Summary
בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקול שונה כדי לבדוק שטף מצע נשימתי מיטוכונדריאלי באמצעות רקומביננטי perfringolysin O בשילוב עם רזפירומטריה מבוססת מיקרופלסטיק. עם פרוטוקול זה, אנו מראים כיצד מטפורמין משפיע על נשימה מיטוכונדריאלית של שני קווי תאים סרטניים שונים.
Abstract
שטף מצע מיטוכונדריאלי הוא מאפיין בולט של כל סוג תא, ושינויים במרכיביו כגון מובילים, ערוצים או אנזימים מעורבים בפתוגנזה של מספר מחלות. ניתן לחקור שטף מצע מיטוכונדריאלי באמצעות תאים שלמים, תאים מחלחלים או מיטוכונדריה מבודדת. חקירת תאים שלמים נתקלת במספר בעיות עקב חמצון סימולטני של מצעים שונים. חוץ מזה, מספר סוגי תאים מכילים מאגרים פנימיים של מצעים שונים שמסבך את פרשנות התוצאות. שיטות כגון בידוד מיטוכונדריאלי או שימוש בסוכנים מחלחלים אינם ניתנים לשחזור בקלות. בידוד המיטוכונדריה הטהורה עם ממברנות שלמות בכמויות מספיקות מדגימות קטנות הוא בעייתי. שימוש permeabilizers לא סלקטיבי גורם דרגות שונות של נזק ממברנה מיטוכונדריאלית בלתי נמנע. רקומביננטי perfringolysin O (rPFO) הוצע כמו permeabilizer מתאים יותר, הודות ליכולתו באופן סלקטיבי permeabilize קרום פלזמה מבלי להשפיע על שלמות המיטוכונדריה. כאשר נעשה שימוש בשילוב עם respirometry microplate, זה מאפשר בדיקת השטף של כמה מצעים מיטוכונדריאליים עם מספיק שכפולים בתוך ניסוי אחד תוך שימוש במספר מינימלי של תאים. בעבודה זו, הפרוטוקול מתאר שיטה להשוות שטף מצע מיטוכונדריאלי של שני פנוטיפים תאיים שונים או גנוטיפים וניתן להתאים אישית כדי לבדוק מצעים או מעכבים מיטוכונדריאליים שונים.
Introduction
ספירומטריה מבוססת מיקרופלסטיק חוללה מהפכה במחקר המיטוכונדריאלי בכך שאפשרה את חקר הנשימה התאית בגודל מדגם קטן1. נשימה תאית נחשבת בדרך כלל כאינדיקטור לתפקוד מיטוכונדריאלי או "תפקוד לקוי", למרות העובדה כי טווח הפונקציות המיטוכונדריאלי משתרע מעבר לייצוראנרגיה 2. בתנאים אירוביים, המיטוכונדריה מחלצים את האנרגיה המאוחסנת במצעים שונים על ידי פירוק והמרת מצעים אלה למתווכים מטבוליים שיכולים לתדלק את מחזור חומצת לימון3 (איור 1). השטף המתמשך של המצעים חיוני לזרימה של מחזור חומצת לימון כדי ליצור אנרגיה גבוהה 'תורמי אלקטרונים', אשר מספקים אלקטרונים לשרשרת הובלת האלקטרונים המייצר שיפוע פרוטונים על פני הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית, ומאפשר ATP-סינתאז לזרחן ADP ל- ATP4. לכן, עיצוב ניסיוני כדי לעצור נשימה מיטוכונדריאלית חייב לכלול את טבע המדגם (תאים שלמים, תאים מחלחלים, או מיטוכונדריה מבודדת) ומצעים מיטוכונדריאליים.
תאים לשמור על מאגר של מצעים ילידים5, ומיטוכונדריה לחמצן כמה סוגים של מצעים בו זמנית6, אשר מסבך את הפרשנות של תוצאות המתקבלות מניסויים שבוצעו על תאים שלמים. גישה נפוצה לחקור את היכולת המיטוכונדריאלית לחמצן מצע נבחר היא לבודד את המיטוכונדריה או לחלחל לתאים הנחקרים5. למרות המיטוכונדריה מבודדת הם אידיאליים עבור מחקרים כמותיים, תהליך הבידוד הוא מייגע. הוא מתמודד עם קשיים טכניים כגון הצורך בגודל מדגם גדול, טוהר התשואה, ושחזור של הטכניקה5. תאים מחלחלים מציעים פתרון לחסרונות של בידוד מיטוכונדריאלי; עם זאת, חומרים מחלחלים שגרתיים של טבע דטרגנט אינם ספציפיים ועלולים לפגוע בממברנות המיטוכונדריאליות5.
