Summary
Neste trabalho, descrevemos um protocolo modificado para testar o flux de substrato respiratório mitocondrial usando perfringolysina recombinante O em combinação com respirometria à base de microplato. Com este protocolo, mostramos como a metformina afeta a respiração mitocondrial de duas linhas diferentes de células tumorais.
Abstract
O flux de substrato mitocondrial é uma característica distintiva de cada tipo de célula, e mudanças em seus componentes como transportadores, canais ou enzimas estão envolvidas na patogênese de várias doenças. Flux de substrato mitocondrial pode ser estudado usando células intactas, células permeabilizadas ou mitocôndrias isoladas. Investigar células intactas encontra vários problemas devido à oxidação simultânea de diferentes substratos. Além disso, vários tipos de células contêm lojas internas de diferentes substratos que complicam a interpretação dos resultados. Métodos como isolamento mitocondrial ou uso de agentes permeabilizantes não são facilmente reprodutíveis. Isolar mitocôndrias puras com membranas intactas em quantidades suficientes de pequenas amostras é problemático. O uso de permeabilizers não seletivos causa vários graus de danos inevitáveis da membrana mitocondrial. A perfringolysina recombinante O (rPFO) foi oferecida como um permeabilizer mais apropriado, graças à sua capacidade de permeabilize seletivamente a membrana plasmática sem afetar a integridade mitocondrial. Quando usado em combinação com respirometria de microplaco, permite testar o fluxo de vários substratos mitocondriais com réplicas suficientes dentro de um experimento enquanto usa um número mínimo de células. Neste trabalho, o protocolo descreve um método para comparar o flux de substrato mitocondrial de dois fenótipos ou genótipos celulares diferentes e pode ser personalizado para testar vários substratos mitocondriais ou inibidores.
Introduction
A respirometria baseada em microplacar revolucionou a pesquisa mitocondrial, permitindo o estudo da respiração celular de um pequeno tamanho amostral1. A respiração celular é geralmente considerada como um indicador de função mitocondrial ou "disfunção", apesar do fato de que a gama mitocondrial de funções se estende além da produção de energia2. Em condições aeróbicas, as mitocôndrias extraem a energia armazenada em diferentes substratos, quebrando e convertendo esses substratos em intermediários metabólicos que podem alimentar o ciclo do ácido cítrico3 (Figura 1). O fluxo contínuo de substratos é essencial para o fluxo do ciclo do ácido cítrico gerar "doadores de elétrons" de alta energia, que fornecem elétrons para a cadeia de transporte de elétrons que gera um gradiente de prótons através da membrana mitocondrial interna, permitindo atp-synthase para fosforilato ADP para ATP4. Portanto, um projeto experimental para avaliar a respiração mitocondrial deve incluir a natureza amostral (células intactas, células permeabilizadas ou mitocôndrias isoladas) e substratos mitocondriais.
As células mantêm um estoque de substratos indígenas5, e mitocôndrias oxidam vários tipos de substratos simultaneamente6, o que complica a interpretação dos resultados obtidos a partir de experimentos realizados em células intactas. Uma abordagem comum para investigar a capacidade mitocondrial de oxidar um substrato selecionado é isolar mitocôndrias ou permeabiliizar as células investigadas5. Embora mitocôndrias isoladas sejam ideais para estudos quantitativos, o processo de isolamento é trabalhoso. Enfrenta dificuldades técnicas como a necessidade de grande tamanho amostral, pureza do rendimento e reprodutibilidade da técnica5. As células permeabilizadas oferecem uma solução para as desvantagens do isolamento mitocondrial; no entanto, os agentes de permeabilização de rotina da natureza detergente não são específicos e podem danificar as membranas mitocondriais5.
A perfringolysina recombinante O (rPFO) foi oferecida como um agente de permeabilizing de membrana plasmática seletiva7, e foi utilizada com sucesso em combinação com um analisador de fluxo extracelular em vários estudos7,8,9,10. Modificamos um protocolo usando rPFO para tela de flux de substrato mitocondrial usando o analisador de fluxo extracelular XFe96. Neste protocolo, quatro diferentes vias oxidantes de substratos em dois fenótipos celulares são comparadas, tendo réplicas suficientes e o controle adequado para cada material testado.
