Summary
In dieser Arbeit beschreiben wir ein modifiziertes Protokoll zum Testen des mitochondrialen respiratorischen Substratflusses unter Verwendung von rekombinantem Perfringolysin O in Kombination mit mikroplattenbasierter Respirometrie. Mit diesem Protokoll zeigen wir, wie Metformin die mitochondriale Atmung von zwei verschiedenen Tumorzelllinien beeinflusst.
Abstract
Der mitochondriale Substratfluss ist ein Unterscheidungsmerkmal jedes Zelltyps, und Veränderungen seiner Komponenten wie Transporter, Kanäle oder Enzyme sind an der Pathogenese mehrerer Krankheiten beteiligt. Mitochondrialer Substratfluss kann mit intakten Zellen, permeabilisierten Zellen oder isolierten Mitochondrien untersucht werden. Die Untersuchung intakter Zellen stößt aufgrund der gleichzeitigen Oxidation verschiedener Substrate auf mehrere Probleme. Außerdem enthalten mehrere Zelltypen interne Speicher verschiedener Substrate, die die Interpretation der Ergebnisse erschweren. Methoden wie die mitochondriale Isolierung oder die Verwendung von Permeabilisatoren sind nicht leicht reproduzierbar. Die Isolierung reiner Mitochondrien mit intakten Membranen in ausreichenden Mengen aus kleinen Proben ist problematisch. Die Verwendung von nicht-selektiven Permeabilisatoren verursacht verschiedene Grade unvermeidlicher mitochondrialer Membranschäden. Rekombinantes Perfringolysin O (rPFO) wurde dank seiner Fähigkeit, die Plasmamembran selektiv zu permeabilisieren, ohne die mitochondriale Integrität zu beeinträchtigen, als geeigneterer Permeabilisator angeboten. In Kombination mit der Mikroplatten-Respirometrie ermöglicht es, den Fluss mehrerer mitochondrialer Substrate mit genügend Replikaten innerhalb eines Experiments unter Verwendung einer minimalen Anzahl von Zellen zu testen. In dieser Arbeit beschreibt das Protokoll eine Methode zum Vergleich des mitochondrialen Substratflusses von zwei verschiedenen zellulären Phänotypen oder Genotypen und kann angepasst werden, um verschiedene mitochondriale Substrate oder Inhibitoren zu testen.
Introduction
Die Mikroplatten-basierte Respirometrie hat die mitochondriale Forschung revolutioniert, indem sie die Untersuchung der Zellatmung einer kleinen Stichprobengrößeermöglicht 1. Die Zellatmung wird im Allgemeinen als Indikator für die mitochondriale Funktion oder "Dysfunktion" angesehen, obwohl der mitochondriale Funktionsumfang über die Energieproduktion hinausgeht2. Unter aeroben Bedingungen extrahieren Mitochondrien die in verschiedenen Substraten gespeicherte Energie, indem sie diese Substrate abbauen und in metabolische Zwischenprodukte umwandeln, die den Zitronensäurezyklus3 antreiben können (Abbildung 1). Der kontinuierliche Fluss von Substraten ist essentiell für den Fluss des Zitronensäurezyklus, um hochenergetische "Elektronendonatoren" zu erzeugen, die Elektronen an die Elektronentransportkette liefern, die einen Protonengradienten über die innere mitochondriale Membran erzeugt, so dass die ATP-Synthase ADP zu ATP4phosphorylieren kann. Daher muss ein experimentelles Design zur Untersuchung der mitochondrialen Atmung die Probennatur (intakte Zellen, permeabilisierte Zellen oder isolierte Mitochondrien) und mitochondriale Substrate umfassen.
Zellen halten einen Vorrat an einheimischen Substraten5, und Mitochondrien oxidieren mehrere Arten von Substraten gleichzeitig6, was die Interpretation von Ergebnissen aus Experimenten an intakten Zellen erschwert. Ein gängiger Ansatz zur Untersuchung der mitochondrialen Fähigkeit, ein ausgewähltes Substrat zu oxidieren, besteht darin, Mitochondrien zu isolieren oder die untersuchten Zellen zu permeabilisieren5. Obwohl isolierte Mitochondrien ideal für quantitative Studien sind, ist der Isolationsprozess mühsam. Es steht vor technischen Schwierigkeiten wie der Notwendigkeit eines großen Stichprobenumfangs, der Reinheit der Ausbeute und der Reproduzierbarkeit der Technik5. Permeabilisierte Zellen bieten eine Lösung für die Nachteile der mitochondrialen Isolierung; Routinemäßige Permeabilisatoren der Detergenziennatur sind jedoch nicht spezifisch und können die mitochondrialen Membranen schädigen5.
