Summary
I dette arbeidet beskriver vi en modifisert protokoll for å teste mitokondrie substratfluks ved hjelp av rekombinant perfringolysin O i kombinasjon med mikroplatebasert respirometri. Med denne protokollen viser vi hvordan metformin påvirker mitokondrie respirasjon av to forskjellige tumorcellelinjer.
Abstract
Mitokondrie substratflux er en kjennetegn ved hver celletype, og endringer i komponentene som transportører, kanaler eller enzymer er involvert i patogenesen av flere sykdommer. Mitokondrie substrat flux kan studeres ved hjelp av intakte celler, permeabiliserte celler eller isolert mitokondrier. Undersøkelse av intakte celler støter på flere problemer på grunn av samtidig oksidasjon av forskjellige substrater. Dessuten inneholder flere celletyper interne lagre av forskjellige substrater som kompliserer resultattolkning. Metoder som mitokondrieisolasjon eller bruk av permeabiliserende midler er ikke lett reproduserbare. Det er problematisk å isolere rene mitokondrier med intakte membraner i tilstrekkelige mengder fra små prøver. Bruk av ikke-selektive permeabilisatorer forårsaker ulike grader av uunngåelig mitokondriemembranskade. Rekombinant perfringolysin O (rPFO) ble tilbudt som en mer passende permeabilizer, takket være dens evne til selektivt å permeabilisere plasmamembran uten å påvirke mitokondrieintegriteten. Når det brukes i kombinasjon med mikroplate respirometri, tillater det å teste fluxen til flere mitokondrie substrater med nok replikeringer i ett eksperiment mens du bruker et minimalt antall celler. I dette arbeidet beskriver protokollen en metode for å sammenligne mitokondrie substratfluks av to forskjellige cellulære fenotyper eller genotyper og kan tilpasses for å teste ulike mitokondrie substrater eller inhibitorer.
Introduction
Mikroplatebasert respirometri har revolusjonert mitokondrieforskning ved å muliggjøre studiet av cellulær respirasjon av en liten prøvestørrelse1. Cellulær respirasjon betraktes generelt som en indikator på mitokondriefunksjon eller 'dysfunksjon', til tross for at mitokondrieområdet av funksjoner strekker seg utover energiproduksjonen2. Under aerobe forhold trekker mitokondrier ut energien som er lagret i forskjellige substrater ved å bryte ned og konvertere disse substratene til metabolske mellomprodukter som kan drive sitronsyresyklusen3 (figur 1). Den kontinuerlige strømmen av substrater er avgjørende for strømmen av sitronsyresyklusen for å generere høyenergi "elektrondonorer", som leverer elektroner til elektrontransportkjeden som genererer en protongradient over den indre mitokondriemembranen, slik at ATP-syntase kan fosforylere ADP til ATP4. Derfor må en eksperimentell design for å analyse mitokondrie respirasjon inkludere prøven natur (intakte celler, permeabiliserte celler, eller isolerte mitokondrier) og mitokondrie substrater.
Celler holder en butikk med innfødte substrater5, og mitokondrier oksiderer flere typer substrater samtidig6, noe som kompliserer tolkningen av resultater oppnådd fra eksperimenter utført på intakte celler. En vanlig tilnærming for å undersøke mitokondrie evne til å oksidere et valgt substrat er å isolere mitokondrier eller permeabilisere de undersøkte cellene5. Selv om isolerte mitokondrier er ideelle for kvantitative studier, er isolasjonsprosessen arbeidskrevende. Det står overfor tekniske vanskeligheter som behovet for stor prøvestørrelse, renhet av utbyttet og reproduserbarhet av teknikken5. Permeabiliserte celler tilbyr en løsning for ulempene ved mitokondrieisolasjon; Rutinemessige permeabiliserende midler av vaskemiddel natur er imidlertid ikke spesifikke og kan skade mitokondriemembraner5.
