Summary
इस काम में, हम माइक्रोप्लेट-आधारित रेस्पिरोमेट्री के साथ संयोजन में पुनः संयोजक perfringolysin O का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन सब्सट्रेट फ्लक्स का परीक्षण करने के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल के साथ, हम दिखाते हैं कि मेटफॉर्मिन दो अलग-अलग ट्यूमर सेल लाइनों के माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को कैसे प्रभावित करता है।
Abstract
माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट फ्लक्स प्रत्येक सेल प्रकार की एक विशिष्ट विशेषता है, और इसके घटकों जैसे ट्रांसपोर्टर, चैनल, या एंजाइमों में परिवर्तन कई बीमारियों के रोगजनन में शामिल हैं। माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट फ्लक्स का अध्ययन बरकरार कोशिकाओं, permeabilized कोशिकाओं, या पृथक माइटोकॉन्ड्रिया का उपयोग करके किया जा सकता है। अक्षुण्ण कोशिकाओं की जांच विभिन्न सब्सट्रेट्स के एक साथ ऑक्सीकरण के कारण कई समस्याओं का सामना करती है। इसके अलावा, कई सेल प्रकारों में विभिन्न सब्सट्रेट्स के आंतरिक भंडार होते हैं जो परिणामों की व्याख्या को जटिल बनाते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव या permeabilizing एजेंटों का उपयोग करने जैसे तरीके आसानी से पुन: प्रस्तुत करने योग्य नहीं हैं। छोटे नमूनों से पर्याप्त मात्रा में बरकरार झिल्ली के साथ शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करना समस्याग्रस्त है। गैर-चयनात्मक permeabilizers का उपयोग अपरिहार्य माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षति के विभिन्न डिग्री का कारण बनता है। पुनः संयोजक perfringolysin O (rPFO) को एक अधिक उपयुक्त permeabilizer के रूप में पेश किया गया था, माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता को प्रभावित किए बिना चुनिंदा रूप से प्लाज्मा झिल्ली को permeabilize करने की क्षमता के लिए धन्यवाद। जब माइक्रोप्लेट श्वसनमिति के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है, तो यह कोशिकाओं की न्यूनतम संख्या का उपयोग करते हुए एक प्रयोग के भीतर पर्याप्त प्रतिकृति के साथ कई माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट के प्रवाह का परीक्षण करने की अनुमति देता है। इस काम में, प्रोटोकॉल दो अलग-अलग सेलुलर फेनोटाइप या जीनोटाइप के माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट फ्लक्स की तुलना करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है और विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट या अवरोधकों का परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
माइक्रोप्लेट-आधारित श्वसनमिति ने एक छोटे से नमूना आकार1के सेलुलर श्वसन के अध्ययन को सक्षम करके माइटोकॉन्ड्रियल अनुसंधान में क्रांति ला दी है। सेलुलर श्वसन को आम तौर पर माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन या 'डिसफंक्शन' के संकेतक के रूप में माना जाता है, इस तथ्य के बावजूद कि कार्यों की माइटोकॉन्ड्रियल रेंज ऊर्जा उत्पादन से परे फैली हुईहै। एरोबिक स्थितियों में, माइटोकॉन्ड्रिया विभिन्न सब्सट्रेट्स में संग्रहीत ऊर्जा को तोड़कर और इन सब्सट्रेट्स को चयापचय मध्यवर्ती में परिवर्तित करके निकालता है जो साइट्रिक एसिड चक्र3 (चित्रा 1)को ईंधन दे सकता है। सब्सट्रेट्स का निरंतर प्रवाह साइट्रिक एसिड चक्र के प्रवाह के लिए उच्च ऊर्जा 'इलेक्ट्रॉन दाताओं' को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है, जो इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला में इलेक्ट्रॉनों को वितरित करता है जो आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में एक प्रोटॉन ढाल उत्पन्न करता है, एटीपी-सिंथेज़ को एटीपी4के लिए फॉस्फोराइलेट एडीपी को सक्षम करता है। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन परख करने के लिए एक प्रयोगात्मक डिजाइन में नमूना प्रकृति (बरकरार कोशिकाओं, permeabilized कोशिकाओं, या पृथक माइटोकॉन्ड्रिया) और माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट शामिल होना चाहिए।
