Summary
I detta arbete beskriver vi ett modifierat protokoll för att testa mitokondriellt luftvägarna substrat flux med rekombinant perfringolysin O i kombination med mikroplate-baserade respirometry. Med detta protokoll visar vi hur metformin påverkar mitokondriell andning av två olika tumör cellinjer.
Abstract
Mitokondriellt substratflöde är en särskiljande egenskap hos varje celltyp, och förändringar i dess komponenter som transportörer, kanaler eller enzymer är involverade i patogenesen vid flera sjukdomar. Mitokondriellt substratflöde kan studeras med intakta celler, permeabiliserade celler eller isolerade mitokondrier. Att undersöka intakta celler stöter på flera problem på grund av samtidig oxidation av olika substrat. Dessutom innehåller flera celltyper interna lager av olika substrat som komplicerar resultattolkningen. Metoder som mitokondriell isolering eller användning av permeabiliserande medel är inte lätt reproducerbara. Att isolera rena mitokondrier med intakta membran i tillräckliga mängder från små prover är problematiskt. Användning av icke-selektiva permeabilizers orsakar olika grader av oundviklig mitokondriell membranskada. Rekombinant perfringolysin O (rPFO) erbjöds som en lämpligare permeabilizer, tack vare dess förmåga att selektivt permeabilize plasma membran utan att påverka mitokondriell integritet. När det används i kombination med mikroplatta respirometry, det gör det möjligt att testa flödet av flera mitokondriella substrat med tillräckligt med replikater inom ett experiment samtidigt som man använder ett minimalt antal celler. I detta arbete beskriver protokollet en metod för att jämföra mitokondriellt substratflöde av två olika cellulära fenotyper eller genotyper och kan anpassas för att testa olika mitokondriella substrat eller hämmare.
Introduction
Mikroplatebaserad respirometri har revolutionerat mitokondriell forskning genom att möjliggöra studier av cellandning av ett litet provstorlek1. Cellulär andning anses i allmänhet vara en indikator på mitokondriell funktion eller "dysfunktion", trots att det mitokondriella utbudet av funktioner sträcker sig utöver energiproduktion2. Under aeroba förhållanden extraherar mitokondrier den energi som lagras i olika substrat genom att bryta ner och omvandla dessa substrat till metaboliska intermediärer som kan driva citronsyracykeln3 (figur 1). Det kontinuerliga flödet av substrat är avgörande för flödet av citronsyracykeln för att generera högenergi "elektrondonatorer", som levererar elektroner till elektrontransportkedjan som genererar en protongradient över det inre mitokondriella membranet, vilket gör det möjligt för ATP-syntas att fosforylera ADP till ATP4. Därför måste en experimentell design för att analysera mitokondriell andning omfatta provnaturen (intakta celler, permeabiliserade celler eller isolerade mitokondrier) och mitokondriella substrat.
Celler håller ett lager av inhemska substrat5, och mitokondrier oxiderar flera typer av substrat samtidigt6, vilket komplicerar tolkningen av resultat som erhållits från experiment som utförs på intakta celler. Ett vanligt tillvägagångssätt för att undersöka mitokondriell förmåga att oxidera ett valt substrat är att isolera mitokondrier eller permeabilisera de undersökta cellerna5. Även om isolerade mitokondrier är idealiska för kvantitativa studier, är isoleringsprocessen mödosam. Det står inför tekniska svårigheter som behovet av stor provstorlek, renhet av utbytet och reproducerbarhet av tekniken5. Permeabiliserade celler erbjuder en lösning för nackdelarna med mitokondriell isolering; Rutinmässiga permeabiliserande medel av tvättmedelskaraktär är dock inte specifika och kan skada mitokondriella membran5.