רקומביננטי perfringolysin O (rPFO) הוצע כקרום פלזמה סלקטיבי מחלחל סוכן7, והוא שימש בהצלחה בשילוב עם מנתח שטף חוץ תאי במספר מחקרים7,8,9,10. שינינו פרוטוקול באמצעות rPFO כדי לסנן שטף מצע מיטוכונדריאלי באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי XFe96. בפרוטוקול זה, ארבעה מסלולים שונים חמצון מצע בשני פנוטיפים הסלולר משווים תוך שיש מספיק שכפולים ואת השליטה הנכונה עבור כל חומר נבדק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. יום אחד לפני ההסתה
- הכנת ריאגנטים ומצעים.
- פתרון בדיקת מיטוכונדריאלי (MAS): הכן פתרונות מלאי של כל הריאגנטים כמתואר בטבלה 1. מחממים את המניות של מניטול סוכרוז ל 37 °C (50 °F) להתמוסס לחלוטין. מערבבים את הריאגנטים כדי להכין 2x MAS, ולאחר מכן לחמם את התערובת ל 37 °C (50 °F). התאימו את ה-pH עם 5N KOH ל-7.4 (~7 מ"ל), ולאחר מכן הוסיפו מים כדי להביא את הנפח עד 1 ליטר. מסננים-לעקר ולאחסן את aliquots ב -20 °C עד יום המדידה.
- אלבומין בסרום בקר (5% BSA): יש להמיס 5 גרם BSA ב-90 מ"ל של מים סטריליים עם וורטר על מערבל מגנטי ולהימנע מרעד. התאימו את ה-pH ל-7.4 עם 5 N KOH ולאחר מכן הוסיפו מים כדי להביא את הנפח עד 100 מ"ל. מסנן-לחטא ולאחסן את aliquots ב -20 °C (50 °F) עד יום המדידה.
- מצעים מיטוכונדריאליים: הכינו 1 M פתרונות מלאי של נתרן תמציתי, נתרן פירובט ונתרן גלוטמט במים סטריליים. הכן פתרון מלאי 100 mM של נתרן malate במים סטריליים ולהשתמש במים סטריליים מוארים מראש כדי להכין פתרון מלאי 10 mM של קרניטין פלמיטויל. כוונן את רמת ה-pH של כל פתרון ל-7.4 על 5 N KOH וחטא מסנן. לאחסן את המצעים ב 2-8 °C (5 °F). בזמן השימוש, קרניטין פלמיטויל חם ל 37 °C (50 °F) כדי להמיס כל משקעים. לשימוש מאוחר יותר, יש לאחסן עליקוטים של כל המצעים למעט פירובט ב-20 מעלות צלזיוס.
- מעכבי מיטוכונדריאליים: השתמש דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי להכין פתרונות מלאי של 25 mM אוליגומיצין, 50 mM קרבוניל ציאניד 4-(טריפלואורומתוקסי) פניל הידרוזון (FCCP), 20 mM רוטנון, ו 20 mM עתיקות A. לאחסן את aliquots ב -20 °C.
- זריעה וטיפול בתאים: כפי שמוצג באיור 2, זרעו את התאים בעמודות 2-11. יש להשאיר עמודות 1 ו- 12 ריקות כדי לשמש כבארות רקע. בעבודה זו, נעשה שימוש בתאי HepG2 ו- A549.
- זרע את התאים בצפיפות של 20,000 תאים לבאר. השתמש 50-80 μL של תרבית התא בינוני עבור זריעה.
- מלא את הבארות הריקות בנפח שווה של תרבית תאים בינוני ודגר את התאים ב 37 °C בחממה לחה עם 5% CO2. אפשר לתאים להתחבר במשך 3-4 שעות ולאחר מכן הוסף 100 μL של תרבית תאים בינונית לכל בארות.