कोशिकाएं स्वदेशीसब्सट्रेट्स 5का एक स्टोर रखती हैं, और माइटोकॉन्ड्रिया कई प्रकार के सब्सट्रेट्स को एक साथ6ऑक्सीकरण करते हैं, जो बरकरार कोशिकाओं पर किए गए प्रयोगों से प्राप्त परिणामों की व्याख्या को जटिल बनाता है। एक चयनित सब्सट्रेट को ऑक्सीकरण करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल क्षमता की जांच करने के लिए एक सामान्य दृष्टिकोण माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करना या जांच की गई कोशिकाओं को परमेबिलाइज़ करनाहै। यद्यपि पृथक माइटोकॉन्ड्रिया मात्रात्मक अध्ययन के लिए आदर्श हैं, अलगाव प्रक्रिया श्रमसाध्य है। यह तकनीकी कठिनाइयों का सामना करता है जैसे कि बड़े नमूना आकार की आवश्यकता, उपज की शुद्धता, और तकनीक की पुनरुत्पादकता5। Permeabilized कोशिकाएं माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव के नुकसान के लिए एक समाधान प्रदान करती हैं; हालांकि, डिटर्जेंट प्रकृति के नियमित permeabilizing एजेंट विशिष्ट नहीं हैं और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को नुकसान पहुंचा सकते हैं5।
पुनः संयोजक perfringolysin O (rPFO) एक चयनात्मक प्लाज्मा झिल्ली permeabilizing एजेंट 7 के रूप में की पेशकश की गई थी, और यह सफलतापूर्वककईअध्ययनों 7,8,9,10में एक extracellular फ्लक्स विश्लेषक के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया गया था। हमने XFe96 एक्स्ट्रासेल्युलर फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट फ्लक्स को स्क्रीन करने के लिए आरपीएफओ का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल को संशोधित किया है। इस प्रोटोकॉल में, दो सेलुलर फेनोटाइप में चार अलग-अलग सब्सट्रेट ऑक्सीकरण मार्गों की तुलना की जाती है, जबकि प्रत्येक परीक्षण की गई सामग्री के लिए पर्याप्त प्रतिकृति और उचित नियंत्रण होता है।
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Protocol
1. परख से पहले एक दिन
- अभिकर्मकों और substrates की तैयारी.
- माइटोकॉन्ड्रियल परख समाधान (एमएएस): तालिका 1में वर्णित के रूप में सभी अभिकर्मकों के स्टॉक समाधान तैयार करें। पूरी तरह से भंग करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस करने के लिए mannitol और सुक्रोज के शेयरों को गर्म करें। 2x MAS तैयार करने के लिए अभिकर्मकों को मिलाएं, फिर मिश्रण को 37 °C तक गर्म करें। 5N KOH के साथ पीएच को 7.4 (~ 7 मिलीलीटर) में समायोजित करें, फिर मात्रा को 1 एल तक लाने के लिए पानी जोड़ें फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें और माप दिवस तक -20 डिग्री सेल्सियस पर एलीकोट को स्टोर करें।
- गोजातीय सीरम एल्बुमिन (5% बीएसए): एक चुंबकीय हलचल पर पूर्वव्यापी बाँझ पानी के 90 मिलीलीटर में बीएसए के 5 ग्राम को भंग करें और हिलाने से बचें। पीएच को 5 एन KOH के साथ 7.4 में समायोजित करें, और फिर 100 mL तक मात्रा लाने के लिए पानी जोड़ें। फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें और माप दिवस तक -20 डिग्री सेल्सियस पर एलीकोट को स्टोर करें।
- माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट्स: बाँझ पानी में सोडियम सक्सिनेट, सोडियम पाइरूवेट और सोडियम ग्लूटामेट के 1 एम स्टॉक समाधान तैयार करें। बाँझ पानी में सोडियम मैलेट का 100 mM स्टॉक समाधान तैयार करें और palmitoyl carnitine के 10 mM स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए prewarmed बाँझ पानी का उपयोग करें। 5 एन KOH द्वारा 7.4 करने के लिए प्रत्येक समाधान के पीएच समायोजित करें और फ़िल्टर-sterilize. सब्सट्रेट्स को 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। उपयोग के समय, किसी भी अवक्षेप को भंग करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म palmitoyl carnitine। बाद के उपयोग के लिए, पाइरूवेट को छोड़कर सभी सब्सट्रेट्स के एलीकोट को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- माइटोकॉन्ड्रियल अवरोधक: 25 mM oligomycin, 50 mM कार्बोनिल साइनाइड 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), 20 mM rotenone, और 20 mM एंटीमाइसिन ए के स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (DMSO) का उपयोग करें।
- सीडिंग और कोशिकाओं का इलाज: जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है, स्तंभ 2-11 में कोशिकाओं को बीज दें। स्तंभ 1 और 12 को पृष्ठभूमि कुओं के रूप में सेवा करने के लिए खाली छोड़ दिया जाना चाहिए। इस काम में, HepG2 और A549 कोशिकाओं का उपयोग किया गया था।
- कोशिकाओं को प्रति अच्छी तरह से 20,000 कोशिकाओं के घनत्व पर बीज दें। सीडिंग के लिए सेल कल्चर माध्यम के 50-80 μL का उपयोग करें।
- सेल संस्कृति माध्यम की एक समान मात्रा के साथ रिक्त कुओं को भरें और 5% CO2के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं incubate। कोशिकाओं को 3-4 घंटे के लिए संलग्न करने की अनुमति दें, और फिर सभी कुओं में 100 μL सेल संस्कृति माध्यम जोड़ें।
- उस अंतिम माध्यम के अलावा के साथ, 7-11 कॉलम में उपचार लागू करें। इस काम में, प्रयोगात्मक समूह को 16 घंटे के लिए 1 एमएम मेटफॉर्मिन हाइड्रोक्लोराइड के साथ इलाज किया गया था, और नियंत्रण समूह को वाहन नियंत्रण के रूप में बाँझ आसुत पानी की समान मात्रा के साथ इलाज किया गया था।
- सेंसर को हाइड्रेट करना: उपयोगिता प्लेट में अच्छी तरह से बाँझ पानी के पिपेट 200 μL, फिर पानी में सेंसर को विसर्जित करते समय सेंसर कारतूस को सावधानीपूर्वक वापस कर दें। अगले दिन तक 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सीओ2-मुक्त इनक्यूबेटर में कारतूस को इनक्यूबेट करें।
- परख प्रोटोकॉल टेम्पलेट: विश्लेषक पर स्विच (सामग्री की तालिकादेखें) और नियंत्रक इकाई. साधन नियंत्रण और डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू करें और तालिका 2में वर्णित के रूप में परख प्रोटोकॉल डिजाइन। समूह परिभाषाओं केतहत, चार इंजेक्शन रणनीतियां बनाएं जहां पोर्ट ए इंजेक्ट किए गए सब्सट्रेट(चित्रा 3)के अनुसार भिन्न होता है। substrates या उनके संक्षिप्त रूपों के बाद रणनीतियों का नाम दें।
- बंदरगाहों बी, सी, और डी के लिए, क्रमशः ओलिगोमाइसिन, एफसीसीपी और रोटेनोन / एंटीमाइसिन ए यौगिकों को असाइन करें। आठ समूह बनाएँ और चित्र 4में दिखाए गए अनुसार उन्हें नाम दें। प्लेट मैप के तहत समूहों को संबंधित कुओं को असाइन करें, फिर प्रोटोकॉल को एक रेडी-टू-यूज टेम्पलेट के रूप में सहेजें। तापमान को रात भर स्थिर करने की अनुमति देने के लिए विश्लेषक को चालू छोड़ दें। अचानक तापमान परिवर्तन से बचने के लिए विश्लेषक को स्थिर तापमान के साथ एक जगह पर रखें।
2. परख के दिन
- कैलिब्रेंट के साथ पानी की जगह: उपयोगिता प्लेट से पानी को त्यागें और उपयोगिता प्लेट में प्रति अच्छी तरह से प्रीवस्ट्रेड कैलिब्रेंट के पिपेट 200 μL। परख के समय तक सीओ2-मुक्त इनक्यूबेटर के लिए कारतूस वापस. कैलिब्रेंट के तेजी से वाष्पीकरण से बचने के लिए, इनक्यूबेटर के अंदर आर्द्रता का एक स्रोत बनाए रखें और पंखे की गति को कम से कम बंद या कम करें।
- काम करने वाले समाधान तैयार करना: 2x MAS, 5% BSA, और 37 °C तक बाँझ पानी को गर्म करके शुरू करें। इस बीच, अवरोधक स्टॉक को कमरे के तापमान तक पहुंचने की अनुमति दें। गर्म 2x MAS और बाँझ आसुत पानी का उपयोग करने के लिए substrates और inhibitors के काम एकाग्रता के 5 mL तैयार करने के लिए के रूप में तालिका 3में वर्णित है.