Rekombinant perfringolysin O (rPFO) erbjöds som ett selektivt plasmameabiliserande medel7, och det användes framgångsrikt i kombination med en extracellulär flödesanalysator i flera studier7,8,9,10. Vi har modifierat ett protokoll med rPFO för att screena mitokondriellt substratflöde med XFe96 extracellulär flödesanalysator. I detta protokoll jämförs fyra olika substratoxiderande vägar i två cellulära fenotyper samtidigt som de har tillräckliga replikat och rätt kontroll för varje testat material.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. En dag före analysen
- Beredning av reagenser och substrat.
- Mitokondriell analyslösning (MAS): Förbered lagerlösningar för alla reagenser enligt beskrivningen i tabell 1. Värm lagren av mannitol och sackaros till 37 °C för att lösa upp helt. Blanda reagenserna för att förbereda 2x MAS och värm sedan blandningen till 37 °C. Justera pH-värdet med 5N KOH till 7,4 (~7 ml), tillsätt sedan vatten för att få upp volymen till 1 L. Filtersterilisera och förvara alikvoterna vid -20 °C fram till mätdagen.
- Bovint serumalbumin (5% BSA): Lös upp 5 g BSA i 90 ml förvarnat sterilt vatten på en magnetomrörare och undvik skakningar. Justera pH till 7,4 med 5 N KOH och tillsätt sedan vatten för att få upp volymen till 100 ml. Filtrera-sterilisera och förvara alikvoterna vid -20 °C fram till mätdagen.
- Mitokondriella substrat: Förbered 1 M buljonglösningar av natriumsuccinat, natriumpyveuvat och natriumglutamat i sterilt vatten. Förbered 100 mM stamlösning av natriummalte i sterilt vatten och använd förvarnat sterilt vatten för att förbereda en 10 mM stamlösning av palmitoylkarnitin. Justera pH-värdet för varje lösning till 7,4 med 5 N KOH och filtersterilisera. Förvara underlagen vid 2-8 °C. Vid användningstillfället, varm palmitoylkarnitin till 37 °C för att lösa upp eventuella fällningar. För senare användning, förvara alikvoter av alla substrat utom pyruvat vid -20 °C.
- Mitokondriella hämmare: Använd dimetylsulfoxid (DMSO) för att förbereda lagerlösningar på 25 mM oligomycin, 50 mM kolylcyanid 4-(trifluorometoxi) fenylhydrazon (FCCP), 20 mM rotenon och 20 mM antimycin A. Förvara alikvoterna vid -20 °C.
- Sådd och behandling av cellerna: Som visas i figur 2,sådd cellerna i kolumnerna 2-11. Kolumnerna 1 och 12 måste lämnas tomma för att fungera som bakgrundsbrunnar. I detta arbete användes HepG2 och A549 celler.
- Så cellerna med en densitet av 20 000 celler per brunn. Använd 50-80 μL cellodlingsmedium för sådd.
- Fyll de tomma brunnarna med en lika stor volym cellodlingsmedium och inkubera cellerna vid 37 °C i en fuktad inkubator med 5% CO2. Låt cellerna fästa i 3-4 timmar och tillsätt sedan 100 μL cellodlingsmedium till alla brunnar.
- Applicera behandlingen i kolumnerna 7–11 med det sista mediumtillägget. I detta arbete behandlades den experimentella gruppen med 1 mM metforminhydroklorid i 16 timmar, och kontrollgruppen behandlades med en lika stor mängd sterilt destillerat vatten som en fordonskontroll.
- Hydrering av sensorerna: Pipettera 200 μL sterilt vatten per brunn i bruksplattan och sätt sedan försiktigt tillbaka sensorpatronen samtidigt som sensorerna sänks ned i vatten. Inkubera patronen i en CO2-fri inkubatorvid 37 °C till nästa dag.
- Analysprotokollmallen: Slå på analysatorn (se Materialtabellen) och styrenheten. Starta programvaran för instrumentkontroll och datainsamling och utforma analysprotokollet enligt tabell 2. Skapa fyra injektionsstrategier där port A skiljer sig åt beroende på det injicerade substratet(figur 3). Namnge strategierna efter substraten eller deras förkortningar.