Rekombinant perfringolysin O (rPFO) ble tilbudt som et selektivt plasmamembranpermeabiliserende middel7, og det ble brukt vellykket i kombinasjon med en ekstracellulær fluksanalysator i flere studier7,8,9,10. Vi har modifisert en protokoll ved hjelp av rPFO for å screene mitokondrie substrat flux ved hjelp av XFe96 ekstracellulær flux analysator. I denne protokollen sammenlignes fire forskjellige substratoksidasjonsveier i to cellulære fenotyper mens de har tilstrekkelige replikeringer og riktig kontroll for hvert testet materiale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. En dag før analysen
- Fremstilling av reagenser og substrater.
- Mitokondrieanalyseløsning (MAS): Klargjør lagerløsninger for alle reagenser som beskrevet i tabell 1. Varm opp lagrene av mannitol og sukrose til 37 °C for å oppløses helt. Bland reagensene for å forberede 2x MAS, og varm deretter blandingen til 37 °C. Juster pH med 5N KOH til 7,4 (~7 ml), tilsett deretter vann for å bringe volumet opp til 1 L. Filtersterilisere og lagre aliquots ved -20 °C til måledagen.
- Bovine serumalbumin (5% BSA): Løs opp 5 g BSA i 90 ml forhåndsvarslet sterilt vann på en magnetisk omrører og unngå risting. Juster pH til 7,4 med 5 N KOH, og tilsett deretter vann for å få volumet opp til 100 ml. Filtrer-steriliser og oppbevar aliquots ved -20 °C til måledagen.
- Mitokondrieunderlag: Klargjør 1 M lagerløsninger av natriumsuccinat, natriumpyuvatt og natriumglutamat i sterilt vann. Forbered 100 mM lagerløsning av natrium malate i sterilt vann og bruk forvarselt sterilt vann for å forberede en 10 mM lagerløsning av palmitoylkarnitin. Juster pH for hver oppløsning til 7,4 x 5 N KOH og filtrerililiser. Oppbevar substratene ved 2-8 °C. På brukstidspunktet, varm palmitoyl karnitin til 37 °C for å oppløse eventuelle utfellinger. For senere bruk, lagre aliquots av alle substratene unntatt pyruvat ved -20 °C.
- Mitokondriehemmere: Bruk dimetylsulfoksid (DMSO) for å tilberede lagerløsninger på 25 mM oligomycin, 50 mM karbonylcyanid 4-(trifluorometoksy) fenylhydrazon (FCCP), 20 mM rotenon og 20 mM antimycin A. Oppbevar aliquots ved -20 °C.
- Såing og behandling av cellene: Som vist i figur 2, frø cellene i kolonne 2-11. Kolonne 1 og 12 må stå tomme for å fungere som bakgrunnsbrønner. I dette arbeidet ble HepG2- og A549-celler brukt.
- Frø cellene med en tetthet på 20.000 celler per brønn. Bruk 50-80 μL cellekulturmedium for såing.
- Fyll de tomme brønnene med et likt volum cellekulturmedium og inkuber cellene ved 37 °C i en fuktet inkubator med 5 % CO2. La cellene feste i 3-4 timer, og legg deretter 100 μL cellekulturmedium til alle brønner.
- Med det siste medietilskuddet, bruk behandlingen i kolonne 7-11. I dette arbeidet ble den eksperimentelle gruppen behandlet med 1 mM metforminhydroklorid i 16 timer, og kontrollgruppen ble behandlet med et likt volum sterilt destillert vann som en kjøretøykontroll.
- Hydrering av sensorene: Pipette 200 μL sterilt vann per brønn inn i bruksplaten, og returner deretter sensorpatronen forsiktig mens du nedsenker sensorene i vann. Inkuber patronen i en CO2-friinkubator ved 37 °C til neste dag.
- Analyseprotokollmalen: Slå på analysatoren (se Materialfortegner) og kontrollerenheten. Start instrumentkontrollen og datainnsamlingsprogramvaren, og utform analyseprotokollen som beskrevet i tabell 2. Under Gruppedefinisjoneroppretter du fire injeksjonsstrategier der port A er forskjellig i henhold til det injiserte substratet (figur 3). Navngi strategiene etter substratene eller deres forkortelser.