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Protocol
1. Um dia antes do ensaio
- Preparação de reagentes e substratos.
- Solução de ensaio mitocondrial (MAS): Prepare soluções de estoque de todos os reagentes descritos na Tabela 1. Aqueça os estoques de manitol e sacarose a 37 °C para dissolver completamente. Misture os reagentes para preparar 2x MAS e aqueça a mistura a 37 °C. Ajuste o pH com 5N KOH para 7,4 (~7 mL), depois adicione água para levar o volume até 1 L. Estérilize o filtro e armazene as alíquotas a -20 °C até o dia da medição.
- Albumina de soro bovino (5% BSA): Dissolver 5 g de BSA em 90 mL de água estéril pré-armada em um agitador magnético e evitar tremer. Ajuste o pH para 7,4 com KOH de 5 N e, em seguida, adicione água para levar o volume até 100 mL. Esterilize o filtro e armazene as alíquotas a -20 °C até o dia da medição.
- Substratos mitocondriais: Prepare 1 M de soluções de estoque de succinato de sódio, piruvato de sódio e glutamato de sódio em água estéril. Prepare a solução de estoque de 100 mM de malato de sódio em água estéril e use água estéril pré-armada para preparar uma solução de estoque de 10 mM de carnitina palmitoyl. Ajuste o pH de cada solução para 7,4 por 5 N KOH e esterilize o filtro. Armazene os substratos a 2-8 °C. No momento do uso, a carnitina palmitoyl quente a 37 °C para dissolver quaisquer precipitados. Para uso posterior, armazene alíquotas de todos os substratos, exceto piruvato a -20 °C.
- Inibidores mitocondriais: Use sulfoxida de dimetil (DMSO) para preparar soluções de estoque de oligomicina de 25 mM, cianeto carbonil 4-(trifluorometoxy) fenilhydrazone (FCCP), 20 mM rotenona e 20 mM antimicina A. Armazenar as alíquotas a -20 °C.
- Semeadura e tratamento das células: Como mostrado na Figura 2, semeou as células nas colunas 2-11. As colunas 1 e 12 devem ser deixadas vazias para servir como poços de fundo. Neste trabalho, foram utilizadas células HepG2 e A549.
- Semeou as células a uma densidade de 20.000 células por poço. Use 50-80 μL de meio de cultura celular para semeadura.
- Encha os poços em branco com um volume igual de meio de cultura celular e incuba as células a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2. Deixe as células anexar por 3-4 horas e, em seguida, adicione 100 μL de cultura celular ao nível de todos os poços.
- Com essa adição final do meio, aplique o tratamento nas colunas 7-11. Neste trabalho, o grupo experimental foi tratado com cloridrato de metformina de 1 mM durante 16 horas, e o grupo controle foi tratado com igual volume de água destilada estéril como controle veicular.
- Hidratando os sensores: Pipeta 200 μL de água estéril por poço na placa de utilidade, em seguida, devolva cuidadosamente o cartucho do sensor enquanto imergi os sensores na água. Incubar o cartucho em uma incubadora livre de CO2a 37 °C até o dia seguinte.
- O modelo de protocolo de ensaio: Ligue o analisador (ver Tabela de Materiais) e a unidade controladora. Inicie o software de controle de instrumentos e aquisição de dados e projete o protocolo de ensaio conforme descrito na Tabela 2. Em Definições de Grupo,crie quatro estratégias de injeção onde a Porta A difere de acordo com o substrato injetado(Figura 3). Nomeie as estratégias após os substratos ou suas abreviaturas.