Rekombinantes Perfringolysin O (rPFO) wurde als selektives Plasmamembranpermeabilisierungsmittel7angeboten und in mehreren Studien7,8,9,10erfolgreich in Kombination mit einem extrazellulären Flussmittelanalysator eingesetzt . Wir haben ein Protokoll mit rPFO modifiziert, um den mitochondrialen Substratfluss mit dem extrazellulären Flussanalysator XFe96 zu screenen. In diesem Protokoll werden vier verschiedene Substratoxidationswege in zwei zellulären Phänotypen verglichen, während ausreichende Replikate und die richtige Kontrolle für jedes getestete Material vorhanden sind.
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Protocol
1. Einen Tag vor dem Assay
- Herstellung von Reagenzien und Substraten.
- Mitochondriale Assay-Lösung (MAS): Herstellung von Stammlösungen aller Reagenzien wie in Tabelle 1beschrieben. Erwärmen Sie die Bestände an Mannitol und Saccharose auf 37 °C, um sich vollständig aufzulösen. Mischen Sie die Reagenzien, um 2x MAS vorzubereiten, dann erwärmen Sie die Mischung auf 37 ° C. Stellen Sie den pH-Wert mit 5N KOH auf 7,4 (~ 7 ml) ein, fügen Sie dann Wasser hinzu, um das Volumen auf 1 L zu bringen. Filtern Sie die Aliquots und lagern Sie die Aliquots bis zum Messtag bei -20 ° C.
- Rinderserumalbumin (5% BSA): 5 g BSA in 90 ml vorgewärmtem sterilem Wasser auf einem Magnetrührer auflösen und Schütteln vermeiden. Stellen Sie den pH-Wert mit 5 N KOH auf 7,4 ein und fügen Sie dann Wasser hinzu, um das Volumen auf 100 ml zu bringen. Filtriern-sterilisieren und lagern Sie die Aliquots bei -20 °C bis zum Messtag.
- Mitochondriale Substrate: Bereiten Sie 1 M Stammlösungen von Natriumsuccinat, Natriumpyruvat und Natriumglutamat in sterilem Wasser vor. Bereiten Sie 100 mM Stammlösung von Natriummalat in sterilem Wasser vor und verwenden Sie vorgewärmtes steriles Wasser, um eine 10 mM Stammlösung von Palmitoylcarnitin herzustellen. Stellen Sie den pH-Wert jeder Lösung auf 7,4 x 5 N KOH ein und filtern Sie ihn. Lagern Sie die Substrate bei 2-8 °C. Zum Zeitpunkt der Anwendung Palmitoylcarnitin auf 37 °C erwärmen, um etwaige Ausscheidungen aufzulösen. Zur späteren Verwendung aliquots aller Substrate außer Pyruvat bei -20 °C lagern.
- Mitochondriale Inhibitoren: Dimethylsulfoxid (DMSO) zur Herstellung von Stammlösungen aus 25 mM Oligomycin, 50 mM Carbonylcyanid 4-(Trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP), 20 mM Rotenon und 20 mM Antimycin A. Lagern Sie die Aliquots bei -20 °C.
- Seeding und Behandlung der Zellen: Wie in Abbildung 2gezeigt, säen Sie die Zellen in den Spalten 2-11. Die Spalten 1 und 12 müssen leer gelassen werden, um als Hintergrundschächte zu dienen. In dieser Arbeit wurden HepG2- und A549-Zellen verwendet.
- Säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 20.000 Zellen pro Vertiefung aus. Verwenden Sie 50-80 μL Zellkulturmedium für die Aussaat.
- Füllen Sie die leeren Vertiefungen mit einem gleichen Volumen Zellkulturmedium und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5%CO2. Lassen Sie die Zellen für 3-4 Stunden anhaften und geben Sie dann 100 μL Zellkulturmedium zu allen Vertiefungen hinzu.