- Til portene B, C og D tilordner du forbindelsene henholdsvis oligomycin, FCCP og rotenon/antimycin A. Opprett åtte grupper, og gi dem et navn, som vist i Figur 4. Under Platekart tilordner du gruppene til de tilsvarende brønnene, og lagrer deretter protokollen som en mal som er klar til bruk. La analysatoren være slått på slik at temperaturen stabiliserer seg over natten. Oppbevar analysatoren på et sted med stabil temperatur for å unngå plutselige temperaturendringer.
2. Analysedagen
- Utskifting av vann med kalibrering: Kast vannet fra bruksplaten og pipetten 200 μL for forhåndsvarslet kalibrant per brønn inn i bruksplaten. Returner patronen til CO2-friinkubator til analysetidspunktet. For å unngå rask fordampning av kalibratoren, oppretthold en fuktighetskilde inne i inkubatoren og slå av eller reduser viftehastigheten til et minimum.
- Klargjøring av arbeidsløsningene: Start med å varme opp 2x MAS, 5% BSA og sterilt vann til 37 °C. I mellomtiden, la inhibitorlagrene nå romtemperatur. Bruk varm 2x MAS og sterilt destillert vann for å forberede 5 ml av arbeidskonsentrasjonen av substratene og inhibitorene som beskrevet i tabell 3.
- Lasting av injeksjonsportene: Som vist i figur 3, last 20 μL av underlagene i port A. Last succinate/rotenoneblanding i port A av rad A og B. Last pyruvat/malateblanding i port A av rad C og D. Last glutamat/malateblanding i port A av radene E og F. Last palmytonkarnitin/malateblanding inn i port A av rader G og H. Last palmitoylkarnitin/malateblanding inn i babord A av rader G og H. Last palmitoylkarnitin/malateblanding inn i babord A av rader G og H. Last palmitoylkarnitin/malateblanding inn i babord A. For hele platen, lastport B med 22 μL oligomycinpreparat, port C med 25 μL FCCP-preparat og port D med 27 μL rotenon / antimycin A-blanding.
- Starte kalibreringstrinnet: Under Kjør analyse-fanen klikker du på Start run for å starte analysen. Sett inn den lastede sensorpatronen og start kalibreringstrinnet. Vent til kalibreringen er fullført før du går videre til neste trinn.
- Fremstilling av analysemediet (MAS-BSA-rPFO): For å forberede 20 ml analysemedium, bland 10 ml 2x MAS, 9,2 ml sterilt vann og 0,8 ml 5% BSA i et 50 ml rør. Tilsett 2 μL 10 μM rPFO for å oppnå en konsentrasjon på 1 nM og resuspender blandingen med skånsom pipettering. Unngå risting og ikke bruk en virvelblander til blanding. Inkuber røret ved 37 °C til brukstidspunktet.
- Vask cellene: Vask cellene og de tomme tomme brønnene to ganger med forhåndsvarslet kalsium- og magnesiumfritt fosfatbufret saltvann (PBS) ved hjelp av en flerkanals pipette. Unngå å bruke de samme tipsene på nytt for å kaste cellekulturmediet og legge til PBS. Utfør dette trinnet utenfor laminærstrømmen for å beskytte cellene mot å tørke ut av luftstrømmen.
- Cellepermeabilisering i analysemedium: Bruk en flerkanals pipette, kast PBS og erstatt den med 180 μL av det forhåndsvarslede analysemediet (MAS-BSA-rPFO).
- Starte målingen: Umiddelbart etter permeabilisering, bytt ut verktøyplaten til den kalibrerte sensorpatronen med celleplaten og start målingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Begynn med å normalisere resultatene til det andre målet for baseline respirasjon for å vise verdier som oksygenforbruksrateprosent (OCR%). Resultatene av analysen vises i Figur 5, Figur 6, Figur 7 og Figur 8. Det er viktig å tildele de riktige bakgrunnsbrønnene for hver gruppe og inaktivere bakgrunnsbrønnene til andre grupper. Figur 5 viser at den behandlede gruppen har en høyere grad av kortfattet åndedrett. Responsen til A549-celler til metforminbehandling (figur 5A) var høyere enn HepG2-celler (figur 5B). Bakgrunnskontrollbrønnene var bare de fra de samme radene i den sammenliknede gruppen, i dette tilfellet brønnene A1, B1, A12 og B12. Figur 6 viser endringene i pyruvat/malateindusert åndedrett. Figur 7 viser endringene i glutamat/malateindusert respirasjon, og figur 8 viser endringene i palmitoylkarnitin/malateindusert respirasjon.