- עם תוספת בינונית סופית זו, יש למרוח את הטיפול בעמודות 7-11. בעבודה זו, קבוצת הניסוי טופלה עם 1 mM מטפורמין הידרוכלוריד במשך 16 שעות, וקבוצת הביקורת טופלה בנפח שווה של מים מזוקקים סטריליים כבקרה לרכב.
- לחות החיישנים: Pipette 200 μL של מים סטריליים לבאר לתוך צלחת השירות, ולאחר מכן בזהירות להחזיר את מחסנית החיישן תוך טבילת החיישנים במים. לדגור את המחסנית באינקובטורCO 2-חינםב 37 °C (50 °F) עד למחרת.
- תבנית פרוטוקול ה- assay: עבור את המנתח (ראה טבלת חומרים) ויחידת הבקר. הפעל את תוכנת בקרת המכשירים ורכישת הנתונים ותכנן את פרוטוקול בדיקת ה- assay כמתואר בטבלה 2. תחת הגדרות קבוצה, צור ארבע אסטרטגיות הזרקה שבהן יציאה A שונה בהתאם למצע המוזרק ( איור3). תן שם לאסטרטגיות על שם המצעים או הקיצורים שלהן.
- ליציאות B, C ו- D, הקצה את התרכובות אוליגומיצין, FCCP, ורוטנון / אנטימיצין A, בהתאמה. צרו שמונה קבוצות ותנו להן שם כפי שמוצג באיור 4. תחת מפת לוחות הקצה את הקבוצות לבארות המתאימות ולאחר מכן שמור את הפרוטוקול כתבנית מוכנה לשימוש. השאר את המנתח מופעל כדי לאפשר את הטמפרטורה להתייצב לילה. שמור את המנתח במקום עם טמפרטורה יציבה כדי למנוע שינויי טמפרטורה פתאומיים.
2. יום ההסתה
- החלפת מים עם הכיול: להשליך את המים מצלחת השירות ו pipette 200 μL של כיול מוזהר מראש לכל באר לתוך צלחת השירות. החזר את המחסנית לאינקובטורCO 2-חינםעד למועד ההסתה. כדי למנוע אידוי מהיר של הכיול, לשמור על מקור לחות בתוך האינקובטור ולכבה או להפחית את מהירות המאוורר למינימום.
- הכנת פתרונות העבודה: התחל על ידי חימום 2x MAS, 5% BSA, ומים סטריליים ל 37 °C (5 °F). בינתיים, לאפשר את מלאי המעכב להגיע לטמפרטורת החדר. השתמש 2X MAS חם ומים מזוקקים סטריליים כדי להכין 5 מ"ל של ריכוז העבודה של המצעים והמעכבים כמתואר בטבלה 3.
- טעינת יציאות ההזרקה: כפי שמוצג באיור 3, טען 20 μL של המצעים ליציאה A. טען תערובת תמציתית / רוטנון לתוך יציאה A של שורות A ו- B. לטעון תערובת pyruvate / malate לתוך יציאה A של שורות C ו- D. לטעון גלוטמט / תערובת malate לתוך יציאה A של שורות E ו- F. לטעון תערובת פלמיטויל קרניטין / malate לתוך יציאה A של שורות G ו- H. עבור כל הצלחת, לטעון יציאה B עם 22 μL של הכנת אוליגומיצין, יציאה C עם 25 μL של הכנת FCCP, ופורט D עם 27 μL של תערובת רוטנון / אנטימיצין A.
- התחלת שלב הכיול: תחת הכרטיסיה הפעל את הכרטיסיה 'הפעלה של 'הפעלה', לחץ על 'התחל לרוץ' כדי להתחיל בבדיקה. הכנס את מחסנית החיישן הטעון והתחל את שלב הכיול. המתן להשלמת הכיול לפני שתמשיך לשלב הבא.