- Till portarna B, C och D tilldelar du föreningarna oligomycin, FCCP respektive rotenone/antimycin A. Skapa åtta grupper och namnge dem enligt figur 4. Under Plåtkarta tilldela grupperna till motsvarande brunnar och spara sedan protokollet som en färdig mall. Låt analysatorn vara påslagen så att temperaturen stabiliseras över natten. Håll analysatorn på en plats med en stabil temperatur för att undvika plötsliga temperaturförändringar.
2. Dagen för analysen
- Byta vatten mot kalibranten: Kasta vattnet från bruksplattan och pipetten 200 μL förvärmd kaliber per brunn in i bruksplattan. Sätt tillbaka patronen till den CO2-fria inkubatornfram till tidpunkten för analysen. För att undvika snabb avdunstning av kalibbranten, behåll en fuktkälla inuti inkubatorn och stäng av eller minska fläkthastigheten till ett minimum.
- Förbereda arbetslösningarna: Börja med att värma 2x MAS, 5% BSA och sterilt vatten till 37 °C. Låt under tiden inhibitorlagren nå rumstemperatur. Använd varm 2x MAS och sterilt destillerat vatten för att bereda 5 ml av arbetskoncentrationen hos substrat och hämmare enligt tabell 3.
- Lastning av insprutningsportarna: Som visas i figur 3, lasta in 20 μL av substraten i port A. Ladda succinate/rotenonblandningen i port A av raderna A och B. Last pyruvat/malateblandning i port A på raderna C och D. Last glutamat/malatblandning i port A i raderna E och F. Lasta palmitoylkarnitin/malateblandning i port A i raderna G och H. För hela plattan, lastport B med 22 μL oligomycinberedning, port C med 25 μL FCCP-beredning och port D med 27 μL rotenon/antimycin A-blandning.
- Starta kalibreringssteget: Klicka på Starta körning under fliken Kör analys för att starta analysen. Sätt i den laddade sensorpatronen och starta kalibreringssteget. Vänta tills kalibreringen är klar innan du går vidare till nästa steg.
- Beredning av analysmediet (MAS-BSA-rPFO): För att förbereda 20 ml analysmediet, blanda 10 ml 2x MAS, 9,2 ml sterilt vatten och 0,8 ml 5% BSA i ett 50 ml rör. Tillsätt 2 μL 10 μM rPFO för att uppnå en koncentration på 1 nM och återanvända blandningen med skonsam pipettering. Undvik skakningar och använd inte en virvelblandare för blandning. Inkubera röret vid 37 °C fram till användningstillfället.
- Tvätta cellerna: Tvätta cellerna och de tomma tomma brunnarna två gånger med förvarnad kalcium- och magnesiumfri fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med hjälp av en flerkanalspipetter. Undvik att återanvända samma tips för att kassera cellodlingsmediet och lägga till PBS. Utför detta steg utanför laminärt flöde för att skydda cellerna från att torka ut av luftflödet.
- Cellpermeabilisering i analysmedium: Använd en flerkanalspipett och kassera PBS och ersätt den med 180 μL av det förvarnade analysmediet (MAS-BSA-rPFO).
- Starta mätningen: Omedelbart efter genomverkning, byt ut verktygsplattan på den kalibrerade sensorpatronen med cellplattan och starta mätningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Börja med att normalisera resultaten till den andra mätningen av baslinjeandning för att visa värden som syreförbrukningsprocent (OCR%). Resultaten av analysen visas i figurerna 5,figur 6,figur 7 och figur 8. Det är viktigt att tilldela rätt bakgrundsbrunnar för varje grupp och inaktivera bakgrundsbrunnarna i andra grupper. Figur 5 visar att den behandlade gruppen har en högre grad av kondrerad andning. Svaret från A549-celler på metforminbehandling (figur 5A) var högre än HepG2-celler (figur 5B). Bakgrundskontrollbrunnarna var bara de från samma rader i den jämförda gruppen, i det här fallet brunnarna A1, B1, A12 och B12. Figur 6 visar förändringarna i pyruvat/malateinducerad andning. Figur 7 visar förändringarna i glutamat/malate-inducerad andning, och figur 8 visar förändringarna i palmitoylkarnitin/malate-inducerad andning.