- Wenden Sie mit dieser letzten mittleren Zugabe die Behandlung in den Spalten 7–11 an. In dieser Arbeit wurde die experimentelle Gruppe 16 Stunden lang mit 1 mM Metforminhydrochlorid behandelt, und die Kontrollgruppe wurde mit einem gleichen Volumen sterilen destillierten Wassers als Vehikelkontrolle behandelt.
- Hydratisierung der Sensoren: 200 μL steriles Wasser pro Vertiefung in die Versorgungsplatte pipettieren und dann die Sensorpatrone vorsichtig zurückgeben, während die Sensoren in Wasser eingetaucht werden. Inkubieren Sie die Kartusche ineinem CO2-freienInkubator bei 37 °C bis zum nächsten Tag.
- Die Assay-Protokollvorlage: Schalten Sie den Analysator (siehe Materialtabelle)und die Controller-Einheit ein. Starten Sie die Gerätesteuerungs- und Datenerfassungssoftware, und entwerfen Sie das Assay-Protokoll wie in Tabelle 2beschrieben. Erstellen Sie unter Gruppendefinitionenvier Injektionsstrategien, bei denen sich Port A je nach injiziertem Substrat unterscheidet (Abbildung 3). Benennen Sie die Strategien nach den Substraten oder deren Abkürzungen.
- Weisen Sie den Ports B, C und D die Verbindungen Oligomycin, FCCP bzw. Rotenon/Antimycin A zu. Erstellen Sie acht Gruppen, und benennen Sie sie wie in Abbildung 4 dargestellt. Weisen Sie unter Plate Map die Gruppen den entsprechenden Wells zu und speichern Sie das Protokoll dann als gebrauchsfertige Vorlage. Lassen Sie den Analysator eingeschaltet, damit sich die Temperatur über Nacht stabilisieren kann. Bewahren Sie den Analysator an einem Ort mit einer stabilen Temperatur auf, um plötzliche Temperaturänderungen zu vermeiden.
2. Der Tag des Assays
- Ersetzen von Wasser durch den Kalifrant: Entsorgen Sie das Wasser von der Versorgungsplatte und pipettieren Sie 200 μL vorgewärmtes Calibrant pro Vertiefung in die Versorgungsplatte. Geben Sie die Kartusche bis zum Zeitpunkt des Assays in denCO2-freienInkubator zurück. Um eine schnelle Verdunstung des Kalifrants zu vermeiden, halten Sie eine Feuchtigkeitsquelle im Inneren des Inkubators aufrecht und schalten Sie die Lüfterdrehzahl aus oder reduzieren Sie sie auf ein Minimum.
- Vorbereitung der Arbeitslösungen: Beginnen Sie mit dem Erwärmen von 2x MAS, 5% BSA und sterilem Wasser auf 37 °C. In der Zwischenzeit lassen Sie die Inhibitorvorräte Raumtemperatur erreichen. Verwenden Sie warmes 2x MAS und steriles destilliertes Wasser, um 5 ml der Arbeitskonzentration der Substrate und Inhibitoren wie in Tabelle 3beschrieben herzustellen.
- Laden der Injektionsöffnungen: Wie in Abbildung 3gezeigt, laden Sie 20 μL der Substrate in Port A. Laden Sie das Succinat/Rotenon-Gemisch in Port A der Reihen A und B. Laden Sie das Pyruvat/Malat-Gemisch in Port A der Reihen C und D. Laden Sie das Glutamat/Malat-Gemisch in Port A der Reihen E und F. Laden Sie das Palmitoylcarnitin/Malat-Gemisch in port A der Zeilen G und H. Für die gesamte Platte laden Sie Port B mit 22 μL Oligomycin-Vorbereitung, Port C mit 25 μL FCCP-Vorbereitung und Port D mit 27 μL Rotenon/Antimycin A-Gemisch.
- Starten des Kalibrierungsschritts: Klicken Sie auf der Registerkarte Run Assay auf Start Run, um den Assay zu starten. Setzen Sie die geladene Sensorkassette ein und starten Sie den Kalibrierungsschritt. Warten Sie, bis die Kalibrierung abgeschlossen ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Herstellung des Assay-Mediums (MAS-BSA-rPFO): Um 20 ml des Assay-Mediums herzustellen, mischen Sie 10 ml 2x MAS, 9,2 ml steriles Wasser und 0,8 ml 5% BSA in einem 50-ml-Röhrchen. Fügen Sie 2 μL 10 μM rPFO hinzu, um eine Konzentration von 1 nM zu erreichen, und resuspenieren Sie die Mischung mit schonender Pipettung. Vermeiden Sie Schütteln und verwenden Sie keinen Wirbelmischer zum Mischen. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C bis zum Zeitpunkt der Verwendung.