Figur 1: En skjematisk representasjon av sitronsyresyklusen. De brukte substratene for å teste mitokondrie substratfluks er i rødt. Malate brukes ikke alene, men brukes i kombinasjon med pyruvat, palmitoylkarnitin og glutamat. Rollen som malate i pyruvat/ malate- og palmitoylkarnitin / malateindusert åndedrett er å gi oksalacetat gjennom virkningen av malate dehydrogenase enzymet. Ved glutamat/malateindusert åndedrett deltar malate i malate-aspartat-shuttle. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Illustrasjon av cellesåingsplanen i mikroplaten for cellekulturen. Tomme brønner i kolonne 1 og 12 må stå tomme uten celler. Kolonne 7-11 brukes til å behandle den eksperimentelle gruppen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Illustrasjon av injeksjonsstrategien. Port A av rad A og B er lastet med succinate / rotenone blanding. Port A av rad C og D er lastet med pyruvat / malate blanding. Port A av rad E og F er lastet med glutamat / malate blanding. Port A av rad G og H er lastet med palmitoylkarnitin / malateblanding. For hele platen er portene B, C og D lastet med henholdsvis oligomycin, FCCP og rotenon/antimycin A. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Gruppenavn og platekart. Hver gruppe er navngitt i henhold til fenotypen (kontroll eller behandlet) og substratet som brukes til å indusere åndedrett. (S), kortfattet respirasjon. (P/M), pyruvat/malateindusert åndedrett. (G/M), glutamat/malateindusert åndedrett. (CP/M), palmitoylkarnitin/malateindusert åndedrett. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Succinate-indusert åndedrett. (A) A549 og (B) HepG2. Den testede gruppen ble behandlet med 1 mM metforminhydroklorid i 16 timer. Bare bakgrunnsbrønnene A1, B1, A12 og B12 brukes til korreksjon. Resultatene vises som gjennomsnittlig OCR% ± SD. Grafen og platenettet ble opprettet og eksportert som bildefiler av analysedesign, dataanalyse og filbehandlingsprogramvare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Pyruvat/malateindusert åndedrett. (A) A549 og (B) HepG2. Den testede gruppen ble behandlet med 1 mM metforminhydroklorid i 16 timer. Bare bakgrunnsbrønnene C1, D1, C12 og D12 brukes til korreksjon. Resultatene vises som gjennomsnittlig OCR% ± SD. Grafen og platenettet ble opprettet og eksportert som bildefiler av analysedesign, dataanalyse og filbehandlingsprogramvare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Glutamat/malateindusert åndedrett. (A) A549 og (B) HepG2. Den testede gruppen ble behandlet med 1 mM metforminhydroklorid i 16 timer. Bare bakgrunnsbrønnene E1, F1, E12 og F12 brukes til korreksjon. Resultatene vises som gjennomsnittlig OCR% ± SD. Grafen og platenettet ble opprettet og eksportert som bildefiler av analysedesign, dataanalyse og filbehandlingsprogramvare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Palmitoylkarnitin/malateindusert åndedrett. (A) A549 og (B) HepG2. Den testede gruppen ble behandlet med 1 mM metforminhydroklorid i 16 timer. Bare bakgrunnsbrønnene G1, H1, G12 og H12 brukes til korreksjon. Resultatene vises som gjennomsnittlig OCR% ± SD. Grafen og platenettet ble opprettet og eksportert som bildefiler av analysedesign, dataanalyse og filbehandlingsprogramvare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Mitokondrieanalyse medium | ||||
| Lager (mM) | Volum fra lager per liter (ml) | 2x MAS (mM) | MAS (mM) | |
| Sukrose | 1000 | 140 | 140 | 70 |
| Mannitol | 1000 | 440 | 440 | 220 |
| KH2Po4 | 1000 | 20 | 20 | 10 |
| MgCl2 | 200 | 50 | 10 | 5 |
| HEPES | 200 | 20 | 4 | 2 |
| EGTA | 200 | 10 | 2 | 1 |
| ADP | 200 | 20 | 4 | 2 |
Tabell 1: Mitokondrieanalyseløsning. Bland det angitte volumet av hver ingrediensbestandsløsning for å tilberede (2x MAS). Varm oppløsningen til 37 °C, og juster deretter pH med 5 N KOH til 7,4. Tilsett destillert vann for å bringe volumet opp til 1 L. Filtersterilisere og lagre deretter aliquots ved -20 °C. Forbered analysemediet og arbeidsløsningene til mitokondriesubstrater og hemmere ved hjelp av 2x MAS.