- Às portas B, C e D, atribuem os compostos oligomicina, FCCP e rotenona/antimicina A, respectivamente. Crie oito grupos e nomeie-os como mostrado na Figura 4. Em Mapa de placas, atribua os grupos aos poços correspondentes e, em seguida, salve o protocolo como um modelo pronto para uso. Deixe o analisador ligado para permitir que a temperatura se estabilize durante a noite. Mantenha o analisador em um lugar com temperatura estável para evitar mudanças bruscas de temperatura.
2. O dia do ensaio
- Substituição da água pelo calibrador: Descarte a água da placa de utilidade e a pipeta de 200 μL de calibrante pré-armado por poço na placa de utilidade. Devolva o cartucho à incubadora sem CO2até o momento do ensaio. Para evitar a evaporação rápida do calibrador, mantenha uma fonte de umidade dentro da incubadora e desligue ou reduza a velocidade do ventilador ao mínimo.
- Preparando as soluções de trabalho: Comece aquecendo 2x MAS, 5% BSA e água estéril a 37 °C. Enquanto isso, permita que os estoques inibidores atinjam a temperatura ambiente. Use 2x MAS quente e água destilada estéril para preparar 5 mL da concentração de trabalho dos substratos e inibidores conforme descrito na Tabela 3.
- Carregando as portas de injeção: Como mostrado na Figura 3, carregue 20 μL dos substratos na porta A. Carregue a mistura de succinato/rotenona na porta A das linhas A e B. Carregue a mistura piruvato/malato na porta A das linhas C e D. Carregue a mistura de glutamato/malato na porta A das linhas E e F. Carregue a mistura de carnitina/malato palmitoyl na porta A de linhas G e H. Para toda a placa, carregue a porta B com 22 μL de preparação de oligomicina, a porta C com 25 μL de preparação da FCCP e a porta D com 27 μL de mistura de rotenona/antimicina A.
- Iniciando a etapa de calibração: Na guia Executar o ensaio, clique em Iniciar a execução para iniciar o ensaio. Insira o cartucho do sensor carregado e inicie a etapa de calibração. Aguarde que a calibração seja concluída antes de prosseguir para a próxima etapa.
- Preparação do meio de ensaio (MAS-BSA-rPFO): Para preparar 20 mL do meio de ensaio, misture 10 mL de 2x MAS, 9,2 mL de água estéril e 0,8 mL de 5% BSA em um tubo de 50 mL. Adicione 2 μL de 10 μM rPFO para atingir uma concentração de 1 nM e resuspensar a mistura com tubulação suave. Evite tremer e não use uma batedeira de vórtice para misturar. Incubar o tubo a 37 °C até o momento do uso.
- Lavagem das células: Lave as células e os poços vazios em branco duas vezes com soro fisco pré-cozido e sem fosfato (PBS) usando uma pipeta multicanal. Evite reutilizar as mesmas dicas para descartar o meio de cultura celular e adicionar PBS. Realize este passo fora do fluxo laminar para proteger as células de secar pelo fluxo de ar.
- Permeabilização celular no meio de ensaio: Utilizando uma pipeta multicanal, descarte o PBS e substitua-o por 180 μL do meio de ensaio pré-armado (MAS-BSA-rPFO).
- Iniciando a medição: Imediatamente após a permeabilização, substitua a placa de utilidade do cartucho do sensor calibrado pela placa celular e inicie a medição.
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Representative Results
Comece pela normalização dos resultados para a segunda medição da respiração da linha de base para mostrar valores como percentual de taxa de consumo de oxigênio (OCR%). Os resultados do ensaio são mostrados nas Figuras 5,Figura 6,Figura 7 e Figura 8. É importante atribuir os poços de fundo adequados para cada grupo e inativar os poços de fundo de outros grupos. A Figura 5 mostra que o grupo tratado tem maior taxa de respiração induzida pelo succinato. A resposta das células A549 ao tratamento da metformina(Figura 5A) foi maior do que as células HepG2(Figura 5B). Os poços de controle de fundo eram apenas os das mesmas fileiras do grupo comparado, neste caso, os poços A1, B1, A12 e B12. A Figura 6 mostra as alterações na respiração induzida por piruvato/malate. A Figura 7 mostra as alterações na respiração induzida por glutamato/malato, e a Figura 8 mostra as alterações na respiração palmitoyl carnitina/malte induzida.