- Waschen der Zellen: Waschen Sie die Zellen und die leeren Rohlinge zweimal mit vorgewärmter kalzium- und magnesiumfreier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einer Mehrkanalpipette. Vermeiden Sie es, die gleichen Spitzen wiederzuverwenden, um das Zellkulturmedium zu verwerfen und PBS hinzuzufügen. Führen Sie diesen Schritt außerhalb der laminaren Strömung durch, um die Zellen vor dem Austrocknen durch den Luftstrom zu schützen.
- Zellpermeabilisierung im Assay-Medium: Verwerfen Sie das PBS mit einer Mehrkanalpipette und ersetzen Sie es durch 180 μL des vorgewärmten Assay-Mediums (MAS-BSA-rPFO).
- Beginn der Messung: Ersetzen Sie unmittelbar nach der Permeabilisierung die Versorgungsplatte der kalibrierten Sensorpatrone durch die Zellplatte und starten Sie die Messung.
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Representative Results
Beginnen Sie mit der Normalisierung der Ergebnisse auf die zweite Messung der Baseline-Atmung, um Werte als Prozentsatz der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) anzuzeigen. Die Ergebnisse des Assays sind in abbildung 5, Abbildung 6, Abbildung 7 und Abbildung 8 dargestellt. Es ist wichtig, jeder Gruppe die richtigen Hintergrundbohrungen zuzuweisen und die Hintergrundbohrungen anderer Gruppen zu inaktivieren. Abbildung 5 zeigt, dass die behandelte Gruppe eine höhere Rate an Succinat-induzierter Atmung aufweist. Das Ansprechen von A549-Zellen auf die Metformin-Behandlung (Abbildung 5A) war höher als bei HepG2-Zellen (Abbildung 5B). Die Hintergrundkontrollbohrungen waren nur diejenigen aus den gleichen Reihen der verglichenen Gruppe, in diesem Fall aus den Vertiefungen A1, B1, A12 und B12. Abbildung 6 zeigt die Veränderungen der Pyruvat/Malat-induzierten Atmung. Abbildung 7 zeigt die Veränderungen der Glutamat/Malat-induzierten Atmung und Abbildung 8 zeigt die Veränderungen der Palmitoylcarnitin/Malat-induzierten Atmung.
Abbildung 1: Eine schematische Darstellung des Zitronensäurezyklus. Die zum Testen des mitochondrialen Substratflusses verwendeten Substrate sind rot. Malat wird nicht allein verwendet, sondern in Kombination mit Pyruvat, Palmitoylcarnitin und Glutamat. Die Rolle von Malat in der Pyruvat/Malat- und Palmitoylcarnitin/Malat-induzierten Atmung besteht darin, Oxalacetat durch die Wirkung des Malatdehydrogenase-Enzyms bereitzustellen. Bei der Glutamat/Malat-induzierten Atmung nimmt Malat am Malat-Aspartat-Shuttle teil. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Illustration des Zellsaatplans in der Zellkultur-Mikrotiterplatte. Rohlinge in den Spalten 1 und 12 müssen ohne Zellen leer bleiben. Die Spalten 7-11 werden verwendet, um die experimentelle Gruppe zu behandeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Illustration der Injektionsstrategie. Port A der Reihen A und B sind mit Succinat/Rotenon-Gemisch beladen. Port A der Reihen C und D ist mit Pyruvat/Malat-Gemisch beladen. Port A der Reihen E und F ist mit Glutamat/Malat-Gemisch beladen. Port A der Reihen G und H sind mit Palmitoylcarnitin/Malat-Gemisch beladen. Für die gesamte Platte sind die Ports B, C und D mit Oligomycin, FCCP bzw. Rotenon / Antimycin A