Figur 1: En schematisk representation av citronsyracykeln. De använda substraten för att testa mitokondriellt substratflöde är i rött. Malate används inte ensam utan används i kombination med pyruvat, palmitoylkarnitin och glutamat. Malatens roll i pyruvat/malat- och palmitoylkarnitin/malate-inducerad andning är att ge oxaloacetate genom verkan av malate dehydrogenas enzym. Vid glutamat/malateinducerad andning deltar malat i malate-aspartat shuttle. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Illustration av cellsåddsplanen i cellodlingsmikroplattan. Tomma brunnar i kolumnerna 1 och 12 måste lämnas tomma utan celler. Kolumnerna 7-11 används för att behandla den experimentella gruppen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Illustration av injektionsstrategin. Port A av raderna A och B är laddade med succinate/rotenonblandning. Port A på raderna C och D är laddade med pyruvat/malatblandning. Port A av raderna E och F är laddade med glutamat/malateblandning. Port A av raderna G och H är laddade med palmitoylkarnitin/malatblandning. För hela plattan är portarna B, C och D laddade med oligomycin, FCCP respektive rotenone/antimycin A. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 4: Gruppnamn och plåtkarta. Varje grupp namnges enligt fenotypen (kontroll eller behandlad) och det substrat som används för att inducera andning. (S), succinate-inducerad andning. (P/M), pyruvat/malateinducerad andning. (G/M), glutamat/malateinducerad andning. (CP/M), palmitoylkarnitin/malateinducerad andning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Succinateinducerad andning. a)A549 ochB)HepG2. Den testade gruppen behandlades med 1 mM metforminhydroklorid i 16 timmar. Endast bakgrundsbrunnarna A1, B1, A12 och B12 används för korrigering. Resultaten visas som genomsnittlig OCR% ± SD. Graf- och plåtrutnätet skapades och exporterades som bildfiler av analysdesignen, dataanalysen och filhanteringsprogramvaran. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Pyruvat/malatinducerad andning. Den testade gruppen behandlades med 1 mM metforminhydroklorid i 16 timmar. Endast bakgrundsbrunnarna C1, D1, C12 och D12 används för korrigering. Resultaten visas som genomsnittlig OCR% ± SD. Graf- och plåtrutnätet skapades och exporterades som bildfiler av analysdesignen, dataanalysen och filhanteringsprogramvaran. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 7: Glutamat/malatinducerad andning. Den testade gruppen behandlades med 1 mM metforminhydroklorid i 16 timmar. Endast bakgrundsbrunnarna E1, F1, E12 och F12 används för korrigering. Resultaten visas som genomsnittlig OCR% ± SD. Graf- och plåtrutnätet skapades och exporterades som bildfiler av analysdesignen, dataanalysen och filhanteringsprogramvaran. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 8: Palmitoylkarnitin/malateinducerad andning. Den testade gruppen behandlades med 1 mM metforminhydroklorid i 16 timmar. Endast bakgrundsbrunnarna G1, H1, G12 och H12 används för korrigering. Resultaten visas som genomsnittlig OCR% ± SD. Graf- och plåtrutnätet skapades och exporterades som bildfiler av analysdesignen, dataanalysen och filhanteringsprogramvaran. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Mitokondriellt analysmedium | ||||
| Lager (mM) | Volym från lager per liter (ml) | 2x MAS (mM) | MAS (mM) | |
| Sackaros | 1000 | 140 | 140 | 70 |
| Mannitol | 1000 | 440 | 440 | 220 |
| KH 2PO4 | 1000 | 20 | 20 | 10 |
| MgCl2 | 200 | 50 | 10 | 5 |
| HEPES | 200 | 20 | 4 | 2 |
| EGTA | 200 | 10 | 2 | 1 |
| ADP | 200 | 20 | 4 | 2 |
Tabell 1: Mitokondriell analyslösning. Blanda den angivna volymen av varje ingrediensbuljonglösning för att förbereda (2x MAS). Värm lösningen till 37 °C och justera sedan pH med 5 N KOH till 7,4. Tillsätt destillerat vatten för att få upp volymen till 1 L. Filtersterilisera och förvara sedan alikvoter vid -20 °C. Förbered analysmediet och arbetslösningarna för mitokondriella substrat och hämmare med 2x MAS.