- הכנת מדיום ה-assay (MAS-BSA-rPFO): להכנת 20 מ"ל של מדיום ה-assay, יש לערבב 10 מ"ל של 2x MAS, 9.2 מ"ל של מים סטריליים ו-0.8 מ"ל של 5% BSA בצינור 50 מ"ל. הוסף 2 μL של 10 rPFO μM כדי להשיג ריכוז של 1 ננומטר ו resuspend התערובת עם pipetting עדין. יש להימנע מרעדים ואין להשתמש במערבל מערבולת לערבוב. לדגור על הצינור ב 37 °C (55 °F) עד זמן השימוש.
- שטיפת התאים: לשטוף את התאים ואת בארות ריקות ריק פעמיים עם סידן מוזהם מראש ללא סידן ומגנזיום ללא תמיסת מלח (PBS) באמצעות פיפטה רב ערוצית. הימנע משימוש חוזר באותן עצות כדי להשליך את המדיום של תרבית התא ולהוסיף PBS. בצע שלב זה מחוץ לזרימת למינאר כדי להגן על התאים מפני התייבשות על ידי זרימת האוויר.
- חלחלות תאים במדיום אסאי: באמצעות פיפטה רב-ערוצית, השלך את ה-PBS והחלף אותו ב-180 מיקרו-אל של מדיום ה-assay המואר מראש (MAS-BSA-rPFO).
- התחלת המדידה: מיד לאחר ההחלמה, החלף את צלחת השירות של מחסנית החיישן המכוילת בלוח התא והתחל את המדידה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התחל על ידי נרמול התוצאות למדידה השנייה של נשימה בסיסית כדי להציג ערכים כאחוז צריכת חמצן (OCR%). תוצאות ההסתה מוצגות באיורים 5, איור 6, איור 7 ואיור 8 . חשוב להקצות את בארות הרקע המתאימות לכל קבוצה ולהנטרל את בארות הרקע של קבוצות אחרות. איור 5 מראה שלקבוצה המטופלת יש שיעור גבוה יותר של נשימה תמציתית. התגובה של תאי A549 לטיפול במטפורמין (איור 5A) הייתה גבוהה יותר מתאי HepG2(איור 5B). בארות בקרת הרקע היו רק אלה מאותן שורות של הקבוצה בהשוואה, במקרה זה, בארות A1, B1, A12 ו- B12. איור 6 מראה את השינויים בנשימה הנגרמת על-ידי פירובט/מאלאט. איור 7 מראה את השינויים בנשימה הנגרמת על-ידי גלוטמט/מלאט, ואיור 8 מראה את השינויים בנשימה המושרה בפלמיטויל קרניטין/מאלאט.
איור 1: ייצוג סכמטי של מחזור חומצת לימון. המצעים המשמשים לבדיקת שטף מצע מיטוכונדריאלי הם באדום. מלאט אינו משמש לבד אלא משמש בשילוב עם פירובט, פלמיטויל קרניטין וגלוטמט. תפקידו של מלאט בפירובאט/מאלאט, פלמיטויל קרניטין/נשימה המושרה במלאט הוא לספק אוקסלואצטט באמצעות פעולת האנזים דהידרוגנאז מלאט. בנשימה הנגרמת על ידי גלוטמט/מלאט, המלאט משתתף במעבורת המלט-אספרטט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: איור של תוכנית זריעת התאים במיקרו-לוח תרבית התאים. יש להשאיר בארות ריקות בעמודות 1 ו- 12 ריקות ללא תאים. עמודות 7-11 משמשות לטיפול בקבוצת הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: איור של אסטרטגיית ההזרקה. יציאה A של שורות A ו- B עמוסות בתערובת תמציתית / רוטנון. יציאה A של שורות C ו- D נטענות בתערובת פירובט /מלאט. יציאה A של שורות E ו- F נטענות בתערובת גלוטמט / מלאט. יציאה A של שורות G ו- H עמוסות בתערובת פלמיטויל קרניטין/מלאט. עבור כל הצלחת, יציאות B, C ו- D עמוסות באוליגומיצין, FCCP, ורוטנון / אנטימיצין A, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: שמות קבוצות ומפת לוחות. כל קבוצה נקראת על פי פנוטיפ (שליטה או מטופלת) והמצע המשמש לזירוז נשימה. (S), נשימה תמציתית. (P/M), נשימה המושרה פירובט/מלאט. (G/M), נשימה המושרה גלוטמט/מלאט. (CP/M), פלמיטויל קרניטין/נשימה