beladen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Gruppennamen und Kennzeichenkarte. Jede Gruppe wird nach dem Phänotyp (Kontrolle oder Behandlung) und dem Substrat benannt, das zur Induktion der Atmung verwendet wird. (S), Succinat-induzierte Atmung. (P/M), Pyruvat/Malat-induzierte Atmung. (G/M), Glutamat/Malat-induzierte Atmung. (CP/M), Palmitoylcarnitin/Malat-induzierte Atmung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Succinat-induzierte Atmung. (A) A549 und (B) HepG2. Die getestete Gruppe wurde 16 Stunden lang mit 1 mM Metforminhydrochlorid behandelt. Nur die Hintergrundbohrungen A1, B1, A12 und B12 werden zur Korrektur verwendet. Die Ergebnisse werden als durchschnittliche OCR% ± SD angezeigt. Der Graph und das Plattenraster wurden von der Assay-Design-, Datenanalyse- und Dateiverwaltungssoftware erstellt und als Bilddateien exportiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Pyruvat/Malat-induzierte Atmung. (A) A ) A549 und (B) HepG2. Die getestete Gruppe wurde 16 Stunden lang mit 1 mM Metforminhydrochlorid behandelt. Nur die Hintergrundbohrungen C1, D1, C12 und D12 werden zur Korrektur verwendet. Die Ergebnisse werden als durchschnittliche OCR% ± SD angezeigt. Der Graph und das Plattenraster wurden von der Assay-Design-, Datenanalyse- und Dateiverwaltungssoftware erstellt und als Bilddateien exportiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Glutamat/Malat-induzierte Atmung. (A) A549 und (B) HepG2. Die getestete Gruppe wurde 16 Stunden lang mit 1 mM Metforminhydrochlorid behandelt. Zur Korrektur werden nur die Hintergrundbohrungen E1, F1, E12 und F12 verwendet. Die Ergebnisse werden als durchschnittliche OCR% ± SD angezeigt. Der Graph und das Plattenraster wurden von der Assay-Design-, Datenanalyse- und Dateiverwaltungssoftware erstellt und als Bilddateien exportiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Palmitoylcarnitin/Malat-induzierte Atmung. (A) A ) A549 und (B) HepG2. Die getestete Gruppe wurde 16 Stunden lang mit 1 mM Metforminhydrochlorid behandelt. Nur die Hintergrundbohrungen G1, H1, G12 und H12 werden zur Korrektur verwendet. Die Ergebnisse werden als durchschnittliche OCR% ± SD angezeigt. Der Graph und das Plattenraster wurden von der Assay-Design-, Datenanalyse- und Dateiverwaltungssoftware erstellt und als Bilddateien exportiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Mitochondriales Assay-Medium | ||||
| Bestand (mM) | Volumen ab Lager pro Liter (ml) | 2x MAS (mM) | MAS (mM) | |
| Saccharose | 1000 | 140 | 140 | 70 |
| Mannit | 1000 | 440 | 440 | 220 |
| KH2PO4 | 1000 | 20 | 20 | 10 |
| MgCl2 | 200 | 50 | 10 | 5 |
| HEPES | 200 | 20 | 4 | 2 |
| EGTA | 200 | 10 | 2 | 1 |
| ADP | 200 | 20 | 4 | 2 |
Tabelle 1: Mitochondriale Assay-Lösung. Mischen Sie das angegebene Volumen jeder Zutatenstocklösung zur Zubereitung (2x MAS). Erwärmen Sie die Lösung auf 37 °C und stellen Sie dann den pH-Wert mit 5 N KOH auf 7,4 ein. Fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, um das Volumen auf 1 L zu bringen. Filtern Sie es und lagern Sie die Aliquots dann bei -20 ° C. Bereiten Sie das Assay-Medium und die Arbeitslösungen von mitochondrialen Substraten und Inhibitoren unter Verwendung von 2x MAS vor.