| Befallning | Varaktighet | Injicerad förening |
| Kalibrering | som standard | |
| Jämvikt | Ja | |
| Baslinje | ||
| 2 Cykler | ||
| Blanda | 30 s | |
| Vänta | 30 s | |
| Mått | 2 min | |
| Mata in port A | Substrat | |
| 2 Cykler | ||
| Blanda | 30 s | |
| Vänta | 30 s | |
| Mått | 2 min | |
| Mata in port B | Oligomycin | |
| 2 Cykler | ||
| Blanda | 30 s | |
| Vänta | 30 s | |
| Mått | 2 min | |
| Mata in port C | FCCP | |
| 2 Cykler | ||
| Blanda | 30 s | |
| Vänta | 30 s | |
| Mått | 2 min | |
| Mata in port D | Rotenone + Antimycin A | |
| 2 Cykler | ||
| Blanda | 30 s | |
| Vänta | 30 s | |
| Mått | 2 min |
Tabell 2: Kommandon i analysprotokollet.
| Volym i 5 ml | ||||||
| Substrat | Aktien ger upp. | Jobbar med conc. | Lager | 2x MAS | dH2O | Sista insläpp. |
| Succinate/rotenone | 1 M/20 mM | 100 mM/10 μM | 500 μL/ 2,5 μL | 2.5 ml | 1997.5 μL | 10 mM/1 μM |
| Pyruvate/malate | 1 M/100 mM | 100 mM /10 mM | 500 μL/500 μL | 2.5 ml | 1500 μL | 10 mM /1 mM |
| Glutamat/malat | 1 M/100 mM | 100 mM /10 mM | 500 μL/500 μL | 2.5 ml | 1500 μL | 10 mM /1 mM |
| Palmitoylkarnitin/malat | 10 mM/100 mM | 400 μM /10 mM | 200 μL/500 μL | 2.5 ml | 1800 μL | 40 μM /1 mM |
| Hämmare | ||||||
| Oligomycin | 25 mM | 15 μM | 3 μL | 2.5 ml | 2497 μL | 1,5 μM |
| FCCP | 50 mM | 40 μM | 4 μL | 2.5 ml | 2496 μL | 4 μM |
| Rotenone/antimycin A | 20 mM/20 mM | 10 μM/ 10 μM | 2,5 μL/2,5 μL | 2.5 ml | 2495 μL | 1 μM/ 1 μM |
Tabell 3: Förteckning över mitokondriella substrat och hämmare som ska lastas i insprutningsportarna på sensorpatronerna enligt vad som tidigare diskuterats i figur 3. Blanda de angivna volymerna från lagerlösningar, 2x MAS, och destillerat vatten för att förbereda 5 ml av arbetskoncentrationen för varje substrat eller inhibitorblandning. Den slutliga koncentrationen uppnås i brunnarna efter injektionsprocessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll är en ändring av tidigare publicerade studier7,8,9,10 och produktens användarhandbok. I motsats till tillverkarens protokoll används 2x MAS istället för 3x MAS, eftersom 2× MAS är lättare att lösa upp och inte bildar nederbörd efter frysning. Frysta 2x MAS alikvoter kan lagras upp till sex månader och visa konsekventa resultat. En annan skillnad är att inkludera ADP i komponenterna i 2x MAS och utelämna BSA från formeln. Lösningar som innehåller BSA är svårare att injicera och orsakar en större risk för fel och avvikande värden. Förekomsten av BSA är dock avgörande för att minska den mängd som behövs av rPFO för att uppnå korrekt permeabilisering. Därför tillsätts BSA endast till analysmediet (MAS-BSA-rPFO) som används i permeabiliseringssteget efter celltvätt.