| Kommando | Varighet | Injisert forbindelse |
| Kalibrering | som standard | |
| Likevekt | Ja | |
| Grunnlinje | ||
| 2 Sykluser | ||
| Blande | 30 s | |
| Vent | 30 s | |
| Måle | 2 min. | |
| Sett inn port A | Underlag | |
| 2 Sykluser | ||
| Blande | 30 s | |
| Vent | 30 s | |
| Måle | 2 min. | |
| Sett inn port B | Oligomycin | |
| 2 Sykluser | ||
| Blande | 30 s | |
| Vent | 30 s | |
| Måle | 2 min. | |
| Sett inn port C | FCCP | |
| 2 Sykluser | ||
| Blande | 30 s | |
| Vent | 30 s | |
| Måle | 2 min. | |
| Sett inn port D | Rotenone + Antimycin A | |
| 2 Sykluser | ||
| Blande | 30 s | |
| Vent | 30 s | |
| Måle | 2 min. |
Tabell 2: Kommandoer i analyseprotokollen.
| Volum i 5 ml | ||||||
| Underlag | Lager innbilsk. | Jobber med conc. | Lager | 2x MAS | dH2O | Siste innrømmelse. |
| Succinate/rotenone | 1 M/20 mM | 100 mM/ 10 μM | 500 μL/ 2,5 μL | 2,5 ml | 1997,5 μL | 10 mM/1 μM |
| Pyruvat/malate | 1 M/100 mM | 100 mM /10 mM | 500 μL/500 μL | 2,5 ml | 1500 μL | 10 mM /1 mM |
| Glutamat/malate | 1 M/100 mM | 100 mM /10 mM | 500 μL/500 μL | 2,5 ml | 1500 μL | 10 mM /1 mM |
| Palmitoyl karnitin/malate | 10 mM / 100 mM | 400 μM /10 mM | 200 μL/500 μL | 2,5 ml | 1800 μL | 40 μM /1 mM |
| Hemmere | ||||||
| Oligomycin | 25 mM | 15 μM | 3 μL | 2,5 ml | 2497 μL | 1,5 μM |
| FCCP | 50 mM | 40 μM | 4 μL | 2,5 ml | 2496 μL | 4 μM |
| Rotenone/antimycin A | 20 mM / 20 mM | 10 μM/ 10 μM | 2,5 μL/2,5 μL | 2,5 ml | 2495 μL | 1 μM/ 1 μM |
Tabell 3: Liste over mitokondrieunderlag og hemmere som skal lastes inn i injeksjonsportene til sensorpatronene som tidligere omtalt i figur 3. Bland de angitte volumene fra lagerløsninger, 2x MAS og destillert vann for å forberede 5 ml av arbeidskonsentrasjonen av hvert substrat eller inhibitorblanding. Den endelige konsentrasjonen oppnås i brønnene etter injeksjonsprosessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen er en endring av tidligere publiserte studier7,8,9,10 og produktbrukerhåndboken. I motsetning til produsentens protokoll brukes 2x MAS i stedet for 3x MAS, siden 2× MAS er lettere å oppløse og danner ikke nedbør etter frysing. Frosne 2x MAS aliquots kan lagres opptil seks måneder og vise konsistente resultater. En annen forskjell er å inkludere ADP i komponentene i 2x MAS og utelate BSA fra formelen. Løsninger som inneholder BSA er vanskeligere å injisere og forårsaker større mulighet for feil og outliers. Tilstedeværelsen av BSA er imidlertid viktig for å redusere mengden som trengs av rPFO for å oppnå riktig permeabilisering. Derfor legges BSA bare til analysemediet (MAS-BSA-rPFO) som brukes i permeabiliseringstrinnet etter cellevask.