- इंजेक्शन पोर्ट लोड हो रहा है: जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है, पोर्ट A में सब्सट्रेट्स के 20 μL लोड करें। पंक्तियों A और B के पोर्ट A में succinate/rotenone मिश्रण लोड करें। पंक्तियों C और D के पोर्ट A में पाइरूवेट/मैलेट मिश्रण लोड करें। पंक्तियों E और F के पोर्ट A में ग्लूटामेट/मैलेट मिश्रण लोड करें। पंक्ति G और H के पोर्ट A में palmitoyl carnitine/malate मिश्रण लोड करें। पूरी प्लेट के लिए, ओलिगोमाइसिन तैयारी के 22 μL के साथ लोड पोर्ट बी, एफसीसीपी तैयारी के 25 μL के साथ पोर्ट सी, और 27 μL rotenone / एंटीमाइसिन ए मिश्रण के साथ पोर्ट डी।
- अंशांकन चरण शुरू: के तहत चलाएँ परख टैब, प्रारंभ चलाएँ पर क्लिक करें परख शुरू करने के लिए. लोड किए गए सेंसर कारतूस डालें और अंशांकन चरण प्रारंभ करें। अगले चरण पर जाने से पहले अंशांकन के पूर्ण होने की प्रतीक्षा करें.
- परख माध्यम (MAS-BSA-rPFO) की तैयारी: परख माध्यम के 20 mL तैयार करने के लिए, मिश्रण 2x MAS के 10 mL, बाँझ पानी के 9.2 mL, और एक 50 mL ट्यूब में 5% BSA के 0.8 mL. 10 μM rPFO के 2 μL जोड़ें 1 nM की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए और कोमल pipetting के साथ मिश्रण resuspend. हिलाने से बचें और मिश्रण के लिए एक भंवर मिक्सर का उपयोग न करें। उपयोग के समय तक 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
- कोशिकाओं को धोना: कोशिकाओं और खाली खाली कुओं को दो बार प्रीवस्ट्र्ड कैल्शियम- और मैग्नीशियम-मुक्त फॉस्फेट बफ़र्ड खारा (पीबीएस) के साथ एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके धोएं। सेल संस्कृति माध्यम को त्यागने और पीबीएस जोड़ने के लिए एक ही युक्तियों का पुन: उपयोग करने से बचें। एयरफ्लो द्वारा कोशिकाओं को सूखने से बचाने के लिए लैमिनर प्रवाह के बाहर इस चरण को निष्पादित करें।
- परख माध्यम में सेल permeabilization: एक multichannel पिपेट का उपयोग कर, PBS त्याग और prewarmed परख माध्यम (MAS-BSA-rPFO) के 180 μL के साथ इसे प्रतिस्थापित करें।
- माप शुरू करना: permeabilization के तुरंत बाद, सेल प्लेट के साथ कैलिब्रेटेड सेंसर कारतूस की उपयोगिता प्लेट को बदलें और माप शुरू करें।
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Representative Results
ऑक्सीजन खपत दर प्रतिशत (OCR%) के रूप में मूल्यों को दिखाने के लिए बेसलाइन श्वसन के दूसरे माप के लिए परिणामों को सामान्य करके शुरू करें। परख के परिणामों को चित्र 5, चित्र 6 , चित्र 7 , और चित्र 8 में दिखाया गया है . प्रत्येक समूह के लिए उचित पृष्ठभूमि कुओं को असाइन करना और अन्य समूहों की पृष्ठभूमि कुओं को निष्क्रिय करना महत्वपूर्ण है। चित्रा 5 से पता चलता है कि उपचारित समूह में सक्सिनेट-प्रेरित श्वसन की उच्च दर होती है। मेटफॉर्मिन उपचार के लिए A549 कोशिकाओं की प्रतिक्रिया(चित्रा 5A)HepG2 कोशिकाओं(चित्रा 5B)की तुलना में अधिक थी। पृष्ठभूमि नियंत्रण कुओं केवल तुलनात्मक समूह की एक ही पंक्तियों से थे, इस मामले में, कुओं A1, B1, A12, और B12. चित्र 6 पाइरूवेट/मैलेट-प्रेरित श्वसन में परिवर्तन को दर्शाता है। चित्रा 7 ग्लूटामेट / मैलेट-प्रेरित श्वसन में परिवर्तन को दर्शाता है, और चित्रा 8 पामिटोइल कार्निटाइन / मैलेट-प्रेरित श्वसन में परिवर्तन दिखाता है।