Figura 1: Uma representação esquemática do ciclo do ácido cítrico. Os substratos usados para testar o flux de substrato mitocondrial estão em vermelho. O malato não é usado sozinho, mas usado em combinação com piruvato, carnitina palmitoyl e glutamato. O papel do malato na respiração de piruvato/malato e palmitoyl induzida por malate é fornecer oxaloacetato através da ação da enzima desidrogenase malate. Na respiração induzida por glutamato/malato, o malato participa da nave malate-aspartato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Ilustração do plano de semeadura celular na microplacão da cultura celular. Poços em branco nas colunas 1 e 12 devem ser deixados vazios sem células. As colunas 7-11 são usadas para tratar o grupo experimental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ilustração da estratégia de injeção. A porta A das linhas A e B são carregadas com mistura de succinato/rotenona. A porta A das linhas C e D são carregadas com mistura piruvato/malate. A porta A das linhas E e F são carregadas com mistura de glutamato/malato. Porta A das linhas G e H são carregadas com mistura palmitoyl carnitina/malate. Para toda a placa, as portas B, C e D são carregadas com oligomicina, FCCP e rotenona/antimicina A, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Nomes de grupo e mapa da placa. Cada grupo é nomeado de acordo com o fenótipo (controle ou tratado) e o substrato usado para induzir a respiração. (S), respiração induzida por succinato. (P/M), respiração induzida por piruvato/malate. (G/M), respiração induzida por glutamato/malate. (CP/M), respiração carnitina palmitoyl/malate-induzida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Respiração induzida por succinato. (A)A549 e (B) HepG2. O grupo testado foi tratado com cloridrato de metformina de 1 mM durante 16 horas. Apenas os poços de fundo A1, B1, A12 e B12 são usados para correção. Os resultados são mostrados como OCR% médio ± SD. A grade de gráficos e placas foi criada e exportada como arquivos de imagem pelo design de ensaio, análise de dados e software de gerenciamento de arquivos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Respiração induzida por piruvato/malate. (A)A549 e (B) HepG2. O grupo testado foi tratado com cloridrato de metformina de 1 mM durante 16 horas. Apenas os poços de fundo C1, D1, C12 e D12 são usados para correção. Os resultados são mostrados como OCR% médio ± SD. A grade de gráficos e placas foi criada e exportada como arquivos de imagem pelo design de ensaio, análise de dados e software de gerenciamento de arquivos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Respiração induzida por glutamato/malato. (A)A549 e (B) HepG2. O grupo testado foi tratado com cloridrato de metformina de 1 mM durante 16 horas. Apenas os poços de fundo E1, F1, E12 e F12 são usados para correção. Os resultados são mostrados como OCR% médio ± SD. A grade de gráficos e placas foi criada e exportada como arquivos de imagem pelo design de ensaio, análise de dados e software de gerenciamento de arquivos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Respiração carnitina/malate induzida por malate. (A)A549 e (B) HepG2. O grupo testado foi tratado com cloridrato de metformina de 1 mM durante 16 horas. Apenas os poços de fundo G1, H1, G12 e H12 são usados para correção. Os resultados são mostrados como OCR% médio ± SD. A grade de gráficos e placas foi criada e exportada como arquivos de imagem pelo design de ensaio, análise de dados e software de gerenciamento de arquivos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Meio de ensaio mitocondrial | ||||
| Estoque (mM) | Volume de estoque por litro (mL) | 2x MAS (mM) | MAS (mM) | |
| Sacarose | 1000 | 140 | 140 | 70 |
| Manitol | 1000 | 440 | 440 | 220 |
| KH2PO4 | 1000 | 20 | 20 | 10 |
| MgCl2 | 200 | 50 | 10 | 5 |
| HEPES | 200 | 20 | 4 | 2 |
| EGTA | 200 | 10 | 2 | 1 |
| ADP | 200 | 20 | 4 | 2 |
Tabela 1: Solução de ensaio mitocondrial. Misture o volume indicado de cada solução de estoque de ingredientes para preparar (2x MAS). Aqueça a solução a 37 °C e ajuste o pH com 5 N KOH para 7,4. Adicione água destilada para levar o volume até 1 L. Esterilizar o filtro e, em seguida, armazenar alíquotas a -20 °C. Prepare as soluções de ensaio média e trabalho de substratos mitocondriais e inibidores usando 2x MAS.