For å vaske cellene fra cellekulturmediet bruker denne protokollen PBS i stedet for MAS. PBS er isotonisk og forårsaker ingen endring i cellulær form, i motsetning til den natriumfrie MAS som er rik på kalium og kan endre cellulær morfologi. En annen stor forskjell er å holde likevektstrinnet i analyseprotokollen. Likevektstrinnet varer i 12 min, som er lik 2 målesykluser. Målet med å holde likevektstrinnet er å stabilisere temperaturen inne i instrumentet og samtidig la cellene oksidere eventuelle interne oksidasjonsbutikker, noe som forsterkes av tilstedeværelsen av ADP i analysemediet.
Det bør tas hensyn til cellekulturteknikker. I dette arbeidet ble de undersøkte cellene sådd dagen før analysen. Noen celler krever imidlertid lengre kultur- eller behandlingstid. Hvis studiedesignet inkluderer differensierte celler, nyisolerte eller ikke-tilhengerceller, er det nødvendig med et riktig belegg for å fikse celler i cellekulturmikroplaten. Denne protokollen er ikke egnet for celler i suspensjon, og bruk av celle- og vevslim anbefales. En annen begrensning i denne protokollen er at denne metoden ikke er egnet til å konkludere kvantitative data. Det er med andre ord ikke mulig med denne metoden å estimere den faktiske mengden mitokondrieprotein i hver brønn før målingen. Derfor genererer denne metoden en rask screening av mitokondrie substratfluks uten å gi et nøyaktig estimat av fosfat / oksygenforholdet (P / O-forholdet)5. Det er imidlertid mulig å bruke denne protokollen for kvantitative studier på små utvalg11. Til dette formål er det nødvendig å skaffe nyisolerte mitokondrier og bruke celle- og vevslim for å fikse mitokondrier til cellekulturmikroplaten.
For å oppnå de beste reproduserbare resultatene ved bruk av denne protokollen, vær oppmerksom på konsentrasjonen av de brukte reagensene. Temperaturen på de brukte løsningene, inkubatorene og instrumentet skal være stabil. Sørg for at alle løsninger og substrater har en justert pH. Som tidligere nevnt anbefales det ikke å inkludere BSA i løsningene som er planlagt å bli injisert. Hvis resultatene viser et bredt feilområde, viser du resultatene i brønnformatet i stedet for gruppeformat for å se etter og slette mulige ytterpunkter.
I dette arbeidet prøvde vi å oppnå maksimal bruk av en enkelt måling for samtidig å screene flere mitokondrie substratflukser med riktig bakgrunnskontroll og nok replikerer på relativt kort tid. Som vist i resultatene, er metoden nyttig for å sammenligne to fenotyper opprettet ved å behandle en gruppe med en konsentrasjon av et stoff. Det kan brukes til å sammenligne forskjellige cellelinjer eller genetisk konstruerte celler. Protokollen er allsidig og forskjellige substrater, eller inhibitorer kan brukes til å skjermtilpasning av mitokondrie substratfluks i en hvilken som helst cellulær modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt å erklære.
Acknowledgments
Forfatterne takker de ansatte ved Institutt for fysiologi ved Det medisinske fakultet i Hradec Králové og Institutt for patofysiologi ved Det tredje fakultet for medisin for hjelp med kjemikalier og prøvepreparering. Dette arbeidet ble støttet av Charles Universitys tilskuddsprogrammer PROGRES Q40/02, Det tsjekkiske helsedepartementet gir NU21-01-00259, tsjekkisk science foundation grant 18-10144 og INOMED prosjekt CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 finansiert av Departementet for utdanning, ungdom og sport i Tsjekkia og av EU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
| Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 - 8 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
| HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
| L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
| L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
| Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
| Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
| Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 - 8 °C |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
| Water | Merck | W3500 | store at RT |
| XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
| XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 °C |
References
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
- Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. , Academic press. London. (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).
- Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).