המושרה מאלאט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: נשימה תמציתית. (א)A549 ו -( B)HepG2. הקבוצה שנבדקה טופלה עם 1 mM מטפורמין הידרוכלוריד במשך 16 שעות. רק בארות הרקע A1, B1, A12 ו- B12 משמשות לתיקון. התוצאות מוצגות כ- OCR ממוצע ± SD. הגרף ורשת הלוחות נוצרו ויצאו כקבצי תמונה על-ידי תוכנת עיצוב הבדיקה, ניתוח הנתונים וניהול הקבצים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: נשימה הנגרמת על ידי פירובט/מלאט. (A) A549 ו -B) HepG2. הקבוצה שנבדקה טופלה עם 1 mM מטפורמין הידרוכלוריד במשך 16 שעות. רק בארות הרקע C1, D1, C12 ו- D12 משמשות לתיקון. התוצאות מוצגות כ- OCR ממוצע ± SD. הגרף ורשת הלוחות נוצרו ויצאו כקבצי תמונה על-ידי תוכנת עיצוב הבדיקה, ניתוח הנתונים וניהול הקבצים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: נשימה הנגרמת על ידי גלוטמט/מלאט. (A) A549 ו-(B)HepG2. הקבוצה שנבדקה טופלה עם 1 mM מטפורמין הידרוכלוריד במשך 16 שעות. רק בארות הרקע E1, F1, E12 ו- F12 משמשות לתיקון. התוצאות מוצגות כ- OCR ממוצע ± SD. הגרף ורשת הלוחות נוצרו ויצאו כקבצי תמונה על-ידי תוכנת עיצוב הבדיקה, ניתוח הנתונים וניהול הקבצים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: פלמיטויל קרניטין/נשימה המושרה מאלאט. (A)A549 ו -( B) HepG2. הקבוצה שנבדקה טופלה עם 1 mM מטפורמין הידרוכלוריד במשך 16 שעות. רק בארות הרקע G1, H1, G12 ו- H12 משמשות לתיקון. התוצאות מוצגות כ- OCR ממוצע ± SD. הגרף ורשת הלוחות נוצרו ויצאו כקבצי תמונה על-ידי תוכנת עיצוב הבדיקה, ניתוח הנתונים וניהול הקבצים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| מדיום ת'אוויי מיטוכונדריאלי | ||||
| סטוק (מ"מ) | נפח מהמלאי לליטר (mL) | 2x MAS (mM) | MAS (mM) | |
| סוכרוז | 1000 | 140 | 140 | 70 |
| מניטול | 1000 | 440 | 440 | 220 |
| KH2PO4 | 1000 | 20 | 20 | 10 |
| MgCl2 | 200 | 50 | 10 | 5 |
| HEPES | 200 | 20 | 4 | 2 |
| אגטה | 200 | 10 | 2 | 1 |
| ADP | 200 | 20 | 4 | 2 |
טבלה 1: פתרון בדיקת מיטוכונדריאלי. מערבבים את הנפח המצוין של כל פתרון מלאי מרכיבים להכנה (2x MAS). חמם את הפתרון ל 37 °C (77 °F), ולאחר מכן להתאים את ה-pH עם 5 N KOH ל 7.4. הוסף מים מזוקקים כדי להביא את הנפח עד 1 L. מסנן לעקר ולאחר מכן לאחסן aliquots ב -20 °C (50 °F). הכן את פתרונות בינוניים ועובדים של מצעים ומעכבים מיטוכונדריאליים באמצעות 2x MAS.
| פקודה | משך | תרכובת מוזרקת |
| כיול | כברירת מחדל | |
| שוויון | כן | |
| בסיסית | ||
| 2 מחזורים | ||
| לערבב | שנות ה-30 | |
| המתין | שנות ה-30 | |
| מידה | 2 דקות | |
| הזרק יציאה A | מצעים | |
| 2 מחזורים | ||
| לערבב | שנות ה-30 | |
| המתין | שנות ה-30 | |
| מידה | 2 דקות | |
| הזרק יציאה B | אוליגומיצין | |
| 2 מחזורים | ||
| לערבב | שנות ה-30 | |
| המתין | שנות ה-30 | |
| מידה | 2 דקות | |
| הזרק יציאה C | FCCP | |
| 2 מחזורים | ||
| לערבב | שנות ה-30 | |
| המתין | שנות ה-30 | |
| מידה | 2 דקות | |
| הזרק יציאה D | רוטנון + אנטימיצין A | |
| 2 מחזורים | ||
| לערבב | שנות ה-30 | |
| המתין | שנות ה-30 | |
| מידה | 2 דקות |
טבלה 2: פקודות פרוטוקול ההסתה.
