgøre mitokondrier til cellekulturens mikroplade.
For at opnå de bedste reproducerbare resultater ved at bruge denne protokol skal du være opmærksom på koncentrationen af de anvendte reagenser. Temperaturen på de anvendte opløsninger, inkubatorer og instrument skal være stabil. Sørg for, at alle løsninger og substrater har en justeret pH-fejl. Som tidligere nævnt anbefales det ikke at medtage BSA i de løsninger, der er planlagt til at blive injiceret. Hvis resultaterne viser et bredt fejlområde, skal du vise resultaterne i brøndformatet i stedet for gruppeformat, som du kan søge efter, og slette mulige afvigelser.
I dette arbejde forsøgte vi at opnå maksimal brug af en enkelt måling til samtidig at screene flere mitokondriesubstrat fluxer med korrekt baggrundskontrol og nok replikerer på relativt kort tid. Som vist i resultaterne er metoden nyttig til at sammenligne to fænotyper skabt ved at behandle en gruppe med en koncentration af et lægemiddel. Det kan anvendes til at sammenligne forskellige cellelinjer eller genetisk manipulerede celler. Protokollen er alsidig og forskellige substrater, eller hæmmere kan bruges til at screene tilpasning af mitokondrie substrat flux i enhver cellulær model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt at erklære.
Acknowledgments
Forfatterne takker de ansatte på Institut for Fysiologi på Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet i Hradec Králové og Institut for Patofysiologi på Det Tredje Sundhedsvidenskabelige Fakultet for hjælp til fremstilling af kemikalier og prøver. Dette arbejde blev støttet af Charles University tilskud programmer PROGRES Q40/02, tjekkiske sundhedsministerium tilskud NU21-01-00259, Tjekkisk Videnskab Foundation tilskud 18-10144 og INOMED projekt CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Ungdom og Sport i Tjekkiet og af Den Europæiske Union.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
| Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 - 8 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
| HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
| L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
| L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
| Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
| Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
| Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 - 8 °C |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
| Water | Merck | W3500 | store at RT |
| XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
| XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 °C |
References
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
- Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. , Academic press. London. (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).
- Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).