| Befehl | Dauer | Injizierte Verbindung |
| Kalibrierung | standardmäßig | |
| Gleichgewicht | Ja | |
| Grundlinie | ||
| 2 Zyklen | ||
| Mischen | 30 Sek. | |
| Warte | 30 Sek. | |
| Messen | 2 Minuten | |
| Injektion Port A | Substrate | |
| 2 Zyklen | ||
| Mischen | 30 Sek. | |
| Warte | 30 Sek. | |
| Messen | 2 Minuten | |
| Injektion Port B | Oligomycin | |
| 2 Zyklen | ||
| Mischen | 30 Sek. | |
| Warte | 30 Sek. | |
| Messen | 2 Minuten | |
| Injektion Port C | FCCP | |
| 2 Zyklen | ||
| Mischen | 30 Sek. | |
| Warte | 30 Sek. | |
| Messen | 2 Minuten | |
| Einschleusen von Port D | Rotenon + Antimycin A | |
| 2 Zyklen | ||
| Mischen | 30 Sek. | |
| Warte | 30 Sek. | |
| Messen | 2 Minuten |
Tabelle 2: Befehle des Assay-Protokolls.
| Volumen in 5 mL | ||||||
| Substrate | Lagerbestand conc. | Arbeiten conc. | Lager | 2x MAS | dH2O | Finale conc. |
| Succinat/Rotenon | 1 M/20 mM | 100 mM/10 μM | 500 μL/ 2,5 μL | 2,5 ml | 1997,5 μL | 10 mM/1 μM |
| Pyruvat/Malat | 1 M/100 mM | 100 mM /10 mM | 500 μL/500 μL | 2,5 ml | 1500 μL | 10 mM /1 mM |
| Glutamat/Malat | 1 M/100 mM | 100 mM /10 mM | 500 μL/500 μL | 2,5 ml | 1500 μL | 10 mM /1 mM |
| Palmitoylcarnitin/Malat | 10 mM/100 mM | 400 μM /10 mM | 200 μL/500 μL | 2,5 ml | 1800 μL | 40 μM /1 mM |
| Hemmer | ||||||
| Oligomycin | 25 mM | 15 μM | 3 μL | 2,5 ml | 2497 μL | 1,5 μM |
| FCCP | 50 mM | 40 μM | 4 μL | 2,5 ml | 2496 μL | 4 μM |
| Rotenon/Antimycin A | 20 mM/20 mM | 10 μM/ 10 μM | 2,5 μL/2,5 μL | 2,5 ml | 2495 μL | 1 μM/ 1 μM |
Tabelle 3: Liste der mitochondrialen Substrate und Inhibitoren, die in Injektionsanschlüsse der Sensorkartuschen geladen werden sollen, wie zuvor in Abbildung 3 erläutert. Mischen Sie die angegebenen Mengen aus Stammlösungen, 2x MAS und destilliertem Wasser, um die 5 ml der Arbeitskonzentration jedes Substrats oder jeder Inhibitormischung herzustellen. Die Endkonzentration wird nach dem Injektionsprozess in den Vertiefungen erreicht.
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Discussion
Dieses Protokoll ist eine Modifikation der zuvor veröffentlichten Studien7,8,9,10 und des Produkt-Benutzerhandbuchs. Im Gegensatz zum Protokoll des Herstellers wird anstelle von 3x MAS 2x MAS verwendet, da 2× MAS leichter aufzulösen ist und nach dem Einfrieren keine Ausfällungen bildet. Gefrorene 2x MAS Aliquots können bis zu sechs Monate gelagert werden und zeigen konsistente Ergebnisse. Ein weiterer Unterschied besteht darin, ADP in die Komponenten von 2x MAS aufzunehmen und BSA aus der Formel wegzulassen. Lösungen, die BSA enthalten, sind schwieriger zu injizieren und verursachen eine größere Wahrscheinlichkeit von Fehlern und Ausreißern. Das Vorhandensein von BSA ist jedoch unerlässlich, um die Menge an rPFO zu reduzieren, um eine ordnungsgemäße Permeabilisierung zu erreichen. Daher wird BSA nur dem Assay-Medium (MAS-BSA-rPFO) zugesetzt, das im Permeabilisierungsschritt nach dem Zellwaschen verwendet wird.
Um die Zellen aus dem Zellkulturmedium zu waschen, verwendet dieses Protokoll PBS anstelle von MAS. PBS ist isotonisch und verursacht keine Veränderung der Zellform, im Gegensatz zum natriumfreien MAS, das reich an Kalium ist und die Zellmorphologie verändern kann. Ein weiterer großer Unterschied besteht darin, den Gleichgewichtsschritt im Assay-Protokoll beizubehalten. Der Gleichgewichtsschritt dauert 12 min, was 2 Messzyklen entspricht. Das Ziel der Beibehaltung des Gleichgewichtsschritts besteht darin, die Temperatur im Inneren des Instruments zu stabilisieren und gleichzeitig den Zellen zu ermöglichen, mögliche interne oxidierbare Speicher zu oxidieren, was durch das Vorhandensein von ADP im Assay-Medium verstärkt wird.