| עוצמת קול ב- 5 מ"ל | ||||||
| מצעים | ת'ורס. | עובד לוותר. | מניות | 2x MAS | ד"ה2O | ויתור סופי. |
| תמציתי/רוטנון | 1 מ'/20 מ'/מ"מ | 100 מ"מ/10 מיקרומטר | 500 μL / 2.5 μL | 2.5 מ"ל | 1997.5 μL | 10 מ"מ/1 מיקרומטר |
| פירובט/מלאט | 1 M/100 mM | 100 מ"מ /10 מ"מ | 500 μL/500 μL | 2.5 מ"ל | 1500 μL | 10 מ"מ /1 מ"מ |
| גלוטמט/מלאט | 1 M/100 mM | 100 מ"מ /10 מ"מ | 500 μL/500 μL | 2.5 מ"ל | 1500 μL | 10 מ"מ /1 מ"מ |
| פלמיטויל קרניטין/מאלאט | 10 מ"מ/100 מ"מ | 400 מיקרומטר /10 מ"מ | 200 μL/500 μL | 2.5 מ"ל | 1800 μL | 40 מיקרומטר /1 מ"מ |
| מעכבי | ||||||
| אוליגומיצין | 25 מ"ר | 15 מיקרומטר | 3 μL | 2.5 מ"ל | 2497 μL | 1.5 מיקרומטר |
| FCCP | 50 מ"ר | 40 מיקרומטר | 4 μL | 2.5 מ"ל | 2496 μL | 4 מיקרומטר |
| רוטנון/אנטימיצין A | 20 מ"מ/20 מ"מ | 10 מיקרומטר/ 10 מיקרומטר | 2.5 μL/2.5 μL | 2.5 מ"ל | 2495 μL | 1 מיקרומטר/ 1 מיקרומטר |
טבלה 3: רשימת מצעים ומעכבים מיטוכונדריאליים שיש לטעון ליציאות הזרקה של מחסניות החיישנים כפי שנדונו בעבר באיור 3. מערבבים את הכרכים המצוינים מפתרונות מלאי, 2x MAS ומים מזוקקים כדי להכין את 5 מ"ל של ריכוז העבודה של כל תערובת מצע או מעכב. הריכוז הסופי מושג בבארות לאחר תהליך ההזרקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה הוא שינוי של מחקרים שפורסמו בעבר7,8,9,10 ואת מדריך המשתמש במוצר. בניגוד לפרוטוקול היצרן, 2x MAS משמש במקום 3x MAS, שכן 2× MAS קל יותר להתמוסס ואינו יוצר משקעים לאחר הקפאה. ניתן לאחסן עד שישה חודשים ולהראות תוצאות עקביות. הבדל נוסף הוא כולל ADP ברכיבים של 2x MAS והשמטת BSA מהנוסחה. פתרונות המכילים BSA קשה יותר להזריק ולגרום אפשרות גדולה יותר של שגיאות חריגים. עם זאת, נוכחות של BSA חיונית כדי להפחית את כמות rPFO הדרוש כדי להשיג permeabilization תקין. לכן, BSA מתווסף רק למדיום ה- assay (MAS-BSA-rPFO) המשמש בשלב ההחלמה לאחר שטיפת התא.