| Comando | Duração | Composto injetado |
| Calibração | por padrão | |
| Equilibration | Sim | |
| Referência | ||
| 2 Ciclos | ||
| Misturar | 30 s | |
| Esperar | 30 s | |
| Medir | 2 min. | |
| Porta de injeção A | Substratos | |
| 2 Ciclos | ||
| Misturar | 30 s | |
| Esperar | 30 s | |
| Medir | 2 min. | |
| Injetar porta B | Oligomiina | |
| 2 Ciclos | ||
| Misturar | 30 s | |
| Esperar | 30 s | |
| Medir | 2 min. | |
| Injetar porta C | FCCP | |
| 2 Ciclos | ||
| Misturar | 30 s | |
| Esperar | 30 s | |
| Medir | 2 min. | |
| Injetar Porta D | Rotenone + Antimicina A | |
| 2 Ciclos | ||
| Misturar | 30 s | |
| Esperar | 30 s | |
| Medir | 2 min. |
Tabela 2: Comandos do protocolo de ensaio.
| Volume em 5 mL | ||||||
| Substratos | Conc estoque. | Trabalhando conc. | Estoque | 2x MAS | dH2O | Conc final. |
| Succinato/rotenona | 1 M/20 mM | 100 mM/10 μM | 500 μL/ 2,5 μL | 2,5 mL | 1997,5 μL | 10 mM/1 μM |
| Piruvato/malato | 1 M/100 mM | 100 mM /10 mM | 500 μL/500 μL | 2,5 mL | 1500 μL | 10 mM /1 mM |
| Glutamato/malato | 1 M/100 mM | 100 mM /10 mM | 500 μL/500 μL | 2,5 mL | 1500 μL | 10 mM /1 mM |
| Palmitoyl carnitina/malate | 10 mM/100 mM | 400 μM /10 mM | 200 μL/500 μL | 2,5 mL | 1800 μL | 40 μM /1 mM |
| Inibidores | ||||||
| Oligomiina | 25 mM | 15 μM | 3 μL | 2,5 mL | 2497 μL | 1,5 μM |
| FCCP | 50 mM | 40 μM | 4 μL | 2,5 mL | 2496 μL | 4 μM |
| Rotenona/anticcine A | 20 mM/20 mM | 10 μM/ 10 μM | 2,5 μL/2,5 μL | 2,5 mL | 2495 μL | 1 μM/ 1 μM |
Tabela 3: Lista de substratos mitocondriais e inibidores a serem carregados em portas de injeção dos cartuchos do sensor como discutido anteriormente na Figura 3. Misture os volumes indicados de soluções de estoque, 2x MAS e água destilada para preparar os 5 mL da concentração de trabalho de cada mistura de substrato ou inibidor. A concentração final é alcançada nos poços após o processo de injeção.
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Discussion
Este protocolo é uma modificação dos estudos publicados anteriormente7,8,9,10 e o guia do usuário do produto. Em contraste com o protocolo do fabricante, o 2x MAS é usado em vez de 3x MAS, uma vez que 2× MAS é mais fácil de dissolver e não forma precipitações após o congelamento. Alíquotas MAS 2x congeladas podem ser armazenadas até seis meses e mostrar resultados consistentes. Outra diferença é incluir ADP nos componentes de 2x MAS e omitir BSA da fórmula. Soluções que contêm BSA são mais difíceis de injetar e causam uma maior possibilidade de erros e outliers. No entanto, a presença da BSA é essencial para reduzir a quantidade necessária de rPFO para alcançar a permeabilização adequada. Portanto, o BSA é adicionado apenas ao meio de ensaio (MAS-BSA-rPFO) que é usado na etapa de permeabilização após a lavagem celular.