चित्र 1:साइट्रिक एसिड चक्र का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट फ्लक्स का परीक्षण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सब्सट्रेट लाल रंग में हैं। मैलेट का उपयोग अकेले नहीं किया जाता है, लेकिन पाइरूवेट, पामिटोइल कार्निटाइन और ग्लूटामेट के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है। पाइरूवेट/मैलेट- और पाल्मिटोयल कार्निटाइन/मैलेट-प्रेरित श्वसन में मैलेट की भूमिका मैलेट डिहाइड्रोजनेज एंजाइम की कार्रवाई के माध्यम से ऑक्सालोएसीटेट प्रदान करना है। ग्लूटामेट / मैलेट-प्रेरित श्वसन में, मैलेट मैलेट-एस्पार्टेट शटल में भाग लेता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2:सेल संस्कृति माइक्रोप्लेट में सेल सीडिंग योजना का चित्रण। स्तंभ 1 और 12 में रिक्त कुओं को कोशिकाओं के बिना खाली छोड़ दिया जाना चाहिए। स्तंभ 7-11 का उपयोग प्रयोगात्मक समूह के इलाज के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3:इंजेक्शन रणनीति का चित्रण। पंक्तियों A और B के पोर्ट A को succinate/rotenone मिश्रण से भरा जाता है। पंक्तियों C और D के पोर्ट A को पाइरूवेट/मैलेट मिश्रण से भरा जाता है। पंक्तियों E और F के पोर्ट A ग्लूटामेट/मालेट मिश्रण से भरे हुए हैं। पंक्तियों G और H के पोर्ट A palmitoyl carnitine / malate मिश्रण के साथ लोड कर रहे हैं। पूरी प्लेट के लिए, पोर्ट बी, सी, और डी क्रमशः ओलिगोमाइसिन, एफसीसीपी और रोटेनोन / एंटीमाइसिन ए से भरे हुए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4:समूह नाम और प्लेट मानचित्र. प्रत्येक समूह को फेनोटाइप (नियंत्रण या उपचारित) और श्वसन को प्रेरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सब्सट्रेट के अनुसार नामित किया जाता है। (एस), succinate प्रेरित श्वसन. (पी / एम), पाइरूवेट / मैलेट-प्रेरित श्वसन। (जी / एम), ग्लूटामेट / मालेट-प्रेरित श्वसन। (सीपी / एम), पामिटोइल कार्निटाइन / मालेट-प्रेरित श्वसन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5:Succinate-प्रेरित श्वसन. (ए)ए 54 9 और(बी)हेपजी 2। परीक्षण किए गए समूह को 16 घंटे के लिए 1 एमएम मेटफॉर्मिन हाइड्रोक्लोराइड के साथ इलाज किया गया था। सुधार के लिए केवल पृष्ठभूमि कुओं A1, B1, A12, और B12 का उपयोग किया जाता है। परिणाम एसडी के औसत OCR% ± रूप में दिखाए जाते हैं। ग्राफ और प्लेट ग्रिड बनाया गया था और परख डिजाइन, डेटा विश्लेषण, और फ़ाइल प्रबंधन सॉफ्टवेयर द्वारा छवि फ़ाइलों के रूप में निर्यात किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 6:पाइरूवेट/मैलेट-प्रेरित श्वसन. (A)A549 और(B)HepG2. परीक्षण किए गए समूह को 16 घंटे के लिए 1 एमएम मेटफॉर्मिन हाइड्रोक्लोराइड के साथ इलाज किया गया था। सुधार के लिए केवल पृष्ठभूमि कुओं C1, D1, C12, और D12 का उपयोग किया जाता है। परिणाम एसडी के औसत OCR% ± रूप में दिखाए जाते हैं। ग्राफ और प्लेट ग्रिड बनाया गया था और परख डिजाइन, डेटा विश्लेषण, और फ़ाइल प्रबंधन सॉफ्टवेयर द्वारा छवि फ़ाइलों के रूप में निर्यात किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 7:ग्लूटामेट/मैलेट-प्रेरित श्वसन( A)A549 और(B)HepG2. परीक्षण किए गए समूह को 16 घंटे के लिए 1 एमएम मेटफॉर्मिन हाइड्रोक्लोराइड के साथ इलाज किया गया था। सुधार के लिए केवल पृष्ठभूमि कुओं E1, F1, E12, और F12 का उपयोग किया जाता है। परिणाम एसडी के औसत OCR% ± रूप में दिखाए जाते हैं। ग्राफ और प्लेट ग्रिड बनाया गया था और परख डिजाइन, डेटा विश्लेषण, और फ़ाइल प्रबंधन सॉफ्टवेयर द्वारा छवि फ़ाइलों के रूप में निर्यात किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र8:Palmitoyl carnitine / malate-प्रेरित श्वसन. (A)A549 और(B)HepG2. परीक्षण किए गए समूह को 16 घंटे के लिए 1 एमएम मेटफॉर्मिन हाइड्रोक्लोराइड के साथ इलाज किया गया था। सुधार के लिए केवल पृष्ठभूमि कुओं G1, H1, G12, और H12 का उपयोग किया जाता है। परिणाम एसडी के औसत OCR% ± रूप में दिखाए जाते हैं। ग्राफ और प्लेट ग्रिड बनाया गया था और परख डिजाइन, डेटा विश्लेषण, और फ़ाइल प्रबंधन सॉफ्टवेयर द्वारा छवि फ़ाइलों के रूप में निर्यात किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| माइटोकॉन्ड्रियल परख माध्यम | ||||
| स्टॉक (mM) | स्टॉक प्रति लीटर से वॉल्यूम (एमएल) | 2x MAS (mM) | MAS (mM) | |
| शर्करा | 1000 | 140 | 140 | 70 |
| मैनिटोल | 1000 | 440 | 440 | 220 |
| KH2PO4 | 1000 | 20 | 20 | 10 |
| MgCl2 | 200 | 50 | 10 | 5 |
| HEPES | 200 | 20 | 4 | 2 |
| EGTA | 200 | 10 | 2 | 1 |
| ADP | 200 | 20 | 4 | 2 |
तालिका 1: माइटोकॉन्ड्रियल परख समाधान| (2x MAS) तैयार करने के लिए प्रत्येक घटक स्टॉक समाधान की संकेतित मात्रा को मिलाएं। समाधान को 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें, फिर 7.4 के लिए 5 एन कोह के साथ पीएच को समायोजित करें। आसुत पानी जोड़ें 1 एल तक की मात्रा लाने के लिए फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें और फिर -20 डिग्री सेल्सियस पर ऐलीकोट स्टोर करें। परख माध्यम और माइटोकॉन्ड्रियल substrates और 2x MAS का उपयोग कर inhibitors के काम समाधान तैयार.
| आज्ञा | अवधि | इंजेक्ट किया गया यौगिक |
| अंशांकन | डिफ़ॉल्ट रूप से | |
| संतुलन | हाँ | |
| बेसलाइन | ||
| 2 चक्र | ||
| मिलाना | 30 सेकंड | |
| ज़रा रुको | 30 सेकंड | |
| माप | 2 मिनट | |
| पोर्ट A इंजेक्ट करें | Substrates | |
| 2 चक्र | ||
| मिलाना | 30 सेकंड | |
| ज़रा रुको | 30 सेकंड | |
| माप | 2 मिनट | |
| पोर्ट B इंजेक्ट करें | ऑलिगोमाइसिन | |
| 2 चक्र | ||
| मिलाना | 30 सेकंड | |
| ज़रा रुको | 30 सेकंड | |
| माप | 2 मिनट | |
| पोर्ट C इंजेक्ट करें | FCCP | |
| 2 चक्र | ||
| मिलाना | 30 सेकंड | |
| ज़रा रुको | 30 सेकंड | |
| माप | 2 मिनट | |
| पोर्ट D इंजेक्ट करें | रोटेनोन + एंटीमाइसिन ए | |
| 2 चक्र | ||
| मिलाना | 30 सेकंड | |
| ज़रा रुको | 30 सेकंड | |
| माप | 2 मिनट |
तालिका 2: परख प्रोटोकॉल के आदेश.