Einige Überlegungen zu Zellkulturtechniken sollten angestellt werden. In dieser Arbeit wurden die untersuchten Zellen am Tag vor dem Assay ausgesät. Einige Zellen benötigen jedoch eine längere Kultur- oder Behandlungszeit. Wenn das Studiendesign differenzierte Zellen, frisch isolierte oder nicht adhärente Zellen umfasst, ist eine geeignete Beschichtung erforderlich, um Zellen in der Zellkultur-Mikroplatte zu fixieren. Dieses Protokoll ist nicht für Zellen in Suspension geeignet, und die Verwendung von Zell- und Gewebekleber wird empfohlen. Eine weitere Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass diese Methode nicht geeignet ist, quantitative Daten zu gewinnen. Mit anderen Worten, es ist mit dieser Methode nicht möglich, die tatsächliche Menge an mitochondrialem Protein in jeder Vertiefung vor der Messung abzuschätzen. Daher erzeugt diese Methode ein schnelles Screening des mitochondrialen Substratflusses, ohne eine genaue Schätzung des Phosphat/Sauerstoff-Verhältnisses (P/O-Verhältnis)zu liefern 5. Es ist jedoch möglich, dieses Protokoll für quantitative Studien an kleinen Stichproben zu verwenden11. Zu diesem Zweck ist es notwendig, frisch isolierte Mitochondrien zu erhalten und Zell- und Gewebekleber zu verwenden, um Mitochondrien an der Zellkultur-Mikroplatte zu fixieren.
Um die besten reproduzierbaren Ergebnisse aus diesem Protokoll zu erhalten, achten Sie auf die Konzentration der verwendeten Reagenzien. Die Temperatur der verwendeten Lösungen, Inkubatoren und Instrumente sollte stabil sein. Stellen Sie sicher, dass alle Lösungen und Substrate einen eingestellten pH-Wert haben. Wie bereits erwähnt, wird es nicht empfohlen, BSA in die zu injizierenden Lösungen aufzunehmen. Wenn die Ergebnisse einen großen Fehlerbereich aufweisen, zeigen Sie die Ergebnisse im Well-Format anstelle des Gruppenformats an, um nach möglichen Ausreißern zu suchen und diese zu löschen.
In dieser Arbeit haben wir versucht, die maximale Nutzung einer einzigen Messung zu erreichen, um mehrere mitochondriale Substratflüsse gleichzeitig mit der richtigen Hintergrundkontrolle und genügend Replikaten in relativ kurzer Zeit zu screenen. Wie in den Ergebnissen gezeigt, ist die Methode nützlich beim Vergleich von zwei Phänotypen, die durch die Behandlung einer Gruppe mit einer Konzentration eines Arzneimittels entstehen. Es kann verwendet werden, um verschiedene Zelllinien oder gentechnisch veränderte Zellen zu vergleichen. Das Protokoll ist vielseitig und verschiedene Substrate oder Inhibitoren können verwendet werden, um die Anpassung des mitochondrialen Substratflusses in jedem zellulären Modell zu screenen.
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Disclosures
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.
Acknowledgments
Die Autoren danken den Mitarbeitern der Abteilung für Physiologie an der Medizinischen Fakultät in Hradec Králové und der Abteilung für Pathophysiologie der Dritten Medizinischen Fakultät für die Hilfe bei chemikalien und Probenvorbereitung. Diese Arbeit wurde durch die Stipendienprogramme der Karlsuniversität PROGRES Q40/02, den Zuschuss des tschechischen Gesundheitsministeriums NU21-01-00259, den Zuschuss der tschechischen Wissenschaftsstiftung 18-10144 und das INOMED-Projekt CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 unterstützt, das vom Ministerium für Bildung, Jugend und Sport der Tschechischen Republik und von der Europäischen Union finanziert wurde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
| Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 - 8 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
| HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
| L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
| L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
| Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
| Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
| Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 - 8 °C |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
| Water | Merck | W3500 | store at RT |
| XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
| XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 °C |
References
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