Para lavar as células do meio de cultura celular, este protocolo usa PBS em vez de MAS. O PBS é isotônico e não causa qualquer mudança na forma celular, em contraste com o MAS livre de sódio que é rico em potássio e pode alterar a morfologia celular. Outra grande diferença é manter o passo de equilíbrio no protocolo de ensaio. A etapa de equilíbrio dura 12 min, o que equivale a 2 ciclos de medição. O objetivo de manter o passo de equilíbrio é estabilizar a temperatura dentro do instrumento e, ao mesmo tempo, permitir que as células oxidam quaisquer possíveis lojas oxidadas internas, o que é potencializado pela presença de ADP no meio de ensaio.
Algumas considerações sobre técnicas de cultura celular devem ser dadas. Neste trabalho, as células examinadas foram semeadas no dia anterior ao ensaio. No entanto, algumas células requerem maior cultura ou tempo de tratamento. Se o desenho do estudo incluir células diferenciadas, células recém-isoladas ou não aderentes, um revestimento adequado é necessário para fixar células na microplacão da cultura celular. Este protocolo não é adequado para células em suspensão, e recomenda-se o uso de adesivo celular e tecido. Outra limitação para este protocolo é que este método não é adequado para concluir dados quantitativos. Em outras palavras, não é possível por este método estimar a quantidade real de proteína mitocondrial em cada poço antes da medição. Portanto, este método gera uma triagem rápida do flux de substrato mitocondrial sem fornecer uma estimativa precisa da relação fosfato/oxigênio (razão P/O)5. No entanto, é possível utilizar este protocolo para estudos quantitativos em pequenas amostras11. Para isso, é necessário obter mitocôndrias recém-isoladas e usar adesivo celular e tecido para fixar mitocôndrias à microplacúria da cultura celular.
Para obter os melhores resultados reprodutíveis a partir do uso deste protocolo, preste atenção à concentração dos reagentes usados. A temperatura das soluções usadas, incubadoras e instrumentos deve ser estável. Certifique-se de que todas as soluções e substratos tenham um pH ajustado. Como mencionado anteriormente, não é recomendável incluir bsa nas soluções planejadas para serem injetadas. Se os resultados mostrarem uma ampla gama de erros, exiba os resultados no formato de poço em vez do formato de grupo para procurar e excluir possíveis outliers.
Neste trabalho, tentamos obter o máximo uso de uma única medição para simultaneamente tela múltiplos fluxes de substrato mitocondrial com controle de fundo adequado e réplicas suficientes em um tempo relativamente curto. Como mostrado nos resultados, o método é útil na comparação de dois fenótipos criados pelo tratamento de um grupo com uma concentração de uma droga. Pode ser empregado para comparar diferentes linhas celulares ou células geneticamente modificadas. O protocolo é versátil e diferentes substratos, ou os inibidores podem ser usados para tela adaptação de flux de substrato mitocondrial em qualquer modelo celular.
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Disclosures
Os autores não têm conflito de interesses para declarar.
Acknowledgments
Os autores agradecem aos funcionários do Departamento de Fisiologia da Faculdade de Medicina de Hradec Králové e do Departamento de Fisiopatologia da Terceira Faculdade de Medicina pela ajuda com a preparação de produtos químicos e amostras. Este trabalho foi apoiado pelos programas de bolsas da Universidade Charles PROGRES Q40/02, O Ministério da Saúde tcheco concede nu21-01-00259, a Fundação Tcheca de Ciências concede 18-10144 e o projeto INOMED CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 financiado pelo Ministério da Educação, Juventude e Esportes da República Tcheca e pela União Europeia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
| Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 - 8 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
| HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
| L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
| L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
| Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
| Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
| Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 - 8 °C |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
| Water | Merck | W3500 | store at RT |
| XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
| XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 °C |
References
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
- Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. , Academic press. London. (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).
- Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).