| 5 mL में वॉल्यूम | ||||||
| Substrates | स्टॉक कॉन्क. | काम कर रहे conc. | भंडार | 2x MAS | dH2O | अंतिम conc. |
| Succinate/rotenone | 1 M/20 mM | 100 mM/10 μM | 500 μL/ 2.5 μL | 2.5 mL | 1997.5 μL | 10 mM/1 μM |
| पाइरूवेट/मैलेट | 1 M/100 mM | 100 mM /10 mM | 500 μL/500 μL | 2.5 mL | 1500 μL | 10 mM /1 mM |
| ग्लूटामेट/मैलेट | 1 M/100 mM | 100 mM /10 mM | 500 μL/500 μL | 2.5 mL | 1500 μL | 10 mM /1 mM |
| पाल्मिटोइल कार्निटाइन/मैलेट | 10 mM/100 mM | 400 μM /10 mM | 200 μL/500 μL | 2.5 mL | 1800 μL | 40 μM /1 mM |
| अवरोधक | ||||||
| ऑलिगोमाइसिन | 25 mM | 15 μM | 3 μL | 2.5 mL | 2497 μL | 1.5 μM |
| FCCP | 50 mM | 40 μM | 4 μL | 2.5 mL | 2496 μL | 4 μM |
| रोटेनोन/एंटीमायसिन ए | 20 mM/20 mM | 10 μM/ 10 μM | 2.5 μL/2.5 μL | 2.5 mL | 2495 μL | 1 μM/ 1 μM |
तालिका 3: माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट और अवरोधकों की सूची सेंसर कारतूस के इंजेक्शन बंदरगाहों में लोड की जानी है जैसा कि पहले चित्रा 3में चर्चा की गई थी। प्रत्येक सब्सट्रेट या अवरोधक मिश्रण की कार्यशील एकाग्रता के 5 मिलीलीटर तैयार करने के लिए स्टॉक समाधान, 2x एमएएस और आसुत पानी से संकेतित मात्राओं को मिलाएं। इंजेक्शन प्रक्रिया के बाद कुओं में अंतिम एकाग्रता प्राप्त की जाती है।
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Discussion
यह प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित अध्ययन7,8,9,10 और उत्पाद उपयोगकर्ता गाइड का एक संशोधन है। निर्माता के प्रोटोकॉल के विपरीत, 3x MAS के बजाय 2x MAS का उपयोग किया जाता है, क्योंकि 2× MAS को भंग करना आसान होता है और ठंड के बाद वर्षा नहीं होती है। जमे हुए 2x एमएएस एलीकोट को छह महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है और लगातार परिणाम दिखा सकता है। एक अन्य अंतर 2x MAS के घटकों में ADP को शामिल करना और सूत्र से BSA को छोड़ना है। बीएसए युक्त समाधानों को इंजेक्ट करना अधिक कठिन है और त्रुटियों और बाहरी लोगों की एक बड़ी संभावना का कारण बनता है। हालांकि, उचित permeabilization प्राप्त करने के लिए rPFO की आवश्यक राशि को कम करने के लिए बीएसए की उपस्थिति आवश्यक है। इसलिए, बीएसए केवल परख माध्यम (MAS-BSA-rPFO) है कि सेल धोने के बाद permeabilization चरण में उपयोग किया जाता है करने के लिए जोड़ा जाता है।
सेल कल्चर माध्यम से कोशिकाओं को धोने के लिए, यह प्रोटोकॉल एमएएस के बजाय पीबीएस का उपयोग करता है। पीबीएस आइसोटोनिक है और सेलुलर आकार में किसी भी बदलाव का कारण नहीं बनता है, सोडियम-मुक्त एमएएस के विपरीत जो पोटेशियम में समृद्ध है और सेलुलर आकृति विज्ञान को बदल सकता है। एक और प्रमुख अंतर परख प्रोटोकॉल में संतुलन कदम रखना है. संतुलन चरण 12 मिनट तक रहता है, जो 2 माप चक्रों के बराबर होता है। संतुलन चरण को बनाए रखने का उद्देश्य उपकरण के अंदर के तापमान को स्थिर करना है और एक ही समय में, कोशिकाओं को किसी भी संभावित आंतरिक ऑक्सीकरण योग्य स्टोर को ऑक्सीकरण करने की अनुमति देता है, जिसे परख माध्यम में एडीपी की उपस्थिति से बढ़ाया जाता है।
सेल संस्कृति तकनीकों के बारे में कुछ विचार दिए जाने चाहिए। इस काम में, परख से पहले दिन पर जांच की कोशिकाओं seeded थे. हालांकि, कुछ कोशिकाओं को लंबे समय तक संस्कृति या उपचार समय की आवश्यकता होती है। यदि अध्ययन डिजाइन में विभेदित कोशिकाएं, ताजा अलग-थलग, या गैर-अनुयायी कोशिकाएं शामिल हैं, तो सेल संस्कृति माइक्रोप्लेट में कोशिकाओं को ठीक करने के लिए एक उचित कोटिंग की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल निलंबन में कोशिकाओं के लिए उपयुक्त नहीं है, और सेल और ऊतक चिपकने वाले के उपयोग की सिफारिश की जाती है। इस प्रोटोकॉल की एक और सीमा यह है कि यह विधि मात्रात्मक डेटा को समाप्त करने के लिए उपयुक्त नहीं है। दूसरे शब्दों में, इस विधि से माप से पहले प्रत्येक में माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की वास्तविक मात्रा का अनुमान लगाना संभव नहीं है। इसलिए, यह विधि फॉस्फेट / ऑक्सीजन अनुपात (पी / ओ अनुपात) 5 का सटीक अनुमान प्रदान किए बिना माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट फ्लक्स की एक त्वरित स्क्रीनिंग उत्पन्न करतीहै। हालांकि, छोटे नमूनों पर मात्रात्मक अध्ययन के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना संभव है11। इस उद्देश्य के लिए, ताजा अलग माइटोकॉन्ड्रिया प्राप्त करना और सेल संस्कृति माइक्रोप्लेट में माइटोकॉन्ड्रिया को ठीक करने के लिए सेल और ऊतक चिपकने वाला का उपयोग करना आवश्यक है।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने से सर्वोत्तम पुनरुत्पादक परिणाम प्राप्त करने के लिए, उपयोग किए गए अभिकर्मकों की एकाग्रता पर ध्यान दें। उपयोग किए गए समाधानों, इनक्यूबेटरों और साधन का तापमान स्थिर होना चाहिए। सुनिश्चित करें कि सभी समाधान और substrates एक समायोजित पीएच है. जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, इंजेक्ट किए जाने की योजना के समाधानों में बीएसए को शामिल करने की सिफारिश नहीं की जाती है। यदि परिणाम एक विस्तृत त्रुटि श्रेणी दिखाते हैं, तो संभावित आउटलायर्स को देखने और हटाने के लिए समूह स्वरूप के बजाय अच्छी तरह से स्वरूप में परिणाम प्रदर्शित करें।
इस काम में, हमने एक एकल माप के अधिकतम उपयोग को प्राप्त करने की कोशिश की ताकि एक साथ उचित पृष्ठभूमि नियंत्रण के साथ कई माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट फ्लक्स को स्क्रीन किया जा सके और अपेक्षाकृत कम समय में पर्याप्त प्रतिकृति हो सके। जैसा कि परिणामों में दिखाया गया है, यह विधि एक दवा की एक एकाग्रता के साथ एक समूह का इलाज करके बनाए गए दो फेनोटाइप की तुलना करने में उपयोगी है। इसे विभिन्न सेल लाइनों या आनुवंशिक रूप से इंजीनियर कोशिकाओं की तुलना करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल बहुमुखी और विभिन्न substrates है, या अवरोधकों का उपयोग किसी भी सेलुलर मॉडल में माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट फ्लक्स के अनुकूलन को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
लेखकों Hradec Králové में चिकित्सा के संकाय में फिजियोलॉजी विभाग के कर्मचारियों के सदस्यों और रसायनों और नमूनों की तैयारी के साथ मदद के लिए चिकित्सा के तीसरे संकाय में Pathophysiology विभाग के सदस्यों को धन्यवाद. इस काम को चार्ल्स विश्वविद्यालय अनुदान कार्यक्रमों PROGRES Q40/02, चेक स्वास्थ्य मंत्रालय अनुदान NU21-01-00259, चेक विज्ञान फाउंडेशन अनुदान 18-10144 और INOMED परियोजना CZ.02.1.01/0.0/0.0/0.0/18_069/0010046 द्वारा समर्थित किया गया था, जो चेक गणराज्य के शिक्षा, युवा और खेल मंत्रालय और यूरोपीय संघ द्वारा वित्त पोषित है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
| Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 - 8 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
| HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
| L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
| L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
| Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
| Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
| Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 - 8 °C |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
| Water | Merck | W3500 | store at RT |
| XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
| XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 °C |
References
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
- Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. , Academic press. London. (2002).
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- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).