כדי לשטוף את התאים מדיום תרבית התא, פרוטוקול זה משתמש PBS במקום MAS. PBS הוא איזוטוני ואינו גורם לשינוי כלשהו בצורת התא, בניגוד ל- MAS נטול נתרן העשיר באשלגן ויכול לשנות את המורפולוגיה התאית. הבדל גדול נוסף הוא שמירה על שלב ההתיילות בפרוטוקול ההסתייגות. שלב שיווי משקל נמשך 12 דקות, השווה ל-2 מחזורי מדידה. המטרה של שמירה על שלב שיווי משקל היא לייצב את הטמפרטורה בתוך המכשיר, באותו זמן, לאפשר לתאים לחמצן כל מאגרים מחמצנים פנימיים אפשריים, אשר משופר על ידי נוכחות של ADP במדיום אסאי.
יש לתת כמה שיקולים לגבי טכניקות תרבית התאים. בעבודה זו, התאים שנבדקו נזרעו ביום שלפני הבדיקה. עם זאת, תאים מסוימים דורשים זמן רב יותר של תרבות או טיפול. אם עיצוב המחקר כולל תאים מובחנים, תאים מבודדים טריים או תאים שאינם דבקים, נדרש ציפוי מתאים כדי לתקן תאים לתוך מיקרו-לוח תרבית התא. פרוטוקול זה אינו מתאים לתאים בהשעיה, ומומלץ להשתמש בדבק תאים ורקמות. מגבלה נוספת לפרוטוקול זה היא ששיטה זו אינה מתאימה לסיום נתונים כמותיים. במילים אחרות, לא ניתן בשיטה זו להעריך את הכמות בפועל של חלבון מיטוכונדריאלי בכל באר לפני המדידה. לכן, שיטה זו מייצרת סינון מהיר של שטף מצע מיטוכונדריאלי מבלי לספק הערכה מדויקת של יחס הפוספט / חמצן (יחס P / O)5. עם זאת, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה למחקרים כמותיים על דגימות קטנות11. לשם כך, יש צורך להשיג מיטוכונדריה מבודדת טרי ולהשתמש דבק תא ורקמות כדי לתקן מיטוכונדריה למיקרו-לוח תרבית התא.
לקבלת התוצאות הטובות ביותר לשחזור משימוש בפרוטוקול זה, שים לב לריכוז ריאגנטים משומשים. הטמפרטורה של הפתרונות, האינקובטורים והמכשירים המשומשים צריכה להיות יציבה. ודא שלכל הפתרונות והמצעים יש pH מותאם. כאמור, לא מומלץ לכלול BSA בפתרונות המתוכננים להיות מוזרקים. אם התוצאות מציגות טווח שגיאות רחב, הצג את התוצאות בתבנית הבאר במקום תבנית קבוצה שיש לחפש ולמחוק חריגים אפשריים.
בעבודה זו, ניסינו להשיג שימוש מרבי במדידה אחת כדי לסנן בו זמנית שטפי מצע מיטוכונדריאליים מרובים עם בקרת רקע נכונה ומספיק שכפולים בזמן קצר יחסית. כפי שמוצג בתוצאות, השיטה שימושית בהשוואת שני פנוטיפים שנוצרו על ידי טיפול בקבוצה אחת עם ריכוז אחד של תרופה. זה יכול להיות מועסק כדי להשוות קווי תאים שונים או תאים מהונדסים גנטית. הפרוטוקול הוא רב-תכליתי ומצעים שונים, או מעכבים יכולים לשמש להסתגלות המסך של שטף מצע מיטוכונדריאלי בכל מודל הסלולר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגוד אינטרסים להצהיר.
Acknowledgments
המחברים מודים לחברי הצוות של המחלקה לפיזיולוגיה בפקולטה לרפואה בחרדק קרלובה ולמחלקה לפתופיזיולוגיה בפקולטה השלישית לרפואה על העזרה בהכנת כימיקלים ודגימות. עבודה זו נתמכה על ידי תוכניות המענקים של אוניברסיטת צ'ארלס PROGRES Q40/02, משרד הבריאות הצ'כי מענק NU21-01-00259, קרן המדע הצ'כית מענק 18-10144 ופרויקט INOMED CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 במימון משרד החינוך, הנוער והספורט של צ'כיה ועל ידי האיחוד האירופי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
| Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 - 8 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
| HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
| L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
| L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
| Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
| Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
| Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 - 8 °C |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
| Water | Merck | W3500 | store at RT |
| XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
| XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 °C |
References
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
- Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. , Academic press. London. (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).
- Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).