För att tvätta cellerna från cellodlingsmediet använder detta protokoll PBS istället för MAS. PBS är isotonisk och orsakar ingen förändring i cellulär form, i motsats till den natriumfria MAS som är rik på kalium och kan förändra cellulär morfologi. En annan stor skillnad är att hålla jämviktssteget i analysprotokollet. Jämviktssteget varar i 12 min, vilket motsvarar 2 mätcykler. Syftet med att hålla jämviktssteget är att stabilisera temperaturen inuti instrumentet och samtidigt tillåta cellerna att oxidera eventuella inre oxideringsbara butiker, vilket förstärks av närvaron av ADP i analysmediet.
Vissa överväganden om cellodlingstekniker bör tas. I detta arbete såddes de undersökta cellerna dagen före analysen. Vissa celler kräver dock längre kultur eller behandlingstid. Om studiens design omfattar differentierade celler, nyisolerade eller icke-vidhäftande celler krävs en korrekt beläggning för att fixera celler i cellkulturens mikroplatta. Detta protokoll är inte lämpligt för celler i suspension, och användning av cell- och vävnadslim rekommenderas. En annan begränsning av detta protokoll är att denna metod inte är lämplig för att dra slutsatsen kvantitativa data. Med andra ord är det inte möjligt med denna metod att uppskatta den faktiska mängden mitokondriellt protein i var och en långt före mätningen. Därför genererar denna metod en snabb screening av mitokondriellt substratflöde utan att ge en noggrann uppskattning av förhållandet mellan fosfat och syre (P/O-förhållandet)5. Det är dock möjligt att använda detta protokoll för kvantitativa studier på små prover11. För detta ändamål är det nödvändigt att erhålla nyisolerade mitokondrier och använda cell- och vävnadslim för att fixera mitokondrier till cellodlingsmikroplattan.
För att uppnå bästa reproducerbara resultat från att använda detta protokoll, var uppmärksam på koncentrationen av de använda reagenserna. Temperaturen på de använda lösningarna, inkubatorerna och instrumentet ska vara stabil. Se till att alla lösningar och substrat har ett justerat pH. Som tidigare nämnts rekommenderas det inte att inkludera BSA i de lösningar som planeras att injiceras. Om resultaten visar ett brett felområde visar du resultaten i brunnsformatet i stället för gruppformat för att leta efter och ta bort möjliga avvikande värden.
I detta arbete försökte vi uppnå maximal användning av en enda mätning för att samtidigt screena flera mitokondriella substratflöde med rätt bakgrundskontroll och tillräckligt med replikat på relativt kort tid. Som visas i resultaten är metoden användbar för att jämföra två fenotyper som skapas genom att behandla en grupp med en koncentration av ett läkemedel. Det kan användas för att jämföra olika cellinjer eller genetiskt konstruerade celler. Protokollet är mångsidigt och olika substrat, eller hämmare kan användas för att screena anpassning av mitokondriellt substratflöde i alla cellulära modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt att deklarera.
Acknowledgments
Författarna tackar personalen vid institutionen för fysiologi vid medicinska fakulteten i Hradec Králové och Institutionen för patofysiologi vid tredje medicinska fakulteten för hjälpen med kemikalier och proverberedning. Detta arbete stöddes av Charles Universitys stipendieprogram PROGRES Q40/02, Tjeckiska hälsoministeriets bidrag NU21-01-00259, tjeckisk vetenskapsstiftelsebidrag 18-10144 och INOMED-projektet CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 finansierat av Tjeckiens utbildnings-, ungdoms- och idrottsministerium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
| Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 - 8 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
| HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
| L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
| L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
| Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
| Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
| Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 - 8 °C |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
| Water | Merck | W3500 | store at RT |
| XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
| XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 °C |
References
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
- Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. , Academic press. London. (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).
- Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).
